Tesis 294

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
ESTANDARIZACIN DEL TIEMPO DE INCUBACIN Y

CONCENTRACIN DE CaCO3, SO4(NH4)2 Y KNO3 PARA LA PRUEBA DEL
NMP CON BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES USANDO
COMO MATRIZ COMPOST
NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO

CHRISTIAN ALFONSO TORO LOZANO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de
MICROBIOLOGA AGRCOLA Y VETERINARIA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogot, D.C.
Noviembre 22 del 2006
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por
los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se
publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia".
Artculo 23 de la Resolucin No13 de julio de
1946.

COMO MATRIZ COMPOST
NATALIA CAROLINA RODRGUEZ MORENO

APROBADO
__________________________
Maria Mercedes Martnez M. Sc.
_________________________
Marcela Mercado Reyes M. Sc.
Directora
Asesora
__________________________
_________________________
Ruth Bonilla Ph. D.
Amanda Lozano M. Sc.
Jurado
Jurado

COMO MATRIZ COMPOST

__________________________
ngela Umaa Muoz M. Phil.
_____________________________
David Gmez M. Sc.
Decana Acadmica
Director Carrera de Microbiologa
Facultad de Ciencias
Agrcola y Veterinaria e Industrial
DEDICATORIA
DEDICADO A NUESTROS PADRES, HERMANOS Y AMIGOS POR

QUIENES FUE POSIBLE ALCANZAR ESTE LOGRO TAN IMPORTANTE
EN NUESTRAS VIDAS
AGRADECIMIENTOS
A la Pontificia Universidad Javeriana por el prstamo de sus instalaciones y

equipos para el desarrollo del trabajo.
A la Doctora Mara Mercedes Martnez por la confianza depositada en

nosotros en momentos tan difciles, su paciencia, asesora y sugerencias.
A la Doctora Marcela Mercado por sus valiosos aportes.
A nuestros Padres y hermanos por su confianza, paciencia y dedicacin.
A nuestros amigos y compaeros por su apoyo incondicional.
A Ti, por que sin tu apoyo y fortaleza nada habra sido posible.
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1. INTRODUCCION
13
2. MARCO TEORICO
14
2.1. Bioinsumos agrcolas
14
2.2. Ciclos biogeoqumicos
16
2.2.1. Nitrgeno
16
2.2.1.1. Nitrificacin
18
2.2.1.2. Reduccin del nitrato y desnitrificacin
21
2.3. Determinacin microbiolgica de la nitrificacin y desnitrificacin 23

2.4.Tcnica del nmero ms probable
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
25
26
3.1.Formulacin del problema
26
3.2.Justificacin
26
4. OBJETIVOS
27
4.1.Objetivo general
27
4.2.Objetivos Especficos
27
5. MATERIALES Y METODOS
27
5.1. Diseo de la Investigacin
27
5.1.2. Poblacin de Estudio y Muestra
28
5.1.3. Recoleccin de las Muestras
28
5.1.4. Regularidad de la Toma de Muestras
29
5.1.5. Variables de Estudio
29
5.2. Mtodos
29
5.2.1. Determinacin del pH del compost
29
5.2.2. Estandarizacin del Tiempo
30
5.2.3. Estandarizacin de Sales
30
5.2.4. Nmero Ms Probable Bacterias Nitrificantes
31
5.2.5. Nmero Ms Probable Bacterias Denitrificantes
32
Pg.
5.2.6. Anlisis de Informacin
6. RESULTADOS
32
34
6.1. Muestras para estandarizacin del tiempo de incubacin
35
6.2. Muestras para estandarizacin de sales
36
6.3. Estandarizacin del tiempo de incubacin
39
6.4. Estandarizacin de Sales
47
6.4.1. Estandarizacin de la concentracin de SO4(NH4)2 y la adicin

o no de CaCO3 para bacterias nitrificantes
47
6.4.2. Estandarizacin de la concentracin de KNO3 y la adicin

o no de CaCO3 para bacterias denitrificantes
52
7. CONCLUSIONES
57
8. RECOMENDACIONES
58
9. BIBLIOGRAFA
59
ANEXOS
75
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Niveles del factor de diseo utilizados para estandarizar
la concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adicin o no
de CaCO3
Figura 2. Pilas de compostaje muestreadas, Cultivos del Norte
28
35
Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias

nitrificantes con desviacin estndar
39
Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias

nitrificantes el da 15 de las muestras recolectadas
para la estandarizacin del tiempo de incubacin
40
Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias

nitrificantes, a los 15 das de incubacin
41
Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de

denitrificantes con desviacin estndar
43
Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias

denitrificantes a los 15 das de incubacin
45
Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la

incubacin durante 15 das en caldo nitrato para bacterias
denitrificantes
45
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las

muestras recolectadas para la estandarizacin del tiempo
de incubacin
46
Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de

bacterias nitrificantes con desviacin estndar
49

bacterias denitrificantes con desviacin estndar
53
LISTA DE TABLAS
Pg.
Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes

concentraciones
31
Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes

concentraciones
31
Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarizacin del tiempo de

incubacin
del
NMP
en
bacterias
nitrificantes
denitrificantes.
36
Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarizacin de la

concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3 y adicin o no de
CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes
37
Tabla 5. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del

NMP de bacterias nitrificantes para estandarizacin del
tiempo
40
Tabla 6. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del

NMP de bacterias denitrificantes para estandarizacin del
tiempo
43
Tabla 7. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk

aplicado a tratamientos para la estandarizacin de sales en
NMP de bacterias nitrificantes
48
Tabla 8. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk

aplicado a tratamientos para la estandarizacin de sales en
NMP de bacterias denitrificantes
53
LISTA DE ANEXOS
Pg.
Anexo 1. Medios de cultivos y reactivos
75
1.1. Caldo amonio
75
1.2. Caldo nitrato
75
1.3. Reactivo de Nessler
75
1.4. Reactivo de Griess
76
1.5. Solucin amortiguadora de pHmetro
76
Anexo 2. Anlisis de la informacin
77
Tabla 9. Media y desviacin estndar del NMP/g de compost de

bacterias nitrificantes, tomado diariamente para cada una de las
muestras.
77
Tabla 10. Media y desviacin estndar del NMP/g de compost de

bacterias denitrificantes, tomado diariamente para cada una de las
muestras.
77
Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes

para estandarizacin del tiempo
Tabla 12. Prueba no paramtrica Kruskal-Wallis aplicada para
homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para
estandarizacin del tiempo
Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias
denitrificantes para estandarizacin del tiempo
Tabla 14. Prueba no paramtrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad
de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para estandarizacin
78
78
78
79
del tiempo
homogeneidad de grupos a NMP de bacterias nitrificantes para
79
estandarizacin de sales con un 0.05

homogeneidad de grupos a NMP de bacterias denitrificantes para
estandarizacin de sales 0.05
79
RESUMEN
En Colombia no se han realizado estudios para estandarizar metodologas que
permitan determinar la concentracin de bacterias nitrificantes y denitrificantes en
compost. Las bacterias nitrificantes y denitrificantes basan su importancia en el
ciclaje del nitrgeno en diferentes ambientes, llevndolo de la forma ms oxidada
(NO3) a la ms reducida (N2). La importancia de estudiar estas bacterias en compost
se debe al uso de este bioinsumo en el pas, por lo que resulta importante cuantificar
la presencia de estas bacterias en el compost para el suelo al que vaya a ser aplicado.
La tcnica que se utiliz fue la del numero mas probable (NMP), revelando los tubos
con reactivo de Griess (nitrito), reactivo de Nessler (amonio), y el polvo de zinc
(nitrato). En este trabajo, se estandariz el tiempo de crecimiento de estas bacterias,
dos concentraciones diferentes del sustrato, y la necesidad de agregar o no CaCO3 al
medio para obtener un mejor crecimiento, con estas ltimas dos variables se aplicaron
4 tratamientos para bacterias nitrificantes y denitrificantes respectivamente,
trabajando a concentraciones de 0.5 o 0.33 g de SO4(NH4)2 y 0.5 o 2 g de KNO3. Las
tres variables se evaluaron con respecto al mayor crecimiento de biomasa. No se
encontr diferencias significativas en la biomasa de los das 14, 15 y 16 para las
bacterias nitrificantes, pero el da con mayor reporte fue el 15 con 115.88 NMP/g de
compost, mientras que para las bacterias denitrificantes el da 15 y 16 arrojaron el
mismo resultado con 31.42 NMP/g de compost. El tratamiento 1 (0.5 g de SO4(NH4)2
con 1 g
de CaCO3 en nitrificantes y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 en
denitrificantes) obtuvo el mejor crecimiento en bacterias nitrificantes y denitrificantes

con 112.67 NMP/g de compost y 27.53 NMP/g de compost respectivamente. Los
resultados obtenidos, determinaron que el crecimiento optimo para los dos grupos de
bacterias se encuentra el da 15 debido a que es el tiempo que necesitan para
desarrollar su maquinaria enzimtica y reproducirse, as como la importancia de la
cantidad de sustrato, y la adicin del CaCO3 para el mantenimiento del pH en el
medio, promoviendo las reacciones y evitando la inhibicin de las enzimas por este
factor.
1. INTRODUCCIN
El nitrgeno, uno de los macronutrientes de mayor importancia en los procesos
biolgicos, es para los agricultores uno de los mayores problemas debido al costo de
los fertilizantes nitrogenados y a la facilidad con la que el sistema puede perderlos.
Los microorganismos en el suelo desarrollan funciones bioqumicas de gran
importancia en el ciclaje de nutrientes debido a que muchos de los compuestos
orgnicos pueden ser degradados o transformados como ocurre en los procesos de
compostaje o degradacin de materia orgnica. En general dependiendo del sustrato
que utilicen, los microorganismos asociados a la transformacin del nitrgeno,
incluyen grupos funcionales que realizan procesos de oxidorreduccin como bacterias
nitrificantes y denitrificantes.
La importancia agronmica de las bacterias nitrificantes se basa en la capacidad de
oxidar el NH4 a formas ms asimilables como NO3 para las plantas. Los grupos
bacterianos que intervienen en este proceso son las bacterias oxidantes de amonio
como Nitrosomonas sp., y las bacterias oxidantes de nitrito como Nitrobacter sp. Las
bacterias denitrificantes evitan las perdidas de nitrgeno por escorrenta y lixiviacin,
al reducir formas oxidadas del nitrgeno reintegrndolo al ambiente. Algunas
bacterias de este grupo incluyen varias especies de Pseudomonas., Alcaligenes y
Bacillus.
La tcnica del numero mas probable (NMP) se utiliza para observar la densidad
poblacional de un grupo determinado de microorganismos de forma indirecta. Girard
y Rougieux desde 1964 describieron la metodologa NMP para realizar recuento de
bacterias nitrificantes y denitrificantes empleando suelo como matriz, con 0.5 g de
SO4(NH4)2 como sustrato y adicionando CaCO3 como estabilizador de pH. En 1991,
Verhagen y Laandbroek, realizaron un recuento de bacterias nitrificantes
quimiolitotrfas y hetertrofas utilizando una concentracin de 2 g de KNO3 para la
13
misma tcnica sin adicin de CaCO3. Hashimoto et al., en el 2005 modificaron la

tcnica del NMP de Tiedje 1982 para enumerar bacterias denitrificantes copitrofas y
oligtrofas de la superficie del suelo en la regin de Okinawa en el sur de Japn,
usando 0.5 g de SO4(NH4)2.
Sin embargo en matrices diferentes a suelo como es el caso de compost, no se han
reportado estudios con relacin a tiempos de incubacin, concentraciones de sustrato
y requerimiento de CaCO3. Siendo el nitrgeno necesario para la descomposicin de
la materia orgnica por parte de los microorganismos y pretendiendo concluir que tan
determinante es la concentracin del sustrato, la adicin de CaCO3 y el tiempo de
incubacin en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes recolectadas a
partir de una pila de compostaje se estandarizar una tcnica que aun no ha sido
reportada para dicha matriz, que a su vez sea aplicable como una herramienta
confiable y de fcil manejo.
2. MARCO TERICO
2.1.
BIOINSUMOS AGRCOLAS
Los bioinsumos son recursos o productos de origen biolgico elaborados

comercialmente con el fin de ser utilizados en nutricin vegetal principalmente en
programas de control, manejo integrado de los cultivos o mejoramiento de las
caractersticas biolgicas del suelo (ICA 2004). Dentro de los bioinsumos se incluyen
agentes biolgicos para el control de plagas, inoculantes biolgicos, bioabonos,
inculos microbiales para compostaje y productos bioqumicos. Es importante
destacar que no se consideran bioinsumos los extractos botnicos complejos como
rotenona, piretrinas, butxido de piperonilo; productos obtenidos de algas, tales
como: giberelinas y citoquininas, ni productos de fermentacin, como antibiticos y
betaexotoxina de Bacillus thuringiensis (Gutirrez et al., 2005).
14
El compost es un tipo de bioinsumo en el cual se produce una transformacin de los

materiales orgnicos, de tal suerte que ya no es posible reconocer a las partes que le
dieron origen. Este producto rico en nutrimentos (carbono, nitrgeno, fsforo, azufre,
etc.) y flora microbiana ayuda a mejorar la estructura del suelo hacindolo mas
esponjoso y permitiendo aumentar la densidad poblacional de los organismos
habitantes en el suelo (Labrador 1996).
Un factor que afecta el proceso de compostaje es la temperatura, la cual depende de la
flora microbiana y puede disminuir si hay falta de oxigeno y humedad (Cegarra
1994). El compost alcanza su mxima eficiencia con una humedad entre 50 y 60%
debido a que por debajo del 40% la descomposicin es aerbica y por ende mas lenta,
mientras que por encima del 60% la cantidad de poros libres de agua es muy pequea
con dificultad para la difusin de oxigeno, con lo cual se obtiene como resultado la
anaerobiosis (Pla 1994). La concentracin de oxigeno necesaria para que no se limite
el proceso esta entre el 5 y el 10% en los macroporos, pero si la concentracin de
oxigeno es alta en los macroporos es posible que se presente anaerobiosis en los
microporos (Cegarra 1994). La relacin C:N ideal para un compostaje rpido es
25:35, debido a que relaciones menores pueden causar la volatilizacin del amonio y
relaciones mayores resultan en compostaje mas lento. Durante el compostaje el
nitrgeno total disminuye relativamente rpido al comienzo y luego se re distribuye
entre fracciones sin perdidas significativas (Par et al., 1998). Los compuestos
nitrogenados presentes en residuos orgnicos son elevadamente heterogneos y los
materiales protenicos son algunos de los primeros en ser usados por los
microorganismos. Otras formas ms complejas de nitrgeno sufren cambios a fin de
proveer a la planta de formas asimilables de nitrgeno, debido a que no son
inmediatamente amonificables (Dalzell et al., 1987). El compostaje genera amonio y
nitrato, y compuestos aminos que son rpidamente asimilados por la planta antes o
despus de la hidrlisis por las enzimas del suelo. Todos estos compuestos estn
asociados con las perdidas de nitrgeno (Smith et al., 1989).
15
El valor optimo de pH esta entre seis y siete cinco, debido a que los valores extremos
inhiben la actividad microbiana durante el proceso de degradacin. Al disminuir el
tamao de las partculas aumenta la superficie para el ataque microbiano, por esta
razn el exceso de partculas mas pequeas puede conducir a la compactacin y
formacin de gran cantidad de microporos, favoreciendo el desarrollo de condiciones
anaerbicas (Labrador 1996, Meja et al, 2005 y Osorio 2005).
2.2.
CICLOS BIOGEOQUIMICOS
Los ciclos biogeoqumicos describen el movimiento de materia a travs de reacciones

en toda la biosfera de manera cclica. Los principales elementos de la biomasa que
son ciclados por los microorganismos son carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y
oxigeno. Las actividades humanas, como la liberacin de desechos, uso de
agroinsumos, deforestacin, pueden tener una gran influencia en las tasas de actividad
cclicas de los microorganismos, ocasionando cambios significativos en las
caractersticas bioqumicas de un hbitat determinado (Gmez 2004).
2.2.1.
NITROGENO
El nitrgeno es uno de los elementos mas ampliamente distribuidos en la naturaleza.

