CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE MINAS GERAIS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS

CURSO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS

ERIKA ALCNTARA
LUCAS MEDEIROS
MATHEUS MARTINS

COLGENO ADSORVIDO EM SUPERFCIE DE TITNIO

BELO HORIZONTE
2015

Introduo

As propriedades do titnio para aplicaes em biomateriais so bastante

conhecidas e estudadas. O uso do titnio em aplicaes ortopdicas e dentais deve-se as
propriedades de boa interface entre osso e material, alm da j conhecida
osteointegrao promovida pelo mesmo. No entanto, o uso de tcnicas de modificao
de superfcie no titnio uma rea que ainda demanda estudos e um campo que tem
ainda muito que ser explorado. Com a modificao da superfcie do titnio torna-se
possvel uma acelerao do processo de regenerao ssea, podendo diminuir a
morbidez do paciente e prejuzos financeiros (MORRA, 2003)
Atualmente tm-se trs tipos de modificaes nas superfcies de biomateriais de
titnio, sendo eles: fsico-mecnico, bioqumico e morfolgico, sendo o ltimo o mais
amplamente utilizado. O mtodo bioqumico tem se mostrando uma alternativa
interessante, baseado na liberao de protenas ou enzimas que induziriam uma resposta
das clulas e tecidos. Dentro desse contexto o colgeno se mostra como uma molcula
de extrema importncia, uma vez que est associada a uma mais rpida regenerao
ssea (MORRA, 2003)
Biomateriais de Titnio com colgeno na superfcie foram estudados e
comprovou-se que os mesmos propiciam uma maior distribuio de osteoblastos e mais
rpida adeso de clulas do que o material sem revestimento (MORRA, 2003)

Metodologia

2.1 Produtos Qumicos

Folhas de titnio (0,125 mm de espessura, 99,7%), cido acrlico, propileno, N(3
dimetilaminopropil)
N-etilcarbodiimida
hidrocloridrato
(EDC),
Nhidroxissuccinimida (NHS) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich. Para as
experincias de ATR-IR, foram usadas pelculas muito finas de Ti (99,98%, 0,025 mm
de espessura, Sigma Aldrich), para melhorar o contato com o cristal ATR devido
flexibilidade da amostra.
O colgeno (KNC Semed S p de colgeno) foi fornecido a partir de Kensey
Nash (Lot. No. 24903). Este basicamente colgeno do tipo I bovino.
2.2 A modificao da superfcie
2.2.1 Deposio de plasma
A deposio de plasma foi realizada num reator de placas paralelas acopladas
capacitivamente colocadas dentro de uma sala limpa de uma classe 10.000. As amostras
foram localizadas no eletrodo aterrado watercooled. Tanto o reator e os eletrodos so
feitos de ao inoxidvel. O volume do reator de cerca de 3 dm3 e a distncia entre os

eletrodos de 5 cm. Foram utilizados os seguintes tratamentos: 1 min plasma de ar, 50

