UNIVERSIDAD DE QUINTANA ROO

DIVISIN
CIENCIAS
DE LA SALUD

GENTICA
INSULINA RECOMBINANTE:
FUNDAMENTO
Y
MTODO

Prof.: Amrica Granados

Alumnos
Raymundo Sotelo Puc
Ingrid M. Villanueva Cach
Russel A. Sols Marrufo
Jess E. Gala Morales
Darwin U. Tamayo Chuc

GENTICA
Produccin de la Insulina recombinante.
Fundamento, utilidad y mtodos.

Introduccin
La diabetes mellitus es una de las enfermedades con mayor impacto socio-sanitario, no solo por su
elevada frecuencia, sino por las consecuencias de las complicaciones crnicas que comporta esta
enfermedad. Esta se caracteriza por tener una insuficiente produccin de insulina por clulas
denominadas beta del pncreas, esta problemtica provoca que las personas presenten una
elevacin de la glucosa en la sangre (hiperglucemia) y otras alteraciones que cambian el
metabolismo. En el caso de los individuos genticamente predispuestos, los factores de riesgo
suelen ser la obesidad y el sedentarismo que conducen primero a la resistencia a la insulina y
despus la diabetes, que produce problemas cardiovasculares como la dislipidemia, la hipertensin y
factores pro trombticos y otras alteraciones como la debilidad, sueo, delgadez, obesidad, infarto,
ceguera o insuficiencia renal.

Produccin de la insulina recombinante

Una vez que se conoce la secuencia nucleotdica de las cadenas A y B que conforman la insulina, se
pudieron disear dos fragmentos de DNA sinttico que codifican los 21 aminocidos de la cadena A y
los 30 de la cadena B. Estos genes son fcilmente clonables en el vector pBR322, que tiene sitios
especficos de corte para las enzimas EcoR1 y BamH1 formando as extremos cohesivos y
complementarios a los genes sintticos. Al insertar las secuencias sintticas en el plsmido, se
inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, de esta manera las bacterias transformadas
expresaran su sensibilidad a la tetraciclina pero seguirn siendo resistentes a la ampicilina. Debido a
que el plsmido hbrido no contiene un promotor adecuado para ser reconocido por la ARN
polimerasa para poder transcribirse a ARN mensajero, y posteriormente ser traducido en protena, es
necesario colocar un fragmento de ADN que contenga un promotor de Escherichia coli antes de la
secuencia nucleotdica de los genes sintticos.
Muchas veces cuando las protenas que desean obtenerse son muy pequeas, son fcilmente
degradadas por la Escherichia coli y por tanto no se expresan a pesar de que poseen el plsmido
hbrido. Para evitar esto, puede obtenerse una protena ms estable utilizando lo que se conoce
como fusin de genes. Este mtodo se realiza uniendo las cadenas A y B de la Insulina con una
protena que la bacteria no reconozca como extraa y por tanto no sea degradada; una de las
protenas ms estudiadas es la que produce el opern lacZYA, que se encarga de codificar para la
B-galactosidasa, una permeasa transcetilasa de la lactosa.
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La enzima EcoR1 reconoce dos sitios en el opern de la lactosa, el primero entre el gen i (que es
un represor) y la regin P (que es el promotor), y el segundo sitio se encuentra a 3009 pb despus
del codn de iniciacin de la B-galactosidasa. Al obtener este fragmento podemos clonarlo fcilmente
en los plsmidos derivados de pBR322 que contienen cada uno la secuencia que codifica para una
de las cadenas de la insulina; al realizar la clonacin de este fragmento de ADN, la orientacin que
este debe tener, es aquella en que el promotor del opern se encuentre en el extremo distal con
respecto al ADN de las cadenas de insulina, esto se realiza mediante la caracterizacin de los
plsmidos con las enzimas de restriccin.
Estas molculas resultarn en un gen hbrido el cual tienen informacin para codificar casi toda
la B-galactosidasa y para codificar las cadenas de la insulina, ya sea A o B. Al traducir la informacin
del gen se obtendr una protena que constar de casi toda la B-galactosidasa y una de las cadenas
de la insulina unida a la porcin carboxilo-terminal de la B-galactosidasa en dos aminocidos y hay
un residuo de metionina entre las dos secuencias. La protena hbrida no tiene actividad enzimtica
sobre la lactosa y es insoluble en agua, contrario a la B-galactosidasa nativa que es soluble en agua.
Para obtener la cadena de la insulina debe extraerse la protena hbrida de la clula
hospedadora y tratarla con bromuro de ciangeno, el cual, corta las protenas en los residuos de
metionina, y como ninguna de las cadenas de la insulina contienen metioninas, stas no sern
cribadas, obteniendo de este modo, la cadena completamente libre. Al obtener cada una de las
cadenas, se deben purificar y unir entre s a travs de puentes disulfuro, mediante la oxidacin
regulada de sus derivados sulfonados. Existe la posibilidad de que las cadenas se unan entre s
inespecficamente, por ello deben seleccionarse solo aquellas molculas que presenten la estructura
tridimensional adecuada, ya que slo stas son biolgicamente activas.

