Qumica Orgnica II

Aminocidos y Protenas

Trabajo Prctico de Laboratorio 4

Tema: Aminocidos y Protenas
Introduccin Terica
AMINOCIDOS
Propiedades qumicas
Los aminocidos poseen en su estructura un grupo cido y un grupo bsico, por lo
cual presentan propiedades anfotricas. Un anfolito es aquella especie que puede aceptar y
donar protones (H+). En una solucin de bajo pH, los aminocidos estn totalmente
protonados y tienen una carga positiva. Si la solucin es casi neutra, los aminocidos existen
como iones dipolares, o sea iones con una carga positiva y una carga negativa. Los iones
dipolares tambin se conocen como zwitteriones. Un aminocido que existe como un ion
dipolar es neutro ya que las cargas, positiva y negativa, se cancelan. Para valores de pH altos,
los aminocidos se cargan negativamente. En solucin se establece un equilibrio entre las
tres formas.
Por ejemplo, para el aminocido glicina:

A pH 2 todos los grupos aparecen protonados: -COO- como -COOH y -NH2 como NH3+. El aminocido tiene una carga positiva neta.

A partir de pH 2,34 (pK1) el carboxilo se disocia (-COO-) y el amino sigue protonado (NH3+). El aminocido tendr simultneamente carga positiva y negativa (zwitterion).

A partir de pH 9,60 (pK2) el carboxilo sigue disociado (-COO-) y el amino pierde el

protn (-NH2). El aminocido queda con una carga negativa neta.

Si analizamos el movimiento electrofortico de los aminocidos a distintos valores de

pH, encontraremos un valor al cual su movilidad es nula. Este valor de pH corresponde a la
condicin en la cual la especie dominante es aquella que no posee carga elctrica neta. Este
valor de pH recibe el nombre de punto isoelctrico (pI). Podemos definir entonces al pI
como el valor de pH al cual un aminocido, un pptido o una protena poseen carga neta
0. Este valor se puede calcular a partir de la curva de titulacin o empleando la siguiente
ecuacin: pI= (pK1+ pK2)/2.

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Titulacin en presencia de formaldehido

Este procedimiento de titulacin de aminocidos con un hidrxido en presencia de

formaldehido fue diseado por Srensen en 1907 y se basa en el consumo de la especie con el
grupo amino libre, lo cual produce un desplazamiento a la derecha del equilibrio indicado como
pK2, con la consiguiente liberacin de protones y acidificacin del medio. El descenso en los
valores de pH se registra a partir de la generacin de la especie nuclefila, es decir a partir del
punto de inflexin correspondiente al valor de pK del grupo amino.
En el caso de un aminocido dicarboxlico, como cido asprtico como por ejemplo:

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En este caso, para calcular el pI deben considerarse los valores de pK que rodean a la
especie de carga neta 0.

Por ltimo, para el caso de un aminocido dibsico, como arginina, se observa que:

Al igual que en caso anterior para calcular el pI deben considerarse los valores de pK
que rodean a la especie de carga neta 0, encontrndose el zwitterion a pH bsico.

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Una reaccin caracterstica de aminocidos es la conjugacin de su grupo amino con

ninhidrina. Esta reaccin es de gran utilidad porque genera un aducto coloreado que sirve
como revelador en cromatografa en placa delgada (CCD).
Reaccin general de un aminocido con ninhidrina

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Mecanismo de reaccin

Reaccin de ninhidrina con el aminocido prolina

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ENLACE PEPTDICO
Una unin peptdica es un enlace amida entre el grupo -amino de un aminocido y
el -carboxilo de otro. Como cualquier amida su estructura presenta ms de una forma
contribuyente con buen peso en su hbrido de resonancia:

Esta es una caracterstica central de pptidos y protenas, que determina no solo la

arquitectura proteica, sino tambin cuestiones importantes en relacin a su qumica. Una de
ellas es la interpretacin de su mecanismo de hidrlisis en medio cido, dnde el anlisis de
las estructuras contribuyentes al hbrido de resonancia justifica la posicin ms bsica del
enlace.