W, taxa de fluxo de 20 sccm (passo de limpeza), seguido de deposio de plasma
propileno por 5 min, 50 W, taxa de fluxo de 100 sccm (taxa de fluxo controlada por
um controlador de fluxo de massa MKS) (etapa de deposio).
Algumas amostras foram utilizadas para a avaliao da espessura da camada
enxertada de cido acrlico. Para esse efeito, aps a deposio de plasma, uma mscara
feita por uma folha de ao inoxidvel com furos redondos de 40 mm de dimetro foi
suavemente pressionada sobre a amostra de titnio. A amostra mascarada foi colocada
no reator de plasma e um tratamento de condicionamento foi realizado para remover a
camada de depsito de plasma a partir das reas expostas (plasma de ar, 10 min 100 W).
2.2.2 Enxerto de cido acrlico
Aps a deposio, as amostras tratadas foram submetidas enxertia de cido
acrlico. Em particular, o enxerto foi executado a partir de uma soluo a 40% de cido
acrlico aquoso. A soluo foi misturada suavemente utilizando uma barra de agitao
durante 2 min. Neste ponto, de argnio(Ar) foi suavemente borbulhado na soluo
durante 10 min, e depois 3% de uma soluo cida de nitrato de crio amnio foi
adicionado, sem interromper o Ar. A soluo foi misturada enquanto se borbulhava
durante mais 2 minutos, e em seguida foi cuidadosamente vertida em tubos de ensaio,
contendo as amostras de plasma depositado. A enxertia foi realizada durante 45 min,
temperatura ambiente. No final a reao de enxerto, as amostras foram enxaguadas em
gua durante a noite. Plasma depositado, amostras de cido acrlico enxertado sero
codificadas por AATi.
2.2.3 Acoplamento de Colgeno
As amostras AATi foram ainda submetidos a acoplamento de colgeno. O
acoplamento foi realizado como se segue: amostras AATI foram imersas num colgeno
a 0,5%, soluo aquosa de cido actico a 1%. Depois de 2 h, as amostras foram
removidas da soluo e lavadas vrias vezes em 1% de cido actico aquoso, para
remover o excesso de colgeno adsorvido. Aps lavagem, as amostras foram imersas
em gua contendo 0,25% de EDC e 0,25% NHS, ambos da Sigma, e mantidas durante a
noite em soluo deste acoplamento. Aps o acoplamento, todas as amostras foram
cuidadosamente lavadas com 1% de cido actico aquoso e gua, depois secadas sob um
exaustor. As amostras de colgeno acopladas sero codificada por ColTi.
2.2.4 Caracterizao superfcial
Anlise XPS foi realizada com um sistema de Perkin Elmer PHI ESCA 5500. O
instrumento est equipado com uma fonte de raios-X monocromticos (nodo Al Ka)
operando a 14 kV e 250 W. O dimetro do ponto analisado de aproximadamente 400
m, a presso de base 10-8 Pa. O ngulo entre o analisador de eltrons e a superfcie da
amostra foi de 45. Quantificaes dos elementos foram realizadas utilizando o software
e de fatores de sensibilidade fornecidos pelo fabricante.

2.2.5 ATR-IR
Espectros ATR-IR foram obtidas utilizando um Mattson Research Series
Spectrometer. Os espectros foram obtidos usando uma resoluo 4 cm-1 e um 45
Cristal Ge. Usando este arranjo, a profundidade de amostragem analtica na regio do
espectro da carbonila de cerca de 300 nm. As amostras foram prensadas contra o
cristal usando MiniGrip (Thermo Spectra-Tech). Os dados apresentados so calculados
a partir de 256 espectros.
2.2.6 Anlise AFM
A anlise AFM foi realizada utilizando um AFM Nanoscope III pela Digital. As
medies foram realizadas tanto em ar e em solues aquosas. Uma ponta de nitreto de
silcio convencional foi utilizada nestas experincias. A da ponta da mola constante,
conforme avaliado pelo produtor, de 0,06 N / m. As imagens foram obtidas no modo
de contato. O modo de tipo Altura de foi usado, que so dados correspondentes
variao na altura piezo necessria para manter o arco de deflexo constante. A fim de
reduzir os danos da superfcie das amostras pelo arco da ponta, a fora foi
constantemente monitorizada e minimizada usando o software de controle de
instrumento. As imagens foram constantemente monitoradas para detectar efeitos
devido ao arco da ponta ''arar'' a superfcie da amostra. Em nenhum dos casos foram
observados tais efeitos.
Dados de rugosidade foram calculados a partir das imagens usando o software
do aparelho. T-testes Student foram realizadas para determinar as eventuais diferenas
entre os dados, conforme relatado na seo relevante.
Curvas fora-distncia em soluo aquosa foram obtidas utilizando o fluido
celular fornecido pela Digital. Na medio da fora a amostra movido continuamente
para cima e para baixo. Deformao da posio do arco e altura da amostra so
gravadas. A fora obtida multiplicando a deflexo do cantilever vezes o seu constante
da mola. Neste caso, a constante pela multiplicao dos tempos da deflexo do arco sua
constante da mola. Neste caso, a constante de mola no foi medida e foi utilizado o
valor sugerido pelo produtor, mas isto no afeta o significado dos dados.
As medidas foram repetidas usando o mesmo arco para todo o conjunto de
amostras, e repetido para confirmar que os valores obtidos no foram afetados pelo
desgaste ou outros efeitos inesperados sobre a ponta. As diferenas entre os dados
obtidos com a mesma amostra em diferentes momentos no foram significativas, e a
mesma tendncia geral entre diferentes amostras foi detectado.
Para obter curvas de fora versus distncia, a deflexo do arco deve ser subtrada
posio do scanner piezo. O ponto de distncia zero foi determinado a partir da parte
linear da linha de contato. Curvas de fora versus posio de varredura foram
registradas continuamente com uma frequncia tpica de cerca de 1 Hz, o comprimento