En la atmsfera se halla en forma de dinitrgeno N2, donde representa alrededor del
78%, lo que equivale a 2.8 x 1014 Tm de nitrgeno. El N en la atmsfera se encuentra
presente un 25%, mientras que en la litosfera se encuentra estable en rocas primarias
y sedimentarias, de modo que nicamente un 0.03% se encuentra en el suelo y que de
este suelo una proporcin muy pequea esta en forma asimilable por los seres vivos
(Guerrero 1990; Atlas y Bartha 2002).
El nitrgeno es un elemento muy importante para las plantas debido a que es un
constituyente de los tejidos vegetales, formando parte de numerosas biomolculas,
como los son las protenas, cidos nucleicos, porfirinas y alcaloides (Ingham et al.
16
1978). Al fijarse nitrgeno (reduccin del N2 atmosfrico), las plantas pueden obtener
nitrgeno por absorcin del suelo en forma de NO3 y NH4, estableciendo asociaciones
simbiticas con diversas bacterias, no obstante este debe ser modificado antes de que
pueda ser utilizado por la mayora de los sistemas vivos. Dicho elemento sufre una
serie de transformaciones en las cuales participan compuestos orgnicos e
inorgnicos (Aparicio y Arrese 1996). No es posible que una planta asimile nitrgeno
orgnico directamente, necesita determinadas condiciones de humedad, temperatura y
la actividad de la enzima ureasa para transformarlo rpidamente en nitrgeno
amoniacal, el cual es soluble en agua y es retenido por absorcin del suelo (Aparicio
y Arrese 1996, Mayea 1982).
El ciclo inicia con la materia orgnica muerta estructurada de compuestos orgnicos

complejos ricos en nitrgeno de modo que hongos y bacterias presentes en los suelos
lo transforman a partir de aminocidos y protenas, y se deshacen del nitrgeno
restante en forma de iones amonio, proceso denominado amonificacin (Atlas y
Bartha 2002). En los suelos habitan bacterias capaces de oxidar iones amonio al
transformarlos en iones de nitrato produciendo energa en el proceso denominado
nitrificacin (Prosser 1989). La aminacin consiste en que estos iones de nitrato
penetran en las clulas de las plantas, donde son nuevamente reducidos a iones
amonio y transformados en componentes que contienen carbono para producir
aminocidos y otros componentes orgnicos ricos en nitrgeno. Los aminocidos y
componentes orgnicos retornan al suelo al morir las plantas, o a travs de los
excrementos de los animales que las ingieren. De este modo se vuelve a dar comienzo
el proceso denominado amonificacin (Madigan et al., 2000; Atlas y Bartha 2002). El
ciclo del nitrgeno comprende varias etapas en las que participan diversos
organismos edficos. Fijacin de nitrgeno, mineralizacin o amonificacin,
inmovilizacin, nitrificacin y desnitrificacin (Atlas y Bartha 2002).
17
2.2.1.1. NITRIFICACIN
En medios alcalinos se puede liberar nitrgeno a la atmsfera en forma de amonaco
gaseoso, y otra gran parte del amonaco sufre el proceso denominado nitrificacin, en
el cual los iones de amonio se oxidan a iones nitritos y estos son transformados a
iones nitrato. Este proceso parece estar limitado en su mayor parte a un nmero
restringido a microorganismos aerobios quimiolitoauttrofos (Focht y Verstraete
1977; Hooper 1990; Owen y Jones, 2001). La formacin de nitrito y de nitrato la
realizan poblaciones de bacterias distintas, sin embargo, los dos estn muy
relacionados de modo que no habra una acumulacin de nitrito (De Boer and
Kowalchuck 2001).
La oxidacin del amonio a nitrito y luego a nitrato son procesos exotrmicos. Debido
a que las bacterias nitrificantes son quimiolitotrofas utilizan la energa derivada de la
nitrificacin para asimilar el CO2 en el paso del amonio a nitrito en donde el oxigeno
molecular se incorpora a la molcula de amonio. Las bacterias que usan estos
compuestos como dadores de electrones utilizan un complejo de citocromos para
bombear al espacio periplsmico protones que usarn luego en la sntesis de ATP. A
partir del CO2 se generarn compuestos orgnicos utilizando la energa acumulada en
el ATP. Hay un primer grupo de bacterias que oxidan el amonaco a nitrito en una
reaccin catalizada por la enzima amonaco monooxigenasa (Ecuacin 1),
posteriormente la hidroxilamina oxidorreductasa oxida la hidroxilamina a nitrito
(Ecuacin 2), por ultimo un grupo de bacterias se encarga de oxidar los nitritos a
nitratos usando la nitrito oxidorreductasa (Ecuacin 3) (Harrison 2003; Maier 2000).
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- NH2OH + H2O (1)
NH2OH + H2O NO2- + 5H+ (2)
NO2- + H2O NO3- + 2H+ (3)
18
La cantidad de energa que obtienen estas bacterias a partir de estos procesos es

bastante baja, de ah que sean especies con crecimiento lento. (Koops and
Pommerening 2001; Atlas y Bartha 2002; Myrold 2002). El paso de nitrito a nitrato
depende tambin del oxigeno el cual se obtiene de una molcula de agua; pero el
oxigeno molecular solo sirve como aceptor de electrones. La oxidacin del nitrito es
un proceso de un paso que produce una pequea cantidad de energa (Atlas y Bartha
2002).
Las bacterias nitrificantes se encuentran en la mayora de los suelos y aguas con pH
de 4.5 a 8.0, teniendo un ptimo desempeo entre 6.6 y 7.8; estas no son activas a un
pH menor de 4.5 (Maier 2000). Las especies nitrificantes son bacterias de los gneros
Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus y Nitrosovibrio que estn
especializadas para convertir amonio a nitrito, y adems de Nitrobacter miembros de
los gneros Nitrospira, Nitrospina y Nitrococcus estn especializadas para convertir
nitrito a nitrato (Head et al., 1993; Bock et al. 1990). La acumulacin de nitrito
inhibe la accin de Nitrosomonas, as que dependen de Nitrobacter para que lo
conviertan en nitrato. A su vez, Nitrobacter depende de Nitrosomonas para generar
nitrito (Utker y Nes 1998). Es posible que cualquier tipo de estrs ambiental afecte
gravemente el proceso de nitrificacin debido a que son relativamente pocos los
gneros bacterianos los que intervienen en l (Bollag y Kurek 1980; Bremner y
McCarty 1993; Teske et al., 1993; De Boer y Kowalchuck 2001).
Las bacterias nitrificantes son comunes en un suelo oxigenado y con agua adecuada,
de manera que generan importantes consecuencias ambientales, la mayora del
amonio que capturan es convertido a nitrato. Casi la totalidad de plantas y
microorganismos pueden tomar tanto amonio como nitrato. Sin embargo, el nitrato
con carga negativa no es retenido por el suelo como se retiene el amonio por su carga
positiva ya que las arcillas y coloides estn cargados negativamente, por esta razn el
nitrato puede ser fcilmente lixiviado o lavado. Es as como se puede perder
nitrgeno de los suelos (Utker y Nes 1998).
19
La disponibilidad de nitrgeno usualmente limita la productividad de las plantas en

ecosistemas terrestres. Los factores que controlan la mineralizacin y la nitrificacin
han sido estudiados porque estos procesos determinan la disponibilidad de nitrgeno
para plantas y la captacin microbial (Montagninp et al., 1989). El resultado de la
nitrificacin es la formacin de iones de nitrato que pueden lixiviarse, readucirse o
perderse en formas gaseosas. Los factores que afectan principalmente la nitrificacin
son la temperatura, humedad, pH, y substratos como NH4-N, 02 y CO2 (Stevenson
1986). Evidencia de que la nitrificacin se inhibe por la descomposicin de los
productos de residuos orgnicos en los suelos, o por excrecin de metabolitos por
parte de plantas o microorganismos aun no se han podido establecer (Montagninp et
al., 1989). En suelos cidos no hay fosfato ni calcio disponible, los cuales son
esenciales para las bacterias nitrificantes (Bundy y Bremner 1973; De Boer y
Kowalchuck 2001).
El suelo inicialmente esta cargado positivamente pero al llevarse a cabo el proceso de
nitrificacin, se realiza una transformacin de iones amonio a nitrito y nitrato y se
provoca un cambio en la carga de la molcula de modo que esta pasa a ser negativa
(Atlas y Bartha 2002). Durante dicho proceso las bacterias nitrificantes se
especializan en obtener energa de la oxidacin del amonio y la utilizacin del CO2
como fuente de carbono para la sntesis de compuestos orgnicos.
El proceso de nitrificacin debe verse como un proceso de movilizacin del nitrgeno
entre diferentes hbitat del suelo. En el suelo el amonio es oxidado por accin de las
bacterias nitrificantes de modo que las plantas pueden asimilarlo en forma de
compuestos orgnicos (Atlas y Bartha 2002), no obstante, la captacin de nitrato y
nitrito puede provocar una perdida por lixiviacin debido a que dichos iones son
fcilmente lavados y dirigidos generalmente a aguas subterrneas (Maier 2000),
perdiendo as, suelo que podra ser utilizado por las plantas para producir biomasa
(Atlas y Bartha 2002).
20
2.2.1.2.REDUCCION DEL NITRATO Y DENITRIFICACION

Una gran cantidad de organismos pueden usar el nitrato producido por el proceso
anteriormente descrito como fuente de nitrgeno. Muchas bacterias pueden usarlo
tambin como aceptor de electrones en la respiracin anaerobia de la materia
orgnica, en un proceso de reduccin del nitrgeno que finaliza con la liberacin a la
atmsfera de N2 o, menos comnmente, de NO o N2O, proceso conocido como
desnitrificacin (Gottschalk 1986, Robertson 1989). La actividad desnitrificante es
controlada por varias condiciones ambientales, como la humedad del suelo,
concentracin de oxgeno, concentracin de NO3-, contenido de carbono, pH y
temperatura (Tiedje, 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry, 1996
Del inicio de estas reacciones se encarga la nitrato reductasa (reaccin 1, ecuacin 4),
una enzima de membrana que incluye molibdeno en su estructura y que se ve inhibida
en presencia de O2 (Atlas y Bartha 2002; Priem et al., 2002). Luego el nitrito es
sometido a un proceso de reduccin por la nitrito reductasa (reaccin 2, ecuacin 4),
donde el producto inicial es xido ntrico seguido por el xido nitroso con la
participacin de la xido ntrico reductasa (reaccin 3, ecuacin 4) y finalmente
nitrgeno gaseoso con la xido nitroso reductasa (reaccin 4, ecuacin 4) (Maier
2000; Atlas y Bartha 2002).
Los sistemas enzimticos asimiladores de nitrato se inactivan en presencia de amonio
o de metabolitos orgnicos nitrogenados reducidos (Atlas y Bartha 2002). Si el
amonio esta presente en el ambiente en exceso, la reduccin asimilatoria del
nitrgeno se podra llegar a interrumpir (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Las
nitrato reductasas asimilatorias (Nas) dependientes de ferredoxina o flavodoxina las
poseen las Cianobacterias, Azotobacter sp., respectivamente y las Nas dependientes
de NADH son Klebsiella oxytoca, Bacillus subtilis, Rhodobacter capsulatus (Atlas y
Bartha 2002; Myrold 2002; Priem et al., 2002).
21
Otras bacterias auttrofas usan el mismo nitrato como fuente de energa, usando la
acumulada en los enlaces N-O, pero sin aprovechar el oxgeno que se libera
(Ecuacin 5). Y as, con el retorno al nitrgeno gas, se cierra el ciclo del nitrgeno.
Las verdaderas bacterias denitrificantes realizan todo este proceso. Sin embargo
muchas bacterias anaerobias facultativas, enterobacterias principalmente poseen
nicamente la nitrato reductasa y slo son capaces de realizar la reaccin (Ecuacin
6).
1
NO3 - NO2 - NO N2O N2 (4)

2NO3- + 5H2 N2 + 4 H2O + 2OH- (5)
NO3- + 2H+ NO2- + H2O (6)
A partir de aqu usan el nitrito como aceptor de electrones, y as al reducirse y

eliminar H2 del medio citoplasmtico favorece una reaccin fermentativa propia de
estas bacterias que transforma acetilfosfato en acetato (o butirilfosfato en butirato),
captando el fosfato inorgnico que libera una molcula de ADP para transformarse en
ATP (Ye et al., 1994; Vitousek et al., 1997; Myrold 2002).
Los microorganismos pueden utilizar el nitrato como aceptor final de electrones
durante la respiracin anaerbica y actuar en la oxidacin de compuestos orgnicos
(Maier 2000). Este proceso se conoce como respiracin de nitrato o reduccin
desasimilatoria de nitrato. Hay dos vas separadas para este procedimiento, uno, es la
reduccin desasimilatoria de nitrato a amonio donde este es el producto final y otro es
la desnitrificacin donde una mezcla de gases se producen, incluyendo la formacin
del N2 y N2O (Maier 2000; Atlas y Bartha 2002). Algunas bacterias anaerobias
facultativas como Alkaligenes sp, Escerichia sp., Nocardia sp. y Vibrio sp. reducen el
nitrato a nitrito en condiciones anxicas, en donde dicho proceso permite el uso de
compuestos orgnicos con una reduccin mayor de energa que la que se obtiene de la
fermentacin (Atlas y Bartha 2002). A partir del nitrato se produce nitrito que bajo la
22
accin de la hidroxilamina puede producir amonio y muy posiblemente nitrgeno

orgnico (Atlas y Bartha 2002; Priem et al., 2002).
La desnitrificacin es un proceso biolgico en el cual el nitrato es reducido a

nitrgeno gaseoso (Zumft 1997), y esto juega un papel importante en el ambiente
global teniendo como rol la reaccin inversa a la fijacin del nitrgeno (Takaya y
Shoun 2000). Por mucho tiempo se pens que la desnitrificacin era una
caracterstica exclusiva de los procariotes pero varios hongos filamentosos han sido
encontrados exponiendo dicha actividad (Shoun et al. 1992). El sistema de hongos
denitrificantes no puede reducir el oxido nitroso (N2O) a nitrgeno gaseoso (N2), y de
esta manera N2O queda como producto final (Shoun y Tanimoto 1991). Esto ha sido
observado debido a que las enzimas involucradas estn localizadas en la mitocondria
respaldando la sntesis de ATP (Kobayashi et al. 1996), actuando como sistemas de
respiracin anaerbica similar a lo ocurrido en bacterianos (Heiss et al. 1989; Myrold
2002).
La ruta manejada por los reductores de nitrato desnitrificadotes como Paracoccus

denitrificans, Thiobacillus denitrificans y diversas Pseudomonadaseas, para convertir
de nitrato a nitrgeno atmosfrico es activada en carencia de oxigeno (Hutchinson
1970; Zumft 1997), principalmente se habla de E. coli, Pseudomonas, Bacillus,
Mycobacterium,
Thermus
thermophilus,
Ralstonia
eutropha,
Paracoccus
denitrificans, Bradyrhizobium japonicum (Tiedje 1994; Nielssen et al. 1996).
2.3.
DETERMINACIN MICROBIOLOGICA DE LA NITRIFICACION Y

DENITRIFICACIN
El nitrgeno disponible es equivalente al nitrgeno mineralizado, que est compuesto

por el nitrato y el nitrito soluble, junto con el nitrgeno amnico capaz de
intercambiarse y el soluble. Usualmente para el estudio de las diferentes formas de
23
nitrgeno se han utilizado metodologas a nivel qumico las cuales exponen datos
acerca de los elementos que mas tarde sern definitivos en el xito de los procesos,
entre ellos est la determinacin de los nitratos mediante el electrodo selectivo para el
in, la determinacin del N amnico extrable, e innumerables tcnicas mas que
dependen de la forma de nitrgeno a estudiar, con las cuales es posible determinar la
cantidad de nitrgeno disponible en el suelo. Las diferentes concentraciones de
nitrgeno fluctan a lo largo de periodos cortos de tiempo y dependen mucho de la
actividad microbiana; como el gas amnico que puede escapar de la muestra por
volatilizacin (Faithfull, 2005). De este modo haciendo un anlisis microbiolgico
con el cual no se tiene en cuenta la cantidad de nitrgeno sino la poblacin
microbiana y su actividad que lo hace capaz de ciclar de modo que pueda llevar al
nitrgeno a sus formas ms oxidadas o a sus formas ms reducidas las cuales sern
utilizadas por las plantas o retornadas a la atmsfera.
Uno de los mtodos ms utilizados para el estudio de la nitrificacin son las curvas de
absorbancia las cuales estn basadas en tcnicas de colorimetra dependiendo de la
forma del nitrgeno objeto de estudio, en donde luego de la incubacin de la muestra
segn el protocolo a seguir, arrojar resultados del porcentaje de nitrgeno existente,
los cuales sern empleados para determinar la actividad microbiana utilizando
clculos matemticos (Cataldo et al., 1975). En otra metodologa para observacin de
la actividad nitrificante y/o denitrificante se utilizan tubos inoculados con suelo y con
las formas de nitrgeno a estudiar, estos son incubados y por medio de reactivos se
verifican los procesos (Loynachan, 1985). Para observar el proceso de
desnitrificacin se emplea la cromatografa, en la cual se analiza el N2O usando un
electrn de nitrgeno marcado el cual funciona como detector, los valores arrojados
se llevan a una tabla de factores de correccin con el fin de cuantificar la reduccin
(Payne 1991). Para la cuantificacin de la poblacin se utiliza la tcnica de recuento
en placa, la cual se fundamenta en la estimacin del nmero de clulas presentes en la
muestra sembrada, por medio de diluciones (Girard, y Rougieux, 1964; Mayea et al.
1982; Tiedje 1994). La siguiente tcnica es el nmero ms probable, la cual es una
24
metodologa eficiente de estimacin de densidades poblacionales especialmente

cuando una evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es factible. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililstica (Cochran 1950; Rowe et al.
1977; Hashimoto et al. 2005).
2.4. TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE

La tcnica del numero mas probable (NMP), es un mtodo eficiente de estimacin de
densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de
clulas individuales no es factible, esta tcnica se basa en la determinacin de
presencia o ausencia (positivo o negativo) en rplicas de diluciones consecutivas de
atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros
ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de
poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio de crecimiento
a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia
de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililstica (Blodgett
2006).
Algunas de las ventajas del NMP son: la capacidad de estimar tamaos poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); provee una
recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados,
determina slo organismos vivos y activos metablicamente, y suele ser ms rpido e
igual de confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en cajas de petri,
entre otros (Blodgett 2006).
25
3.
3.2.
FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Formulacin del problema

