APUNTES DE BIOQUMICA

3
ENZIMAS & CINTICA ENZIMTICA

Julin A. Chamucero Millares1

os catalizadores son sustancias que se

caracterizan por:
1. Aumentar la velocidad de una
reaccin qumica
2. No se alteran en el proceso [no se
consumen]
3. No interfieren en el estado de
equilibrio de la reaccin. Es decir,
no cambiar la direccin de la
reaccin.
En los sistemas biolgicos, la mayora de las
sustancias catalizadoras son protenas que
reciben el nombre de enzimas. Las enzimas
y cualquier catalizador acta sobre otras
sustancias a las que llamamos sustratos.
En el siguiente ejemplo observamos la
reaccin de descomposicin del perxido de
hidrgeno:
H202

2H20 + 02

Esta
reaccin
est
favorecida
termodinmicamente, puesto que su G es
negativo y por lo tanto la direccin de la
reaccin se encuentra desplazada hacia la
izquierda; sin embargo, la descomposicin
de 1 mol de perxido de hidrgeno a
condiciones ambientales puede tardar
1

Mdico Interno. Internado nfasis en

investigacin. Laboratorio de Biomimticos
Instituto de Biotecnologa. Universidad Nacional
de Colombia. 2012

mucho ms de un ao. No obstante, la

adicin de una molcula de in frrico es
capaz de acelerar la velocidad de la reaccin
hasta 1000 veces; ms an, la hemoglobina
incrementa la tasa en un milln de veces.
El ejemplo anterior nos permite concluir
dos cosas:
1. Existen sustancias que aumentan la
velocidad de una reaccin, y
2. El hecho de que una reaccin sea
termodinmicamente favorable; es
decir, que su G sea negativo, no
significa en absoluto que la reaccin
ocurra a gran velocidad.

Cmo se estudian las velocidades de las

reacciones?

El estudio de las velocidades de las

reacciones es el campo de aplicacin de la
cintica qumica. sta rama de la qumica
utiliza modelos y ecuaciones matemticas
para evaluar la velocidad a la cual una serie
de sustancias reaccionan para formar unos
productos, veamos:
Consideremos una reaccin qumica simple,
A

donde la velocidad es igual a la

concentracin de B por unidad de tiempo:
es decir, a la velocidad de la formacin del
producto.

Donde la velocidad es igual a menos la

concentracin de A por unidad de tiempo;
es decir, la velocidad a la que se consume el
reactante.
Dado que estamos considerando una
reaccin irreversible, existe una proporcin
lineal en la que:

O sea que la velocidad a la que se forma el

producto es la misma a la que se consume el
reactante, por lo que podemos obtener una
constante K de velocidad:

Por lo que al intentar conocer los

determinantes de la velocidad de una
reaccin, lo que queremos averiguar en s,
son las variables que afectan la constante de
velocidad. Entre dichas variables tenemos la
temperatura y el pH de la solucin; sin
embargo, la ms importante es la BARRERA
ENERGTICA DEL ESTADO DE TRANSICIN. El
estado de transicin es una fase de la reaccin
qumica en la que los reactantes adoptan una
configuracin intermedia para transformarse
luego en productos. La importancia del
estado de transicin radica en que presenta
un valor de G muy grande el cual deben
superar los reactantes para continuar el
curso de la reaccin; esto quiere decir que
cuanto ms alto sea el G del estado de
transicin, ms lenta ser la reaccin. Para
que los reactantes alcancen ese nivel de
energa se requieren mnimo 3 cosas:
1. Una adecuada disposicin de las
molculas
2. Colisiones eficientes entre las
molculas
3. Precisa energtica de las colisiones

Consideremos ahora la misma reaccin,

pero sta vez con la particularidad de ser
reversible:
A

Por lo que ahora,

Estas demostraciones nos permiten tener un

conocimiento bsico de las velocidades de
una reaccin y de sus respectivas constantes
de velocidad, empero, qu determina la
velocidad de una reaccin qumica?
Primero que todo es importante conocer el
significado del valor de K:

Una k alta indica una reaccin rpida

Una k baja indica una reaccin lenta

Recordemos ahora que la energa libre del

estado de transicin se define por:
G = H - T. S
Entonces si H es alto y S es bajo, el G
ser mayor a cero, por ende la reaccin ser
lenta. Esto nos indica que una reaccin
tendr una constante de velocidad baja entre
mayor sea la energtica de las colisiones y

menor desorganizacin haya en el sistema;

es decir, donde el movimiento de las
molculas tienda a la no aleatorizacin y
disminuya entonces la adecuada disposicin
y las colisiones de las mismas.

