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EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE ISOFLAVONAS SOBRE O METABOLISMO DE RATAS OVARIECTOMIZADAS.

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Prof. Dr. Carlos Alexandre Habitante

Coordenador do Curso de Educação Física UNIDERP Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal. Rua Alexandre Herculano, 1400 Parque dos Poderes. CEP: 79037-

280. Telefone: (067) 3318 3000. Cidade: Campo Grande, MS, Brasil. Endereço para

Correspondência: habitante355@gmail.com

Ana Berenis Blan de Menezes - Acadêmica do curso de nutrição UNIDERP Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal.

Neire Alves de Lima Acadêmica do curso de nutrição UNIDERP Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal

RESUMO Objetivo O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da dieta suplementada com isoflavonas sobre o metabolismo de ratas ovariectomizadas.

Métodos Foram utilizadas 27 ratas adultas, com 3 meses de idade, pesando aproximadamente 200 gramas e foram divididas em 3 grupos: Grupo Controle (GC) - Ratas pseudo-ovariectomizadas que receberam dieta padrão; Grupo Dieta Padrão (GDP) - Ratas ovariectomizadas que receberam dieta padrão; Grupo Dieta Isoflavona (GDI) - Ratas ovariectomizadas que receberam dieta padrão suplementada com Isoflavona de Soja e todos os grupos receberam água “ad libitum”. Os animais foram sacrificados em jejum, por decaptção, colhidos os órgãos, tecidos e soro para dosagens bioquímicas.

Resultados Foram analisados peso dos tecidos adiposos brancos, fígado e rim, a evolução do peso corporal e as concentrações séricas de colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídeos e glicose. Os resultados demonstraram que a administração de isoflavonas em ratas ovariectomizadas reduziu o ganho de peso, o peso dos tecidos adiposos e as concentrações de colesterol e triglicerídeos desencadeadas pela cirurgia, além de aumentar a concentração de HDL colesterol.

Conclusão A administração de isoflavonas em ratas ovariectomizadas reduziu o ganho de peso, o peso dos tecidos adiposos e as concentrações de colesterol e triglicerídeos desencadeadas pela cirurgia, além de aumentar a concentração de HDL colesterol. Há controvérsias quanto a dose ideal de isoflavonas para administração segura. Palavras-chave: Isoflavonas; metabolismo lipídico; glicemia; ratas ovariectomizadas.

Introdução A menopausa é caracterizada pela suspensão irreversível da função ovariana, com o declínio da secreção estrogênica 8 . Apresenta mudanças neuropsicológicas, no perfil lipídico, em particular, aumento das lipoproteínas de baixa densidade (c-LDL) e redução das lipoproteínas de alta densidade (c-HDL) 7.

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Nessa fase, há alterações fisiológicas e clínicas decorrentes do hipoestrogenismo, como: fogachos,

sudoreses, nervosismo, irritabilidade, insônia, cefaléia, vertigem, depressão, labilidade emocional, diminuição da capacidade de memorização, parestesia, formigamento, palpitações, mialgias, altralgias, atrofia urogenital e diminuição da libido 9,11 . As alterações lipídicas são responsáveis pelos eventos cardiovasculares, principalmente, pela doença coronariana, uma das principais causas de morte em

mulheres

A deficiência estrogênica é uma das causas mais comuns de hipercolesterolemia e hiperglicemia (BHATHENA 21 ) em mulheres na pós- menopausa . A terapia de reposição estrogênica diminui o risco de enfermidades cardiovascular por fatores, como melhora no perfil lipídico através da redução dos níveis circulantes de c - LDL, aumento na concentração plasmática de c-HDL e diminuição do colesterol total 8, 18, 19 . Os pesquisadores têm grande interesse na farmacologia e fisiologia das isoflavonas, pois se comportam como estrógenos na maioria dos sistemas biológicos. Em adição à sua atividade anti- estrogênica, funciona como regulador hormonal quando há excesso de estrógenos e possui proprie dades biológicas tais como: antioxidantes, inibidores de atividades enzimáticas como colagenase e elastase 32 . Uma das opções alternativas aos estrógenos tem sido as isoflavonas genericamente conhecidas como fitoestrógenos. Sua molécula tem uma estrutura semelhante ao 17-β-estradiol e é capaz de atuar sobre os receptores estrogênicos simulando algumas das propriedades dos hormônios femininos, incluindo os efeitos protetores cardiovasculares e sobre o perfil lipídico 6,10. Um estudo realizado pela Universidade Federal de São Paulo, com 80 mulheres na menopausa que receberam 100mg/dia de