Es determinante la concentracin de SO4(NH4)2 o KNO3, la adicin o no de CaCO3 y
el tiempo de incubacin en el crecimiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes
en compost?
3.3.
Justificacin
Para favorecer la concentracin de nitrgeno disponible en el suelo y mejorar el
ciclaje de nutrientes en general se han propuesto tcnicas como la rotacin de
cultivos, uso de labranza conservadora, el manejo integrado de plagas y la aplicacin
de materia orgnica, rutinas que mantengan un mejor equilibrio en la microbiota del
suelo. El compost como bioinsumo con capacidad mejoradora de la estructura del
suelo, aporta a este, nutrientes y flora microbiana, puede llegar a utilizarse, como se
hace en diferentes agroecosistemas, para optimizar y aliviar los desfavorables
resultados de las prcticas regulares, pero debido al desconocimiento de la flora
presente, el control de calidad se realiza nicamente desde el punto de vista qumico
(% N total generalmente). Por lo anterior este proyecto de tesis tuvo como finalidad
estandarizar el tiempo de incubacin, necesidad de CaCO3, y concentracin de
SO4(NH4)2 y KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y
denitrificantes respectivamente usando como matriz compost, para tener una tcnica
en una matriz diferente al suelo que permita mejorar el control de calidad de
bioinsumos agrcolas.
26
4.
4.2.
OBJETIVOS
Objetivo general
Estandarizar el tiempo de incubacin y concentracin de CaCO3, SO4(NH4)2 y KNO3
para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como
matriz compost.
4.3.
Objetivos Especficos
4.3.1. Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias nitrificantes y
denitrificantes provenientes del proceso de compostaje determinando el da de
mayor abundancia.
4.3.2. Determinar la importancia de la adicin de CaCO3 sobre la recuperacin de
biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y denitrificantes provenientes
del proceso de compostaje.
4.3.3. Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias para
estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias nitrificantes y
denitrificantes respectivamente por la tcnica del NMP en compost.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1.Diseo de la Investigacin
La investigacin realizada fue de tipo experimental teniendo como factores de diseo:
requerimiento de CaCO3, concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3, y tiempo de
incubacin. Los niveles del factor de diseo concentracin de sales y requerimiento
de CaCO3 en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes se
presentan en la figura 1.
27
TRATAMIENTOS
Con
CaCO3
Medio
Amonio
1
0.5 g SO4
(NH4)2
3
0.33 g
SO4(NH4)2
Sin
CaCO3
Medio
Nitrato
1
0.5 KNO3
Medio
Amonio
3
2 g KNO3
2
0.5 g
SO4(NH4)2
4
0.33 g
SO4(NH4)2
Medio
Nitrato
2
0.5 KNO3
4
2 g KNO3
Figura 1. Niveles del factor de diseo utilizados para estandarizar la concentracin

de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adicin o no de CaCO3
5.1.1. Poblacin de Estudio y Muestra

El rea de estudio est en las pilas de compostaje del cultivo de flores (Cultivos del
Norte) con siembras de rosas, crisantemo y pompn, ubicado en el municipio de
Tocancip departamento de Cundinamarca a 2.600 msnm con temperatura promedio
de 14 C (IGAC 1996).
5.1.2. Recoleccin de las Muestras

De la pila de compost de 18x1.5x1 m3 proveniente de residuos de flores con 13
semanas de maduracin se colectaron 10 submuestras con el fin de obtener una
muestra compuesta, este procedimiento de repiti cinco veces utilizando tubos PVC
70 cm y 3 de dimetro. Al iniciar cada muestreo la temperatura de la pila fue
registrada y se procedi a tomar las muestras en bolsas ziploc las cuales fueron
almacenadas en nevera a 4C hasta el momento del procesamiento (24 horas). Luego
28
de tener todas las muestras, se rotularon (nombre del propietario, nombre de la finca,
ubicacin geogrfica, nmero de muestra y lote, superficie que representa,
condiciones climticas) (Landon 1984).
5.1.3. Regularidad de la Toma de Muestras

Para la estandarizacin del tiempo de incubacin se recolectaron 11 muestras durante
22 das de modo que se obtuvo una muestra preliminar y 10 muestras prueba. Para la
estandarizacin de la concentracin de sales la recoleccin de cinco muestras se hizo
durante un periodo de 15 das.
5.1.4. Variables de Estudio

La variable dependiente fue la concentracin de bacterias por el NMP/g de muestra
medido en variables independientes de concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3,
requerimiento de CaCO3, y tiempo de incubacin de las muestras.
5.2. METODOS
Para el anlisis de las muestras, a partir de la muestra compuesta se tomaron 10 g
aproximadamente y cada uno de los procesos descritos se realizaron con tres rplicas,
excepto la determinacin del pH.
5.2.1. Determinacin del pH del compost.

Se determin el pH utilizando un potencimetro digital. Se realiz una solucin
acuosa pesando 10 g de compost con 25 ml de agua desmineralizada. Luego esta
mezcla fue agitada por 5 min, y se dejada en reposo 30 min. Nuevamente fue agitada
por 2 min, e instantneamente colocado el electrodo previamente calibrado con la
29
solucin amortiguadora (anexo 1). Luego se esper hasta que arroj un valor exacto
del pH, y este fue el valor correspondiente al pH del compost (Benavides 2004).
5.2.2. Estandarizacin del Tiempo

Para estandarizar el tiempo de incubacin de la tcnica se tom como base la
informacin obtenida de la aplicacin de la tcnica en matriz suelo (tablas 1 y 2). En
esta modificacin se utiliz nicamente el tratamiento 1 (figura 3) para los dos grupos
debido a que en el nico estudio que se ha aplicado NMP para bacterias nitrificantes y
denitrificantes segn Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de
desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y
Laanbroek (1991). Cada muestra compuesta fue sembrada en caldo nitrato (anexo 1)
por triplicado y en caldo amonio (anexo 1) por triplicado y la lectura se realiz a los
12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 das, con el fin de estandarizar el tiempo de incubacin.
Con el anlisis estadstico de los resultados obtenidos se seleccion el da de mayor
produccin de biomasa para todas las muestras.
5.2.3. Estandarizacin de Sales

Para matriz compost, la modificacin con respecto a la tcnica propuesta por Girard y
Rougieux 1964, Verhagen y Laandbroek 1991 y Hashimoto et al., 2005, se centr en
la evaluacin de dos concentraciones de SO4(NH4)2 o KNO3, y en la adicin o no de
CaCO3 sobre la recuperacin de la microbiota nitrificante y denitrificante. Se
probaron dos medios, amonio y nitrato (anexo 1), con diferentes concentraciones de
los mencionados componentes (figura 1) (tablas 1 y 2).
30
Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones
Concentracin de CaCO3
Concentracin de SO4(NH4)2
1 g (Verhagen y Laandbroek 1991) 0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)

0 g (Girard y Rougieux 1964)
0.5 g (Verhagen y Laandbroek 1991)
1 g (Verhagen y Laandbroek 1991)
0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
0.33 g (Girard y Rougieux 1964)
Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes concentraciones
Concentracin de CaCO3
Concentracin de KNO3
0.5 g (Hashimoto et al., 2005)
0.5 g (Hashimoto et al., 2005)
Luego de la estandarizacin del tiempo se recolectaron cinco muestras nuevas que

fueron sembradas en los 4 tratamientos (tabla 1 y 2) y fueron ledos el da de
incubacin que se determin previamente.
5.2.4. Nmero Ms Probable Bacterias Nitrificantes

Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembr 1 ml en 5
tubos con caldo amonio (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos
fueron incubados a 28 oC en durante dos semanas. Se procedi a calcular el valor de
NMP a partir de la determinacin del nmero de tubos positivos, en cada dilucin
para bacterias oxidantes de amonio. Se adicionaron 2 gotas del reactivo Griess (ver
anexo 1) con el fin de realizar la deteccin de nitritos. Los tubos positivos tomaron
coloracin roja despus de 5 minutos. Los datos fueron anotados segn el nmero de
tubos positivos y negativos por dilucin. A los tubos negativos se les adicion polvo
de zinc para detectar la presencia de nitrato en el medio, los tubos positivos tomaron
31
coloracin rojiza naranja, los que no cambiaron fueron tubos negativos a los cuales se
les adicion reactivo de Nessler (anexo 1), y as se confirm la presencia de amonio,
indicativo de que no existi proceso de nitrificacin. Luego se realiz el recuento por
medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), con el ajuste dependiendo de las
diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964; Schmidt y Belser 1982;
Loynachan 1985; Verhagen y Laandbroek 1991; Deni y Penninckx 1999).
5.2.5. Nmero Ms Probable Bacterias Denitrificantes

Se realizaron diluciones seriadas de la muestra hasta 10-3. Luego se sembr 1 ml en 5
tubos con caldo nitrato (anexo 1) para cada una de las diluciones y cada uno de estos
fue incubado a 28 oC en campanas de anaerobiosis durante dos semanas. Se procedi
a calcular el valor de NMP a partir de la determinacin del nmero de tubos
positivos, en cada dilucin para bacterias reductoras de nitrato. Se adicionaron 2
gotas del reactivo Griess (anexo 1) con el fin de realizar la deteccin de nitritos. Los
tubos positivos tomaron coloracin roja despus de 5 minutos. Los datos fueron
anotados segn el nmero de tubos positivos y negativos por dilucin. A los tubos
negativos se les adicion 2 gotas del reactivo de Nessler (anexo 1) para detectar la
presencia de amonio en el medio, los tubos positivos tornaron coloracin amarilla, los
que no viraron fueron tubos negativos y se les adicion polvo de zinc, confirmando
as la presencia de nitratos lo que signific que no hubo desnitrificacin. Luego se
realizar el recuento por medio de las tablas de Cochran (Cochran 1950), y haciendo
el ajuste dependiendo de las diluciones tomadas para leer (Girard y Rougieux 1964;
Hashimoto et al. 2005).
5.2.6. Anlisis de Informacin

Para definir el tiempo adecuado de incubacin se calcularon las medias del resultado
de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias fueron
sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les aplic
32
la prueba de Kruskal-wallis con un de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las hiptesis

planteadas fueron las siguientes:
H0: las medias de la biomasa en los das 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 de incubacin son
iguales
Hi : al menos una de las medias es diferente
1= Biomasa el da 12
2= Biomasa el da 13
3= Biomasa el da 14
H0 = 1 = 2 = 3 = 4 = 5 = 6 = 7
4= Biomasa el da 15
Hi = 1 2 = 3 = 4 = 5 = 6 = 7
5= Biomasa el da 16
6= Biomasa el da 17
7= Biomasa el da 18
Para determinar si la concentracin de SO4(NH4)2 con y sin CaCO3 ejerce diferencia
sobre la biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias
del resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias
fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les
aplic la prueba de Kruskal-wallis con un de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las
hiptesis planteadas fueron las siguientes:
1 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 con CaCO3
2 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 con CaCO3
3 = Biomasa con 0.33 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3
4 = Biomasa con 0.5 g de SO4(NH4)2 sin CaCO3
H0 = 1 = 2 = 3 = 4
Hi = 1 2 = 3 = 4
33
Para determinar si la concentracin de KNO3 con y sin CaCO3 apropiada para la

biomasa de bacterias nitrificantes y denitrificantes, se calcularon las medias del
resultado de NMP arrojado por las muestras colectadas para dicho fin. Las medias
fueron sometidas a la prueba de Shapiro Wilk y al no distribuirse normalmente se les
aplic la prueba de Kruskal-wallis con un de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000). Las
hiptesis planteadas fueron las siguientes:
1 = Biomasa con 2 g de KNO3 con CaCO3
2 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 con CaCO3
H0 = 1 = 2 = 3 = 4
3 = Biomasa con 2 g de KNO3 sin CaCO3
Hi = 1 = 2 3 = 4
4 = Biomasa con 0.5 g de KNO3 sin CaCO3

Cabe resaltar que las desviaciones estndares que se encontraron el los resultados
fueron proporcionales a la estadstica aplicada para la determinacin de biomasa de la
tabla del nmero ms probable.
6.
RESULTADOS
Las muestras de compost provienen del cultivo de flores Cultivos del Norte
maduradas por 13 semanas, a partir de residuos de pompn, papel, un inoculante
microbiano y leche. La adicin de estos ltimos compuestos se hace de acuerdo a la
resolucin nmero 00074 de 2002 del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
en donde se especifica que es posible utilizar las preparaciones apropiadas a base de
vegetales o de microorganismos no patgenos y estn permitidas las sustancias de
origen animal como leche y productos lcteos, respectivamente, para activar el
compost. Teniendo en cuenta la adicin de residuos de pompn es posible denominar
este insumo agrcola tambin como abono foliar de origen natural y preparados
vegetales, el cual tiene como condicin de uso la exclusin de sustancias y/o material
vegetal de especies de uso restringido (Min. Agrcola 2002).
34
6.1. Muestras para estandarizacin del tiempo de incubacin

Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba
de estandarizacin del tiempo de incubacin del NMP en bacterias nitrificantes y
denitrificantes presentaron un promedio de temperatura de 21C con un rango mnimo
de 19C y mximo de 24C y pH entre 7.89 y 8.54 (tabla 3).
35
Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarizacin del tiempo de incubacin del NMP en
bacterias nitrificantes y denitrificantes.
Fecha
montaje de
pila de
Compost
06/03/06
20/03/06
30/06/06
22
8.53
20/03/06
30/06/06
22
8.3
20/03/06
30/06/06
22
8.54
27/03/06
04/07/06
19
8.5
27/03/06
05/07/06
19
7.89
27/03/06
07/07/06
19
7.89
27/03/06
07/07/06
19
8.06
10/04/06
18/07/06
21
7.89
10
10/04/06
18/07/06
21
8.14
11
17/04/06
27/07/06
24
8.2
Muestra
Fecha
recoleccin
Temperatura
(C)
pH
10/06/06
19
8.07
6.2. Muestras para estandarizacin de Sales

Las muestras de compost de flores recolectadas en Cultivos del Norte, para la prueba
de estandarizacin de la concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3 y adicin o no de
CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes presentaron un promedio
de temperatura de 21 C, con un rango mnimo de 19 C y mximo de 24 C y pH
entre 8.08 y 8.24 (tabla 4).
36
Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarizacin de la concentracin de SO4(NH4)2 y

KNO3 y adicin o no de CaCO3 del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes
pH
12/06/06
Fecha de
Recoleccin
11/09/06
19
8.11
19/06/06
18/09/06
23
8.24
19/06/06
18/09/06
23
8.17
26/06/06
20/09/06
20
8.16
26/06/06
20/09/06
20
8.08
Muestra
Fecha Inicio
La importancia que tiene el periodo de incubacin de muestras (Belser 1977) en

general para todos los procesos, y en este caso para los relacionados con el nitrgeno,
fue la razn por la cual se tomaron 11 muestras para la estandarizacin del tiempo, y
cinco para la estandarizacin de las sales, ya que con el seguimiento realizado durante
siete das fue posible reconocer la fluctuacin de los valores de NMP/g. De otro modo
al analizar los resultados obtenidos se demostr que cinco muestras fueron suficientes
para lograr resultados estadsticamente significativos para una estandarizacin.
Gephart (2006) observ que en un compost con 60 das de maduracin, hay 320 mg
NH4/kg de nitrgeno y 240 mg de nitrato/kg de nitrgeno.
Se tom compost de 13 semanas de madurez, debido a que es suficientemente estable
por baja emisin de CO2 y alta mineralizacin (Costa et al. 1991) de modo que pueda
ser usado con propsitos agrcolas sin ningn riesgo para la cosecha.
El promedio de la temperatura del compost muestreado fue mayor al promedio de la
del ambiente (14), debido posiblemente a la fase de maduracin en la que se
encuentra el proceso, la cual implica una disminucin en la temperatura (Labrador
1996). Zibilske 2005, indica que a los 100 das del proceso, la materia orgnica
restante es degradada lentamente, por lo cual la baja actividad microbiana genera
menos calor del que se pierde en el sistema, por lo tanto el material se enfra. El pH
final del proceso se acerc a la neutralidad, producto de la actividad y procesos
metablicos que afectaban fuertemente el pH de los materiales (Costa et al. 1991).
37
Aunque el uso del compostaje con desechos vegetales como biofertilizante ha

incrementado en estos aos, es insuficiente lo que se conoce acerca de los
microorganismos responsables de las transformaciones de nitrgeno ocurridas en
este. El departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2006) ha hecho
algunas revisiones con respecto al compost y microorganismos como Azospirillum sp,
Bacillus sp, Azospirillum brasilense, fijadores de nitrgeno, bacterias sulfato
reductoras, microflora de compost urbano, entre otros.
El compost provee productos estables con alta cantidad de nutrientes y de fcil acceso
para las plantas, como el amonio, que durante la rpida hidrlisis de la urea y la
deaminacin de pptidos no incorporados es transformado a NH3+, compuesto
nitrogenado mas disponible en compost. Al no ser esta la forma de nitrgeno ms
usada por las plantas, las bacterias amonio-oxidadoras quimiolittrofas lo utilizan
como sustrato para la nitrificacin (Fauci et al., 1999).
En el compost, la nitrificacin puede llevar a la lixiviacin del nitrato que
acompaado de una desnitrificacin incompleta da como resultado una prdida de
nitrgeno del sistema por la produccin de oxido nitroso (Bauhus y Melwes 1991;
Paul et al., 1993). La nitrificacin es un proceso muy importante para el material
compostado, debido a que si no se presenta, el nitrgeno puede perderse por
volatilizacin del amonio, evitando as la acidificacin del sustrato (Eghball y Power
1994; Hom et al., 1994).
Segn Invar et al, 1993, la nitrificacin se cualific como un proceso normal en el
compostaje que depende totalmente de las condiciones y sustratos usados en el
compost. En la fase de maduracin de los sistemas de compostaje, siempre se hallan
micro sitios anaerbicos, los cuales contienen muchos microorganismos anaerobios
facultativos encargados de mas de la mitad del proceso de descomposicin,
obteniendo como resultado productos usualmente reducidos a compuestos como
amonio y sulfuro que son acumulados durante el compostaje (Zibilske 2005).
38
6.3. Estandarizacin del tiempo de Incubacin