Cmo trabajan las enzimas?

Las enzimas actan en dos puntos

crticos:
1. Disminuyen la barrera energtica de
la reaccin
2. Aumentan la fraccin de las
molculas reactantes
Como hemos indicado, la barrera energtica
se define por:

odelos del mecanismo de accin

de las enzimas

Reconocemos ahora que las enzimas

disminuyen el valor de G [energa libre de
Gibbs estndar del estado de transicin]
facilitando la formacin de un estado similar
al estado de transicin. Para que ello sea
posible, el sustrato se une a una regin
aminoacdica especfica denominada sitio
activo donde ocurre la formacin de dicho
estado. Para explicar la interaccin del
sustrato con el sitio activo de la enzima, se
han planteado 2 modelos o hiptesis:

G = H - T. S
Y lo que debe hacer una enzima es permitir
una reacomodacin de los valores de
entalpia y entropa para aumentar la
velocidad de la reaccin:

Para disminuir H, el sustrato

adopta dentro del sitio activo de la
enzima una configuracin molecular
diferente con menor energa.
Para aumentar S, la enzima ajusta
la direccin de los sustratos para
favorecer la colisin.

1. El primero de ellos fue postulado

hacia el ao 1894 por un bioqumico
alemn llamado Emili Fischer. El
pretenda explicar que el sustrato se
une a la enzima del mismo modo
que una llave encaja perfectamente
en una cerradura; sin embargo, este
modelo
slo
explica
la
especificidad de las enzimas pero
no responde a la pregunta de cmo
se consigue formar un estado
configuracional similar al del estado
de transicin.
2. Posteriormente Daniel Koshland
propona en 1958 un modelo
diferente al que llam del ajuste
inducido. Esta hiptesis plantea
que el sitio activo de la enzima induce
al sustrato y a la misma enzima a

adoptar una configuracin molecular

diferente. Teniendo en cuenta esta
modificacin del modelo previo, la
hiptesis del ajuste inducido explica
tanto la especificidad como las
caractersticas propias de la catlisis
enzimtica [disminucin de la
barrera energtica].

residuos
de
aminocidos
importantes:
a. La histidina que acta como
donadora de protones
b. El glutamato que funciona
como aceptor de protones
Durante la catlisis se forma un
compuesto intermediario de menor
energa llamado enediol, ya que, el
glutamato acepta un protn del
carbono 2 [C2] del gliceraldehido-3fosfato y el residuo de histidina dona
un protn al grupo carbonil del
mismo G3P.

Ahora, si bien es cierto que la estructura

completa de la enzima es importante, debido
a que la secuencia completa de aminocidos
es la que permite el diseo especfico de
cada tipo de enzima, es el sitio activo quien
juega el papel ms substancial en la funcin
cataltica de la enzima. Veamos 2 ejemplos
para reconocer por qu.
1. Triosa fosfato isomerasa. Esta
enzima como su nombre lo indica
isomerisa las triosas fosfato. Un
ejemplo es el cambio del
gliceraldehido-3-fosfato
a
dihidroxiacetona-fosfato. El sitio
activo de la enzima contiene 2

2. Serina proteasas. Las proteasas son

enzimas que catalizan la hidrlisis de
los enlaces peptdicos. Las serina
proteasas son proteasas en las cuales
el residuo de serina del sitio activo es
el que juega el papel fundamental en
la actividad cataltica. Dos ejemplos
de esta clase de enzimas son la
tripsina y la quimotripsina. El sitio
activo de las
enzimas est
formado
por
los
residuos
aspartato,
histidina y
serina; sta
ltima
se
ubica justo

al lado del bolsillo donde se posar

la cadena lateral del residuo de
aminocido en el cual la enzima
corta el enlace peptdico. Ya que
todas las serina proteasas tienen los
mismos residuos en el sitio activo,
stas se diferencias por la
caracterstica del bolsillo que fija la
cadena laretal del residuo especfico
para el que trabaja la enzima.