fitoestrógenos de soja, apresentou significativa diminuição nos níveis de colesterol sangüíneo 16 . Um mecanismo proposto é a atuação sobre os receptores de estrogênios simulando algumas das propriedades dos hormônios femininos. A dieta rica em soja parece também ser benéfica para o sistema cardiovascular, pelo efeito favorável sobre o perfil lipídico 3, 4. Alguns estudos demonstram elevação do HDL em cerca de 10% dos casos 5, 6. Em estudos experimentais, a indução da redução de estrógenos pode ser observada em ratas submetidas a ovariectomia bilateral que constituem um modelo animal para o estudo das alterações pós- menopáusicas como as mudanças do perfil lipídico 6, 10, 12, 20. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos da dieta suplementada com isoflavonas sobre o metabolismo de ratas ovariectomizadas.

na pós- menopausa.

MÉTODOS Foram utilizadas vinte e sete Ratas Wistar adultas, virgens pesando aproximadamente 200±15 gramas e três meses idade no início do experimento, provenientes do Biotério Central da Universidade para o Desenvolvimento do Estado e Região do Pantanal- UNIDERP e mantidos no Biotério da UNIDERP, num regime de luz (12 horas claro e 12 horas escuro) e temperatura controlada (25 2C). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos contendo nove ratas em cada grupo, conforme esquema experimental abaixo descrito:

Grupo Controle (GC) - Ratas pseudo-ovariectomizadas que receberam dieta comercial padrão (nuvilab®) e água “ad libitum”.

Grupo Dieta Padrão (GDP) - Ratas ovariectomizadas que receberam dieta comercial padrão (nuvilab®) e água “ad libitum”

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Grupo Dieta Isoflavona (GDI) - Ratas ovariectomizadas que receberam dieta comercial padrão (nuvilab®) suplementada com Isoflavona de Soja e água “ad libitum”. Os animais dos grupos GDP e GDI foram submetidos à ovariectomia sendo anestesiados via intraperitoneal com solução de cloridrato de xilazina (20 mg/Kg) e ketamina (100mg/Kg). Foram realizadas duas incisões bilaterais paralelas à ultima costela, para a exposição e retirada dos ovários. Na região do corte dos ovários foi realizada cauterização para prevenção de hemorragias. Os animais do grupo controle(GC) foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos dos grupo dieta padrão(GDP) e grupo dieta isoflavonas (GDI) no entanto, não foram retirados os ovários. No pós-operatório, todos os animais receberam a mesma quantidade de água e ração. No Grupo GDI foi acrescentado à dieta padrão isoflavo nas isoladas da soja, na proporção de 1.66 mg/kg/dia durante onze semanas após o procedimento cirúrgico. Os grupos GC e GDP receberam dieta padrão. Durante todo o processo experimental a evolução do peso corporal de todas as ratas foi registrada uma vez por semana, sempre nos mesmos dias e horários. Na décima primeira semana pós-operatóro, os animais foram sacrificados por decapitação, em jejum, entre 10:00 e 12:00 horas da manhã. Imediatamente após a decapitação, foram retirados e pesados os tecidos adiposos brancos parametrial (PAR) e retroperitoneal (RET), fígado e rins. Para a análise das concentrações de metabólitos e hormônios, os animais foram mantidos em jejum das 22:00h às 10:00h. O sangue foi coletado imediatamente após o sacrifício, através de um funil diretamente no tubo de ensaio, foi centrifugado e o soro utilizado para determinação das concentrações de triglicerídeos, colesterol, HDL-colesterol e glicose através de kits colorimétricos enzimáticos (Labtest Diagnóstica S.A®). Os resultados foram expressos como média das variáveis. Para análise estatística foi utilizada a análise de variância de três vias “Anova three way” para a comparação dos efeitos da ovariectomia e do tratamento com isoflavonas. Para a comparação entre as médias dos resultados obtidos foi aplicado o teste de comparações múltiplas de “Duncan”, utilizando como nível de significância (p 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO figura 1 Evolução semanal do peso corporal (g) de ratas controle (GC), ovariectomizadas dieta isoflavona, e (GDI), ovariectomizadas dieta padrão (GDP)

