Cinetica enzimatica

Objetivo:
1. Analizar algunos factores que modifican la velocidad de reaccion catalizada
por la invertasa.
2. Demostrar la relacion lineal entre la velocidad de reaccion y la concentracion
de la enzima presente.
3. Determinar como influye el pH del medio sobre la velocidad de reaccion
enzimatica y su efecto sobre el caracter ionico de la enzima y del sustrato.
4. Demostrar que la temperatura afecta las reacciones enzimaticas.
5. Observar el efecto de la concentracion del sustrato sobre la velocidad de la
reaccion enzimatica.
Hiptesis:
Conocer el comportamiento de la actividad enzimatica de la invertasa siendo
esta afectada o alterada yha sea por el aumento de temperatura, diferentes
pH, concentraciones diferentes tanto de sustratos como de la misma enzima.
Ademas de que se determinara la velocidad de reaccion de los experimentos
realizados e interpretar las graficas.
Resultados:
Efectos de la concentracion de la enzima
Concentrac
ion de
enzima
(g)
Absorbanci
a

0.5

1.5

2.5

0.000

0.014

0.106

0.169

0.242

0.408

Curva estandar de azucares reductores

Concentrac
ion de
azucares
reductores
(mol)
Absorbanci
a

2.5

10

20

30

37.5

0.000

0.220

0.270

0.432

1.181

1.322

1.939

Efectos del sustrato

Concentraci
on de
sacarosa
(mol)
Absorbanci

17.5

42

59.5

87.5

175

350

437.5

0.152

0.195

0.244

0.248

0.325

0.316

0.254

0.187

a
Efectos del pH
Regulador
de pH
Absorbanci
a

5
0

2.5
0.003

3.5
0.015

4.5
0.085

5
0.475

5.5
0.349

Temperatur
a (C)
Absorbanci
a

0
0.037

25
0.101

37
0.280

50
0.330

75
0.206

92
0.098

6.5
.191

7
0.090

Nota: Los resultados se muestran en las graficas que se localizan despues del
anexo.
Anlisis de resultados:
1. En la grafica de velocidad vs temperatura se puede notar que al
incremento de cada 10C se duplica la actividad enzimtica hasta que llega
al punto donde se encuentra la llamada temperatura optima, despus de esa
temperatura la enzima se desnaturaliza porque es una protena. Y es por eso
que la curva disminuye porque pierde su actividad enzimtica.
2. En la grafica de velocidad vs pH se puede notar que la velocidad de
reaccin incrementa considerablemente aunque despus pierde su actividad
enzimtica debido a que el pH afecta las fuerzas ionicas y esta pierde su
actividad enzimtica y aqu se puede ver en que pH es optimo esta enzima.
3. En la grafica de velocidad vs concentracin de substrato no se observa
que la velocidad permanezca constante, pues aunque la concentracin del
substrato la velocidad permanece constante, sin embargo esta disminuye.
En esta grafica se debe de calcular el km para conocer la concentracin
donde se obtiene la mitad de la velocidad mxima.
Lo que se debe realizar en esta prctica se debe de hacer muestras ms
cercanas en cuestin de temperatura, pH, concentracin del substrato, para
que su estudio y anlisis sea ms perceptible. En la grafica se puede observar
que se obtuvo una km de 0.44 esto quiere decir que este valor muestra la
afinidad que tiene la enzima por el sustrato. La velocidad a la cual la enzima
reacciona con el sustrato segn la grafica es de 0.89.
Conclusiones:
En esta prctica se estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas, esta medida siempre se realiza en condiciones ptimas de pH,
temperatura y cofactores. Para tener un buen desarrollo de la actividad

enzimtica, donde se pueden calcular su km y su velocidad max

Bibliografa:
Holum J.R. Practias de quimica general, quimica organica y
bioquimica. Limus Wiley. 1972.
Plummer D. Introduccion a la bioquimica ractica. McGraw-Hill.
1987.
Rendina G. Tecnicas de bioquimica aplicada. Interamericana.
1979.
Wynn C. Estructura y funcion de las enzimas. Omega. Espaa.
1977.
Anexo:

Enzimas termorresistenetes:

La temperatura influye en la actividad enzimatica y al igual que la actividad

enzimatica tiene un pH optimo, tambien hay una temperatura optima. Esto se
debe a que, en el tramo inferior, la velocidad de reaccion aumenta con la
temperatura (rama ascendente) pero a cierto punto la enzima comienza a
desnaturalizarse (rama descendente). El habitat termico de las especies
biologicas tienen relacion con la temperatura optima de sus enzimas. Se han
encontrado enzimas que resisten temperaturas mayores a 100C. Las
enzimas termorresistentes se obtienen de bacterias termofilias que viven a
temperaturas altas. Algunas enzimas termorresistentes aisladas tienen
aplicaciones industriales importantes porque permiten procesos a
temperaturas altas. Por ejemplo, la termolisina obtenida de Bacillus
termoproteoliticus para sintetizar peptidos (el edulcoroante aspartama). Una
-amilasa obtenida de Bacillus stearotermofilus resiste a los 120C y se
utiliza para obtener glucosa apartir de la hidrolisis del almidon. Una glucosa
isomerasa, obtenida de Bacillus coagulans, se utiliza para obtener una
mezcla de glucosa y fructuosa en un proceso de 70C.