La constante de velocidad de la reaccin

entre la enzima y el sustrato est dada por la
suma entre la constante de disociacin del
complejo enzima sustrato en enzima y
sustrato (K-1) y la constante de disociacin
del complejo en enzima y producto (K2).
5

K1[E][S] = K-1[ES] + K2[ES]

Sacamos factor comn
K1[E][S] = {[ES] (K-1+K2)}
Despejamos la concentracin del complejo
enzima sustrato
(

Encontramos una constante de equilibrio

general para toda la reaccin
(1)
Reemplazamos en la ecuacin anterior
(

Despejamos y obtenemos la concentracion

del complejo enzima sustrato en la
constante de quilibrio en trminos de la
concentracin de la enzima y el sustrato
KM [ES] = [E] [S]

intica enzimtica
La cintica enzimtica estudia
las velocidades de las reacciones
catalizadas
por
enzimas.
Consideremos lo siguiente:

La reaccin entre la enzima y el sustrato

incluye la formacin de un complejo
enzima-sustrato
E+S

K1
K-1

ES

K2

E+P

(2)

Teniendo en cuenta que cuantificar la

concentracin del complejo enzima-sustrato
es en trminos prcticos algo imposible,
consideremos que la concentracin de la
enzima despus de la reaccin es igual a la
suma de la concentracin de la enzima total
menos la del complejo
[E]f = [E]T [ES]

(3)

Reemplazamos esta ecuacin en la igualdad

nmero 2
KM [ES] = {[E]T [ES]} . [S]

KM [ES] = [E]T[S] [ES][S]

Organizamos trminos para obtener una
formulacin que nos permita calcular la
concentracin del complejo con valores que
si podamos medir
KM [ES] + [ES][S] = [E]T[S]
[ES] (KM + [S]) = [E]T[S]
(4)

Ahora, partiendo que la reaccin inicia

desde el complejo enzima-sustrato ya
formado, la velocidad de la reaccin est
dada por:
v = K2 [ES]
Reemplazamos este trmino en la ecuacin
nmero 4
v = K2

(5)

Llegado el momento, hay un punto de

saturacin de la concentracin total de la
enzima por el sustrato, por lo que la
reaccin llega a su velocidad mxima:
vmax = K2 [E]T
Establecemos este trmino en la ecuacin
nmero 5
v=

(6)

Esta es la ecuacin final del anlisis de

cintica enzimtica y se denomina ecuacin
de Michaelis Menten y KM es la
constante de Michaelis.

Cul es la interpretacin de KM?

Si KM tiene un valor mayor a cero [>0] nos

indica que,
K-1>k1, por lo que hay una disociacin
rpida del sustrato.
De este modo, una primera aproximacin a
la constante de Michaelis es la de la
afinidad por el sustrato, por lo que, entre
ms grande sea el valor de KM menor ser la
afinidad. No obstante, la interpretacin real
es que la KM constituye un valor
numricamente igual a la concentracin del
sustrato ([S]) a la que la la velocidad de la
reaccin es la mitad de la velocidad mxima;
es decir, vmax/2.
Ejemplo: los valores de KM para la tripsina
y la quimotripsina son:

Tripsina: 1.5 x10-2 M

Quimotripsina: 3 x10-4 M

Esto quiere decir que se nececita una

solucin de sustrato en una concentracin
de 0,015 M para conseguir la mitad de la
velocidad mxima de la reaccin.
Supongamos que la vmax = 10 moles/s; o sea,
que en un segundo la enzima cataliza 10
moles de sustrato. Cuando el sustrato
alcanza una concentracin de 0,015 M, la
enzima cataliza la reaccin de 5 moles de
sustrato por segundo. Si comparamos los
valores de KM para ambas enzimas, la
tripsina requiere una concentracin menor
que la quimotripsina para conseguir la mitad
de la velocidad mxima de la reaccin.
Para los diferentes estudios experimentales
con enzimas, la tabulacin y diagramacin
de los datos, se facilita el uso de una
transformacin algebrica de la ecuacin de
michaelis-menten. Al obtener los recprocos
a ambos lados de la igualdad y organizando
los trminos, obtenemos una ecuacin que
obedece a la formulacin de lnea recta:

Revisemos la siguiente fraccin de la

constante:
y = (m) (x) + b

Esta igualdad se conoce como la ecuacin

de Lineweaver-Burk y permite hacer una
grfica en lnea recta denominada
representacin
doble-inversa
que
presenta:

Una pendiente

Una intercepcin de

sobre el

eje (o sea el eje y)

Una intercepcin de
de

sobre el eje

(o sea el eje x]