Se decidi estandarizar el tiempo para bacterias nitrificantes y denitrificantes con el
T1 (0.5 g de SO4(NH4)2 con 1 g de CaCO3 y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3
respectivamente), debido a que en el nico estudio que se ha aplicado NMP para
bacterias nitrificantes segn Kowalchuk et al., (1999) fue en compost procedente de
desechos animales en donde utilizaron las concentraciones usadas por Verhagen y
Laanbroek (1991).
Con el fin de establecer el mejor da para hacer la lectura despus de la incubacin,
obteniendo mayor biomasa en caldo amonio, se calcularon las medias (tabla 5) para
cada una de las muestras registrando el mayor crecimiento el da 15 (figura 3). Dichos
datos no se distribuyeron normalmente segn el test de Shapiro Wilk (anexo 2 tabla
11), por tanto se aplic la prueba de Kruskal-Wallis con un =0.05, (anexo 2 tabla
12) obteniendo un p 0.00001, con lo que se demostr que no existen diferencias
significativas entre los das 14,15 y 16 pero el mayor ndice de crecimiento fue del
da 15, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo
menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 12).
() bacterias nitrificantes (NMP/g)
150
100
50
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
Tiempo de Incubacin (Das)
Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviacin
estndar
39
Tabla 5. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del NMP de bacterias nitrificantes
para estandarizacin del tiempo
Variable
Media
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
33
33
33
33
33
33
33
13.436
27.394
102.52
115.88
98.394
33.000
13.500
Desviacin
estndar
2.8877
12.949
31.912
25.134
30.254
18.635
5.2817
Aunque no se presentaron diferencias significativas entre la concentracin de

bacterias de los das 14, 15 y 16, la concentracin mxima de bacterias nitrificantes se
obtuvo el da 15, con biomasa mayor de 143 NMP/g de compost de la muestra 10 con
(figura 4), mientras que la ms baja fue de 70 NMP/g de compost obtenida de la
muestra 5 (figura 4). Las diferencias que se encontraron entre las muestras se
debieron a la alta variabilidad de la tabla del NMP ya que sus valores oscilan
determinantemente dependiendo del nmero de tubos positivos, sin tener en cuenta la
similitud de los resultados cualitativos arrojados.
160
NMP/g
140
120
100
80
60
40
20
0
1
10
11
Muestra
Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el da 15 de las muestras
recolectadas para la estandarizacin del tiempo de incubacin
40
Segn Neil (1992) al incubar las bacterias nitrificantes siete das, no se observ
presencia a causa de que usan varios senderos aerbicos para reciclar el nitrgeno
orgnico compuesto en nitrato y nitrito. Segn Verhagen y Laanbroek (1991) 15 das
es el tiempo suficiente para que las bacterias amonio-oxidadoras pasen el amonio a
nitrito, en condiciones ptimas, lo que sugiere que se gastara un mes para evidenciar
la presencia de bacterias nitrito oxidadoras, ya que en los ltimos 15 das de
incubacin ocurrira el paso de nitrito a nitrato, si se parte de caldo amonio como
sustrato. Quastel y Scholefield (1951) utilizaron un aparato de perfusin en el suelo,
el cual agregaba cloruro de amonio, y luego tomaban una muestra del suelo
perfundido, y lean la cantidad nitrito o nitrato que se acumulaba en el suelo por
medio de colorimetra, dndose cuenta que la mayor intensidad de color se daba el da
14 y luego se mantena, por tanto la formacin de nitrato a partir de cloruro de
amonio se encontraba del da 14 al 16.
NITRITO
POSITIVO
Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias nitrificantes, a los 15 das de
incubacin
Segn Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995) el color de los tubos persiste
luego de un mes de incubacin a 28C. Con este fenmeno se sugiere que el NO2
41
puede coexistir con el NO3 en el medio amonio del NMP y los reactivos no
diferencian entre NO3 y NO2. Por esto Belser y Schmidt (1978), afirman que el NMP
es un acercamiento tradicional a estudiar la dinmica de poblacin de nitrificantes en
suelo, y por tanto esta tcnica debe leerse cuando se observe la mayor cantidad de
tubos positivos, ya que por razones fisicoqumicas, las poblaciones desaparecen a
menudo con la incubacin.
Por tanto cabe la posibilidad de que pasados 15 das de incubacin con nitrito o
nitrato formado puede suceder desnitrificacin incompleta que podra formar oxido
nitroso (reaccin 7) que se va a perder, por cual los resultados de biomasa del da 16
en adelante resultaron menores, al reaccionar dichos compuestos con el reactivo de
Griess o el polvo de Zinc. Tambin puede que se haya dado el ciclo completo del
nitrgeno en algunos micrositios por presencia de bacterias capaces de reducir en
bajas condiciones de oxigeno, llevando NO3 a N2, (reaccin 8) (Cadrin 1997) o por
ltimo realice una reduccin desasimilatoria que lleve el nitrito o nitrato formado a
amonio nuevamente, razn por la cual los tubos dieron negativos a la reaccin con el
reactivo de Nessler.
4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e 4CO2 + 2N2O + 6 H2O (7)
5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e 5CO2 + 2N2 + 7 H2O (8)
Fue necesario incubar los tubos de bacterias nitrificantes por 15 das, ya que segn
Gmez y Nageswara 1995, y Fleisher et al. 1987, el periodo comprendido entre los
das 7 y 14 se denomina lag, el cual es completamente independiente de la cantidad
de material existente en el suelo y representa el tiempo necesario para que estos
microorganismos alcancen su mxima actividad y crecimiento.
Con el fin de establecer el da de incubacin en que se obtuvo mayor biomasa de
bacterias denitrificantes en caldo nitrato del NMP, se calcularon las medias para cada
una de las muestras (tabla 6) registrando el mayor crecimiento los das 15 y 16 (figura
42
6). Dichos datos no se distribuyeron normalmente segn el test de Shapiro Wilk

(anexo 2 tabla 13) por tanto se aplic la prueba de Kruskal-Wallis con un =0.05,
obteniendo un p 0.00001, (anexo 2 tabla 14) con lo que se demostr nuevamente
que el mayor ndice de crecimiento se evidenci los das 15 y 16, de modo que se
rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las
medianas es diferente (anexo 2, tabla 14).
() bacteria denitrificantes (NMP/g)
40
30
20
10
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
Tiempo de Incubacin (das)
Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con desviacin
estndar
Tabla 6. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del NMP de bacterias
denitrificantes para estandarizacin del tiempo
Variable
Media
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
33
33
33
33
33
33
33
4.6515
9.4576
21.030
31.424
31.424
21.758
11.358
Desviacin
estndar
1.9712
2.5720
6.5693
6.2100
6.2100
7.5168
3.3640
Estos resultados contradicen lo descrito por Belser 1977, quien atribuye buenos
resultados en experimentos con bacterias denitrificantes a las tres semanas utilizadas
43
como tiempo de incubacin, mientras que en el presente estudio se evidenci que

luego del aumento inicial de biomasa seguido de una estabilizacin, el nmero de
individuos disminuye en funcin del tiempo. Es de resaltar que los das con mayor
biomasa presentaron altas desviaciones estndares (anexo 2, tabla 10).
En cuanto a la utilizacin del nitrato como fuente de nitrgeno Samuelsson y
Gustafsson en 1988, describen mayor la acumulacin de oxido nitroso en siembra con
caldo nitrito comparada con el caldo nitrato, posiblemente debido a la toxicidad del
nitrito, ya que Kaspar (1982) enuncia que la reduccin de nitrito a oxido nitroso
puede ser la detoxificacin del proceso.
Por otro lado las bacterias denitrificantes reducen nitrato produciendo coloracin roja
con la adicin del reactivo de Griess (Valerie y Bardin 1995), indicativo del primer
paso de la desnitrificacin (nitrato a nitrito) (figura 5); luego con la adicin del
reactivo de Nessler (Mariorri et al., 1982), la produccin de amonio en el medio
causa tonalidad amarilla (figura 9). La presencia de nitrato en el medio sumado a la
adicin de polvo de zinc, indica ausencia de bacterias denitrificantes o alguna falla en
el proceso evidenciado con viraje del medio a rojo. Si el color rojo no aparece, el
microorganismo ha reducido todo el nitrato y probablemente ha ocurrido
desnitrificacin.
Adicionalmente Samuelsson, 1985, encontr que la desnitrificacin puede llevarse a
cabo en caldo con medio nutritivo a las 12 horas de incubadas las muestras, de modo
que el polvo de zinc pudo haberse inactivado despus del un perodo de
almacenamiento; por lo tanto, algunos de los tubos pudieron haber arrojados falsos
negativos, aunque este factor pudo haber sido controlado con la observacin diaria de
la capacidad de reducir nitrato a nitrito.
44
NITRATO POSITIVO
Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias denitrificantes a los 15 das de
incubacin
AMONIO POSITIVO
Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la incubacin durante 15 das en caldo
nitrato para bacterias denitrificantes
45
Con la lectura del NMP para bacterias denitrificantes se obtuvo una concentracin
mxima de 39 NMP/g de compost, a partir de la muestra 4 (figura 9). Mientras que la
mnima fue 23.3 NMP/g de compost obtenido de la muestra 3 (figura 9).
45
40
Concentracin (NMP/g)
35
30
25
20
15
10
5
0
1
10
11
Nmero de Muestra
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las muestras recolectadas para la
estandarizacin del tiempo de incubacin
Pese a que las muestras tres y cuatro fueron recolectadas el mismo da, reportaron pH
y temperatura similar, y el tiempo y temperatura de incubacin fue la misma, los
resultados obtenidos demuestran una biomasa heterognea. Es posible que tal
diferencia se deba a que las muestras no fueron incubadas en la misma campana de
anaerobiosis y la muestra tres haya albergado microorganismos denitrificantes que
realizan reduccin desasimilatoria de nitrato y nitrito y alguna falencia en el
procedimiento haya permitido una entrada de oxigeno que interfiri enzimticamente
la desnitrificacin ya que inhibi la nitrato, nitrito reductasa (Revsbech 1988) u oxido
nitroso reductasa (Bell y Ferguson 1991). En este caso, con el oxigeno y el nitrato
como aceptores de electrones puede haberse presentado acumulacin de nitrito
(Samuelsson y Gustafsson 1988). No obstante Mckenney et al., 1982 encuentra que
con establecer condiciones anaerbicas se muestra un aumento rpido de NO2
46
seguido de su disminucin gradual. El comportamiento similar es expuesto por NO y

N2O, aunque el aumento inicial de N2O sea menos pronunciado.
Respecto a la enzima nitrato reductasa desasimilatoria Letey et al., 1980 encontraron
que tiene la capacidad de desarrollarse rpidamente, mientras que la enzima xido
nitroso reductasa desasimilatoria se desarrolla lentamente luego del inicio de las
condiciones anxicas.
Es de mencionar que las muestras dos y ocho, las cuales presentaron baja biomasa,
fueron incubadas en la misma campana de anaerobiosis donde se incub la muestra
tres. Del mismo modo se evidenci que la actividad denitrificante no fue nula,
posiblemente gracias a que los mecanismos de inhibicin de las oxido nitroso
reductasa difieren por cada enzima. En algunas especies de denitrificantes estas
funciones dependen de condiciones aerbicas o de la presencia de mecanismos para
protegerse del oxigeno, como el reportado en Azotobacter sp. para proteger la
nitrogenasa (Bell y Ferguson 1991). Los mismos autores concluyeron que la
reduccin del nitrato y la formacin de gas puede observarse en presencia de oxigeno,
pero hay directa evidencia de que la produccin de nitrgeno atmosfrico no es
viable, de modo que el oxigeno sigue siendo considerado como inhibidor de la
desnitrificacin.
6.4. Estandarizacin de Sales
6.4.1. Estandarizacin de la concentracin de SO4(NH4)2 y la adicin o no de

CaCO3 para bacterias nitrificantes
En la estandarizacin de dos concentraciones de SO4(NH4)2 y la adicin o no de
CaCO3 sobre la recuperacin de biomasa, actividad y contribucin del mayor
recuento de bacterias nitrificantes por la tcnica del NMP, se trabajaron
concentraciones en combinacin (tabla 7).
47
Tabla 7. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la

estandarizacin de sales en NMP de bacterias nitrificantes
Desviacin
Concentracin
Adicin de
Amplitud
p
media
Variable
n
estndar
de SO4(NH4)2
CaCO3
T1
T2
T3
T4
15
15
15
15
0.5 g
0.5 g
0.33 g
0.33 g
1g
0g
1g
0g
112.67
5.3333
27.600
2.6667
7.0373
0.9759
2.2297
0.9759
0.4128
0.6034
0.5470
0.6034
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
Con el objeto de puntualizar con que tratamiento se obtena mayor biomasa en caldo
amonio del NMP para bacterias nitrificantes se calcularon las medias para cada una
de las muestras (tabla 7 figura 10) obteniendo el mayor crecimiento para el T1 (tabla
7 figura 10), con 112 NMP/g de compost, mientras que el tratamiento menos eficiente
fue el nmero cuatro (tabla 7 figura 10) con 2.67 NMP/g de compost, con esto se
realiz el test de Shapiro Wilk dando como resultado que los datos no se distribuan
normalmente (tabla 7), por tanto se realiz una prueba de Kruskal-Wallis con un
=0.05, (anexo 2 tabla 15) obteniendo un p 0.00001, con lo que se demostr
nuevamente que el mayor ndice de crecimiento fue el del T1 (tabla 7), de modo que
se rechaza la Ho de igualdad de medianas y se deduce que por lo menos una de las
medianas es diferente (anexo 2, tabla 15).
120
80
40
T1
T2
T3
T4
Tratamiento
Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrificantes con
desviacin estndar
48
Claramente se observa diferencias significativas entre los tratamientos, demostrando