Kcat y

Kcat

/Km :

Kcat : La ecuacin de Michaelis-Menten, V = V max [S] / (K M + [S]), se

puede reescribir como
V = Kcat [E] t [S] / ( KM + [S])

donde V max = Kcat [E] t . Kcat incorpora las constantes de velocidad de las
reacciones entre ES y E + P en un proceso enzimtico en varios pasos. Para
una reaccin de dos etapas, Kcat k = 2 . Para las reacciones ms complejas,
Kcat depende de qu pasos en el proceso son limitante de la velocidad.
Kcat da una medida directa de la produccin cataltica de producto en
condiciones ptimas (enzima saturado). Las unidades de Kcat son segundos -1 .
El recproco de Kcat puede ser pensado como el tiempo requerido por una
molcula de enzima para "entregar" una molcula de sustrato.
Alternativamente,Kcat mide el nmero de molculas de sustrato entregado por
molcula de enzima por segundo. Por lo tanto, Kcat se llama a veces el nmero
de recambio. Ejemplos:

Kcat/Km : Esta relacin es a menudo considerado como una medida de la

eficiencia enzimtica. Ya sea un valor grande de Kcat(rpida rotacin) o un
valor pequeo de KM (gran afinidad por el sustrato) hace Kcat/Km grande.
Cuando [S] << KM (solucin diluida), la ecuacin se convierte en:
V ( Kcat/Km) [E] [S]
Se comporta como una constante para la reaccin entre el sustrato y la
enzima libre de velocidad de segundo orden. Esta relacin es importante, ya
que muestra lo que la enzima y el sustrato puede lograr cuando los sitios de
enzimas abundantes estn disponibles, y que permite la comparacin directa
de la eficacia de una enzima hacia diferentes substratos. Cuando una enzima
tiene una opcin de dos sustratos, A o B, presente en la igualdad,
concentraciones diluidas.

Como una constante

de velocidad de segundo
orden, Kcat / Km tiene un valor mximo posible, que es determinado por la
frecuencia con la cual las molculas de enzima y el sustrato pueden
colisionar. Una reaccin que alcanza una velocidad tal se dice que es
"difusin limitada" porque cada encuentro conduce a la reaccin. Si cada
colisin como resultado la formacin de un complejo enzima-sustrato, la
teora de difusin predice que Kcat / Km alcanzarn un valor de alrededor de
10 8 a 10 9 (mol / L) -1 s -1 . Ejemplos:

Medicion de actividades enzimaticas de reacciones

muy rapidas:

Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de interacciones

con el centro activo u otros centros especficos (alostricos). Esta definicin
excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de
desnaturalizacin de la molcula enzimtica. De esta forma, habr dos tipos
de inhibidores:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando
un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad
enzimtica.

Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y

disminuyen su actividad.
La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio
activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reaccin
correspondiente.

Que parametro es mejor para comparar las

actividades enzimaticas?:

La cantidad de sustrato necesario para obtener una determinada velocidad

de reaccin tambin es importante. Este parmetro viene dado por la
constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentracin de

sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad

mxima. Cada enzima tiene un valor de Km caracterstico para un
determinado sustrato, el cual puede decirnos cmo de afn es la unin entre
el sustrato y la enzima. Otra constante til es kcat, que es el nmero de
molculas de sustrato procesadas por cada sitio activo por segundo.
La eficiencia de una enzima puede ser expresada en trminos de kcat/Km, en lo
que se denomina constante de especificidad, que incorpora la constante de
velocidad de todas las fases de la reaccin. Debido a que la constante de
especificidad contempla tanto la afinidad como la capacidad
cataltica, es un parmetro muy til para comparar diferentes
enzimas o la misma enzima con diferentes sustratos. El valor mximo
terico de la constante de especificidad es denominado lmite de difusin
tiene un valor de 108-109 (M-1s-1). Llegados a este punto, cada colisin de la
enzima con su sustrato da lugar a la catlisis, con lo que la velocidad de
formacin de producto no se ve limitada por la velocidad de reaccin, sino
por la velocidad de difusin.