UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA

AGRICULTURA
INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
ENZIMOLOGA

INTEGRANTES:
Acosta Jonathan
Ceracapa Sandy

NRC: 3268

FECHA DE REALIZACIN: 02/06/2014

FECHA DE ENTREGA: 13/06/2014

INFORME DE LABORATORIO
PRCTICA N 3
1. TEMA:
Identificacin la actividad enzimtica y accin inhibitoria sobre la -amilasa mediante el
empleo del inhibidor proveniente del extracto de Physalis peruviana (Uvilla)
2. OBJETIVOS:
2.1. Objetivo General:

Identificar la actividad enzimtica y accin inhibitoria sobre la -amilasa

mediante el empleo del inhibidor provenientes del extracto de Physalis
peruviana (Uvilla) en tiempos de 5,10 y 15 minutos.

2.2. Objetivos Especficos:

Calcular la velocidad mxima (Vmax) y la constante de Michaelis-Menten

Km para las reacciones enzimticas en funcin de la alfa amilasa
Determinar el tipo de inhibicin presente en la reaccin enzimtica
mediante el uso del modelo de Doble Inversos.

3. MARCO TERICO
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de los polisacridos, tales como
amilopectina, amilosa, glucgenos y sus productos parcialmente hidrolizados. La amilasa (a-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa, E.C.3.2.1.1) se halla presente en los tejidos y
lquidos de animales. Son metaloenzimas que contienen un mnimo de un tomo de calcio
por molcula y necesitan este metal para expresar sus actividades catalticas (Biolinker,
2008).

En el hombre la -amilasa est presente en el pncreas (aproximadamente 200 mg/kg),

glndulas salivales, hgado, msculo, tejido adiposo, saliva, sangre, orina, heces, leche,
semen, rin, cerebro, pulmn, trompas de falopio, intestino, bazo y rin (Biolinker,2008).
Los inhibidores de la - amilasa se encuentra en algunas variedades de plantas como en el
frjol (Phaseolus vulgaris) , siendo parte de su composicin natural. Por esta razn muchas
plantas con similares componentes son utilizadas como inhibidores, siendo complementos
en los tratamientos contra la diabetes y la obesidad. El mecanismo de accin del inhibidor
de la alfa amilasa se basa en la disminucin de la digestin del almidn, mediante un
bloqueo del sitio activo de la enzima (Rodrguez, 2012).
4. Datos
a.- Determinacin de la curva de calibracin
Cuadro 1: Datos para la curva de calibracin
[S] (%)
0.1
0.25
0.5
0.75
1

Absorbancia (=540nm)
0.002
0.004
0.032
0.037
0.042

Lecturas de absorbancia obtenidas a una longitud de 540 nm (columna derecha) para las
concentraciones de 0.1 ,0.25, 0.75 y 1 % de almidn (columna derecha).

[S] vs Absorbancia
0.05

f(x) = 0.05x - 0
R = 0.89

0.04
0.04
0.03
0.03

Absorbancia 0.02
0.02
0.01
0.01
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Concentracin de almidn [S] (%)

Grfico 1: Curva de calibracin para las concentraciones de 0.1 ,0.25, 0.75 y 1 % almidn.
Grfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

b.- Determinacin de las velocidades iniciales sin inhibidor

Cuadro 2: Absorbancias medidas sin inhibidor
Tiempo (min)

Concentracin de sustrato [S] (%)

0.25
0.5
0.75
1
0.208
0.292
0.382
0.479

0.1
0.15

10

0.244

0.334

0.399

0.497

0.59

15

0.31

0.445

0.6

0.724

0.829

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima y las diferentes concentraciones de

sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1) a diferentes tiempos de incubacin (5 ,10 y 15)
Cuadro 3: Concentraciones Residuales
Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l,
Concentra
Tiempo(m ciones de
in)
[0.1](g/ml)

Concentra
Concentra
ciones
Concentra ciones de
de[0.25]
ciones de
[0.75]
(g/ml)
[0.5](g/ml)
(g/ml)

Concentra
ciones de
[1](g/ml)

3.061

4.245

5.959

7.796

9.776

10

4.980

6.816

8.143

10.143

12.041

15

6.327

9.082

12.245

14.776

16.918

donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y

[c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente
de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal,
E=0.049 (g-1*cm-1) ()

Concentracion residual VS Tiempo de reaccin

18.000
Concentraciones de [0.1](g/ml)

Linear (Concentraciones de [0.1](g/ml))