mayor crecimiento el T1 (tabla 7 figura 10) con desviacin estndar 112.67 7.04, y
luego el T3 (tabla 7 figura 10) con 27.60 2.23, estos tratamientos eran los que
tenan en sus medios CaCO3, demostrando la importancia de adicionarlo en un medio
de cultivo para evaluar el crecimiento.
La nitrificacin es un proceso muy dbil, debido a la diversidad de condiciones
qumicas y fsicas que puede inhibirlo como ocurre con la materia orgnica en
exceso, los metales txicos, exceso de NH3, pHs drsticos (<4.5 - >11),
temperaturas extremas (<5C - >65C) o radiacin.(Koops y Moller 1992; Hastings et
al,. 1997; Mendum et al,. 1999). Segn White et al., (1977) un medio de cultivo de
bacterias nitrificantes, as como en el suelo se necesita roca fosfrica, como el
bicarbonato de Sodio o el CaCO3, con el fin de que se de una pobre nitrificacin o
hasta se inhiba.
Los resultados anteriores se deben a cambios de pH en el caldo amonio a causa de la
acidificacin que se da por la nitrificacin, por lo que la presencia de CaCO3 acta
como estabilizador de pH que mantiene el pH neutro en el medio evitando la
inhibicin de las enzimas de las bacterias nitrificantes, como son la Amonio
Monooxigenasa (AMO), la Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO), y la Nitrito
Oxidoreductasa (NOR).
Segn Juliette et al., (1993), la AMO mas que la HAO es comnmente identificada
como la enzima blanco para inhibir la nitrificacin. Es de suma importancia ya que
esta enzima se inhibe a pHs menores de 4.5 y mayores a 11, por esta razn el
CaCO3 jug un papel fundamental en los T1 y T3 (tabla 7), debido a que el segundo
paso de la nitrificacin es el paso de hidroxilamina a nitrito, en el cual se forma el
cido ntrico, el cual, es el mayor causante del descenso de pH en el medio, por lo que
no dejara producir el nitrito necesario en el T2 y T4 (tabla 7), con esto el reactivo de
49
Griess no tenia sustrato con el que reaccionar, y por ende tampoco el polvo de zinc,
por tanto tuvieron tan bajo crecimiento a falta del CaCO3.
Por otra parte la oxidacin del nitrito segn Yuan et al. (2005) debe estar en un rango
de pH de 7.5-8.6, por lo tanto el CaCO3 tom nuevamente importancia al mantener el
pH y evitando que se acidificara en los medios del T1 y T3 (tabla 7), y as llevando el
amonio hasta nitrato. Christianson et al., (1979) y Gmez y Nageswara (1995), dicen
que es posible que bajo condiciones alcalinas del medio, a causa de la no
estabilizacin del pH, la incidencia de estas bacterias resulte aun mayormente
afectada, por las altas concentraciones de amonio libre.
En general, segn Matulewich et al., (1975), los microorganismos nitrificantes de
diferentes ambientes (agua, sedimento, suelo) con un buen buffer que les mantenga el
pH de 7.8 a 8.5, 0.5 g de SO4(NH4)2 y una alta concentracin de oxgeno, son los mas
activos, y obtienen mayor crecimiento.
La concentracin de SO4(NH4)2 a la cual hubo mayor biomasa fue con 0.5 g en el T1
(tabla 7), por encima de los tratamientos dos, tres y cuatro (tabla 7). El segundo
tratamiento en crecimiento de biomasa fue el tres (tabla 7), el cual tenia una
concentracin de 0.33, los dos tenan CaCO3 por lo tanto los otros dos tratamiento no
tuvieron posibilidades de crecer a causa de esto (figura 10).
A mayor concentracin de SO4(NH4)2 no siempre va a ver mayor crecimiento, debido
a que el exceso de los iones de amonio, inhiben la nitrificacin. Segn Quastel y
Scholefield (1951) a una concentracin de 0.01N y con un pH de 7.5-8.0 inhibe un
18% del crecimiento de la poblacin de bacterias nitrificantes, as como con la misma
concentracin y un pH de 9.0-9.5 inhibe el 55%.
En la nitrificacin microbiana el mayor proceso es la oxidacin de amonio a nitrito,
en el cual la hidroxilamina es el nico recurso disponible para la actividad de la
50
AMO, porque la hidroxilamina deriva los electrones a partir de una fuente reductante
con el fin de permitir la amoniooxidacin (Juliette et al., 1993). Segn Juliette et al.,
(1993) y Hyman et al., (1990) la oxidacin del amonio es susceptible a la inhibicin
con efectos directos sobre la AMO, e indirectos sobre la HAO, como es el suplir
electrones a AMO. Al encontrar una mayor cantidad de amonio las bacterias
amoniooxidadoras fueron capaces de producir mayor cantidad de hidroxilamina, as
mismo como se mencion anteriormente HAO supli a AMO de mayor cantidad de
electrones dando como resultado mayor cantidad de nitrito formado en T1 (tabla 5)
frente al tres (tabla5).
El proceso de la nitrificacin en su mayora se presenta por la accin de bacterias
autotrficas, aunque con 0.33 las bacterias heterotrficas, muchas veces hacen parte
este proceso. El resultado es la inhibicin de la nitrificacin por causa de la
produccin de glucosa o compuestos organicos a partir de estas bacterias (Verhagen
et al., 1993). As mismo segn Verhagen y Laanbroek (1991) la ausencia o bajos
rangos de formacin de nitrato se adscrito a la supresin del proceso de nitrificacin
por ms bacterias heterotrofas competitivas. Estas bacterias inmovilizan el nitrgeno
mineral existente, por lo cual el crecimiento de las bacterias en el tratamiento con
0.33 g de SO4(NH4)2 fue menor ya que al haber competencia por el sustrato se
consumi mucho mas rpido el amonio presente. Por lo tanto el T1 (tabla 7) present
mayor crecimiento.
Quastel y Scholefield (1951) indicaron que el clorato de potasio produce una
oxidacin bacterisotatica sobre la nitrito oxidacin, la cual puede ser otra causa en el
crecimiento de las bacterias, ya que el caldo amonio contena cloruro de sodio y
fosfato de potasio en sus componentes pudindose dar esta reaccin e inhibiendo
estas a bacterias, evitando la produccin del nitrito.
Por otra parte, segn Tortoso y Hutchinson (1990), Anderson y Levine (1986) y
Goreau et al., (1980) Nitrosomonas europaea tiene la capacidad de producir NO y
51
N2O proveniente de amonio e hidroxilamina, por lo tanto el nitrgeno se estara

perdiendo sin comenzar un proceso de nitrificacin, y en el caso del T3 sera mas
rpida la perdida al tener menor cantidad de amonio en el medio.
Los tratamientos estuvieron los 15 das en una incubadora en ausencia de luz, algo
que pudo haber afectado el crecimiento, ya que segn White et al., (1977), el efecto
de la luz solar aumenta la nitrificacin paralelo un aumento en el consumo de
oxigeno.
6.4.2. Estandarizacin de la concentracin de KNO3 y la adicin o no de CaCO3

para bacterias denitrificantes
En la estandarizacin de dos concentraciones de KNO3 y la adicin de CaCO3 sobre
la recuperacin de biomasa, actividad y contribucin del mayor recuento de bacterias
denitrificantes por la tcnica del NMP fueron calculadas las medias para cada una de
las muestras (anexo 2 tabla 19) donde se obtuvo que el tratamiento mas eficaz fue el 1
(tabla 8) con 27.5 NMP/g de compost, mientras que le tratamiento menos eficiente
fue el 4 con 3.55 NMP/g de compost. Con esto se realiz el test de Shapiro Wilk
dando como resultado que los datos no se distribuan normalmente (tabla 8), por tanto
se realiz una prueba de Kruskal-wallis con un =0.05, (anexo 2 tabla 16) obteniendo
un p 0.00001, con lo que se demostr nuevamente que el mayor ndice de
crecimiento fue el del T1, de modo que se rechaza la Ho de igualdad de medianas y
se deduce que por lo menos una de las medianas es diferente (anexo 2, tabla 16).
Tabla 8. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk aplicado a tratamientos para la

estandarizacin de sales en NMP de bacterias denitrificantes
Desviacin
Concentracin de
Adicin de
Amplitud
p
Media
Variable
estndar
KNO3
CaCO3
T1
T2
T3
T4
0.5 g
0.5 g
2g
2g
5g
0g
5g
0g
27.533
6.6867
16.400
3.5533
52
3.6814
1.6177
2.9952
1.3389
0.8114
0.8708
0.9132
0.7869
0.0052
0.0347
0.1514
0.0025
() bacterias denitrificantes (NMP/g)
32
24
16
T1
T2
T3
T4
Tratamiento
Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias denitrificantes con
desviacin estndar
Aunque en compost de residuos vegetales no ha sido reportado el uso de la tcnica

del NMP, la enumeracin de las bacterias denitrificantes en suelo por esta tcnica fue
propuesto primero por Halvorson y Ziegler (1933) y fue mejorado por Alexander
(1965) y Focht y Joseph (1973). Weier y Macrae (1992) reportaron la enumeracin de
bacterias denitrificantes de suelo usando el mtodo del NMP. Los tubos del NMP que
resultaron positivos para la desnitrificacin fueron sometidos a la prueba
confirmatoria de Tiedje (1982) antes de que las bacterias denitrificantes fueran
aisladas en cultivos puros.
Blaszczyk (1993), estudiando el efecto de la composicin del medio sobre la
desnitrificacin del nitrato hecha por Paracoccus denitrificans, encuentra que los
mayores aumentos de la biomasa bacterial durante el proceso son evidenciados en el
medio enriquecido con una concentracin de 1.8 g/l KNO3, esto difiere a lo
encontrado en este estudio donde la concentracin mas prxima a la que Blaszczyk
utiliza (T3), (tabla 8, figura 11) arroj menor recuperacin de biomasa, actividad y/o
mayor recuento de bacterias denitrificantes que el T1 (tabla 8, figura 11).
53
En la misma investigacin indican que la dependencia de las bacterias denitrificantes

a la fuente de carbono que en ese caso fue almidn y a la concentracin de nitrato en
el medio, al respecto Mycielski et al., 1985 exponen que la glucosa puede llegar a
hacer la seleccin de las bacterias que son capaces de reducir nitrato a nitrito.
Posiblemente las bacterias denitrificantes provenientes del T1 y T3 (tabla 8)
capturaron el carbono proveniente de la glucosa y de la adicin de CaCO3 de modo
que se sustent la mayor biomasa de bacterias denitrificantes en dichos tratamientos.
Posible ecuacin (ecuacin 9).
C6H12O6+4NO3
6CO2+6H2O+2N2 (9)
Del mismo modo Smith (1982), encontr que con la baja concentracin de glucosa y
nitrato el producto predominante es el nitrito y la produccin de amonio tambin se
evidencia. Igualmente Samuelsson (1985), plantea que cuando Pseudomonas
putrefaciens fue cultivado anaerbicamente con glucosa como fuente de carbono y
nitrato como aceptor de electrones, el consumo de nitrato y la produccin de nitrito
muestran en mismo patrn reportado para Citrobacter sp. El nitrito fue reducido a
amonio tanto como el nitrato se present en el medio. Segn Smith (1982), esta
acumulacin de nitrito puede deberse tanto a la toxicidad que se puede presentar en el
medio al acumularse nitrito como a la inhibicin en el sistema de reduccin de nitrito
por exceso de nitrato. No obstante algunas especies como Pseudomonas aeruginosa
son capaces de reducir nitrato con acumulacin de nitrito en el medio (Samuelsson
1985). Es de aclarar que los niveles de nitrito acumulado dependen de la
concentracin inicial de nitrato en el medio, ya que Blaszczyk et al., (1985), afirma
que en altas concentraciones de NO3 la cantidad de nitrito acumulado podra llegar a
ser casi 1 g de N por litro de medio y que definitivamente la acumulacin de nitrito
durante la reduccin de nitrato depende del equilibrio apropiado y no apropiado de las
fuentes de carbono y nitrgeno.
54
Benavides (2006), menciona que se determin que la acumulacin del nitrito en todos
los aislamientos era ms alta cuando el nitrato era la fuente nica del nitrgeno. Este
estudio sugiere que cuando el amonio existe junto con el nitrato, la reduccin aerobia
del nitrato no produce una alta acumulacin del nitrito.
Son varias las razones por las cuales ocurre acumulacin de nitrito durante la
reduccin de nitrato en cultivos con bacterias denitrificantes: la nitrito reductasa
puede ser inhibida por nitrato, ya que este puede ser utilizado competitivamente como
un aceptor de electrones en la presencia de nitrito (Komada et al., 1969); tambin la
xido ntrico reductasa puede ser inhibida por el nitrato que precede la inhibicin de
la nitrito reductasa por el xido ntrico acumulado (Payne y Riley 1969).
Adicionalmente pueden las reacciones de reduccin de nitrato y nitrito catalizadas por
reductasas apropiadas ser desbalanceadas (Betlach y Tiedje 1981); y la induccin de
nitrito reductasa puede retrasarse respecto a la induccin de nitrato reductasa
(Williams et al., 1978).
Por otra parte, es posible que con la adicin de CaCO3 haya sido posible la regulacin
del pH del medio nitrato de modo que se contribuyera a la recuperacin de bacterias
denitrificantes como se demuestra en los resultados obtenidos (figura 11) ya que
McKeeney, 1985, encontr que en arcilla las condiciones suavemente cidas pueden
llegar a inducir autodescomposicin de cido nitroso (McKeeney et al., 1985) que
podra constituir uno de los principales mecanismos de prdida nitrito (Van Cleemput
et al., 1976). Del mismo modo la descomposicin de HNO2 es el dependiente pH y es
ms significativa con pH menor a 5 (Smith y Chalk 1980).
Para Fauci et al., 1999 la concentracin de nitrato aumenta con la maduracin de las
pilas de compostaje mientras los niveles de amonio disminuyen rpidamente. Debido
a que en la nitrificacin se producen reacciones acidas estas concentraciones elevadas
de nitrato puede explicar el bajo pH de la mayora de las pilas de compostaje, hecho
confirmado por Campbell et al., 1997.
55
Al medio nitrato se le adiciona solucin de oligoelementos que contiene sulfato de

cobre, hecho que pudo haber estimulado la enzima oxido nitroso reductasa
compensando as, la sensibilidad del dicha enzima por el oxigeno (Snyder 1987).
Es importante destacar que es posible que numerosas especies bacterianas puedan
desnitrificar en medios de cultivo pero este hecho no asegura que el organismo sea
capaz de hacer lo mismo en suelo u otro sustrato (Nash y Bollag 1974). Beijerinck et
al., 1970 encontraron que algunos organismos denitrificantes en el suelo, como
Bacillus sp. al ser incubado con nitrato no favoreca el proceso de desnitrificacin.
56
7. CONCLUSIONES
La tcnica del nmero mas probable para bacterias nitrificantes y

denitrificantes en compost, arroj datos importantes, teniendo en cuenta que
era muy poca la informacin de esta tcnica en esta matriz. Se obtuvo un da
ideal para la lectura, en el cual la microbiota tuvo su mximo crecimiento, sin
necesidad de hacer nuevamente un seguimiento para observar los procesos
que se llevan en diferentes tiempos dentro del medio.
Se pudo estandarizar una concentracin de sustrato para cada grupo con la

cual el microorganismo, va a tener un buen crecimiento, y no va a ser inhibido
por exceso del mismo.
Tambin se demostr la importancia del CaCO3 en el medio, como buffer para

mantener el pH debido a que la carencia de este puede disminuir las
reacciones al inhibir la maquinaria enzimtica de cada grupo de bacterias en el
medio por tanto disminuir la biomasa.
Con esto se pudo evidenciar la presencia de bacterias denitrificantes en un

proceso aerbico como es el compostaje, lo cual demuestra la microaerofilia
o anaerobiosis que se produce en ciertas etapas.
Del mismo modo, se evidenci la gran cantidad de bacterias nitrificantes

presentes, lo que es muy bueno para los procesos agrcolas, al ser usado el
compost como un insumo asegura de cierto modo el ciclaje de nitrgeno en el
suelo.
57
8. RECOMENDACIONES
Debido a que las reacciones colorimtricas difieren dependiendo de las

concentraciones de nitrito, nitrato y amonios utilizados como sustratos, se
sugiere no confundir falsos negativos.
As mismo se aconseja la utilizacin de reactivos preparados recientemente

con el fin de que estos no interfieran en las reacciones de las pruebas.
Realizar la conversin dependiendo de la dilucin utilizada para la lectura del

nmero ms probable.
Para la incubacin de bacterias nitrificantes se pueden obtener mejores

resultados si los tubos se incuban en presencia de luz.
Para la incubacin de bacterias denitrificantes se recomienda el uso de

campana de CO2 controlado.
Por ultimo se seala la inutilidad de la realizacin de la tcnica de recuento en

placa para bacterias nitrificantes y denitrificantes debido a la baja sensibilidad
de dicho mtodo con respecto al NMP.
58
BIBLIOGRAFIA
Anderson I. and Levine J. 1986. Relative rates of nitric oxide and nitrous oxide
production by nitrifiers, denitrifiers, and nitrate respirers. Applied and Environmental
Microbiology. (51):938-945.
Aparicio P. y Arrese C. 1996. Fijacin de Nitrgeno. Departamento de Ciencias del
Medio Natural, ETS Ingenieros Agrnomos. Universidad Pblica de Navarra.
Pamplona, Espaa.
Atlas R. 1984. Use of microbial diversity measurements to assess environmental
stress. Current perspectives in microbial ecology. American Society for
Microbiology. Washington D.C., 540-545 pp.
Atlas R. y Bartha R. 2002. Ecologa microbiana y Microbiologa ambiental. Addison
Wesley. Madrid, 677 pp.
Bauhus J. and Melwes K. 1991. Nitrate leaching following organic refuse application
in forests. Mitt Deutschland Boden Kundl Ges. (6):275278.
Beijerinck M. and Minkman D. 1909. Bildung und Verbrauch von Stickstoffoxydul
durch Bakterien. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr. Hyg: Abt. 2 (25):3063.
Bell L. and Ferguson S. 1991. Nitric and nitrous oxide reductases are active under
aerobic conditions in cells of Thiosphaera pantotropha. Biochemical Journal.
(273):423-427
Belser L. 1977. Nitrate reduction to nitrite, a possible source of nitrite for growth of
nitrite-oxidizing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. (34): 403-410.
59
Belser L. and Schmidt E. 1978. Diversity in the Ammonia-Oxidizing Nitrifier