de varredura foi de 200 nm. Foram registradas um mnimo de 20 curvas em cinco

regies diferentes da cada amostra.
2.3 Testes biolgicos
2.3.1 Materiais
As amostras utilizadas para estudos in vitro e implantes intramusculares so
mostrados na Fig. 1. Eles foram obtidas a partir de 2 milmetros de espessura de placas
Ti (99,7%, Aldrich). O tamanho das amostras de 10 x 3 x 2 mm. A fotografia foi
tirada aps colorao com azul de toluidina das amostras. O controle de Ti (Ti
codificados nos seguintes), esquerda, no levou o corante, enquanto o revestido de
colgeno Ti (ColTi na seguinte) sim, e parece mais escura na fotografia. Antes de azul
de toluidina, as amostras so indistinguveis. Amostras foram homogeneamente
revestido de todos os lados.
Parafusos para estudos de implantes sseo foram obtidos a partir cpTi, grau 2.
Eles so mostrados na Fig. 2, tambm neste caso aps colorao com azul de toluidina,
para mostrar a homogeneidade do revestimento (ColTi est direita). O dimetro dos
parafusos s de 2 mm. Nenhum pr-tratamentos que visam a modificao da topografia
da superfcie dos parafusos foi realizada. Ou seja, a partir de um ponto de vista
morfolgico, as superfcies investigados pertencem classe maquinado.

Fig. 1 - Fotografia das amostras utilizadas para estudo dos implantes musculares e celular. As
amostras so coradas com azul de Toluidina para mostrar o homogeneidade do revestimento em
ColTi ( direita).

Fig. 2 - Fotografia dos parafusos usados para implantes sseos. As amostras so coradas com azul
de Toluidina para mostrar o homogeneidade do revestimento na ColTi ( esquerda).