16.000

f(x) = 0.71x + 5.77

14.000
Concentraciones de[0.25] (g/ml)

f(x) = 0.7x + 3.93

Linear (Concentraciones de[0.25] (g/ml))

12.000

f(x) = 0.63x + 2.5

10.000
Concentraciones
de (g/ml)
[0.5](g/ml)
Concentracions
de producto

Linear (Concentraciones de [0.5](g/ml))

f(x) = 0.48x + 1.88

8.000
6.000

f(x) = 0.33x + 1.52

Concentraciones de [0.75](g/ml)
4.000

Linear (Concentraciones de [0.75](g/ml))

2.000
Concentraciones de [1](g/ml) 0.000

Linear (Concentraciones de [1](g/ml))

6
8
10
12
14
16

Tiempo (min)

Grfica 2: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacion en la grfica

concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales
para la reaccin catalizada por la enzima(segun). Grfico y ajuste realizado en
Microsoft Excel
Cuadro 4: Velocidades iniciales para la reaccin sin inhibidor (Io)
[S] (%)
0.1
0.25
0.5
0.75
1

V(g/min)
0.327
0.484
0.629
0.698
0.714

Las velocidades iniciales

(columna derecha) son
las pendientes de las rectas generadas por la linealizacin de la concentracin residual vs
tiempo de incubacin, en la columna izquierda se presentan las concentraciones de almidn
(0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)

c.- Determinacin de las velocidades iniciales con inhibidor al 25% (I1)

Cuadro5: Absorbancias medidas con inhibidor al 25% (I1)
Tiempo (s)

Concentracin de sustrato [S] (%)

0.1
0.25
0.5
0.75
0,692
0,81
0,859
0,903

1
1,068

10

0,793

0,843

0,989

1,184

1,218

15

0,835

1,036

1,141

1,231

1,401

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima, sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 , 1) e
inhibidor (25%) a diferentes tiempos de incubacin (5 ,10 , 15)
Cuadro 6: Concentraciones Residuales
Concentracio Concentracio Concentracio Concentracio Concentracio
nes de [0.1] nes de[0.25] nes de [0.5] nes de [0.75] nes de [1]
Tiempo(min)
(g/ml)
(g/ml)
(g/ml)
(g/ml)
(g/ml)
14,122449 16,5306122 17,5306122 18,4285714 21,7959184
5
16,1836735 17,2040816 20,1836735 24,1632653 24,8571429
10
17,0408163 21,1428571 23,2857143
25,122449 28,5918367
15

Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l,

donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y
[c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente
de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal,
E=0.049 (g-1*cm-1) ()

35
30
f(x) = 0.68x + 18.29
f(x) = 0.67x + 15.88
f(x) = 0.58x + 14.58
f(x) = 0.46x + 13.68

25
20
Concentracin residual(gr/ml)

f(x) = 0.29x + 12.86

15
10
5
0
4

10

12

14

Tiempo(min)
Concentracin [0,1%]

Linear (Concentracin [0,1%])

Concentracin [0,25%]

Linear (Concentracin [0,25%])

Concentracin [0,5%]

Linear (Concentracin [0,5%])

Concentracin [0,75%]

Linear (Concentracin [0,75%])

Concentracin [1%]

Linear (Concentracin [1%])

Grfica 3: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacion en la grfica

concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales
para la reaccin catalizada por la enzima (segun). Grfico y ajuste realizado en
Microsoft Excel
Cuadro 7: Velocidades iniciales para la reaccin con inhibidor (I1)
[S] (%)
0.1
0.25
0.5
0.75
1

V(g/min)
0,291
0,46
0,58
0,67
0,68

Las velocidades iniciales (columna derecha) son las pendientes de las rectas generadas por
la linealizacin de la concentracin residual vs tiempo de incubacin, en la columna
izquierda se presentan las concentraciones de almidn (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)

16

d.- Determinacin de las velocidades iniciales con inhibidor al 50% (I2)

Cuadro 8: Absorbancias medidas con inhibidor 50%( I2)
Tiempo (s)

Concentracin almidn [S]

0.25
0.5
0.75
0,989
1,24
1,408

0.1
0,782

1
1,53

10

0,832

1,12

1,42

1,59

1,767

15

0,905

1,194

1,505

1,72

1,859

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima, sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1) e
inhibidor (50%) a diferentes tiempos de incubacin (5, 10, 15)
Cuadro 9: Concentraciones Residuales