1. Inhibidor
competitivo:
se
caracteriza por ser una molcula
estructuralmente similar al sustrato
original, por lo que, dependiendo de
la concentracin de uno y el otro,
compiten por ocupar el sitio activo
de
la
enzima.
A
mayor
concentracin del inhibidor, menor
ser la concentracin de sustrato que
sea catalizado por la enzima. La
enzima dihidrofolato reductasa en
una enzima encargada de participar
en la sntesis de purinas y pirimidinas
a partir de las reacciones con el
dihidrofolato. Debido a que la
sntesis del DNA y el RNA
dependen de la formacin de
nucletidos en los que participan las
bases de purina y pirimidina, se
desarroll una molcula anloga al
dihidrofolato
conocida
como
metotrexate y que actualmente se
usa entre otras cosas para el
tratamiento quimioteraputico del
cncer, con lo cual se inhibe la
divisin celular por disminucin de
la sntesis de las bases constituyentes
de los nucletidos.

nhibicin enzimtica
Las enzimas son macromolculas cuya
funcin cataltica es susceptible de ser
inhibida, existen dos grandes grupos de
inhibidores:
1. Inhibidores reversibles
2. Inhibidores irreversibles
La diferencia entre ellos radica en el tipo de
enlace que forman con la enzima, el primero
de ellos utiliza enlaces o fuerzas de
interaccin dbiles, mientras que el segundo
lo hace a travpes de enlaces covalentes.
De acuerdo al sitio de unin del inhibidor,
los inhibidores reversibles se dividen en 3
tipos:

2. Inhibicin acompetitiva: en ella, el

inhibidor se une exclusivamente al
complejo enzima sustrato y por
obvias razones en una regin
diferente al sitio activo de la enzima.

aractersticas cinticas de los

inhibidores

Los
experimentos
que
determinan las velocidades de
reacciones
catalizadas
a
diferentes concentraciones de sustrato y del
inhibidor,
permiten
distinguir
las
caractersticas cinticas de los diferentes
tipos de inhibidores:

3. Inhibicin no competitiva: en ella

tanto el sustrato como el inhibidor
pueden fijarse a la enzima y acta
disminuyendo el nmero de
recambio de sustrato.

1. Inhibidor competitivo: ya que la

molcula anloga desplaza al
sustrato del sitio activo, la KM
aparente aumenta, ya que
hablando en trminos del sustrato se requiere mayor concentracin del
sustrato para alcanzar la mitad de la
velocidad mxima de la reaccin.
Ahora, hablando en trminos de la
reaccin en si, independientemente
de qu molcula ocupe el sitio activo
sea sustrato o inhibidor la
velocidad mxima de la reaccin se
conseguir cuando la concentracin
de alguna de las dos molculas
sature la concentracin de enzima
disponible, por lo que finalmente, la
vmax no cambia.

4. Inhibicin mixta: se caracteriza

porque el inhibidor puede unirse
tanto a la enzima como al complejo
enzima sustrato, prevenir la unin
del sustrato o disminuir el recambio.

2. Inhibicin
acompetitiva:
el
inhibidor acompetitivo slo se une al
complejo enzima sustrato ya
formado y bloquea la formacin del
producto. Ya que la enzima libre
tiene ahora mayor concentracin de
sustrato disponible, la velocidad

mxima de la reaccin es ms fcil

de alcanzar, por lo que el valor de
vmax disminuye. Si el valor de vmax
disminuye, significa que se requiere
una concentracin menor de
sustrato para alcanzar la mitad de la
velocidad mxima, por ende la KM
aparente tambin disminuye.

4. Inhibicin mixta:dado que acta

tanto en la enzima como en el
complejo enzima sustrato, aumenta
la KM y disminuye el valor de vmax

En relacin a los inhibidores irreversibles,

en general son sustancias txicas que se
unen de manera covalente al sitio activo de
la enzima y bloquear su actividad cataltica.
Los podemos dividir en:
3. Inhibicin no competitiva: como
mencionamos, el inhibidor no
competitivo se une a una regin
diferente al sitio activo de la enzima
por lo que no interfiere con la unin
del sustrato y por ende la
concentracin para alcanzar la mitad
de la velocidad mxima sigue siendo
la misma y la KM no se ve alterada;
sin embargo, como el inhibidor si
retrasa el efecto cataltico, y la
enzima demora en disociarse, hay
menos enzimas libres para una
concentracin mayor de sustrato por
lo que la velocidad mxima se
alcanza ms rpido y el valor de vmax
disminuye.