2.3.2 Testes de citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada pelo mtodo de contato direto, utilizando a linha
celular de fibroblastos contnuos de ratos L-929. Meio de cultura celular experimental
(Sigma, Milo) foi Minimum Essential Eagles Medium sem l-glutamina, 10% de soro
fetal de bovino, estreptomicina (100 mg / l), penicilina (10 U / ml), 2 mmol / l de Lglutamina em frasco plstico de cultura de 250 ml (Falcont). As clulas so cultivadas a
37 C numa incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. Os fibroblastos foram
colhidos antes da confluncia por meio de uma soluo estril de tripsina-EDTA
(tripsina a 0,05, 0.02 de EDTA em soluo salina tamponada com fosfato normal, pH
7,4) a partir dos frascos de cultura, ressuspendidas em meio de cultura celular
experimental, e diludas para 1x105 clulas / ml, 3,5 ml de suspenso de clulas
semeadas em 6 culturas em placas de tecidos de poliestireno (9,6 cm2 de rea de
crescimento; Falcont), contendo as amostras. Aps 3 dias de crescimento a 37 C, 5%
de CO2 num incubador humidificado, a sequncia de avaliaes peridicas foram
realizadas:
(1) morte celular e morfologia das clulas. A monocamada de clulas em torno das
amostras foi observada por em microscpio invertido (DM IL, Leica). A fronteira entre
as amostras e as monocamadas de clulas foi cuidadosamente controlada, para verificar
se a liberao das amostras resultou na morte celular ou a reduo em nmero. Assim, a
morfologia das clulas foi cuidadosamente controlada e comparada com resultados
obtidos com o controle negativo (isto , as clulas cultivadas em tecido de poliestireno
com um lingote de ouro dentro, mesmo tamanho das amostras experimentais). O
controlo positivo foi obtido a partir do lingote a uma liga Ni-Cu-Al, o mesmo tamanho
que a amostra experimental.
(2) atividade biossinttica. O ensaio MTT foi utilizado para avaliar clulas sadias por
meio da sua atividade biossinttica. Este teste mede a atividade succinato desidrogenase
(SDH) de clulas aps 72 horas de contato com as amostras. SDH uma enzima chave
do ciclo de Krebs (ou seja, o ciclo de cido ctrico), e a sua avaliao por meios
bioqumicos comumente usado para verificar as clulas sade.
Resumidamente, no final de 72 h de contato, as clulas foram lavadas com PBS
estril e em seguida o PBS foi substitudo com 2 ml / poo de soluo de MTT (brometo
de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil brometo de tetrazlio) succinato de sdio. A
soluo de MTT e clulas foram incubadas a 37C durante 3 h na incubadora. Durante
este tempo, a soluo de MTT amarela transformado por desidrogenase das clulas
mitocondriais em azul de formazano insolvel. Ao medir a quantidade de formazano
produzido, possvel medir a atividade mitocondrial, e, como consequncia, a
viabilidade celular. No final do perodo de incubao, a soluo de MTT foi removida e
substituda com 2 ml / poo de uma 6,25% v/v 0,1 mol/L NaOH em dimetilsulfxido, a
fim de dissolver o formazano. Os poos rodaram por 5 minutos at que a cor roxa
ficasse uniforme e a absorvncia foi avaliada a 560 nm. Os valores de absorvncia

obtidos foram em mdia, e a mdia foi expressa como a percentagem do controle

negativo (que, por definio, 100%).
2.3.3 O crescimento de clulas semelhantes a osteoblastos e atividade de fosfatase
alcalina
Osteoblastos como as clulas SaOS-2 foram utilizados nas experincias de
crescimento celular. O meio experimental de cultura de clulas (Biochrom KG, Berlim)
consistiu de Minimum Eagles Medium sem L-glutamina, 10% de soro fetal de bovino,
estreptomicina (100 mg / l), penicilina (100 U / ml), e 2 mmol / l de l-glutamina em
frasco de cultura de plstico de 250 ml (Corningt). As clulas foram cultivadas a 37C
numa incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. As clulas foram colhidas
antes da confluncia por meio de uma soluo estril de tripsina-EDTA (tripsina 0,5 g /
L, 0,2 g / L de EDTA em soluo salina tamponada com fosfato normal, pH 7,4),
ressuspendidas em meio de cultura celular experimental, e diludas a 1x105 clulas / ml.
Para experincias, 5 ml da suspenso de clulas foram semeadas em placas de 6 poos
de cultura de tecidos de poliestireno (9,6 cm2 de rea de crescimento; Falcont),
contendo as amostras. Experimentos foram realizados lobisomem triplicado.
Em intervalos de tempo selecionados (1 dia, 4 dias e 10 dias), o nmero de
clulas na amostra foi avaliado. Resumidamente, as amostras foram removidas dos
recipientes, enxaguadas com PBS e colocados em uma outra placa de multi-poos.
Clulas foram colhidas a partir da superfcie das amostras de superfcie por tripsina e
contadas num hemocitmetro.
A medio da atividade da fosfatase alcalina foi realizada aps 10 dias de
crescimento como se segue: amostras foram enxaguadas com PBS e transferidas para
uma nova placa de multi-recipientes. Um ml de soluo de lise (0,2% de Triton X-100,
Sigma)foi adicionado a cada amostra. Depois disso, os lisados foram incubados durante
2 h a 37 C com 1 ml da soluo de mistura de substratos de enzima, contendo 1 mM
MgCl2 x 6H2O, 1.5 mM 2-amino-2-metil-1-propanol e 20 Mm, p-nitrofenilfosfato. A
reao parou com 1 ml de 1N NaOH. A atividade enzimtica foi medida pela leitura
das amostras a um comprimento de onda de 405 nm usando um leitor de microplacas
Tecan Genios. As leituras obtidas posteriormente foram comparadas com os valores
medidos em uma curva padro, obtida pelas medies de soluo-padro de pnitrofenol.
A atividade especfica da fosfatase alcalina foi obtida por ratioing dos dados
anteriores para a concentrao total de protena, obtida pelo mtodo de Bradford e
usando uma curva de calibrao baseada em solues-padro de albumina de soro
bovino (Sigma). Amostras foram lidas a 595 nm, utilizando o mesmo leitor micro placa,
conforme descrito acima.