Population of a Soil. Applied and Environmental Microbiology. (36):584-588.
Benavides E. 2004. Laboratorio de Bioqumicas: Manual de prcticas. Universidad de
San Buenaventura. Cartagena, Colombia. 155 pp.
Benavides J. 2005. Bioremediacin. Aplicaciones: desnitrificacin de suelos
mediante el uso de consorcios bacterianos. II Simposio Nacional de Medio Ambiente
y Desarrollo Sostenible. Santa fe de Bogota, Octubre 6 y 7 del 2006. 3 pp.
Betlach M. and Tiedje J. 1981. Kinetic explanation for accumulation of nitrite, nitric
oxide, and nitrous oxide during bacterial denitrification. Applied and Environmental
Microbiology. (42):1074-1084
Blaszczyk M., Galka E. Sakowicz E. and Mycielski R. 1985. Denitrification of high
concentrations of nitrites and nitrates in synthetic medium with different sources of
organic carbon. III. Methanol. Acta Microbiology Pol. (34):195-206.
Blaszczyk M. 1993. Effect of Medium Composition on the Denitrification of Nitrate
by Paracoccus denitrificans. Applied and Environmental Microbiology. (59): 39513953.
Blodgett R. 2006. Most Probable Number from Serial Dilutions. Bacteriological
Analytical Manual. 9 pp.
Bock E., Koops H. and Harms H. 1990. Nitrifying bacteria. En Schlegel, H.G. y
Bowien B. (eds.). Autotropic Bacteria. Springer-Verlag, Berln, 81-96 pp.
60
Bollag J., Orcutt M. and Bollag B. 1970. Denitrification by isolated soil bacteria
under various environmental conditions. Soil Science Society American Procariotic.
(34):875-879.
Bollag J. and Kurek E. 1980. Nitrite and nitrous oxide accumulation during
denitrification in presence of pesticida derivatives. Applied and Environmental
Bremner J. and McCarty G. 1993. Inhibition of nitrification in soil by allelochemicals
derived from plants and plants residues, In J. M. Bollag, and G. Stotzky (ed.), Soil
biochemistry. Maecel Dekker, Inc., New York, N.Y. 181-218 pp.
Bundy L., and Bremner J. 1973. Inhibition of nitrification in soils. Soil Science
Sociedad American Procariots. (37):396-398.
Cadrin F. 1997. Effets du travail du soin, des systmes de culture (Monoculture
etrotatuon) et du niveau de fertilisation azotee sur les missions doxyde Nitreux.
Departament des sciences des ressources naturelles. Universite McGU, Montreal. 78
pp.
Cataldo D., Haroon M., Schrader L. and Youngs V. 1975. Rapid colorimetric
determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Comunications in
soil science and plant analysis. (6): 71-80.
Casanova E. 1991. Introduccin a la ciencia del suelo. Universidad Central de
Venezuela. 1era edicin. Litopar. 160 pp.
Cegarra I. 1994. Compostaje de desechos organicos y criterios de calidad del
Compost. En Memorias del VII Congreso Colombiano de la Ciencia del Suelo El
componente bioorgnico del suelo S.C.C.S. Bucaramanga, Colombia. 22-30 pp.
61
Cochran W. 1950. Estimation of bacterial densities by means of the "most probable

number." Biometrics. (6):105-106.
Costa F., Garca C., Hernndez T. y Polo A. 1991. Residuos Orgnicos Urbanos.
Manejo y utilizacin. Consejo Superior de Investigaciones cientficas (ed). Centro de
edafologa y biologa aplicada del Segura. Murcia, Espaa.
Cristianson C., Hedlin R. and Cho C. 1979. Loss of nitrogen from soil during
nitrifacation of urea. Canada Journal of Soil and Science. (59): 147 - 154.
Dalzell H., Biddlestone A., Gray K. and Thurairajan K. 1987. Soil management:
compost production and use in tropical and subtropical enviroments. FAO Soil Bull.
56 pp.
De Boer W. and Kowalchuk G. 2001. Nitrification in acid soil: Microorganisms and
mechanisms. Soil Biology Biochemistry. (33):853-866.
Degrange V.and Bardin R 1995 Detection and counting of Nitrobacter populations in
soil by PCR. Applied and Environmental Microbiology. (61):20932098.
Deni J. and Penninckx M. 1999. Nitrification and Autotrophic Nitrifying Bacteria in a
Hydrocarbon-Polluted Soil. Applied and Environmental Microbiology. (65):40084013.
Eghball B. and Power J. 1994 Beef cattle feedlot manure management. Journal Soil
Water Conservation. (49):113122.
Faithfull N. 2005. Mtodos de anlisis qumico agrcola. Ed. Acribia. Zaragoza,
Espaa. 292 pp.
62
Fauci M., Bezdicek D., Caldwell D. and Finch R. 1999. End-product Quality and
Agronomic Performance of Compost. Compost Science and Utilization. Vol. 1, No.
2.
Fleisher A., Kening A., Rovira I. and Hagin J. 1987. Model of anmonia volatilization
from calcareus soils. Plant Soil. (103): 205 - 212
Focht D. and Joseph H. 1973. An improved method for the enumeration of
denitrifying bacteria. Soil Science Society American Journal.(37): 698-699.
Focht D. and Verstraete W. 1977. Biochemical ecology of nitrification and
denitrification. Advences in Microbial Ecology. (1):135-214.
Garner H. 1970. Abonos y Fertilizantes. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa. 180 pp.
Girard H y Rougieux R. 1964. Tcnicas de microbiologa agrcola. Editorial Acribia,
Zaragoza, Espaa. 267 pp.
Goldstein J. 1994. Composting Source separated organics. The JG Press, Inc.
Pensylvania. 286 pp.
Gmez Y. y Nageswara L. 1995. Efecto de A. hypogaea (Papilloniaceae) y la
alcalinidad del suelo sobre bacterias asociadas con nitrgeno y ureasa. Universidad de
Venezuela.
Gmez D. 2004. Microbiologa de los abonos fermentados. Seminario Microbiologa
de los abonos orgnicos fermentados. Tunja, Colombia. Octubre 2004. 16 pp.
Goreau T., Kaplan W., Wofsy S., McElroy M., Valois M. and Watson S. 1980.
Production of N02- and N20 by nitrifying bacteria at reduced concentrations of
oxygen. Applied Environmental Microbiology. (40):526-532.
63
Gottschalk G. 1986. Bacterial Metabolism. Springer-Verlag, New York.

Guerrero A. 1990. El suelo, los abonos y la fertilizacin de los cultivos. Ediciones
Mundi-Prensa. Madrid. 206 pp.
Guerrero C., Gomez I., Mataix Solera J., Moral R. Mataix Beneyto J. and Hernndez
M. 2000. Effect of solid waste compost on microbiological and physical properties of
a burnt forest soil in field experiments. Biology and Fertility of soils. (32):410-414
Gutierrez V., Sanchez M., Pineres J. 2005. Designing a monitoring system for the
bio-industrial cluster in western Colombia. Cuad. Adm., dez., vol.18, no.30,193-220
pp.
Halvorson H. and
Ziegler N. 1933. Application of Statistics to Problems in
Bacteriology: III. A Consideration of the Accuracy of Dilution Data Obtained by

Using Several Dilutions. Journal of Bacteriology. 26(6):559567.
Harrison J. 2003. El Ciclo del Nitrgeno: De Microbios y de Hombres. Vol. EAS-2
(4s)
Hashimoto T., Sook W. and Nagaoka K. 2005. A quantitative evaluation and
phylogenetic characterization of oligotrophic denitrifying bacteria harbored in
subsurface upland soil using improved culturability. Biology Fertility Soils. (42):
179185.
Hastings R., Ceccherini M., Micalus N., Saunders J., Bazzicalupo M. and McCarthy
A. 1997. Direct molecular biological analysis of ammonia oxidizing bacteria
population in cultivated soil plots treated with swine manure. FEMS Microbiology
Ecology. (23):4554.
64
Heins B., Frunzke K. and Zumft W. 1989. Formation of the N-N bond from nitric
oxide by a membrane-bound cytochrome be complex of nitrate-respiring
(denitrifying) Pseudomonas stutzeri. Journal Bacteriology. (171): 3288-3297.
Hooper A. 1990. Biochemistry of the nitrifyng lithoautotrophic bactera. En Schlegel,
H.G. y Bowien B. (eds.). Autotropic Bacteria. Springer-Verlag, Berln, 239-265 pp.
Horn H., Wilkie A., Powers W. and Nordsted R. 1994. Components of dairy manure
management systems. Journal Dairy Science. (77):20082030
Hutchinson G. 1970. The biosphere. Scientific American (223):45-53.
Hyman M., Kim C. and Arp D. 1990. Inhibition of Ammonia Monooxygenase in
Nitrosomonas europaea by Carbon Disulfide. Applied and Environmental
Microbiology. (172): 4775-4782.
IGAC. 1996. Diccionario Geogrfico de Colombia. Tercera edicin. Instituto
Geogrfico Agustn Codazzi. Colombia. 2322 pp.
Inbar Y., Hadar Y. and Chen Y. 1993. Recycling of cattle manure: the composting
process and characterization of maturity. Journal Environmental Quality. (22):857
863.
Ingham E., Trofymow R., Ames H., Hunt C., Morley C. and Coleman. 1986. Trophic
interactions and nitrogen cycling in a semi-arid grassland soil. Journal applied
Ecological. 23:579 pp.
Instituto Colombiano Agropecuario. [En lnea] Resolucin No. 00375 de 2004. Por la
cual se dictan las disposiciones sobre Registro y Control de los Bioinsumos y
Extractos Vegetales de uso agrcola en Colombia. (2004: Bogot). Feb. 27, 2004.
Bogot:
Colombia:
ICA,
65
2004.
<http://www.ica.gov.co/Normatividad/normas/Archivos/2004r375.pdf#search=%22bi
oinsumos%40ica.gov.co%22> [Consulta: 27 Jul. 2006].
Jansson S. and Persson J. 1982. Mineralization and inmovilization of soil nitrogen.
(In Stevenson (Ed.), Nitrogen in agricultural soils. American Society of Agronomy,
Madison, Wisconsin. 229-252 pp.
Juliette L., Hyman M. and Arp D. 1993. Inhibition of Ammonia Oxidation in
Nitrosomonas europaea by Sulfur Compounds: Thioethers Are Oxidized to
Sulfoxides by Ammonia Monooxygenase. Applied and Environmental Microbiology.
(59): 3718-3727.
Kaspar H. 1982. Nitrite reduction to nitrous oxide by propionibacteria: detoxication
mechanism. Archives of Microbiology. (133):126-130.
Kobayashi M., Matsuo Y., Tanimoto A., Suzuki S., Maruo F., Shoun H. 1996.
Denitrification, a novel type of respiratory metabolism in fungal mitochondrion.
Journal Biology and Chemestry. (271): 16263-16267.
Komada T., Shimada K. and Mori T. 1969. Studies on anaerobic biphasic growth of a
denitrifying bacterium, Pseudomonas stutzen. Plant Cell Physiology. (88):855-865.
Koops H. and Moller U. 1992. The lithotrophic ammonia-oxidizing bacteria. In:
Balows A, Trper H G, Dworkin M, Harder W, Schleifer K H. , editors; Balows A,
Trper H G, Dworkin M, Harder W, Schleifer K H. , ed The prokaryotes. 2nd ed.
New York, USA. Springer-Verlag; pp. 26252637.
Koops H. and Pommerening R. 2001. Distribution and ecophysiology of the
nitrifying bacteria emphasizing cultured species. FEMS Microbial Ecology. (37): 1-9.
66
Kowalchuk G., Naoumenko Z., Derikx P., Felske A., Stephen J. and Irina A. 1999.
Molecular Analysis of Ammonia-Oxidizing Bacteria of the Subdivision of the Class
Proteobacteria in Compost and Composted Materials. Applied Environmental
Microbiology. (65): 396403.
Labrador J. 1996. La materia orgnica en los agrosistemas. V.A. Impresores S.A.
Madrid. 174 pp.
Landon J. 1984. Booker Tropical Soil Manual. Longman. New York. 450 pp.
Letey J., Hadas A., Valoras N. and Focht D. 1980. Effect of preincubation treatments
on the ratio of N20/N2 evolution. Journal Environmental Quality. (9):232-235.
Loynachan T. 1985. Soil Biology. University Bookstore lowa State. 78 pp.
Madigan M., Martinko J. and Parker J. 2000. Biologa de los Microorganismos.
Editorial Prentice Hall. Madrid, Espaa. 986 pp.
Maier R. 2000. Biogeochemical cycling. In: Maier, R., Pepper, I., Gerba, C.
Environmental Microbiology. Academic Press. San Diego, USA. 585 pp.
Mahimairaja S., Bolan S., Hedley J. and Macgregor N. 1994. Losses and
transformation of nitrogen during composting of poultry manure with different
amendments: an incubation experiment. Bioresource Technology. (47):265273.
Matulewich V., Strom P. and Finstein M. 1975. Length of Incubation for
Enumerating Nitrifying Bacteria Present in Various Environments. Applied and
Environmental Microbiology. (29): 265-268.
Mayea S., Novo R. and Valio A. 1982. Introduccin a la microbiologa del suelo.
Editorial Pueblo y Educacin. La Habana, Cuba. 186 pp.
67
Mckenney D., Shutrleworth K., Vriesacker J. and Findlay W. 1982. Production and
Loss of Nitric Oxide from Denitrification in Anaerobic Brookston Clay. Applied and
Environmental Microbiology. (43): 534-541.
Meja A, Arroyave C, Correa W y Pelez C. 2005. El papel de los enzimas en los
procesos de estabilizacin de residuos orgnicos mediante procesos bioxidativos.
Encuentro Nacional de la Ciencia del Suelo Materia Orgnica y Microorganismos en
la Agricultura Colombiana. Septiembre 22 y 23. Sociedad colombiana de la Ciencia
del Suelo. Medelln, Colombia. 13 pp.
Mendum T., Sockett R. and Hirsch P. 1999. Use of molecular and isotopic techniques
to monitor the response of autotrophic ammonia-oxidizing populations of the beta
subdivision of the class Proteobacteria in arable soils to nitrogen fertilizer. Applied
Environmental Microbiology. (65):41554162.
Montagninp F., Raines B. and Swank W. 1989. Factors Controlling Nitrification in
Soils of Early Successional and Oak/Hickory Forests in the Southern Appalachians.
Forest Ecology and Management, (26):77-94 77.
Mycielski R., Jaworowska D. and Blaszczyk M. 1985. Quantitative selection of
denitrifying bacteria in continuous cultures and requirement for organic carbon. I.
Starch. Acta Microbiology. Pol. (34):67-79.
Myrold D. 2005. Transformations of nitrogen in Sylvia, D., Hartel, P., Fuhrmann, J.
and Zuberer, D. Principles and Applications of Soil Microbiology. Ed. Prentice Hall.
New Jersey, USA. 333-372 pp.
Nash C and Bollag J. 1974. Comparative Denitrification of Selected Microorganisms
in a Culture Medium and in Autoclaved Soil. Applied and Environmental
Microbiology. 27(4): 674-677.
68
Neill W. 1992. Temporal Scaling and the organization ofLimnetic Communities in

Aquatic Ecology: scale, pattern and process, Giller, P.S., Hildrew, A.G., Raffaelli,
D.G. ed. Blackwell Scientific Publications. 189-231 pp.
Nelson S. and Terry R. 1996. The effects of soil physical properties and irrigation
method on denitrification. Soil Science. (161): 242-249.
Nielssen T., Nielsen L. y Revsbech N. 1996. Nitrification and coupled nitrificationdenitrification associated with a soil-manure interface. Soil Science Society of
America Journal (60):1829-1840.
Osorio W. 2005. Funcin de las enmiendas orgnicas en el manejo de la fertilidad del
suelo. Encuentro Nacional de la Ciencia del Suelo Materia Orgnica y
Microorganismos en la Agricultura Colombiana Septiembre 22 y 23. Sociedad
Colombiana de la Ciencia del Suelo. Medelln, Colombia. 9 pp.
Owen A., Jones D. 2001. Competition for amino acids between wheat roots and
rhizosphere microorganisms and the role of amino acids in plant N acquisition. Soil
Biology Biochemistry. (33), 651657.
Paul J., Beanchamp E. and Zhang X. 1993. Nitrous and nitric oxide emissions during
nitrification and denitrification from manure-amended soil in the laboratory. Canada
Journal Soil Science. (73):539553.
Payne W. and Riley P. 1969. Suppression by nitrate of enzymatic reduction of nitric
oxide. Procariotes Society Exp. Biology Medical. (132):258-260.
Payne W. 1991. A review of methods for field measurement of the nitrification.
Forest ecology and management. (44): 5-14.
69
Pla I. 1994. La materia orgnica y la degradacin y erosin de suelos en el trpico.

En: memorias del VII Congreso Colombiano de la Ciencia del Suelo El componente
bioorgnico del suelo. S.C.C.S. Bucaramanga, Colombia. 38-47 pp.
Priem A., Braker G. and Tiedje M. 2002. Diversity of nitrite reductase gene
fragments in forested upland and wetland soils. Applied and Environmental
Prosser J. 1989. Autotophic nitrification in bacteria. Adv. Microbiology Physiology.
(30):125-181.
Pur T., Dinel H., Schnitzer M. and Dumontet S. 1998. Transformations of carbon
and nitrogen during composting of animal manure and shredded paper. Biology and
fertility of soils. (26):173-178.
Quastel J. and Scholefield P. 1951. Biochemistry of Nitrification in Soil. Montreal
General Hospital Research Institute. Montreal, Canada.
Revsbech N., Nielsen L., Christensen P. and Sorensen J. 1988. Combined oxygen and
nitrous oxide microsensor for denitrification studies. Applied and environmental
microbiology. (54):2245-2249.
Robertson G. 1989. Nitrification and denitrification in humid tropical ecosystems:
potential controls on nitrogen retention, In Mineral nutriments in tropical forest and
savannah ecosystems. British Ecological Society Special Publication Number 9.
Blackwell Scientific, Oxford, United Kingdom. 55-69 pp.
Rotthauwe J., Witzel K. and Liesack W. 1997. The ammonia monooxygenase
structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural
70
ammonia-oxidizing populations. Applied Environmental Microbiology. (63):47044712.

Rowe R., Tood R. and Waide J. 1977. Microtechnique for most-probable-number
analysis. Applied and Environmental Microbiology. (33):675-680.
Samuelsson M. 1985. Dissimilatory Nitrate Reduction to Nitrite, Nitrous Oxide, and
Ammonium
by
Pseudomonas
putrefaciens.
Applied
and
Environmental
Microbiology. (50): 812-815.

