Conservao de

PESQUISA

Maria Lucia Carneiro Vieira

Dra. Profa. Associada do

Departamento de Gentica
Escola Superior de Agricultura
Luiz de Queiroz / Universidade de So Paulo
mlcvieir@carpa.ciagri.usp.br

Germoplasma in vitro

Fotos cedidas pelo autor

Tecnologias in vitro aplicadas conservao de recursos genticos vegetais

ermoplasma representa o
conjunto de materiais
hereditrios de uma espcie. Segundo Towill
(2000), este conceito pode
ser restrito ao conjunto de gentipos
disponveis para melhoramento de
uma espcie cultivada. A diversidade
contida em um germoplasma deve
ser protegida de eventuais perdas
para garantir a sua utilizao, e tem
sido coletada nos centros de origem
das culturas, isto , nos locais onde se
deram incio os cultivos daquela espcie, ou nas regies onde se desenvolveram raas locais, para as quais
houve migrao da cultura.
A conservao de recursos genticos implica na manuteno de colees in situ, ou seja, nos seus locais
de ocorrncia, ou ex situ. Nesse caso,
podem ser mantidos indivduos, sementes, embries ou outras estruturas vegetais, sob diferentes condies, dependendo do material utilizado: no campo ou em casas de
vegetao, em cmaras secas sob
baixa temperatura, em meio de cultura com baixa concentrao salina
(conservao in vitro) ou criopreservadas.
As colees de germoplasma tm
sido mantidas em instituies diversas que tm por responsabilidade (I)
garantir a sua diversidade gentica
(seja pela iniciativa de coletar periodicamente recursos genticos, seja
por favorecer o intercmbio com
outros bancos de germoplasma), (II)
multiplic-las, (III) distribu-las aos
usurios e (IV) promover a sua caracterizao por diferentes metodologias. Essas colees so ditas ativas.
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Uma segunda forma de conservao

aquela que prope manter as
colees por perodos longos, sem
que se utilize delas para estudo,
cesso, intercmbio, etc. O modo
mais usual para se manter uma coleo por prazos mais longos por
criopreservao, isto , sob temperatura ultra-reduzida. Neste caso, so
denominadas de Colees de Base.
A maioria das sementes tolerantes
desidratao (ou dessecao) sobrevive a tratamentos criognicos,
isto , a temperaturas abaixo de 130C.
Nesse estado, muitas das reaes
celulares que levam deteriorao
so minimizadas e se obtm longevidade extremamente alta, isto , por
dezenas de anos. Na prtica, devido
ao seu custo relativamente baixo,
utiliza-se nitrognio lquido (LN, 196C) ou o seu vapor (-150 a -180C)
para a conservao dessas sementes.
Sementes sensveis dessecao,
ditas recalcitrantes, so comuns em
espcies aquticas, plantas de sementes grandes, certas espcies tropicais e algumas arbreas nativas de
reas temperadas. O coco, o cacau, a
manga e a seringueira so alguns
exemplos de plantas com sementes
recalcitrantes. Sob baixa temperatura
e relativa umidade, sua viabilidade
pode se manter por poucas semanas
ou at por alguns meses, o que
representa muito pouco em termos
de conservao. Usualmente, essas
espcies so conservadas ex situ, isto
, a campo, o que extremamente
caro e laborioso. Da mesma maneira,
populaes com elevada heterozigosidade (I), colees de plantas com
perodos juvenis muito longos (II),

ou cujas sementes so produzidas em

pouca quantidade (III), com viabilidade reduzida (IV) ou quando esta se
mantm por pouco tempo (V), so
mantidas vegetativamente, a campo
ou em casa de vegetao.
As tecnologias, ditas in vitro, representam estratgias importantes
para a conservao de plantas com
sementes recalcitrantes, de viabilidade baixa ou em nmero reduzido:
culturas de embries zigticos e eixos embrionrios isolados, derivados
de sementes maduras, normalmente
sobrevivem dessecao parcial e ao
congelamento, da mesma forma que
pices caulinares e gemas podem ser
criopreservadas. Em certos casos,
especialmente em espcies cujos ciclos de florescimento ocorrem muito
distanciadamente ou em perodos
efmeros, usa-se criopreservar os
gros de plen, os quais podem ser,
posteriormente, utilizados em cruzamentos controlados.
Os sistemas in vitro no eliminam
a importncia de se manter clones in
vivo. So colees que se complementam e ambas podem se constituir
em bancos ativos. Entretanto, dispendioso manter essas colees, principalmente em locais distintos.
A criopreservao uma tcnica
que permite manter o germoplasma
por vrios anos (long term storage)
sob temperatura ultra-reduzida, em
geral, -196C. Nessa temperatura, a
movimentao de molculas super
reduzida e no h fase lquida na
clula. Os riscos de perda do material
biolgico so menores e os custos
mais baixos em relao aos da conservao in vitro. Podem ser criopre-