2.3.4 Estudos in vivo

Todo o estudo in vivo foi realizada seguindo a lei europeia e italiana em
experimentos com animais e de acordo a Garantia do Bem-Estar Animal No. # A542401 pelo Instituto Nacional de Sade (NIHRockville, MD, EUA). O protocolo
experimental foi enviado ao Ministrio da Sade italiano.
Onze coelhos adultos, do sexo masculino, pesando 3.250 0.350 foram usados
(Charles River, Calco, Lecco, Itlia). Coelhos foram aclimatados por 10 dias e se
mostraram saudveis e livres de imperfeio antes da admisso no estudo. Os animais
foram mantidos em gaiolas individuais em um T de 20 0,5 C, a taxa de umidade de
55 10% e gua e comida espontaneamente (Mucedola, Settimo Milanese, Milano,
Italia).
Os implantes foram colocados em estril aps barbear e desinfeco com
soluo de betadine. A anestesia geral foi induzida com injeco de 44 mg / kg de
cetamina (100 Ketavet, Farmaceutici SpA Gellini, Aprilia Lt, Itlia) e 3 mg / kg de
xilazina (Rompun, Bayer AG, Leverkusen, Alemanha), e ventilao assistida (O2: 1 l /
min; N2O: 0,4 l / min; isofluorano: 2,5-3%). No ps-operatrio os animais foram
verificados diariamente, isolando as feridas at a retirada de pontos. A terapia com
antibiticos (cefazolin, 100 mg / kg) foi administrada no pr-operatrio, que,
imediatamente aps a cirurgia e aps 24 h. Analgsicos (cloreto de metamizole, 50 mg /
kg) foram prescrito no ps-operatrio imediato. A sade dos animais foi avaliada
durante todo o estudo por um veterinrio. No final dos protocolos experimentais os
animais foram sacrificados por eutansia sob anestesia geral com administrao
intravenosa farmacolgica de Tanax (Hoechst, Frankfurt am Main, Alemanha).
2.3.5 Implantes intramusculares
Cinco coelhos foram utilizados para o implante intramuscular de 10 placas de Ti
e ColTi. Duas espcimes foram inseridas de cada lado do animal cirurgicamente com o
longo eixo paralelo s fibras musculares e em mais de 25 mm a partir da linha mdia e
para alm de um ao outro como sugerido pela International Standard Organization. As
placas de controle (Ti sem revestimento) foram implantadas no lado esquerdo, enquanto
placas experimentais (ColTi) no lado direito. Uma inciso longitudinal foi feita atravs
da pele na regio dorso-lombar. A pele se separou da fscia. Subsequentemente, a
fscia1 foi dissecada e uma pequena inciso foi feita na a barriga do msculo. Locais de
implantao foram criados para mais separaes das fibras musculares, com dissecao
com tesouras arredondadas. Aps a insero dos implantes, a inciso do msculo no
foi suturada para evitar efeitos secundrios material de sutura. A pele foi suturada com
pontos no-absorvveis. Aps 12 semanas os animais foram sacrificados e o implante
com um suficiente tecido circundante (cerca de 2 cm) no afetado foi removido para
avaliar a resposta biolgica local.

uma bainha fina de tecido fibroso, que encerram um msculo ou outro rgo.