300 290 289 285 284 284 280 278 274 270 270 268 268 260 255
300
290
289
285
284
284
280
278
274
270
270
268
268
260
255
250
245
244
243
243
242
242
241
240
239
238
233
232
230
230
229
229
229
228
228
227
224
221
221
220
217
214
210
200
10ª
11º
GC
GDI
GDP

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Este estudo procurou mimetizar o período feminino conhecido como menopausa, caracterizada principalmente pela redução de estrógenos, que pode, segundo.(Zarrow 12 ) Ser observada em ratas submetidas a ovariectomia bilateral, constituindo modelo animal para o estudo das alterações pós- menopáusicas como as mudanças do perfil lipídico 12. A FIGURA I apresenta os dados relativos à evolução do peso corporal entre os grupos estudados. Podemos observar que não houve diferenças significativas entre o grupo controle (GC) e o grupo ovariectomizado tratado com isoflavonas de soja (GDI), que apresentaram ganho percentual de 7,11% e 6,11%, respectivamente. Por outro lado, o grupo ovariectomizado tratado com dieta padrão (GDP) apresentou um ganho percentual de peso corporal de 19,42%. Após a menopausa, é comum entre mulheres o ganho de peso corporal devido aos efeitos da redução de estrógenos no metabolismo energético. A manutenção do peso corporal resultante da ingestão de isoflavonas demonstra o papel inibitório destas substâncias nas vias lipogênicas, assim como suas atividades semelhantes aos estrógenos 10, 22.

figura 2 - Peso relativo (g/100g de peso corporal) do rim e tecido adiposo retroperitoneal (RET) de ratas controle (GC), ovariectomizadas dieta padrão (GDP) e ovariectomizadas dieta isoflavona (GDI).

+ 1,23 1,40 1,20 0,95 * 1,00 0,83 GC 0,80 GDP 0,60 GDI 0,29 0,29
+ 1,23
1,40
1,20
0,95
*
1,00
0,83
GC
0,80
GDP
0,60
GDI
0,29
0,29
0,28
0,40
0,20
0,00
RIM
RET

+ p≤0.05 comparando - se GC a GDP

*

p≤0.05 comparando - se GDP a GDI

figura 3 - Peso relativo (g/100g de peso corporal) do fígado (FIG) e tecido adiposo parametrial (PAR) de ratas controle (GC), ovariectomizadas dieta padrão (GDP) e ovariectomizadas dieta isoflavona (GDI).

3,00 2,80 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20
3,00
2,80
2,60
2,40
2,20
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
2,97 2,85 2,62 GC 1,99 1,96 GDP GDI 1,42 FIG PAR * + p≤0.05 comparando
2,97
2,85
2,62
GC
1,99
1,96
GDP
GDI
1,42
FIG
PAR
*
+ p≤0.05 comparando - se GC a GDP
p≤0.05 comparando-se GDP a GDI

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Podemos observar nas figuras 2 e 3 que não houve diferenças estatisticamente significantes no peso do fígado e rim em nenhum dos grupos estudados. Tal resultado é importante para a manutenção da homeostase dos animais, uma vez que estes dois tecidos regulam a concentração de um grande número de agentes metabolicamente ativos, como enzimas, hormônios e nutrientes 23, 24. Ainda em relação a figuras 2 nota- se um aumento s ignificante estatisticamente no peso do RET dos animais do GDP em relação aos animais do GC. Estes resultados são compatíveis com a literatura, que demonstra um maior acúmulo de gordura em mulheres a partir da menopausa 25 , investigando a prevalência de obesidade e fatores de risco associados em 1035 indivíduos, na faixa etária entre 20 e 69 anos, residentes em Pelotas, RS, verificaram que esta prevalência aumenta consideravelmente com a idade, sendo cerca de quatro vezes mais elevada após os 40 anos, em relação ao gr upo entre 20 e 29 anos, e duas vezes superior nas mulheres, em relação aos homens, a partir da quarta década de vida. Tal adaptação não foi observada no GDI, onde o valore do tecido adiposo branco retroperitoneal foi igual e o parametrial menor que o GC. Isto sugere uma inibição das vias lipogênicas e da captação de lipídios da dieta por estes tecidos acarretadas pelas isoflavonas, atuando como estrógenos. Neste sentido (VANDER DER SCHOUW, et. al. 27 ), avaliaram a evidência dos benefícios e riscos cardiovasculares associados aos fitoestrógenos que desempenham atividade similar ao estrogênio. Para (MAKELA et. al.,1998 26 ).alguns desses compostos (isoflavonas) são agentes estrogênicos por si, podendo atuar como estrógeno endógeno.