CH C
CH3

CH3

CH3

CH CH3

CH CH3

CH CH3

CH2

OH
H3N

CH3

H
N

CH C

OH

H3N

H
N

CH C

CH C

H3N

OH

CH C

H
N

CH C
O

CH3

CH3

CH2

OH

CH2

OH

lenta

CH3

CH33

CH CH3

CH
CH CH
CH33

CH
CH C
C

CH22
H22
N
N CH
CH C
C

CH
CH33 O
O

OH
OH
H
H33N
N

OH
OH

CH CH3
CH C
CH3

CH2
H3N

H3N

CH C
CH3 OH2

CH3

H3N

CH2

OH

H
H

OH

CH C
O

OH

H
N

CH C
O

OH

OH

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INSULINA
La insulina es una hormona polipeptdica formada por 51 aminocidos, producida y
secretada por las clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas. La insulina es una
hormona anablica por excelencia, ya que permite disponer a las clulas del aporte
necesario de glucosa para los procesos de sntesis con gasto de energa. Esta hormona
reduce el nivel de glucosa en la sangre y promueve el almacenamiento de glucosa como
glucgeno y grasa.
La insulina est constituida por dos secuencias de aminocidos. La cadena A tiene 21
aminocidos, y la cadena B tiene 30 aminocidos. Las cadenas estn unidas entre s a travs
tres puentes disulfuro. Las hormonas peptdicas por lo general son diferentes para cada
especie, aunque conservan similitudes importantes. La insulina humana es idntica a la
insulina de cerdo, excepto que el ltimo aminocido de la cadena B del cerdo es alanina (Ala)
en vez de treonina (Thr).

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ELECTROFORESIS DE PROTENAS
La electroforesis es una tcnica basada en los movimientos de molculas cargadas en
un campo elctrico, cada molcula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (ctodo y
nodo), este movimiento denominado electroforesis da nombre a la tcnica. En el
transporte electrofortico, a la fuerza del campo elctrico se opone la resistencia viscosa del
medio, producindose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las
partculas.
En resumen, puede asumirse que cuando una molcula cargada se coloca en un
campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo tanto de su densidad de
carga y de la intensidad del campo elctrico.
La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de
compuestos que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas y cidos
nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depender del pH del
medio en que se encuentren. Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo y si
tiene carga negativa migrar hacia el nodo. La fuerza inica de la solucin buffer tiene una
importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite
velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con menor desprendimiento de calor.
Como se describi previamente, las protenas pueden encontrarse cargadas positiva
o negativamente o permanecer elctricamente neutras, segn la proporcin de los diversos
grupos ionizados a un determinado pH. En su pI una protena tiene carga neta cero. Por
debajo de los valores de pI las protenas estarn cargadas positivamente y por encima,
negativamente.
Las protenas de suero humano se pueden separar mediante esta tcnica. Sus puntos
isoelctricos estn entre 4,9 (albmina) y 7,4 ( -globulinas). Al realizar la electroforesis con
un buffer de pH= 8,6, todas las protenas del suero tendrn carga negativa. La albmina, al
tener el punto isoelctrico ms alejado del pH, tiene ms carga negativa y avanza ms
rpido, quedando ms cerca del polo positivo que las -globulinas, que migran muy poco
por ser el pH del buffer de corrida prximo a su pI. Las restantes protenas sricas quedan
situadas entre estas dos.
En suero humano la composicin normal es:
Albmina

54 - 62%

-globulinas

9 - 15%

-globulinas

8 - 13%

-globulinas 14% - 19%

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El perfil de un electroforetograma de un suero humano adulto normal es similar al

representado en el siguiente esquema.

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Parte prctica

Parte 1: Propiedades anfotricas de los aminocidos. Curva de Titulacin de Glicina

Objetivo: Obtener la curva de titulacin en funcin del pH, de glicina, en ausencia y presencia
de formaldehido. Comparar las curvas obtenidas, calcular los pKa correspondientes y el punto
isoelctrico del aminocido.

Conocimientos necesarios para la realizacin e interpretacin del trabajo

Equilibrio cido-base. Nomenclatura y formulacin de Bronsted-Lowry y Lewis. pH.