2.3.6 Implante sseo

Seis coelhos foram utilizados para implantao ssea. O fmur middiaphyses foi
exposto e dois defeitos com um dimetro de 1,9 mm foram perfurados em baixa
velocidade e sob irrigao salina contnua no osso cortical do fmur direito e esquerdo.
Parafusos controle de Ti no revestidos foram transversalmente implantados nos
fmures esquerdos de todos os coelhos, enquanto parafusos ColTi foram posicionado
nos fmures direitos, at um total de 12 implantes corticais para cada material.
Finalmente, a pele foi suturada em duas camadas. Quatro semanas aps a cirurgia, os
animais foram sacrificados. Os fmures foram retirados, limpos dos tecidos moles e
preparados para histomorfometria.
2.3.7 Histologia e histomorfometria
Bipsias dos tecidos moles e duros foram fixadas em 4% paraformaldeido
tamponado durante 7 dias para o processo de descalcificao ssea. Em seguida, as
amostras foram desidratadas em sries graduais de lcoois at a absoluta (50%, 75%,
95% e 100% durante 24 horas para cada concentrao). Finalmente elas foram
incorporadas em metacrilato de metila. Blocos foram seccionados ao longo de um plano
paralelo ao eixo longo dos implantes e uma srie de seco de cerca de 1020
milmetros, espaadas por 200 m de distncia, foi btida com um diamante Leica 1600
micrtomo de vista (Leica 1600 Leica SpA, Milano, Italia). Eles foram diludos para
cerca de 10 2 m e 30 2 m (msculos e ossos, respectivamente) por um polidor
Exact (Bioptica, Milano, Itlia). Para cada amostra, trs fatias foram examinados, aps
colorao de hematoxilina eosina (implantes musculares) e Fast Green-cido Fucsina
(implantes sseos). A histomorfometria foi realizada por Axioscop (Carl Zeiss GmbH,
Jena, Alemanha), conectado por uma cmera de vdeo atravs de um computador
pessoal equipado com o software Kontron KS 300 (Kontron eletrnicos, GmbH, em
Eiching Munchen, Alemanha). Como a medida do implante muscular est em causa, a
avaliao envolveu a presena e a espessura da cpsula fibrosa, inflamao,
degenerao, necrose e a natureza das clulas na interface implante-tecido. Por
histomorfometria, os seguintes parmetros foram medidos: presena da cpsula fibrosa
em torno do implante (comprimento do permetro ocupado por cpsula / permetro total
da amostra x 100) e a espessura da cpsula. O ltimo foi medido em 16 locais diferentes
ao longo do permetro da amostra (cinco locais ao longo do lado mais comprido, trs ao
longo do lado curto da amostra).
Para avaliar a interface osso-biomaterial e osteointegrao, as seguintes medidas
histomorfomtricas foram realizadas:

Contato osso-implante: fracional, extenso linear de osso aposto superfcie do

implante dividido pelo permetro da superfcie total do implante x 100;
Crescimento sseo (BI): quantidade de osso na rea delimitada pela superfcie
roscada e uma linha ligando a parte superior dos roscas, dividida pela rea total
do segmento x 100. Este valor foi calculado para todos as roscas de cada