figura 4 - Concentração sérica (mg/dl) de glicose e colesterol total de ratas controle (GC), ovariectomizadas dieta padrão (GDP) e ovariectomizadas dieta isoflavona (GDI).

100 95,64 + 91,28 95 91,61 88,7 90 GC 85 80,14 GDP GDI * 80
100
95,64
+
91,28
95
91,61
88,7
90
GC
85
80,14
GDP
GDI
*
80
75,38
75
70
GLICEMIA
COLESTEROL

+ p≤0.05 comparando - se GC a GDP *p≤0.05 comparando-se GDP a GDI

figura 5 - Concentração sérica (mg/dl) de HDL-Colesterol (HDL) e Triglicerídeos (TG) de ratas controle (GC), ovariectomizadas dieta padrão (GDP) e ovariectomizadas dieta isoflavona (GDI).

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+

87,88 90 85 * 76,65 75,47 80 75 70 GC 59,4 65 GDP * GDI
87,88
90
85
* 76,65
75,47
80
75
70
GC
59,4
65
GDP
*
GDI
60
55
46,38
45,9
50
45
40
HDL
TG

+ p≤0.05 comparando - se GC a GDP *p≤0.05 comparando-se GDP a GDI

Em relação à glicemia, não foram observadas alterações significantes em ne nhum dos grupos estudados, embora nota- se uma tendência à um aumento no GDP em relação ao GC e diminuição do GDI em relação ao GC. Neste sentido, sabe- se que a redução dos estrógenos provoca hiperglicemia no período pós- menopausa 21 . Por outro lado, a ingestão de isoflavonas da soja pode ser uma alternativa na prevenção do diabetes, principalmente o do tipo 2, por sugerir aumento a sensibilidade à insulina 28 . No que diz respeito ao perfil lipídico, foi demonstrado em nosso estudo aumento significante no colesterol total e nos triglicerídeos dos animais GDP em relação ao controle. Segundo a literatura, durante o período pós- menopausa, as mulheres apresentam mudanças neuropsicológicas, no perfil lipídico, em particular, aumento das lipoproteínas de baixa densidade (c-LDL), colesterol e triglicerídeos plasmáticos, além de redução das lipoproteínas de alta densidade (c-HDL) 7, 2 . Este aumento no perfil lipídico não foi observado no grupo suplementado com isoflavonas, demonstrando mais uma vez seu efeito protetor contra dislipidemias. Segundo (WONG, et. al. 7 ), as isoflavonas não só desempenham um papel importante na regulação de lipídios sanguíneos, reduzindo LDL e colesterol e aumentando o HDL, mas também protegem contra o desenvolvimento de placas de ateroma. Os enterócitos e as células hepáticas sintetizam as lipoproteínas de alta densidade (HDL), responsáveis pelo transporte reverso do colesterol. A enzima lecitina colesterol acil-transferase capta o colesterol depositado nos vasos sanguíneos e tecidos periféricos, e a proteína de transferência do éster de colesterol (CEPT) transfere o colesterol da HDL para a LDL para que seja transportado e metabolizado no fígado 29 . Na figura 5, observa- se aumento significante no HDL colesterol do grupo tratado com isoflavonas em relação aos demais animais estudados. Esta é uma importante modificação no metabolismo lipídico, já que esta fração lipídica caracteriza-se como importante doadora de apoproteínas para os quilomícrons e VLDL. Além disso, o HDL retira o colesterol sintetizado nos tecidos periféricos, levando- o de volta para ser excretado no fígado, através de um processo catalisado pela enzima lecitina colesterol acil transferase 30 . Assim, atuando no transporte reverso do colesterol, o HDL exerce efeito protetor contra a aterosclerose, estocando temporariamente lipídios, colesterol e apoproteínas 31. O aumento no HDL colesterol e preservação dos triglicerídeos em função do tratamento com isoflavonas sugere que este pode ser um mecanismo de diminuição do colesterol observado no mesmo grupo. As isoflavonas e seus derivados: daidzeína, genisteína e gliceteína atuam sobre os receptores -