servados pices e gemas, embries

somticos e zigticos, clulas em suspenso e at protoplastos, ou seja,
clulas desprovidas da parede celular.
A priori, preciso otimizar protocolos
visando garantir a regenerao de plantas inteiras a partir das estruturas criopreservadas.
Todos os procedimentos de criopreservao tm uma etapa em comum, que a de preparar a estrutura
vegetal a ser conservada para a imerso em LN. uma etapa de desidratao para evitar a formao de cristais
de gelo no interior da clula, o que
fatal. A desidratao pode ser induzida
por cristalizao do meio externo durante uma fase lenta de resfriamento
at atingir - 30 a - 40 C. Transferindose rapidamente o material vegetal para
o LN, obtm-se a vitrificao da clula,
isto , os componentes celulares solidificam, formando um vidro, sem haver formao de gelo.
Outra alternativa, submeter o
material a agentes crioprotetores,
base de DMSO, glicerol, sacarose, etileno glicol etc. Primeiramente, se utilizam solues com baixas concentraes para que haja entrada dos componentes permeveis na clula e, em
seguida, solues concentradas de crioprotetores para promover a vitrificao, para ento, transferir os frascos
para o nitrognio lquido.
Em algumas situaes, a imerso
em LN pode ser direta, desde que os
pices caulinares sejam pr-tratados
em soluo osmtica de concentrao
moderada, uma vez que a desidratao necessria antes de haver a
vitrificao.
possvel tambm criopreservar
pices, embries somticos encapsulados em alginato de sdio (3 a 5 mm).
Essa tcnica conhecida por encapsulao. As cpsulas so mantidas em
meio de cultura contendo 0,5 a 0,7 M
de sacarose sob agitao, overnight
(etapa de desidratao), sendo, ento,
lavadas e colocadas em ampolas que
sero mantidas em LN. Trata-se de uma
variao da vitrificao utilizando-se
encapsulao em alginato, cultivo em
sacarose, desidratao sob fluxo de ar,
seguindo-se o congelamento rpido.
H registros de colees de batata,
uva, cravo e pera, usando-se brotos
encapsulados (Towill, 2000).

Figura 1. Clones da Coleo de espcies exticas de Passiflora,

mantida in vitro no Departamento de Gentica da ESALQ/USP:
P. edulis f. flavicarpa (A), P. amethystina (B) e P. cincinnata (C).

Um parmetro importante deve

ser definido para cada procedimento:
o storage time. o tempo que um
material pode ser conservado de tal
forma que, quando avaliado, mostre
pelo menos 60 % de sobrevivncia
(Van den Houve et al., 1995). S
podem ser recomendados protocolos nos quais a sobrevivncia tiver
sido avaliada e registrada.
Na tabela 1, so apresentadas as
etapas para se criopreservar e recuperar pices caulinares, as quais podem ser utilizadas em sala de aula, a
ttulo de exerccio. Toda a manipulao deve ser feita em cmara de fluxo
laminar usando solues, vidrarias e
instrumentos previamente esterilizados, com exceo da etapa de congelamento, que pode ser feita na bancada do laboratrio. A soluo PVS2
(Sakai et al., 1991) contm glicerol,
DMSO e etileno glicol e deve ser
preparada em meio aquoso contendo sais e vitaminas de MS (Murashige
& Skoog, 1962) e 0,4 M de sacarose.
Essa soluo deve ser filtro-esterilizada. A soluo contendo 2 M de glicerol + 0,4 M de sacarose (Matsumoto et
al., 1994) deve ser diluda em meio
MS e autoclavada. O meio de diluio
(ou de cultivo), usado para remover
a soluo de vitrificao, contm sais
e vitaminas de MS + 1,2 M de sacarose
+ 100 mgL-1 de mio-inositol (pH 5,7).
As repeties (tubos) devem conter 4
pices.
Manuteno das colees
em meio de cultura
Outra alternativa de conservao

in vitro de germoplasmas aquela

em que as colees so introduzidas
em laboratrio, a partir de diferentes
estruturas da planta (explantes) e
mantidas sob condies asspticas.
Essas colees podem ser estabelecidas a partir da germinao de sementes in vitro ou por cultura de pices
caulinares ou gemas, sob temperatura de 25 a 28C. Esse procedimento
pouco prtico e laborioso pois exige
subculturas mensais, s se prestando,
portanto, para pequenas colees.
Normalmente o que se faz baixar a
temperatura da sala para 15 at 20C,
de tal maneira a obter crescimento
mnimo in vitro e reduzir as trocas de
meio de cultura para uma ao ano.
Dessa forma, por exemplo, so conservados cerca de 1.600 acessos de
mandioca na Embrapa Mandioca e
Fruticultura, em Cruz das Almas, na
Bahia. Por outro lado, esse mtodo
tem a vantagem de garantir maior
segurana aos procedimentos de intercmbio de germoplasma, uma vez
que o material vegetal introduzido,
mantido e transportado sob condies asspticas, isto , dentro do
frasco de cultura.
Em certos casos, a manuteno da
coleo em meio de cultura requer a
adio de fitorreguladores que podem, eventualmente, provocar alteraes genticas. A prpria condio
in vitro pode ser estressante para a
planta, levando-a a instabilidade gentica. Faz-se necessrio, portanto, avaliar esses efeitos, periodicamente, utilizando metodologias moleculares (marcadores de DNA ou
proticos) e citogenticas.
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Colees de germoplasma tropical