implante e foi ento comparada com a sua imagem no espelho (rea de espelho)
(MA).
Cada medida foi tomada semi-automaticamente a um aumento original de x 40
por um investigador cego experiente.
Os dados so apresentados como mdia desvio padro.
2.3.8 Anlise estatstica
A anlise estatstica foi realizada atravs do software SPSS V.10.1 (SPSS / PC
Inc., Chicago, IL). Os dados so apresentados como mdia SD em um nvel de
significncia de p < 0.05. Depois de verificar a distribuio normal e homogeneidade
das varincias, os testes t de Student emparelhados foram utilizados para comparao de
dados entre os parafusos de Ti e ColTi.
3 Resultados
3.1 Anlise XPS
O mtodo de XPS (Espectroscopia Fotoeltrica de Raios-X) foi usado para
determinar a composio da camada superficial das amostras. A superfcie de titnio
coberta por uma fina camada de xido (com espessura aproximada de 4nm). A mxima
concentrao de titnio puro no material de 33%. O restante costuma ser de xido
(sendo o xido de titnio - TiO2 - o mais estvel deles). Contaminaes com
hidrocarbonetos do meio juntamente com impurezas derivadas dos processos realizados
anteriormente no maquinrio aumentam significativamente a presena de carbono.
Diversas literaturas consideram que a presena de 15% de titnio puro indica uma
superfcie limpa.
Tabela 1 - Composio das superfcies de diferentes amostras.

Observaes:

AATi (enxerto com cido acrlico): presena de grupos

carboxlicos com cido acrlico.

ColTi (Ti ligado ao colgeno): no h sinal da subcamada de

titnio e ocorreu a homogeneizao da cobertura do substrato

3.2 ATR-IR
Vale ressaltar que a qualidade do espectro gerado pelo ensaio ATR-IR
(Espectroscopia no Infravermelho de Refletncia Total Atenuada) no muito boa,
devido dificuldade de obter o espectro confiante, para uma camada to fina de metal
opaco, como o caso estudado.
Os ensaios foram feitos com dois ph diferentes: 3 e 7.

Fig.3 Espectro de ATR-IR de amostras do tipo AATi.

Observaes na figura: cido acrlico protonado e ionizado.

Apesar da imobilizao induzida pela superfcie enxertada, a camada de cido
poliacrlico mantm sua atividade cida-bsica. Aps o acoplamento de colgeno,
bandas feitas de grupos carboxlicos so substitudas por bandas tpicas de amida, como
esperado.

3.3 AFM
A primeira informao buscada a partir da anlise de AFM a avaliao da
espessura da camada enxertada.
A efetividade do processo foi confirmada pelo tingimento por toluidina. Tal
substncia azulada somente se adere regio recoberta. Desta maneira, as partes sem o
recobrimento permanecem com sua colorao original.
Alguns detritos podem ser encontrados dentro do buraco analisado na figura que
se segue, ou na regio prxima a ele, que podem ser devido a pequenas pores de cido
acrlido homopolimerizado, que no foram completamente removidos pela limpeza
rotineira. A rea distante e fora do buraco muito mais plana e homognea.
A figura 4 apresenta a anlise da seo atravs de um dos buracos obtidos. Ela
apresenta tambm o perfil da altura ao longo da linha preta desenhada sobre a imagem.
As setas so uma referncia para as medidas, que representam a avaliao da espessura
da camada enxertada, que justamente a distncia vertical entre as duas setas, de
aproximadamente 117nm.

Fig. 4 Anlise da seo da amostra de AATi

Em relao Figura 5, verificou-se que em 5a no houve modificao

significativa na morfologia da superfcie. Em 5b, verificou-se uma superfcie tpica
enxertada com hidrogel. J em 5c, percebeu-se significativa mudana morfolgica. Em

suma, vale ressaltar que o AFM pode detectar, claramente, diferenas entre a
morfologia superficial das amostras.