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estrogênios presentes no fígado. Como conseqüência melhora o perfil lipídico, o que favorece o catabolismo de colesterol. A estimulação desses receptores proporciona a inibição da lipase hepática, implicando no metabolismo do colesterol HDL e ocasionando seu incremento 5 . Os resultados deste estudo demonstram que a administração de isoflavonas em ratas ovariectomizadas reduziu o ganho de peso, o peso dos tecidos adiposos e as concentrações de colesterol e triglicerídeos, além de aumentar a concentração de HDL colesterol dos animais.

REFERÊNCIAS

1. Setchell, K.D. Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones. American Journal Clinical of Nutrition, Bethesda, v. 134, n.6, p. 1333s-1343s, 1998. Supplement.

2. Koike K., Ohno S, Takahashi N, Suzuki N, Nozaki, Murakami K, et. al. Efficacy of the herbal medicine Unkeito as an adjunctive to hormone replacement therapy for postmenopausal women wuth depressive symptoms. Clin Neuropharmacol. 2004; 27(4):157-62.

3. Davis S.R.Phytoestrogens therapy for menopausal symptoms? There`s no good evidence that it`s any better than placebo. BMJ 2001; 323:354-5.

4. De Kleijn M. J., van der Schouw YT, Wilson, Grobbee DE, Jacques PF. Dietary intake ofphytoestrogens is associated with a favorable metabolic cardiovascular risk profile in postmenopausal US women: the Framingham study. J Nutr 2002; 132:276-82.

5. Anderson JW, Johnstone BM, Cook, Newell ME. Meta-analysis of soy protein intake on serum lipids. N Engl J Med 1995; 333:276-82.

6. Scheiber M. D.; Rebar R. W. Isoflavones and postmenopausal bone health : a viable alternative to estrogen therapy. Menopause. 1999, 6, 233 - 241.

7. Wong; W. W.; Smith E. O; Stuff J. E. et al. Cholesterol- lowering effect of soy protein in normocholesterolemic and hyper-cholesterolemic men. Am J Clin Nutr (Suppl). 1998, 68, 1385S - 1389S.

8. Dewell, A.; Hollenbeck, C.B.; Bruce, B. The effects of soyderived phytoestrogens on serum lipids and lipoprotiens in moderately hypercholesterolemic post- menopausal women. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, v. 87, 2002 p. 118 - 121.

9. Baracate E.C, Soares Júnior J.M, Hidar M. A, Rodr igues de Lima G. Aspectos Reprodutivos no climatério. In: Fernandes CE, coordenador. Conselho Brasileiro Multidisciplinar de Assistência à Saúde da Mulher Climatérica. São Paulo: SOBRAC; Rio de Janeiro:

FEBRASGO; 2003. P. 251.

10. Potter S. M.; Baum J. A.; Teng H. et al. Soy protein and isoflavones: their effects on blood lipids and bone density in postmenopausal women. Am J Clin Nutr (Suppl). 1998, 68, 1375S -

1379S.

11. Han, K. Soares JM Jr, Haidar M.A, de Lima G.R, Baracat E.C. Benefits of soy isoflavone therapeutic regimen on menopausal. Symptoms.Obstet Gynecol. 2002; 99 (3):389-94.

12. Zarrow,M.X. et al. Experimental Endocrinology - a sourcebook of basic tecniques. New York: Academic Press, p.136-137, 1964.