Tiempo(min)
5
10
15

Concentraci
ones de
[0.1](g/ml)
15,959

Concentraci
ones
Concentraci Concentraci Concentraci
de[0.25]
ones de
ones de
ones de [1]
(g/ml)
[0.5](g/ml) [0.75](g/ml)
(g/ml)
20,184
25,306
28,735
31,224

16,980

22,857

28,980

32,449

36,061

18,469

24,367

30,714

35,102

37,939

Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l,

donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y
[c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente
de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal,
E=0.049 (g-1*cm-1) ()

40.000
35.000

f(x) = 0.67x + 28.36

f(x) = 0.64x + 25.73

30.000

f(x) = 0.54x + 22.93

25.000
Concentraciones residuales8gr/ml)

f(x) = 0.42x + 18.29

20.000

f(x) = 0.25x + 14.63

15.000
10.000
5.000
0.000
4

10

12

14

16

Tiempo(min)
Concentracin [0,1%]

Linear (Concentracin [0,1%])

Concentracin [0,25%]

Linear (Concentracin [0,25%])

Concentracin [0,5%]

Linear (Concentracin [0,5%])

Concentracin [0,75%]

Linear (Concentracin [0,75%])

Concentracin [1%]

Linear (Concentracin [1%])

Grfica 4: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacin en la grfica

concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales
para la reaccin catalizada por la enzima (segun). Grfico y ajuste realizado en
Microsoft Excel
Cuadro 10: Velocidades iniciales para la reaccin con inhibidor (I2)
[S] (%)
0.1
0.25
0.5
0.75
1

V(g/min)
0.251
0.418
0.540
0.6367
0.671

Las velocidades iniciales (columna derecha) son las pendientes de las rectas generadas por
la linealizacin de la concentracin residual vs tiempo de incubacin, en la columna
izquierda se presentan las concentraciones de almidn (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)
Cuadro 11: velocidades iniciales para las reacciones enzimticas

[S]

V-Io

V-I1

V-I2

0,1

0,33

0,291

0,251

0,25

0,48

0,46

0,42

0,5

0,63

0,58

0,54

0,75

0,7

0,67

0,64

0,71

0,68

0,67

Las velocidades inciales para cada tratamiento dependientes de la concentracin de

sustrato se resumen en el cuadro 11

[S] vs Velocidad
0.80
0.70
0.60
0.50

Velocidades iniciales (g/min) 0.40

0.30
0.20
0.10
0.00
0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

Concentracin de sustrato (%)

V-Io

V-I1

V-I2

Grfico 5: Curva de progresin de la actividad enzimtica, cuyos datos se muestran en el

cuadro 11, como se observa la actividad enzimtica de cada tratamiento va disminuyendo a
partir de la curva sin inhibidor (Io- azul) ,seguida de la reaccin con inhibidor al 25% (I1tomate) y finalmente la curva con inhibidor al 50% (I2-gris)
e.- Determinacin de parmetro cinticos Vmax y Km mediante el mtodo de Dobles
Inversos
Cuadro12: Valores inversos de la concentracin de sustrato y velocidades
1/[S]
10,000

1/V-Io
3,030

1/V-I1
3,436

1/V-I2
3,984

4,000

2,083

2,174

2,381

2,000

1,587

1,724

1,852

1,333

1,429

1,493

1,563

1,000

1,408

1,471

1,493

Se presenta los valores inversos de la concentracin de sustrato y las velocidades iniciales

para cada uno de los tratamientos planteados: sin inhibidor (Io), con inhibidor al 25%(I1) y
con inhibidor al 50% (I2)

Linealizacin : Dobles Inversos

4.500
4.000

f(x) = 0.28x + 1.24

3.500

f(x) = 0.22x + 1.25

3.000

f(x) = 0.18x + 1.24

2.500
1/Vo

2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

1/So
Inhibidor Io

Linear (Inhibidor Io)

Inhibidor I1

Linear (Inhibidor I1)

Inhibidor I2

Linear (Inhibidor I2)

Grfico 6: Linealizacion por el mtodo de doble inversos para cada tratamiento planteado:
sin inhibidor (Io-azul), con inhibidor al 25%(I1-tomate) y con inhibidor al 50% (I2-gris).