Samuelsson M. and Gustafsson L. 1988. Heat Production by the Denitrifying
Bacterium Pseudomonas fluorescens and the Dissimilatory Ammonium-Producing
Bacterium Pseudomonas putrefaciens during Anaerobic Growth with Nitrate as the
Electron Acceptor. Applied and Environmental Microbiology. (54): 2220-2225.
Saunders A. 1993. The phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as
determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences. Journal Genetic
Schmidt E., and Belser L. 1982. Nitrifying bacteria, In A. Page (ed.), Methods of soil
analysis, part 2. Chemical and microbiological properties. American Society of
Agronomy, Inc., Crop Science Society of America, Inc., and Soil Science Society of
America, Inc., Madison, Wisconsin. 1027-1042 pp.
Shoun H. and Tanimoto T. 1991. Denitrification by the fungus Fusarium oxysporium
and involvement of cytochrome P-450 in the respiratory nitrite reduction. Journal
Biology and Chemestry. (266):11078-11082.
Shoun H., Kim D., Uchiyama H. and Sugiyama J. 1992. Denitrification by fungi.
FEMS Microbiology Lett. (73): 277-281.
71
Smith C. and Chalk P. 1980. Fixation and loss of nitrogen during transformations of
nitrite in soils. Soil Science Society American Journal. (44):288-291.
Smith M. and Belser. 1982. Dissimilatory reduction of NO2- to NH4' and N20 by a soil
Citrobacter sp. Applied And Environmental Microbiology.(43):854-860.
Smith M., Rice C. and Paul E. 1989. Metabolism of labelled organic nitrogen in soil:
regulation by inorganic nitrogen. Soil Science Society American Journal. (53):768772.
Sokal, R. and Rohlf, J. 2000. Biometry: The principles and practice of statistics in
biological research. 3 edicin. W. H. Freeman. New York. 887 pp.
Stevenson F., 1986. Cycles of Soils Carbon, Nitrogen, Phosphorus, Sulphur,
Macronutrients. Wiley, New York, 380 pp.
Takaya N. and Shoun H. 2000. Nitric oxide reduction, the last step in denitrification
by Fusarium oxysporium, is obligatorily mediated by cytochrome P450nor.
Teske A., Alm E., Regan J., Toze S., Rittmann and Stahl D. 1994. Evolutionary
relationships among ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria. Journal Bacteriology.
(176):6623-6630.
Tiedje J. 1982. Denitrifiers. In Weaver R., Angle J. and Bottomley P. (Eds.), Methods
of soil analysis, Part 2. Microbiological and biochemical properties. Soil Science
Society of America Book Series No. 5, Madison, Wisconsin, 245-267 pp.
Tiedje J. 1988. Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to
ammonium. In: J.B. Zehnder (ed.). Biology of anaerobic microorganisms. Wiley,
New York . 179-244 pp.
72
Tortoso A. and Hutchinson G. 1990. Contributions of Autotrophic and Heterotrophic

Nitrifiers to Soil NO and N20 Emissionst. Applied and Environmental Microbiology.
56: 1799-1805
United States Departament of Agriculture. [On line] Increasing available nutrients
and
lowering
pH
in
WSU
compost.
http://www.usda.gov/wps/portal/!ut/p/_s.7_0_A/7_0_1OB?navid=SEARCH&q=com
post+%2B+N&site=usda&Go_button.x=18&Go_button.y=13 [Consulta: 13 Nov.
2006].
Utker J. and Nes I. 1998. A qualitative evaluation of the published oligonucleotides
specific for the 16S rRNA gene sequences of ammonia-oxidizing bacteria. System
Applied Microbiology. (21):72-88.
Van Cleemput O., Patrick W. and Mcllhenny R. 1976. Nitrite decomposition in
flooded soil under different pH and redox potential conditions. Soil Science Society
American Journal. (40):55-60.
Verhagen M. and Laanbroek J. 1991. Competition for limiting amounts of
ammonium between nitrifying and heterotrophic bacteria in dual energy-limited
chemostats. Applied Environmental Microbiology. 57:32553263.
Verhagen F., Duyts H. and Laanbroek J. 1993. Effects of Grazing by Flagellates on
Competition for Ammonium between Nitrifying and Heterotrophic Bacteria in Soil
Columns. Applied and Environmental Microbiology. 59:2099-2106.
Vermoesen A., Cleemput O. and Hofman G. 1993. Nitrogen loss processes:
Mechanisms and importance. Pedologie XLIII- Ghent, Belgium. (3): 417-433.
73
Vitousek P., Aber D., Howarth R., Likens G., Matson P., Schindler D., Schlessinger
W. and Tilman D. 1997. Human alteration of the global nitrogen cycle: Sources and
consequences. Ecology Applied. (7):737-750.
Watson S., Bock E., Harms H., Koops P. and Hooper B. 1989. Nitrifying bacteria. In
J. T. Staley M., Bryant N., Pfenning and Holt J. (ed.), Bergey's manual of systematic
bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, Md 1808 -1834 pp.
White J., Schewert D., Ondrako J. and Morgan L.1977. Factors Affecting
Nitrification In Situ in a Heated Stream. Applied and Environmental Microbiology.
33: 918-925.
Williams D., Romero J. and Eagon R. 1978. Denitrifying Pseudomonas aeruginosa:
some parameters of growth and active transport. Applied and Environmental
Ye R., Averill B., and Tiedje J. 1994. Denitrification: Production and consumption of
nitric oxide. Applied and Environmental Microbiology. (60):1053-1058.
Yuan F., Ran W., Shen Q. and Wang D. 2005. Characterization of nitrifying bacteria
communities of soils from different ecological regions of China by molecular and
conventional methods. Biology Fertility Soils. (41): 2227.
Zibilske L. 2005. Composting of Organic Wastes in Sylvia, D., Hartel, P., Fuhrmann,
J. and Zuberer, D. Principles and Applications of Soil Microbiology. Ed. Prentice
Hall. New Jersey, USA. 587-605 p.
Zumft W. 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology
Molecular Biology Review. (61): 533-616.
74
ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

1.3. CALDO AMONIO
El agar amonio est compuesto por 0.5 o 0.33 g de sulfato de amonio, 1 g o sin
carbonato de calcio, 1 g de fosfato de potasio, 0.3 g de sulfato de magnesio, 0.3 g de
cloruro de sodio, 0.03 g de sulfato ferroso, 18 g de agar-agar en caso de requerir
medio slido y 950 ml de agua destilada (Girard y Rougieux 1964; Verhagen and
Laandbroek 1991).
1.4. CALDO NITRATO
El agar nitrato est compuesto por 2 o 0.5 g de nitrato de potasio, 5 g o sin carbonato
de calcio, 10 g de glucosa, 50 ml de solucin salina standard, 1 ml de oligoelementos,
18 g de agar-agar en caso de requerir medio slido y 950 ml de agua destilada (Girard
y Rougieux 1964; Verhagen and Laandbroek 1991; Hashimoto et al. 2005).
1.3. REACTIVO DE NESSLER
Para la deteccin de amonio se preparar el reactivo Nessler en el cual se debe
utilizar: 50 g de Ioduro mercrico, 36.5 g de Ioduro de Potasio. Se le aadir 1 ml de
agua destilada y se tritura. Luego se mezcla 150 g de potasa en pastillas y se completa
con un litro de agua destilada caliente.
75
1.4. REACTIVO DE GRIESS

Para la preparacin del reactivo para deteccin de nitrito se debe utilizar: Solucin de
cido sulfanlico: 0.5 g de cido sulfanlico en 70 ml de agua destilada caliente. Se
dejar enfriar y posteriormente se adicionarn 30 ml de cido actico.
1.5. SOLUCIN AMORTIGUADORA DE pHmetro
Para calibrar el pHmetro a 6.86 se disuelven 3.39 g de Fosfato monopotsico
(KH2PO4) y 3.53 g de Fosfato disdico anhidro (Na2HPO4) en agua destilada y diluya
a un litro. La solucin debe prepararse con agua destilada.
76
ANEXO 2. ANLISIS DE LA INFORMACIN
Tabla 9. Media y desviacin estndar del NMP/g de compost de bacterias nitrificantes, tomado
diariamente para cada una de las muestras.
Muestra
Preliminar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Da 12
Da 13
Da 14
NMP/g
Da 15
Da 16
Da 17
Da 18
8.871.85
16.01.73
16.03.46
16.01.73
15.01.73
13.01.73
15.01.73
9.931.85
14.00.00
12.01.73
12.01.73
18.32.31
26.00.00
29.03.46
28.34.04
23.05.20
18.01.73
28.03.46
22.72.89
24.72.31
58.727.8
24.72.31
13017.3
12017.3
96.342.2
11030.5
70.00.00
11331.1
12526.6
83.323.1
78.013.86
12645.6
76.330.9
13017.3
12017.3
12010.0
12017.3
70.00.00
13311.6
1400.00
1100.00
78.013.86
14323.1
1100.00
13017.3
99.717.9
94.315.5
99.746.4
70.00.00
11823.1
10431.8
94.327.1
78.013.86
94.369.3
99.717.9
21.74.04
16.01.73
30.33.79
63.012.1
32.711.6
63.334.5
36.74.04
24.32.89
18.72.89
33.76.51
22.72.89
6.800.00
9.372.60
14.03.00
19.77.77
10.41.04
21.74.51
18.72.89
12.01.73
9.931.85
14.00.00
12.01.73
Tabla 10. Media y desviacin estndar del NMP/g de compost de bacterias denitrificantes,
tomado diariamente para cada una de las muestras.
Muestra
Preliminar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Da 12
Da 13
Da 14
NMP/g
Da 15
Da 16
Da 17
Da 18
2.671.16
5.871.61
3.331.15
6.570.40
4.000.00
4.701.21
4.931.62
2.671.16
4.701.21
8.401.39
3.331.16
7.601.38
6.800.00
7.601.39
13.72.89
9.270.06
11.72.36
8.301.82
8.401.39
11.11.56
11.11.56
8.533.00
18.03.46
15.01.73
19.06.24
26.310.9
20.35.77
28.011.5
21.72.08
17.00.00
26.06.00
20.05.20
20.05.20
34.03.46
26.00.00
23.32.31
39.00.00
26.70.58
38.03.46
37.03.46
26.00.00
29.00.00
30.74.04
26.00.00
21.674.04
20.36.03
19.77.77
25.311.9
15.01.73
29.39.71
23.78.32
17.07.94
27.710.0
21.34.51
18.32.31
6.800.00
12.01.73
12.01.73
13.01.73
6.031.73
15.01.73
12.71.16
8.434.96
12.71.16
15.01.73
11.30.58
77
34.03.46
26.00.00
23.32.31
39.00.00
26.70.58
38.03.46
37.03.46
26.00.00
29.00.00
30.74.04
26.00.00
Tabla 11. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias nitrificantes para estandarizacin
del tiempo
Variable
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
N
33
33
33
33
33
33
33
Amplitud
0.9022
0.5646
0.9236
0.8868
0.9602
0.7859
0.8896
P
0.0061
0.0000
0.0230
0.0025
0.2616
0.0000
0.0029
Tabla 12. Prueba no paramtrica Kruskal-Wallis aplicada para homogeneidad de grupos a NMP
de bacterias nitrificantes para estandarizacin del tiempo
Numero de
Homogeneidad de
Variable
Rango medianas
muestras
grupos
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
Total
37.1
95.5
177.6
190.9
173.7
101.0
36.2
116.0
33
33
33
33
33
33
33
231
Valor de p
0.0000
C
B
A
A
A
B
C
Tabla 13. Test de Shapiro-Wilk aplicado a NMP de bacterias denitrificantes para

estandarizacin del tiempo
Variable
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
n
33
33
33
33
33
33
33
amplitud
0.8641
0.8689
0.8212
0.8306
0.8306
0.8995
0.8904
78
p
0.0007
0.0009
0.0001
0.0001
0.0001
0.0052
0.0030
Tabla 14. Prueba no paramtrica Kruskal-Wallis aplicada a homogeneidad de grupos a NMP de

bacterias denitrificantes para estandarizacin del tiempo
Variable
Rango
mediana
D12
D13
D14
D15
D16
D17
D18
Total
20.6
59.7
138.2
189.4
189.4
140.0
74.7
116.0
Numero
de
muestras
33
33
33
33
33
33
33
231
Homogeneidad
de Grupos
D
CD
B
A
A
AB
C
Valor de
0.0000
de bacterias nitrificantes para estandarizacin de sales con un 0.05
Variable
T1
T2
T3
T4
Total
Rango
Mediana
53,0
22,2
38,0
8,8
30,5
Numero de
muestra
15
15
15
15
60
Valor P
0.0000
Homogeneidad de
grupos
A
BC
AB
C
de bacterias denitrificantes para estandarizacin de sales 0.05
Variable
T1
T2
T3
T4
Total
Rango
Mediana
52,9
22,0
38,1
9,0
30,5
Numero de
muestra
15
15
15
15
60
Valor-P
0.0000 1
79
Homogeneidad de
grupos
A
BC
AB
C
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA E INDUSTRIAL
Estandarizacin del tiempo de incubacin y concentracin de CaCO3, SO4(NH4)2 y

KNO3 para la prueba del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando
como matriz compost
CICLO DEL NITROGENO
AEROBIOSIS
Remineralizacin
Nitrificacin
N ORG
Reduccin
Hetertrofos
Amonificacin
Desasimilatoria
ifi
ni
tr
de
De
s
ANAEROBIOSIS
ci
n
ca
ci
n
Fij
a
Freshwater Ecology, Dodds 2001, Academic press
NITRIFICACION
1
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- NH2OH + H2O NO23

+ 5H+ H2O NO3- + 2H
1. Amonio Monooxigenasa (AMO)

2. Hidroxilamina Oxidoreductasa (HAO)
3. Nitrito Oxidoreductasa (NOR)
BACTERIAS NITRIFICANTES
Gram negativas
Bacilar, espiral o esfrica
Flagelos
Quimiolittrofas / quimioautotrofas
pH de 4.5 a 8 / T 25-35C
Nitrosomonas, Nitrosospira,
Nitrosococcus, Nitrosolobus
y Nitrosovibrio
Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospina
y Nitrococcus
http://www.procrastin.fr/blog/images/bacterie/Nitrosomonas
(Head et al., 1993; Bock et al. 1990)
Inhibicin: Alta humedad, materia orgnica,

metales pesados, exceso de amonio
http://www.science.oregonstate.edu/bpp/Labs/arpd/Nedivzoomin.jpg
DENITRIFICACION
1
NO3 - NO2 - NO N2O N2

2NO3- + 5H2 N2 + 4 H2O + 2OH-
(1)Nitrato Reductasa (NAR)

(2)Nitrito Reductasa (NIR)
(3)Oxido Ntrico Reductasa (NOR)
(4)Oxido Nitroso reductasa (NOS)
BACTERIAS DENITRIFICANTES
Caractersticas filamentosas
Dependen: Humedad del suelo
[] O2
[] de NO3[] carbono
pH y T
(Tiedje 1988; Vermoesen et al., 1993; Nelson y Terry 1996)
http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/
images/thide.jpg
Alcaligenes sp, Nocardia sp. E. coli, Pseudomonas,

Bacillus, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus
denitrificans, Thiosphaera pantotropha
(Hutchinson 1970; Zumft 1997; Bell y Ferguson)
Inhibidores: amoniaco o metabolitos orgnicos

nitrogenados reducidos, amonio, acidez,
Acetileno, O2
(Revsbech et al., 1988; Maier 2000; Atlas y Bartha 2002)
http://v2.pseudomonas.com/images/
paeruginosa.jpg
Tcnicas Microbiolgicas
Recuento en placa
Cromatografa
http://www.calidadambiental.info/murcia/images/cromatografo.jpg
http://www.isasaleon.com.mx/productos/ovibond/pfx880p.jpg
Colorimetra
Numero Mas Probable (NMP)
NMP Densidad poblacional de un grupo

determinado de microorganismos de forma indirecta
__________________________________________
1933
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
1964 1965
1973
1982
1991 1992
2005
Halvorson y Ziegler Enumeracin de las bacterias denitrificantes en suelo

Girard y Rougieux NMP Describen tcnica bacterias nitrificantes y denitrificantes
Alexander
Focht y Joseph Tcnica en Microplacas
Tiedje Describe la tcnica para Nitrificantes
Verhagen y Laanbroek bacterias nitrificantes quimiolitotrfas y hetertrofas
Weier y Macrae enumeracin de bacterias denitrificantes
Hashimoto et al modificaron NMP de Tiedje
Reactivo de Griess
ll
NH2
HNO2
SO3H
Acido Sulfanlico
SO3H
Acido Nitroso
Acido sulfanlico diazotizado

(sal de diazonio incoloro)
(incolora)
N=N
[C6H5NHN+H3] OSO3H
Agente reductor
Polvo de Zn++
Arilhidrazina (compuesto coloreado)
-Naftilamina
Acoplamiento
(incoloro)
NH2
+ H2O
CH3COOH +
Acido actico
SO3H
NH2
-Sulfobenceno-azo--naftilamina
(colorante azo rojo)