1. Reactivos de grupo especfico:

son molculas que reaccionan con
cadenas laterales especficas de
algunos residuos de aminocidos en
el sitio activo.
2. Sustratos anlogos reactivos: son
molculas estructuralmente similares
a los sustratos nativos pero que se
unen de manera covalente al sitio
activo de la enzima.
3. Inhibidores suicida: son moleculas
similares al sustrato que se
caracterizan por permitir una
reaccin cataltica; sin embargo, los
productos
resultan
ser
intermediarios txicos que se unen
de manera covalente a la enzima y la
inactivan.

ecanismos
enzimtica

de

regulacin

Como
cualquier
otro
mecanismo dentro de los
seres vivos, la catlisis de las
reacciones bioqumicas deben ocurrir en el
lugar y el tiempo adecuados, por lo que se
hace necesaria una regulacin de la actividad
enzimtica. Se han descrito 5 mecanismos
reguladores:
1. Control alostrico: ocurre en
aquellas enzimas de naturaleza
proteca que contienen mltiples
subunidades que actan como sitio
funcional y sitio de control.
Presentan adems una propiedad
llamada cooperatividad de unin y
que quiere decir que la unin de una
molcula a un sitio control o
funcional afecta la actividad de los
dems sitios o subunidades. Si ese
control cooperativo se da por la
unin al sustrato, el mecanismo se
denomina homoalosterismo; mientras
que, si la cooperatividad es por otras
molculas diferentes al sustrato, la
regulacin es del tipo heteroalosterismo.
Este tipo de enzimas no obedecen la
cintica de Michaelis-Menten puesto
que su comportamiento no se refiere
a la unin de una sola molcula de
sustrato al sitio activo sino de varias
molculas a los sitios funcionales.
Un ejemplo clsico de enzima
alostrica
es
la
aspartato
carbamoiltransferasa
[ATCasa],
una protenas con estructura
cuaternaria que incluye 6 unidades
catalticas unidad por 6 unidades
reguladoras. La ATCasa cataliza la
primera reaccin de la biosntesis de
las pirimidinas que incluye la
condensacin del carbamoil fosfato
y el aspartato para formar
carbamoilaspartato. De la secuencia
de la reaccin de sntesis se obtiene
un nucletido de pirimida llamado
citidin trifosfato [CTP] el cual
cuando comienza a acumularse se
une a uno de los sitios regulares de

la enzima e inhibe su actividad

indicando que ya se sintetiz la
suficiente canditad de nucleotidos
necesarios.
2. Diferentes formas de la enzima:
hace referencia a las isozimas o
isoenzimas,
enzimas
estructuralmente diferentes pero que
catalizan la misma reaccin; sin
embargo, varan sus parmetros
cinticos y sus mecanismos de
regulacin. Dos ejemplos de esta
clase de enzimas son la lactado
deshidrogenasa, una enzima que
participa en la gluclisis anaerobia y
que presenta 2 isoenzimas, una en el
msculo cardiaco y otra en el
msculo esqueltico y mostrndo
diferente afinidad por la glucosa
entre ambos tejidos. El segundo
ejemplo
lo
constituye
la
glucoquinasa, una isoenzima de la
hexoquinasa presente en el tejido
heptico pero con menor afinidad
por la glucosa para un adecuado
control de los niveles de liberacin
de insulina y glucagn.
3. Modificaciones
covalentes
reversibles: es un elemento
regulador
abundante
en
los
mecanismos
de
sealizacin
intracelular e involucra la unin
covalente reversible de grupos
fosfato para la activacin o
inactivacin de las enzimas. Una de
las enzimas encargadas de la
fosforilacin [activacin] de otras
enzimas es la protein cinasa K que
cataliza la reaccin de transferencia
de un grupo fosfato desde el ATP
hacia un residuo de aminocido de
otra enzima.
4. Activacin
proteoltica:
son
enzimas que son sintetizadas en un
estado inactivo o zimgenos y que
requieren de un clivaje proteoltico
para su activacin. El tripsingeno
[el zimgeno de la tripsina] es
sintetizado en el pncreas y
secretado al duodeno donde es

10

activado por la enteroquinasa

intestinal.
5. Sntesis de la enzima: es el control
absoluto y est mediado por la
expresin gnica y la sntesis de
mRNA.
11

Bibliografa

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