13. Albertazzi P et al. The ffect of dietary soy supplementation on hot flushes. Obstet. Gynecol, v 91, p. 6-11 1998.

8

14. Brzezinski, A. Adlercreutz H, SHAOUL R. Short-term effects of phytoestrogen-rich on postmenopausal women.J N Am Menopause Soc, v 4,

p. 89-94, 1997.

15. Uomalis D.H et al. Vasomotor symptom relief by soy isoflavone extract tablets in postmenopausal women: a multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled study menopause, v 7, n 4, p. 236-242, 2000.

16. Han, K.K; Kati, L.M.; Haidar, M.A.; Girão, M.J.B.C.;Baracat, E.C.; YIM, D.K.; Carrão- Panizzi,M.C. Efeito de isoflavonas sobre os sintomas da síndrome de climatério. In Simpósio Brasileiro Sobre Os Benefícios da Soja para a Saúde Humana, 1, 2001, Londrina. Anais, Londrina, PR: Embrapa, 2001 p. 28-32.

17. Markiewicz, L. et al. In vitro biossays of non-steroidal phytoestrogens. J. Steroid Biochem. Biol, p.399-405, 1993.

18. Castelli, P. Cardiovascular disease in womwn.Am J Obstet Gynecol. 1998, 158, 1552-60.

19. Yeung, S. C. Shirley; Kung W. C., Annie High dietary intake is associated with higher bone mineral density in posmenopausal but not premenopausal women. J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86, 5217-5221.

20. Matthews, A. R. R. Wing; L.H. Kuller et. al. Influence of the perimenopause on cardiovascular risk factors and symptsoms of middle healthy women. Areh Inter Med. 154. 2349-2355, 1998.

21. Bhathena S.J, Velásquez M.T. Beneficial Role of Dietary Phytoestrogens in Obesity and Diabetes, Am J Clin Nutr 2002; 76(6): 1119-201

22. Vigna, G.B. et al. Plasma lipoproteins in soy-treated postmenopausal women: a double-blind, placebo- controlled trial. Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, v. 10, n. 6, p. 315- 322, 2000.

23. Letteron, P.; Bhahimi-Bourouina, N.;obin, M.A.; Moreau, A.; Feldman, G.; Pessayre, D. Glucocorticoids inhibit mitochondrial matrix acyl-CoA dehydrogenases and fatty acid beta- oxidation. Am J. Physiol., 272 (5pt1): G1141-50, 1997.

24. Gauthier, M.S.; Couturier, K.; Latour, J.G.; Lavoie, J.M. Concurrent exercise prevents high- fat-diet- induced macrovesicular hepatic steatosis. J. Appl. Physiol., 94: 2127-34, 2003.

25. Gigante DP, Barros FC, Cora LA, Olinto MAT. Prevalência de obesidade em adultos e seus fatores de risco. Rev S Públ 1997; 31:236-46.

26. Makela, S. et al. Inhibition of 17 beta-hydroxysteroid oxidoreductase by flavonoids in breast and prostate cancer cells. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,

v. 217, n. 3, p. 310- 316, 1998.

27. Van Der Schouw, Y.T. et al. Phyto-oestrogens and cardiovascular disease risk. Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, v. 10, n. 3, p. 154- 167, 2000.

28. Ashcroft, S. J., Protein phosphorilation and beta-cell function. Diabetologia, Berlin, v.37, p. 215-295, 1994. Suplement 2.

29. Gupta, A.K.; Ross, E.A.; Myers, J.N.; Kashyap, M.L. Increase reverse cholesterol transport in athletes. Metabolism, 42(6): 684-90, 1993.

30. Eisenberg, S.J. High density lipoprotein metabolism. J. Lipid. Res., v.25,

p. 1017-25, 1984.

9

Linscheer, W.G. & Vergroesen, A.J. Lipids. In: Modern Nutrition In Health And Disease. 8ª Ed. Shills, M.E.; Olson, J.A.; Shike, M. Lea and Febiger,

p. 47-88, 1993.

32 SCHRAMM, D.D.;GERMAN, J.B. Potential effects of flavonoids on the etiology of disease. Journal of Nutritional Biochemistry, v.9. n. 10, p. 560 - 566, 1998.