tm sido conservadas in vitro ou criopreservadas na Embrapa - Cenargen, em
Braslia, Brasil; no CIRAD, em Montpellier, Frana; no INIBAP, em Leuven, Blgica, e em vrias outras instituies no
Japo, na Itlia, etc. O Departamento de
Gentica da ESALQ/USP dispe de uma
pequena coleo in vitro de Passiflora
(Figura 1), na qual h cerca de 20
espcies silvestres, acessos comerciais
de maracuj azedo e hbridos somticos,
obtidos por fuso de protoplastos (Vieira & Dornelas, 1996).
Cabe novamente enfatizar que as
alternativas de conservao in vitro so
extremamente teis na conservao de
espcies com sementes recalcitrantes ou
grandes, de plantas de propagao vegetativa ou de certas arbreas, na eliminao de patgenos e para facilitar o
transporte de germoplasmas. Consultando o site da FAO, via internet, podem-se encontrar muitas informaes
interessantes sobre bancos de germoplasma, espcies e acessos disponveis e
tcnicas de conservao. Para informaes sobre aspectos genticos relativos
conservao de germoplasma, recomenda-se a leitura de Morales et al. (1997).
Literatura citada
Matsumoto, T.; Sakai, A.; Nako, Y.
1994. Cryopreservation of in-vitro grown apical meristems of wasabi (Wasabia
japonica) by vitrification and subsequent
high plant regeneration. Plant Cell Rep.
13: 442-446.
Murashige, T & F. Skoog, 1962. A
revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum 15: 473-497
Sakai, A.; Kobayashi, S.; Oiyama, I.
1991. Survival by vitrification of nucellar
cells of Navel Orange (Citrus sinensis
var. brasiliensis Tanaka) cooled to 196
C. J. Plant Physiol. 137: 465-470.
Towill, L. E. 2000. Germplasm preservation. In: R. N. Trigiano & D. J. Gray
(Ed.) Plant tissue culture concepts and
laboratory exercises. 2nd. Edition. CRC
Press, Boca Raton, pp. 337-353.
Vieira, M. L. C.; Dornelas. M. C. 1996.
Regeneration of plants from protoplasts
of Passiflora species (Passion Fruit). In:
Y.P.S. Bajaj (Ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, 38, Plant Protoplasts and Genetic Engineering VII, pp.
108-119. Springer Verlag, Berlin.
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Tabela 1. Etapas da criopreservao e recuperao de pices caulinares

(Towill, 2000)
PASSO

INSTRUES

1 Separe pices caulinares com o auxlio de uma lmina de

bisturi ou agulha hipodrmica; o pice deve apresentar 1mm e
cerca de 4 primrdios foliares); trabalhe rapidamente para
evitar dessecao; escolha plantas saudveis para a exciso
dos pices; como controle, cultive individualmente pices in
vitro (passo 9).
2 Incube os brotos em uma placa de petri em meio de cultura
contendo 0,3 M de sacarose durante 1 a 2 dias, temperatura
ambiente.
3 Remova o lquido com uma pipeta Pasteur e adicione 2 M de
glicerol + 0,4 M de sacarose, incube por 1 hora, temperatura
ambiente; remova parte dos brotos, lave (passo 8) e cultive-os
(passo 9) para verificar se o glicerol + sacarose causam injria.
4 Remova o glicerol + sacarose do restante dos brotos e
adicione 0,5 mL de soluo de vitrificao (PVS2), previamente
resfriada; incube no gelo por 30 min.
5 Cinco min antes do trmino da incubao, transfira 5 brotos
para os criotubos de plstico, recobrindo-os com 0,25 mL de
PVS2.
6 Aps 30 min, use 4 repeties para expor ao nitrognio
lquido e 4 para transferir diretamente ao passo 9.
7 Cubra os tubos e aquea-os em banho-maria a 40C e a 22C,
deixando-os por 1 min. em cada tratamento.
8 Remova a gua do exterior do tubo com etanol 70%;
imediatamente retire os brotos do tubo com pina ou pipeta
Pasteur; incube os explantes por 30 min. no meio de diluio.
9 Remova os brotos do meio de diluio e coloque-os em meio
de slido em pequenas placas de petri; remova todo o
excesso de lquido ao redor do explante; sele a placa com
parafilme.
10 Incube a placa no escuro por uma semana e depois para as
condies de luz indicadas quela espcie; subcultive os
pices a cada 28 dias.