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Placa donora
Figura 1 Placa de Pampa compuesta por placas aceptora y donora, separada por membrana
artificial de fosfolpido.
Trabajo Practico
En el ensayo se utilizarn TIOPENTAL SDICO y Azul de Evans como molculas de estudio de
permeabilidad:
Materiales
Pipeta aforada de 2 mL
Pipeta automtica 1000 L
Pipeta automtica 200 L
Tubos Eppendorf 2 mL
Tubos de ensayo 10 mL
Cubetas de cuarzo (1 cm paso ptico)
Placas para PAMPA
Disolucin de PBS (Buffer Fosfato, pH 7.4) 1L.
Disoluciones de Tiopental
PAMPA: 200 g/ml (2ml)
Stock: 80 g/mL (8ml)
Disolucin de Azul de Evans
PAMPA: 200 g/ml (2ml)
Stock: 80 g/mL (8ml)
Curvas de Calibracin
TIOPENTAL
(g/ml)
Blanco
40
20
10
5
2,5
Azul de
Evans
(g/ml)
Blanco
40
20
10
5
2,5
S.
Stock
40
g/ml
20
g/ml
10
g/ml
5
g/ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
S.
Stock
40
g/ml
20
g/ml
10
g/ml
5
g/ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
PBS
V final
4 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
MES
V final
4 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
Abs
288
nm
-
Abs
570
nm
-
Ensayo PAMPA
De la disolucin del fosfatidilcolina en dodecano (20 mg/ml) tomar 4 L y ponerlos sobre la
membrana de PVDF, esperar aproximadamente 5 minutos para evaporacin del dodecano.
Poner 300 L de PBS en la placa aceptora (TIOPENTAL o Azul de Evans respectivamente).
De los tubos eppendorf rotulados como PAMPA tomar 300 L y ponerlos en la placa dadora,
se ensamblan las placas y se deja en agitacin a 250 rpm durante 2 horas.
Para determinar la concentracin a T0: se ponen 200 L de la disolucin PAMPA de cada
frmaco en un eppendorf de 2 ml (FD = 8) y se agregan 1.4 ml de PBS (segn sea el caso),
luego se lee al UV.
Para determinar la concentracin a T2h: Una vez transcurridas las 2 horas de ensayo, se toman
200 L de cada pocillo (dador y aceptor) y se agregan 1.4 ml de PBS (segn sea el caso) (FD =
8), luego leer al UV.
Con los valores de concentracin obtenidos mediante la interpolacin de las absorbancias
obtenidas en la curva de calibracin se procede a calcular el % de los frmacos en cada
compartimento.
Donde:
t = Tiempo de medicin en horas.
CA = Concentracin del compuesto en la placa aceptora a tiempo t.
CD = Concentracin del compuesto en la placa donora a tiempo cero.
Abs. t0
Abs. tt
TIOPENTAL
Azul de Evans
Conc. a t0
Conc. a tt
% de
Permeabilidad
PE **
(cm/s)