(hidrosoluble)
BIOINSUMO
Inoculantes microbiales
Controlador de plagas
Bioabono
Recurso o producto de origen

biolgico elaborados comercialmente
Nutricin vegetal
MIC
Caractersticas
biolgicas del suelo
COMPOST
nutrimento
flora microbiana
NH4
Formas inorgnicas nitrogenadas
NO3
Mejora calidad del suelo
OBJETIVO GENERAL
Estandarizar el tiempo de incubacin y
concentracin de CaCO3, SO4(NH4)2 y
KNO3 para la prueba del NMP con bacterias
nitrificantes y denitrificantes usando como
matriz compost.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Establecer diferencia entre los valores de NMP para bacterias
nitrificantes y denitrificantes provenientes del proceso de
compostaje determinando el da de mayor abundancia.
Determinar la importancia de la adicin de CaCO3 sobre la
recuperacin de biomasa y actividad de bacterias nitrificantes y
denitrificantes provenientes del proceso de compostaje.
Evaluar dos concentraciones de SO4(NH4)2 y KNO3 necesarias
para estandarizar cual favorece el mayor recuento de bacterias
nitrificantes y denitrificantes respectivamente por la tcnica del
NMP en compost.
DISEO DE LA
INVESTIGACIN
Investigacin experimental
Factores de diseo
Concentracin KNO3
Concentracin de SO4(NH4)2
Tiempo de incubacin
Requerimiento de CaCO3
Niveles del factor de diseo
Concentracin de sales y requerimiento de CaCO3

en los medios de cultivo para bacterias nitrificantes y denitrificantes
TRATAMIENTOS
Con
CaCO3
Medio
Amonio
1
0.5 g SO4
(NH4)2
3
0.33 g
SO4(NH4)2
Sin
CaCO3
Medio
Amonio
Medio
Nitrato
1
0.5 KNO3
3
2 g KNO3
0.5 g
SO4(NH4)2
4
0.33 g
SO4(NH4)2
Medio
Nitrato
2
0.5 KNO3
Figura 1. Niveles del factor de diseo utilizados para estandarizar

la concentracin de SO4(NH4)2 y KNO3 y la adicin o no de CaCO3
4
2 g KNO3
Poblacin de Estudio y Muestra

Compost de 13 semanas a partir de cultivo de
flores
Tocancip (Cundinamarca)
2.600 m.s.n.m.
temperatura promedio de 14 C
(IGAC 1996)
Compost de 13
semanas de
maduracin
10 submuestras
Variable Dependiente
Concentracin de bacterias
por el NMP/g de muestra
Muestra compuesta
Estandarizacin del Estandarizacin

de la concentracin
tiempo de
de sales
incubacin
5 muestras
11 muestras durante
Variables independientes
22 das
15 das
muestra preliminar y
Concentracin de
Requerimiento 10 muestras prueba
de CaCO3
SO4(NH4)2 y KNO3
Tiempo de incubacin
MTODOS
Determinacin del pH del compost
Estandarizacin del Tiempo de Incubacin
Estandarizacin de Sales
Nmero Ms Probable Bacterias Nitrificantes
Nmero Ms Probable Bacterias Denitrificantes
Anlisis de Informacin
Estandarizacin del tiempo de Incubacin

T1
11 muestras
NITRIFICANTES
1 g CaCO3
0.5 g SO4(NH4)2
CALDO AMONIO
DENITRIFICANTES
5 g CaCO3
0.5 g KNO3
CALDO NITRATO
12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 das
Anlisis estadstico de los resultados obtenidos se seleccion el da de mayor produccin

de biomasa para todas las muestras
Kowalchuk et al., 1999
Tabla 2. Medio nitrato con componentes a diferentes concentraciones
Tabla 1. Medio amonio con componentes a diferentes concentraciones
Concentracin de
CaCO3
Concentracin de
SO4(NH4)2
1 g (Verhagen y
Laandbroek 1991)
0.5 g (Verhagen y
Laandbroek 1991)
0.33 g (Girard y
Rougieux 1964)
0 g (Girard y
Rougieux 1964)
0.5 g (Verhagen y
Laandbroek 1991)
0.33 g (Girard y
Rougieux 1964)
5 muestras nuevas
4 tratamientos
Ledos el da de incubacin determinado
Concentracin
de CaCO3
5 g (Verhagen
y Laandbroek
1991)
0 g (Girard y
Rougieux
1964)
Concentracin
de KNO3
0.5 g
(Hashimoto et
al., 2005)
2 g (Girard y
Rougieux
1964)
2 g (Girard y
Rougieux
1964)
0.5 g
(Hashimoto et
al., 2005)
Nmero Ms Probable Bacterias Nitrificantes
10-1
+++++
1 ml
2 gotas de reactivo
de Griess
Caldo amonio
28C
10-2
Rojo
2 semanas
1 ml
Caldo amonio
Incolora
nitritos
10 g + 90 ml
polvo de zinc
10-3
1 ml
+++++
Caldo amonio
Tablas de Cochran 1950
NaranjaRojo
Incolora
2 gotas de
reactivo de
Nessler
Nitrato
Amonio
amarillo
Nmero Ms Probable Bacterias Denitrificantes
10-1
+++++
1 ml
2 gotas de reactivo
de Griess
Caldo nitrato
10-2
Rojo
28C
2 semanas
Anaerobiosis
1 ml
Incolora
nitritos
Caldo nitrato
2 gotas del reactivo

de Nessler
10 g + 90 ml
Amarillo
10-3
1 ml
+++++
Caldo nitrato
Tablas de Cochran 1950
Incolora
Amonio
+
polvo de
zinc
Anlisis de Informacin
Tiempo de incubacin
1. Medias del resultado de NMP
2. Prueba de Shapiro Wilk
3. No distribucin normal
4. Kruskal-wallis con un de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000)
5. Hiptesis:
H0: Las medias de la biomasa en los das 12, 13, 14, 15,
16, 17 y 18 de incubacin son iguales
Hi : Al menos una de las medias es diferente
Concentracin de SO4(NH4)2 / KNO3 con y sin

CaCO3
1.
2.
3.
4.
Medias del resultado de NMP de bacterias

Prueba de Shapiro Wilk
No distribucin normal
Kruskal-wallis con un de 0.05 (Sokal y Rohlf 2000)
5. Hiptesis:
H0 = 1 = 2 = 3 = 4
Hi = 1 2 = 3 = 4
RESULTADOS
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/images/Citrobacter.jpg
Residuos de pompn, papel,

un inoculante microbiano y leche
00074 de 2002 del Ministerio de

Agricultura y Desarrollo Rural
Abono foliar de origen

natural y preparados
vegetales
Caractersticas de las muestras para estandarizacin

del tiempo de Incubacin
8.6
25
8.4
20
8.2
Temperatura C
30
21C
19C / 24C
pH 7.89/ 8.54
10
7.8
7.6
7.4
pH
15
pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Da de Muestreo
Figura 3. pH y temperatura de las muestras recolectadas para la

estandarizacin del tiempo de incubacin del NMP en bacterias
nitrificantes y denitrificantes
T Actividad microbiana
pH Actividad y procesos
metablicos
Caractersticas de las muestras para estandarizacin

de Sales
8.3
25
8.25
20
8.2
Temperatura C
15
8.15
pH
10
T
pH
8.1
5
8.05
8
1
Da de Muestreo
Figura 4. pH y temperatura de las muestras recolectadas para la

estandarizacin de sales del NMP en bacterias nitrificantes y denitrificantes.
21C
19C / 24C
pH 8.08/ 8.24
Estandarizacin del tiempo de Incubacin

T1
0.5 g de SO4(NH4)2
con 1 g de CaCO3
0.5 g de KNO3
con 5 g de CaCO3
Verhagen y Laanbroek (1991)
Kowalchuk et al., (1999)
150
116 NMP/g de compost

14 NMP/g de compost
100
NH4 NO3 15 das

Quastel y Scholefield 1951;
Verhagen y Laanbroek 1991
50
D12
D12
D13
D13
D14
D14
D15
D15
D16
D16
D17
D17
D18
D18
Tiempo de Incubacin (Das)
Tiempo de Incubacin
Figura 5. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con desviacin estndar
C o n c e n t ra c io n ( N M P /g )
143 NMP/g de compost

70 NMP/g de compost
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
10
Numero de Muestra
Figura 6. Registro de las medias del NMP/g de bacterias
nitrificantes el da 15 de las muestras recolectadas para
la estandarizacin del tiempo de incubacin
11
Coexisten NO2 y NO3
Yuan et al. (2005) y Degrange y Bardin (1995)
Leer tcnica tubos positivos

Belser y Schmidt (1978)
NITRITO
POSITIVO
Desnitrificacin completa
Cadrin 1997
7-14 das actividad crecimiento
Gmez y Nageswara 1995; Fleisher et al. 1987
Figura 7. Prueba positiva (roja) en caldo amonio

para bacterias nitrificantes, a los 15 das de incubacin
4CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e 4CO2 + 2N2O + 6 H2O

5CH2O + 4 NO3 + 4H + 5e 5CO2 + 2N2 + 7 H2O
() bacteria denitrificantes (NMP/g)
40
31.42 NMP/g de
compost
30
20
Suelo rido y suelo

humedecido
Smith y Parsons 1985
10
D12
D12
D13
D13
D14
D14
D15
D15
D16
D16
D17
D17
D18
D18
Tiempo de Incubacin (das)
Tiempo de Incubacin
Figura 8. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias

de denitrificantes con desviacin estndar
21 das de incubacin
a 4 diferentes
profundidades de suelo
Belser 1977
12 horas
Incubacin
Sobre incubacin de muestras
Zn
Samuelsson 1985
NITRATO POSITIVO
AMONIO POSITIVO
39 NMP/g de compost
23.3 NMP/g de compost
45
C o n c e n t r a c io n ( N M P /g )
40
Concentraciones de biomasa fueron

heterogneas.
35
30
25
Interrupcin enzimtica
del proceso por O2
20
15
10
Nitrato
Nitrito
Oxido nitroso reductasa
5
0
1
10
11
P. denitrificans mRNA
Numero de Muestra
Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las
muestras recolectadas para la estandarizacin del tiempo de incubacin
Bell y Ferguson 1991
Thiosphaera pantotropha
Azotobacter: Nitrogenasa
Acumulacin de
nitrito
Samuelsson et al., 1988
O2
NO3
P. fluorescens
Estandarizacin de la concentracin de y
SO4(NH4)2, KNO3 la adicin o no de CaCO3
Bacterias Nitrificantes
Bacterias Denitrificantes
120
AMO se inhibe <4.5NH2OHHNO2

NH2OH cede e- a AMO
80
Juliette et al.,1993 y Hyman et al.,1990
40
CaCO3 estabiliza cidos

Luz solar nitrificacin
White et al., 1977
T1
T1
T2
T2
T3
T3
Tratamiento
T4
T4

bacterias nitrificantes con desviacin estndar
Clorato de Potasio Accin Bacteriosttica

Quastel y Scholefield 1951
Bacterias Hetertrofas Glucosa/compuestos orgnicos Inmovilizacin N

Verhagen et al., 1993 y Verhagen y Laanbroek 1991
Nitrosomonas
Nitrosomonas europaea
europaea
NH
NH33yy NH
NH22OHNO
OHNO yy N
N22O
O
(Tortoso
(TortosoyyHutchinson
Hutchinson1990,
1990, Anderson
AndersonyyLevine
Levine1986
1986yyGoreau
Goreauetetal.,
al.,
1980)
1980)
http://www.science.oregonstate.edu/bpp/Labs/arpd/Nedivzoomin.jpg
() bacterias denitrificantes (NMP/g)
32
Paracoccus denitrificans
1.8 g/l KNO3 T2

Blaszczyk 1993

24
Acumulacin de nitrito depende

[] iniciales de NO3
Blaszczyk et al., 1985
16
3.55 NMP/g
de compost
8
T1
T1
T2
T2
T3
T3
Tratamiento
T4
Acumulacin de nitrito
NO3 - NO2 NO N2O N2
T4
Figura 13. Registro de las medias por tratamiento del

NMP/g de bacterias denitrificantes con desviacin estndar
N2 + Inhibidores = incremento y acumulacin de

N2O y NO2
Bollag y Kurek 1980
NH4 y NO3 no acumulacin

Benavides 2006
P. aeruginosa
Samuelsson 1985
Acumulacin de N2O
Stainer et al., 1963
Dependencia de fuente de N y C
C6H12O6 + 4NO3 6CO2+ 6H2O + 2N2
Pseudomonas putrefaciens y Citrobacter sp.

http://v2.pseudomonas.com/images/paeruginosa.jpg
CaCO3
Contribuye a la recuperacin de bacterias
HNO2 mutgeno NOR NO
http://medecinepharmacie.univ-fcomte.fr/bacterio_web/img/phototheque/Examens%20
microscopiques/BGN/Pseudomonas_aeruginosa_Culture.jpg
NMP
Ventajas
Desventajas
Estimar tamaos
poblacionales
selectividad
No realiza identificacin se
especies bacterianas
Recuperacin uniforme
Vivos y activos
metablicamente
Pueden coexistir diferentes

formas inorgnicas del N
Rpido y mas confiable de

confiable
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Nitrate%201.jpg
CONCLUSIONES
Fue posible cuantificar bacterias nitrificantes y denitrificantes

utilizando NMP en una matriz diferente a suelo como es el
compost.
Se logr estandarizar el tiempo de la tcnica en el da 15 basados en

la mayor produccin de la biomasa.
Se obtuvo una concentracin de sustrato optima para cada grupo

con la cual el microorganismo va a tener un buen crecimiento sin
que este sea inhibido por exceso del mismo.
La importancia del CaCO3 en el medio radica en el

mantenimiento del pH, evitando la inhibicin de la Amonio
Monooxigenasa, Hidroxilamina Oxidoreductasa, Nitrato
reductasa y Oxido Ntrico reductasa.
Con esta tcnica se pudo evidenciar la presencia de bacterias

denitrificantes en un proceso aerbico como el compostaje,
lo cual demuestra la microaerofilia o anaerobiosis que se
produce en ciertas etapas.
Se evidenci la gran cantidad de bacterias nitrificantes

presentes, favorable para los procesos agrcolas, al ser usado el
compost como un insumo que asegura de cierto modo el
ciclaje de nitrgeno en el suelo.
RECOMENDACIONES
Debido a que las reacciones colorimtricas difieren

dependiendo de las concentraciones de nitrito, nitrato
y amonios utilizados como sustratos, se sugiere no
confundir falsos negativos.
Se sugiere evaluar la tcnica con medio nitrito para

observar el tiempo de oxidacin de nitrito a nitrato.
As mismo se aconseja la conservacin de los reactivos

en refrigeracin y vigencia mxima de 3 meses.
Estandarizar la tcnica del NMP en lugar con

temperatura ambiente de 28-30C con luz y sin luz
Realizar seguimiento al pH del medio durante los

das de incubacin.
Para la incubacin de bacterias denitrificantes se

recomienda el uso de campana de CO2 controlado.
GRACIAS

Tesis 294

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Tesis 294

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

ESTANDARIZACIN DEL TIEMPO DE INCUBACIN Y

NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO

MICROBIOLOGA AGRCOLA Y VETERINARIA

ESTANDARIZACIN DEL TIEMPO DE INCUBACIN Y

NATALIA CAROLINA RODRGUEZ MORENO

Ruth Bonilla Ph. D.

Amanda Lozano M. Sc.

ESTANDARIZACIN DEL TIEMPO DE INCUBACIN Y

NATALIA CAROLINA RODRIGUEZ MORENO

Director Carrera de Microbiologa

Agrcola y Veterinaria e Industrial

DEDICADO A NUESTROS PADRES, HERMANOS Y AMIGOS POR

A la Pontificia Universidad Javeriana por el prstamo de sus instalaciones y

A la Doctora Mara Mercedes Martnez por la confianza depositada en

A la Doctora Marcela Mercado por sus valiosos aportes.

A nuestros Padres y hermanos por su confianza, paciencia y dedicacin.

A nuestros amigos y compaeros por su apoyo incondicional.

2.1. Bioinsumos agrcolas

2.2. Ciclos biogeoqumicos

2.2.1.2. Reduccin del nitrato y desnitrificacin

2.3. Determinacin microbiolgica de la nitrificacin y desnitrificacin 23

3.1.Formulacin del problema

5.1. Diseo de la Investigacin

5.1.2. Poblacin de Estudio y Muestra

5.1.3. Recoleccin de las Muestras

5.1.4. Regularidad de la Toma de Muestras

5.1.5. Variables de Estudio

5.2.1. Determinacin del pH del compost

5.2.2. Estandarizacin del Tiempo

5.2.3. Estandarizacin de Sales

5.2.4. Nmero Ms Probable Bacterias Nitrificantes

5.2.5. Nmero Ms Probable Bacterias Denitrificantes

6.1. Muestras para estandarizacin del tiempo de incubacin

6.2. Muestras para estandarizacin de sales

6.3. Estandarizacin del tiempo de incubacin

6.4. Estandarizacin de Sales

6.4.1. Estandarizacin de la concentracin de SO4(NH4)2 y la adicin

6.4.2. Estandarizacin de la concentracin de KNO3 y la adicin

Figura 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias

Figura 4. Registro de las medias del NMP/g de bacterias

Figura 5. Prueba positiva (roja) en caldo amonio para bacterias

Figura 6. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de

Figura 7. Prueba negativa (roja) en caldo nitrato para bacterias

Figura 8. Prueba positiva (amarilla) producida luego de la

Figura 9. Registro del NMP/g de bacterias denitrificantes de las

Figura 10. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de

Figura 11. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de

Tabla 1. Medio amonio (anexo 1) con componentes a diferentes

Tabla 2. Medio nitrato (anexo 1) con componentes a diferentes

Tabla 3. Muestras recolectadas para la estandarizacin del tiempo de

Tabla 4. Muestras recolectadas para la estandarizacin de la

Tabla 5. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del

Tabla 6. Estadstica descriptiva. Media y desviacin estndar del

Tabla 7. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk

Tabla 8. Media, desviacin estndar y Test de Shapiro-Wilk

1.1. Caldo amonio

1.2. Caldo nitrato

1.3. Reactivo de Nessler

1.4. Reactivo de Griess

1.5. Solucin amortiguadora de pHmetro

Anexo 2. Anlisis de la informacin

Tabla 9. Media y desviacin estndar del NMP/g de compost de