CROMATOGRAFA

1. DEFINICIN

La cromatografa es una tcnica de separacin en la que los

componentes que se han de separar se distribuyen en dos fases
inmiscibles: una fase mvil que se desplaza en una direccin definida y
otra fase fija o estacionaria.
La palabra cromatografa fue utilizada por primera vez por el botnico
ruso M. Tswett en 1906 para designar una tcnica empleada por l en la
separacin de pigmentos vegetales: hizo pasar un extracto de hojas
verdes por una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio
adicionando un disolvente por la parte superior de la columna y obtuvo
una serie de bandas horizontales coloreadas.
Mediante la cromatografa es posible separar, identificar y
posteriormente cuantificar los componentes de mezclas que de otra
manera slo pueden separarse con grandes dificultades o incluso no
separarse. Es una tcnica utilizada tanto con fines analticos como
preparativos.

2. TRMINOS DEL PROCESO CROMATOGRFICO

Fase mvil: Fluido que se desplaza a travs del lecho cromatogrfico

en una direccin definida. Cuando la fase mvil abandona la columna
cromatogrfica recibe el nombre de eluyente.
Fase estacionaria: Puede ser un slido, un gel o un lquido que
permanece fijo en el interior de la columna cromatogrfica. Si es un
lquido debe estar distribuido en un soporte slido, unido
covalentemente o inmovilizado en l.
Detector: Instrumento que mide el cambio en la composicin del
eluyente mediante la determinacin de sus propiedades fsicas o
qumicas.
Cromatograma: Representacin de la respuesta del detector, en la
que se registra la concentracin de la sustancia o de masa del
componente en estudio en el eluyente respecto al volumen eludo o al
tiempo.

3. TIPOS DE CROMATOGRAFA

Segn el proceso

CROMATOGRAFA FRONTAL: Si la muestra fluye de forma continua por el

lecho cromatogrfico, sin requerir una fase mvil adicional.
CROMATOGRAFIA POR ELUCIN: Cuando la muestra es arrastrada por un
eluyente.
CROMATOGRAFIA POR DESPLAZAMIENTO: Si la fase mvil contiene un
compuesto que queda retenido con ms fuerza que el componente de la
muestra a separar, de modo que ste es desplazada.

http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/materialde-clase-1/Apuntes_Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf

Explicacin de la imagen:

Para llevar a cabo el desarrollo por desplazamiento, se toma como fase

mvil una solucin de una sustancia que sea retenida por el adsorbente
ms fuertemente que cualquiera de los componentes de la mezcla
problema. El soluto presente en el eluyente (es decir, el designado por C
en la figura), desplaza a los componentes de la muestra (A y B por
ejemplo) de la zona en que estn retenidos al principio de la columna. Si
B es adsorbido ms fuertemente que A, B desplaza sucesivamente a A.
Por tanto las zonas descienden por la columna en el orden A, B y C
(parte B de la figura). Sin embargo, esta tcnica presenta el
inconveniente de que las zonas no quedan separadas por regiones de
disolvente puro, pudindose originar, por tanto, una superposicin
considerable. En ciertos casos, este problema se resuelve introduciendo
otra sustancia en el eluyente que tenga unas propiedades de adsorcin
intermedias entre las de A y B.
En el anlisis frontal, una columna pequea se rellena con un peso
conocido de adsorbente, y se hace pasar por ella de modo continuo la
solucin que contiene la muestra problema, la cual, en este caso, se
convierte en la fase mvil. Inicialmente quedan retenidos todos los
solutos presentes en la muestra, pero al continuar la adicin de sta, el
adsorbente alcanza la saturacin y van siendo desplazadas las
sustancias retenidas ms dbilmente (por ejemplo, A), las cuales,
finalmente, salen de la columna. El anlisis de la fase mvil que sale de
la columna da un resultado del tipo indicado en la figura . El Primer
escaln est formado exclusivamente por la sustancia A; el segundo
consta principalmente de la sustancia B, aunque impurificada por la A
que es aportada continuamente por la muestra. El tercer escaln
contiene ya la mezcla inicial A+B+C, aunque al principio algo disminuida
en B. El nmero de escalones en la curva es igual al nmero de
componentes en la mezcla. La cantidad de sustancia A en la mezcla
inicial se calcula a partir del volumen de disolvente que pasa por la
columna hasta el momento que sale A. Los otros componentes se
evalan tambin a partir de relaciones volumen-concentracin.
La cromatografa por elucin se utiliza para obtener productos
biotecnolgicos con un alto grado de pureza.

Segn el estado fsico de la fase mvil

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA: Si la fase mvil es un gas.

CROMATOGRAFA EN FASE LQUIDA: Si la fase mvil es un lquido.

- Liquido-Liquido.

Liquido-Solido.
Liquido-Gel.

Cromatografa lquido-lquido
En la cromatografa lquido-lquido se utiliza un adsorbente slido
impregnado con un lquido que funciona como fase estacionaria. La
separacin de los solutos es resultado de las diferencias en los
coeficientes de particin de cada uno de los solutos de la mezcla entre
las fases lquidas (estacionaria y mvil).
Cromatografa por filtracin en gel
La cromatografa por filtracin en gel utiliza partculas fabricadas de
geles porosas que actan como mallas moleculares que permiten
separar molculas en funcin de su tamao. Este tipo de cromatografa
es comnmente empleada en las ltimas etapas de los procesos de
obtencin de productos biotecnolgicos.
Cromatografa por adsorcin
La cromatografa por adsorcin emplea adsorbentes en los que los
solutos a separar presentan diferentes grados de retencin. Existen
varias modalidades caracterizadas bsicamente por el tipo de
adsorbente que emplean, llamadas cromatografa de adsorcin: fsica,
de intercambio inico, de interaccin hidrofbica, de fase reversa y de
afinidad.
Cromatografa de adsorcin simple
La cromatografa por adsorcin simple se caracteriza por la unin del
soluto al adsorbente por fuerzas dbiles del tipo de van Der Waals. Este
tipo de cromatografa es poco selectiva entonces se utiliza poco a nivel
analtico, pero por su bajo costo es utilizada a nivel industrial.
Cromatografa por intercambio inico
La cromatografa por intercambio inico se basa en la interaccin
electrosttica entre los grupos cargados del soluto y los grupos de carga
contraria de los adsorbentes.
Cromatografa de interaccin hidrofbica y cromatografa de fase
reversa
Tanto la cromatografa de interaccin hidrofbica como la de fase
reversa, se basan en la interaccin entre las regiones hidrofbicas de las
biomolculas y los grupos hidrofbicos de los adsorbentes empleados.

Cromatografa por afinidad

La cromatografa por afinidad est basada en interacciones altamente
especficas entre el soluto de inters y el adsorbente. Este tipo de
cromatografa es muy empleada en la purificacin de protenas. Los
adsorbentes utilizados en esta cromatografa presentan grupos qumicos
llamados ligandos que son altamente especficos para la unin con los
solutos.