Mtodo para la produccin de insulina Humana recombinante

En el presente trabajo se utilizara un kit de clonacin pGEM-T Easy Vector Systems de la casa
PROMEGA LAB.
El contenido del kit es el siguiente:

1.2g pGEM-T Vector (50ng/l) es el plsmido PBR322

12l Control Insert DNA (4ng/l) controles
100u T4 DNA Ligase enzima
200l 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase, ECOR1, BAMH1.
1.2ml JM109 Competent Cells, High Efficiency (6 200l), Escherichia coli modificada.

Procedimiento y materiales
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Placas LB con ampicilina / IPTG / X-Gal.

Medio de enriquecimiento SOC (Escherichia coli selectivo).
Tubos Eppendorf.
Ultrasonicador.
Centrifuga.
Recipientes con hielo.
Bao mara.
Agua grado HPLC.
Medio cido ascrbico.
Bromuro de ciangeno.
Micro pipetas.
Acetonitrilo.
cido trifluoroacetico (TFA).
Equipo HPLC.

Procedimiento de inicio (mezcla inicial)

1. Centrifugar brevemente el pGEM-T o tubos pGEM-T Easy vector y ADN, y controles para
Recoger los contenidos de la parte inferior de los tubos.
2. Establecer reacciones de ligacin como se describe a continuacin.
Mezcle en un Vortex la solucin buffer 2X y enzimas ligasa contenidas vigorosamente antes
de cada uso.
Mezclar las reacciones con la pipeta despus de depositado el contenido.
3. Se incuban las reacciones durante 1 hora a temperatura ambiente. (modificado)
4. Alternativamente, si se requiere un nmero mximo de colonias, incubar las reacciones
durante la noche a 4 C.

Notas: las cantidades pueden variar para aumentar los resultados de productividad.
1. Utilizar nicamente la T4 ADN ligasa suministrados con este sistema ya que otras preparaciones
comerciales de T4 ADN ligasa pueden contener actividades exonucleasa que pueden eliminar
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la
desoxitimidina
terminal
desde
el
vector.
2. El Buffer de ligado 2X contiene ATP, que se degrada durante las fluctuaciones de temperatura. Es
por ello que se debe evitar mltiples congelaciones y descongelaciones.
3. Tiempos de incubacin ms largos aumentaran el nmero de clulas transformantes (Escherichia
coli). Generalmente, la incubacin durante la noche a 4 C produce un mximo nmero de
transformantes.

Procedimiento de Transformacin (recombinacin)

1. Preparar placas LB (tambin contienen ampicilina, IPTG y cromgeno X-Gal) para cada
reaccin de ligacin, adems de dos placas para determinar la eficiencia de transformacin
(controles). Llevar a temperatura ambiente.
2. Centrifugar los tubos que contienen las reacciones de ligacin para recoger el contenido de la
parte inferior (mezcla de inicio).
3. Aadir 25 l de la reaccin de ligacin a un tubo de Eppendorf estril depositado en el hielo y
agregar la cepa de Escherichia coli para que se produzca un choque trmico que permita la
apertura de los poros de la membrana y la introduccin del plasmido con el gen insertado en
ella. Coloque otro tubo en hielo con el plsmido sin cortar 0,1 ng para la determinacin de la
eficiencia de transformacin de las clulas competentes (Escherichia coli)
4. Retire el tubo del hielo que contiene la cepa JM109 y colocar en un bao de agua fra hasta
que est descongelado (unos 5 minutos).
5. Mezclar las clulas suavemente agitando el tubo. El pipeteo debe ser cuidadoso ya que las
bacterias competentes son extremadamente frgiles.
6. Transferir 50 l del tubo de cepas en cada tubo preparado en la Etapa 2. Mezclar suavemente
y colocarlos en hielo durante 10 minutos.
7. Inmediatamente devolver los tubos (cepa) a los 2 minutos.
8. Aadir 950 l de medio SOC a temperatura ambiente a los tubos que contienen a las bacteria
transformadas con reacciones de ligacin y 900 l al tubo que contiene las clulas
transformadas con el plsmido sin cortar (tubo control).
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9. Incubar durante 1,5 horas a 37 C.

10. Colocar de 50-100ul de cada tubo de transformacin en placas LB (ampicilina, IPTG y X-Gal).
Para el control de la transformacin, se recomienda una dilucin 1:10 en medio SOC para el
recubrimiento. Se podra aumentar el nmero de colonias centrifugando el tubo de proceso
final a 1000rpm/10 minutes, colocar 200 l de la suspensin en medio SOC, y 100 l en
placas LB.
11. Se incuban las placas durante la noche (16-24 horas) a 37 C. Si se estran y siembran 100
l, el desarrollo bacteriano ser de aproximadamente 100 colonias por placa. El uso de
clulas competentes de alta eficiencia (Escherichia coli) puede resultar en un mayor nmero
de colonias. El enriquecimiento y aislamiento de las colonias de bacterias modificadas tienen
como caracterstica comn una coloracin blanca, es decir, las que llevan el gen de inters,
aunque se pueden presentar colonias de coloracin azul (viraje del cromgeno X-gal por la Bgalactosidasa). Para un mayor volumen de produccin se puede construir un biorreactor.