Fig. 5 Imagens de AFM mostrando a morfologia superficial

A Tabela 2 mostra o efeito do meio ambiente na rugosidade superficial,

calculado por meio de software.
Tabela 2 Valores de rugosidade no ar

3.4 Testes de citotocidade

O contato direto entre clulas L-929 e amostras de Ti e ColTi no provocou
nenhum efeito de averso a nvel de microscopia tica.
A Tabela 3 apresenta os resultados de testes por MTT, expressos em porcentagem de
controle negativo. Ti e ColTi no apresentaram diferenas significativas.
Tabela 3 Resultados de testes de MTT

Fig. 6 Fotografia de microscpio tico mostrando resultados de ensaio de

citotoxicidade

3.5 Crescimento de clulas SAOS-2 e atividade de fosfatase alcalina

O nmero de clulas na superfcie das amostras em funo do tempo mostrado
na Grfico 1. No primeiro dia, no h diferena significativa, mas aps um tempo
maior, percebe-se grandes diferenas, explicadas pela variao da estrutura superficial
entre as amostras analisadas. Os resultados relacionados fosfatase alcalina remetem,
obviamente, ao grande nmero de clulas na amostra de Ti.

Grfico 1 Resultados de experimentos com crescimento de clulas de SaOS-2.

3.6 Experimentos in vivo

Todos os animais toleraram bem as cirurgias e sobreviveram sem nenhuma
complicao clnica at o final do tempo de experimentos. Radiografias confirmaram as
boas localizaes dos implantes. A nveis macroscpicos, durante a autpsia dos
animais, no houve sinal de inflamao, infeco grosseira, nem danos aos tecidos,
observao feita ao redor dos implantes, tanto em tecidos macios quanto rgidos.
3.7 Implantes no msculo
Aps 12 semanas do implante, a observao histolgica no revelou nenhuma
inflamao remanescente ou detritos de material proveniente do implante. Ambos os
materiais induziram o crescimento de cpsula fibrosa de espessura varivel, com as
fibras orientadas paralelamente interface do implante. No se verificou nenhuma
diferena significativa entre os parmetros das duas amostras analisadas.

Fig.7 Resultados dos experimentos de implante intramuscular

3.8 Implantes sseos

O parafuso de ColTi mostrou maior percentual de contato com o osso
circundante, quando comparado ao Ti no revestido. A semelhana entre os valores da
rea espelhada indicam a homogeneidade do implante no osso. Os valores da Tabela 4
mostram o benefcio do revestimento de colgeno na matriz de titnio.

Fig.8 Resultados de experimentos de implante no osso

Tabela 4 Resultados de experimentos histomorfomtricos

4 Discusso
Dentro das avaliaes biolgicas o teste de citotoxicidade, resultou na no
presena de efeitos adversos bem como no houve liberao de produtos no esperados;
tambm dentro das avaliaes biolgicas no se constatou clulas inflamatrias e
tecidos necrosados em 12 semanas, com teste de implante muscular. Houve formao de
cpsula fibrosa, no diferente da amostra teste. Divergindo de outros estudos que no
houve formao de cpsula fibrosa (MORRA, 2003)

Estudos in vitro tambm mostraram uma reduo no crescimento de clulas

osteoblastas do ColTi comparado ao Titnio, diferente do que foi mostrado em outros
estudos. Tal diferenciao pode ser pelo modelo que se conta as clulas osteoblastas. J
nos estudos in vivo constatou-se resultados positivos, com maior interao entre ossoimplante e maior crescimento sseo do que o implante de Titnio (MORRA, 2003)
Algumas hipteses para o aumento da taxa de reconstituio ssea so:
I.
II.

O notrio papel do colgeno na diferenciao de clulas sseas,

mineralizao ssea e reconstituio ssea;
Ativao plaquetria do colgeno e liberao de fatores de crescimento das
plaquetas ativadas (MORRA, 2003)

5 Concluso
O titnio foi substitudo por um material com superfcie homognea de
colgeno. O mais importante que o teste in vivo traz uma perspectiva interessante para
essa nova classe de material, uma vez que demonstrou maior interao osso-implante e
maior crescimento sseo, sendo, portanto uma alternativa a uma recuperao mais
rpida.

Referncias bibliogrficas
MORRA, M. et. al. Surface engineering of titanium by collagen immobilization.
Surface characterization and in vitro and in vivo studies. In Biomaterials 24, 2003,
p. 46394654.