Curva de titulacin de cidos dbiles.

Aminocidos como iones dipolares. Curvas de titulacin, en medio acuoso y con el

agregado de formol, etanol o acetona. pH observados. Formas inicas.

Punto isoelctrico de un aminocido. Clculo del mismo.

Realizar las siguientes curvas de titulacin:

1) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, titulado con NaOH 1 M.
2) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, con formol (glicina 0,05 M; formol 1 M) titulado con
NaOH 1 M.
Para realizar la curva 1 prepare la siguiente solucin:
Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)
HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)
Agua destilada......... 180,00 ml (exactos)

Para realizar la curva 2 prepare la siguiente solucin:

Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)
HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)
Formaldehdo.......... 01,00 ml (exacto)
Agua destilada......... 170,00 ml (exactos)

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Colocar en un erlenmeyer de 500 ml la mezcla inicial a titular, preparar la bureta con

la solucin titulante de NaOH 1M. (Asegure el buen funcionamiento de los robinetes.
El pHmetro deber estar calibrado con buffer pH 4,0 a temperatura ambiente).

Precauciones: La medicin de los volmenes de glicina, cido clorhdrico y formaldehdo deber

realizarse con exactitud, para ello se utilizar pipetas de doble aforo (usar una pipeta distinta en
cada caso).

Titulacin
Colocar en el vaso de precipitacin la solucin a titular, a temperatura ambiente, con
el agitador. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio hasta que el lquido cubra el
bulbo y el orificio de unin lquida del electrodo. Acercar la bureta de modo que el pico de la
misma est dentro del vaso de precipitacin.
Agitar por un momento; dejar reposar el lquido y medir el pH inicial de la solucin.
Dejar caer un volumen de la solucin de titulacin y agitar suavemente (los volumenes a
agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y proceder a la lectura del pH.
Continuar agregando la solucin de titulacin segn lo indicado en la tabla de valores,
agitando despus de cada agregado y dejando de agitar, para luego realizar la lectura de pH.
Proseguir la titulacin hasta pH extremo (alrededor de pH 10-12) con NaOH.
Tabla de valores
Glicina

Glicina + Formaldehdo

pH

pH

NaOH 1M (ml)
0
0.3
0.6
1
2
3
4
5
6
11

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7
8
9
10
10.3
10.6
11
11.3
11.6
12
13
14
15
16
17
18
19
20.0

Precauciones: Al llegar al pH extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la solucin

por ms de 2 3 minutos (especialmente en medio alcalino), dado que el vidrio con el que est
fabricado el electrodo es atacado y pierde sensibilidad. Inmediatamente, sacar el electrodo y
lavarlo con abundante agua bidestilada. Esta precaucin es esencial y se considerar falta grave
no tratar el electrodo con estos cuidados.
Al finalizar el trabajo prctico, lavar la microbureta con HCl al 10% y con agua destilada, para
evitar de esta forma que se pegue el robinete y quede inutilizado.

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Trazar una curva de titulacin con pH en las ordenadas y miliequivalentes de reactivo

agregado en las abscisas.
Comparar las curvas de glicina con formaldehdo y sin formaldehdo; para ello
grafique las dos curvas de glicina en una misma hoja de papel milimetrado. Indique
los respectivos pK y calcule el punto isoelctrico del aminocido glicina.

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Parte 2: Aminocidos y protenas

Objetivo: Realizar la hidrlisis qumica de un pptido natural y observar sus aminocidos
constituyentes, por anlisis cromatogrfico en CCD.

1.

Hidrlisis de Insulina

Tcnica:
Colocar 1 ml de insulina (80-100 U) en un tubo ampolla y con cuidado, adicionar 1ml
de HCl concentrado. Observe la coagulacin de la protena por adicin del cido. Cerrar el
extremo del tubo sobre la llama de mechero (esta paso ser llevado a cabo previamente por
el ayudante de laboratorio). Colocar el tubo en un bao de agua a ebullicin durante 45
minutos. La temperatura del bao no debe ser inferior a 100 C, en caso contrario, utilizar
un bao de glicerina.
Transcurrido el tiempo de calentamiento, cortar el extremo del tubo ampolla y volcar
su contenido con precaucin, en un vidrio de reloj. Llevar a seco sobre un manto de
evaporacin. Una vez seco, retomar el extracto con 2-3 gotas de cido actico diluido y
realizar los cromatogramas correspondientes.