Procedimiento de extraccin
1. Para este proceso se utilizara el mtodo de sonicacin que a continuacin se describe.
2. Tomar las colonias de la superficie del medio con esptula plstica estril y colocarlos en un
tubo de eppendorf y agregar solucin amortiguadora (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7
mM, pH of 7,4) llevndolos a una temperatura de 6-8C.
3. Colocar el tubo Eppendorf en el ultrasonicador durante 2 minutos a una frecuencia de 20-35
kHz.
4. Despus del proceso de sonicado, centrifugar la muestra durante 10 minutos a 3500 rpm y
separar el sobrenadante. Este procedimiento se puede realizar hasta X veces de acuerdo a
la claridad del sobrenadante.
5. Incubar la muestra en Bromuro de ciangeno (CnBR) a un pH 9.0 para romper los residuos de
metionina y obtener as las dos cadenas libres.

Procedimiento de purificacin

6. Para este proceso se utilizara el mtodo de cromatografa liquida de alta resolucin en fase
reversa con eluyentes de agua y acetonitrilo con una concentracin mnima de ATF.
7. Equipo HPLC: Columna Vydac 218TP54, de 250 x 4,6 mm de DI, 5 m, tamao de poro de
300A. velocidad de flujo de 1 ml/minute a Temperatura ambiente. Eluyentes: A; cido
trifluroactico (TFA) al 0,1% en H2O B; TFA al 0,08% en acetonitrilo.
8. Sonicar los eluyentes A y B para eliminar restos de burbujas y gases que pudieran interferir en
el proceso.
9. Se realizara un purgado de tuberas y columna durante 5-10 minutos a una velocidad de
1ml/minute con una mezcla inicial de 25% de eluyentes B, y posteriormente aumentar su
concentracin hasta el 50% hasta obtener una lnea recta (estable).
10. Inyectar la muestra a purificar, con una velocidad inicial de flujo de 0.8ml/min, con una
absorbancia para la deteccin de 260 nm. El resultado obtenido ser el de molculas
separadas de residuos y restos qumicos.
11. La sustancia purificada se obtendr al cabo de unas horas y deber almacenarse en viales
oscuros, la muestra obtenida contendr los aminocidos complementarios de insulina (cadena
A y B).
12. Al obtener los aminocidos purificados (cadenas A y B en viales separados), se debern
mezclar e incubar 37C durante un perodo de 10 horas a un pH de 10 aproximadamente en
presencia de cido ascrbico a travs de esta reduccin se producirn los puentes disulfuro
que convertirn a las dos cadenas en la molcula de insulina activa.
13. Por ltimo, se purifica nuevamente la molcula que ahora es de mayor tamao en el equipo
HPLC. El mismo mtodo cuantificar de acuerdo a los clculos respectivos, la concentracin
obtenida.
Nota: el anlisis de los resultados se realiza a travs de la comparacin de las seales obtenidas con la deteccin de las
cadenas A y B separadas y de la insulina activa por medio de la cromatografa liquida de alta resolucin usando
estndares de calidad (99% pureza).

Conclusiones
La insulina recombinante es una de las primeras aportaciones de gran importancia en los ensayos
biotecnolgicos de recombinacin de ADN, actualmente muchas casas farmacuticas tienen la
patente de sus productos. Los pacientes con DM requieren un componente molecular totalmente
homlogo a la insulina humana y este mtodo ofrece totalmente una sustancia de procedencia
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humana, esto disminuye totalmente las reacciones adversas y permite una absorcin y asimilacin
adecuada a comparacin de otras formas como la insulina semisinttica (producida en mamferos).
Lo mejor de este mtodo es que se puede realizar en un laboratorio comn, aplicando de
manera adecuada los protocolos y controlando los factores determinantes como la temperatura, las
concentraciones de las enzimas y los tiempos de exposicin en las reacciones, al final, el
rendimiento que obtengamos dependern de nuestras destrezas como analistas. Este trabajo sera
favorable para las personas de nuestra comunidad que padecen DMI, pues se producira insulina a
bajos costos.

REFERENCIAS
Corona, B. R. (2010). Expresin, solubilizacin y purificacin de la protena MSP5 recombinante
del aislamiento Habana de . Tecnologia y ciencia, 32.
Devlin, T. M. (2002). Bioquimica: libro de texto con aplicaciones clinicas. Barcelona, Espaa:
Revert.
Moreno Ortiz, J. P. (2010). Produccin de insulina recombinante mediante ingeniera gentica.
UNICATCUE, 54.
Poi, V. R. (2009). Produccin de insulina a partir de organismos bacterianos: Revisin bibliogrfica
para la tcnica molecular. Revista Iberoamericana de Tecnologa, 23-45.