Cuadro 13: Ecuaciones Lineales

Tratamiento
I0

Ecuacin lineal
Y1 = 0,1827x + 1,2376

I1

Y2 = 0,2198x + 1,2536

I2

Y3 = 0,2756x + 1,2437

Ecuaciones lineales para cada tratamiento planteado: sin inhibidor (Io-azul), con inhibidor
al 25%(I1-tomate) y con inhibidor al 50% (I2-gris).
Y1 = 0,1827x + 1,2376
km
1
1 Vmax
1
=
+
V
[S ]
Vmax
1
=1.2376
Vmax
Vmax=0.8080(

g
)
min

Km
=0.1827
Vmax
Km=0.18270.8080
g
Km= 0.1476 ( )
ml
Y2 = 0,2198x + 1,2536
km
1
1 Vmax
1
=
+
V
[S ]
Vmax
1
=1.2536
Vmax
Vmax=0.7977 (

g
)
min

Km
=0.2198
Vmax
Km=0.21980.7977

g
Km= 0.1753 ( )
ml
Y3 = 0,2756x + 1,2437
km
1
1 Vmax
1
=
+
V
[S ]
Vmax
1
=1.2437
Vmax

Vmax=0. 8040(

g
)
min

Km
=0.2756
Vmax
Km=0.27560.8040

g
Km= 0.2215 ( )
ml

Como Vmax es constante y Km aumenta se deduce que la inhibicin es competitiva

1. DISCUCIN
En la presente prctica se utilizo una muestra de Uvilla (Physalis peruviana), planta que
segn Rodriguez(2012) posee una sustancia que actua como inhibidor de la alfa amilasa
presente en la saliva. La prctica mostro resultados coherentes que concuerdan con una
inhibicin competitiva ya que el km de cada uno de los ensayos aumento mientras que
la velocidad mxima se mantuvo constante, concordando con Munim (2012) que
apunta la presencia de inhibidores competitivos en plantas de este tipo.
Aunque los datos obtenidos en la ecuaciones no fueron exactos, variando en decimales,
lo cual segn lo consultado en el Boletn de producto qumico(2014) puede deberse a la
exactitud con la que se tomo el tiempo o fallas humanas a la hora de calcular el
inhibidor o la enzima.
Segn Rodriguez(2012), son los fenoles presentes en la planta los que actan como
inhibidores, hecho que no pudimos comprobar en nuestro ensayo, ya que aunque se
demostr que el extracto posee capacidad inhibitoria, para determinar el tipo de
sustancias se necesitaran otras pruebas como por ejemplo la prueba de cloruro ferrico
para determinar la presencia de fenoles.
2. CONCLUSIONES
La velocidad mxima calculada para los 3 ensayos fue de 0,80 gr/min, mientras
que los km obtenidos fueron para I0=0.14, I2=0.17 y I3=0.22 gr/ml.
El extracto obtenido de la planta muestra una inhibicin competitiva, lo que se
pudo demostrar al realizar los clculos que indican un aumento en el km pero
una velocidad mxima constante
3. RECOMENDACIONES

 Se deben obtener plantas frescas para realizar el ensayo, debido a que el mal
almacenamiento de la misma puede arrojar resultados confusos.
En el caso de almacenar las muestras, estn deben ser maceradas en agua o
etanol para despus mantenerse en refrigeracin para evitar la oxidacin de las
muestras
4. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Munim, A(2013). Screeaninf of Glucosidase inhibitory activity of some Indonesian

medicinal plants. University of Indonesia. West Java.Indonesia
Rodrigez, M.(2012).Extraccin y purificacin de la alfa amilasa de diferentes
variedades mejoradas de frijol .Universidad Autnoma de Queretaro, Mxico Df,
Mxico.
Recuperado
el
05/06/2014
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Recuperado
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05/06/2014
de
http://www.revistaciencia.uat.edu.mx/index.php/CienciaUat/article/view/6/9
Grupo Alere. Boletn de producto qumico (2014). Biolinker. Recuperado el
05/06/2014 de: http://www.alere.com.ar/productos/PDF_BIO/boletines/boletin-05amilasa.pdf
Recuperado
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05/06/2014
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http://www.slideshare.net/yuricomartinez/determinacion-cuantitativa-de-laactividad-enzimatica-del-preparado
Espectrofotometro:http://www4.ujaen.es/~pedrajas/Espectrofotometria.swf
Universidad de jaen.
Universidad del pas Vasco
http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cinetica.htm
determinacin de velocidades
Tesis sobre la inhibicon a la alfa amilasa y sus inbibidores en frejol
http://ri.uaq.mx/bitstream/123456789/653/1/RI000266.pdf