2. Cromatografa en placa del hidrolizado de insulina

Condiciones de la cromatografa
Material:
Fase estacionaria: Slica gel.
Solvente de corrida: Butanol: cido actico: agua (60:20:20)
Revelador: Ninhidrina (solucin alcohlica 1.5 %)
Con el extracto obtenido, realizar la cromatografa empleando los patrones de
aminocidos disponibles disueltos en cido actico. Una vez desarrollada la cromatografa,
secar la placa, revelarla y colocarla en la estufa a 120 C durante unos minutos.

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Parte 3: Fraccionamiento de protenas sricas por electroforesis

Objetivo: Separar mediante la tcnica electrofortica las protenas presentes en el suero,
utilizando como soporte acetato de celulosa.

1. Obtencin de suero
A partir de 10 ml de sangre extrada sin anticoagulante, separar el suero por
centrifugacin a 3000 rpm durante 5-10 minutos (esta paso ser llevado a cabo previamente
por el ayudante de laboratorio).

2. Puesta a punto de soporte

Sumergir las tiras de 8,5 cm por 2,5 cm de acetato de celulosa en solucin buffer de
veronal-veronal sdico, pH 8,6 y fuerza inica 0,036, durante como mnimo 10 minutos o
hasta saturacin. Eliminar mediante suave presin entre papeles de filtro el exceso de
buffer.

3. Ubicacin del soporte en la cmara de electroforesis

Colocar las tiras (con pinzas) en el puente correspondiente. El contacto soportebuffer, se efecta mediante papel de filtro Whatman N1 del mismo ancho de la tira. Se
debe evitar el contacto directo de las tiras de soporte con la solucin buffer, para prevenir
distorsiones del frente.

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4. Sembrado de la muestra y desarrollo del electroforetograma

Sembrar (con capilar) el suero en una banda estrecha que no alcance los bordes de la
tira de acetato de celulosa y a 2 cm del extremo catdico. Desarrollar la corrida
electrofortica durante 60 minutos aplicando un potencial de 200 V, resultando un amperaje
de 1 a 1,5 Amp por tira.

5. Coloracin
Una vez finalizada la operacin anterior, retirar las tiras y sin secar, sumergir en la
solucin colorante (Negro de Amido 10 B (Amidoschwarz 10 B) al 0,5% en agua) durante 30 a
60 segundos.

6. Decoloracin
Se procede a remover el exceso de colorante usando una mezcla de metanol-cido
actico (95:5), renovando la solucin de lavado hasta que no extraiga ms colorante.

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Algunas consideraciones a tener en cuenta:

a. Conservacin de las tiras de acetato de celulosa:

El paquete abierto debe conservarse en posicin vertical hasta que se utilicen todas
las tiras. Si las 25 tiras se usan en el lapso de una semana, agregar agua dentro del paquete;
pero si se usan en un perodo superior a los 15 das, conservarlas en un recipiente
conteniendo metanol. No dejarlas secar al aire porque las tiras pierden las dimensiones y las
caractersticas del gel.

b. Reconocimiento de la superficie permeable por las protenas:

Slo una superficie es permeable por las protenas y se reconoce fcilmente porque
es ms opaca, despus de secarse entre dos hojas de papel de filtro.

c. Composicin del buffer pH 8.6

-

Veronal sdico 0.04 (recomendado)

Veronal sdico 5.15 + EDTA

Veronal sdico + Veronal cido

d. Solucin de negro amido

-

Metanol 450 ml

cido actico 100 ml

Negro amido 6,0 g

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-

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Agua destilada 450 ml

Precauciones: Utilizar guantes para manipular el suero. No abrir ni sacar las tiras de la cuba
electrofortica mientras el equipo se encuentre enchufado.

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