Validao de mtodos com

abordagem em espectrometria
de massas

Heliara Nascimento
Laboratrio ThoMSon
heliara@iqm.unicamp.br

Apresentao
Palestrante
Profa. Heliara Lopes Nascimento

Formada em Farmcia Industrial e Bioqumica , tambm bacharel em Biologia pela

Universidade de So Paulo. Possui mestrado em Qumica Orgnica e PHD em Qumica
Analtica voltada a rea ambiental.
Auditora lder h 15 anos nas normas ISO 9001:2000;TS 16949; ISO 14001 . Experincia de 11
anos em Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IPT) onde atuou no desenvolvimento de
metodologias e novos processos e 20 anos em Indstria (Oxiteno), onde coordenou a
implantao do sistema de qualidade em P&D e validao de cerca de 1300 mtodos . Atuou
por 13 anos no gerenciamento de laboratrios e atua como especialista na rea de qumica
analtica.
Participa do Programa Brasileiro de Metrologia atravs da Coordenao da Comisso de
metrologia qumica do Sinproquim. ( Sindicato Patronal das Industrias Qumicas do Estado de
SP).
Professora convidada da UNESP Araraquara no curso de ps graduao de metrologia em
qumica.
Diretora tcnica do laboratrio da USP United States Pharmacopeia. 2008
Pesquisadora Colaboradora na UNICAMP Instituto de Quimica Laboratrio Thomson.

Levantamento de Expectativas

Seu nome
Histrico da Carreira

Quais so as suas
expectativas para
este curso?

Porque validar?
Conhecer seu processo significa ...
....conhecer sua variao

Qualquer PROCESSO, instrumento , aparelho ou padro por mais perfeito

que parea ser, estar sempre sujeito a variaes.
Se fizermos uma srie de repeties os resultados das medies nem
sempre so iguais em todos os casos. Portanto estima-se uma INCERTEZA para
todo e qualquer instrumento/equipamento de medio.
4

As medidas no confiveis podem induzir a concluses errneas

PRECISO = REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE

Validao
Ato documentado que
atesta que qualquer
procedimento, processo,
equipamento, material,
operao ou sistema
realmente conduza aos
resultados esperados
(RDC 17).
6

Validao Total
Mtodo quando aplicado pela primeira vez ou
quando for utilizado para determinar um novo
analito na mesma condio analtica.

Validao Parcial
Validaes parciais so modificaes do
mtodo j validado. Uma validao parcial pode
compreender desde uma pequena determinao de
preciso/exatido a at quase uma validao total.
7

E ... por onde comeo??

Qual a
pergunta que
se quer
responder ??

Qual a
LEGISLAO???

O que pode causar a

variao?

Conhecimento das tcnicas utilizadas, suas vantagens e limitaes

Adequao do Sistema Analitico ou System suitability (IQ, OQ,PQ)
Amostragem planejar estou com as amostras adequadas ??
Planejamento experimental
Utilizao das ferramentas Estatisticas adequadas

Conhecimento das tcnicas

utilizadas, suas vantagens e limitaes
Componentes do Espectrmetro
de Massas
Vcuo

Introduo
de amostra

Ionizao
da
amostra
Fonte

GC/LC

Analisadores de
Massas
MS e MS/MS

Detector

MS

Tcnicas de ionizao sob alto vcuo: EI, CI

Tcnicas de ionizao sob Presso Atmosfrica: ESI, APCI, APPI.

Fatores a serem considerados no

desenvolvimento de mtodo de LC/MS
Modo de

Ionizao.

Coluna.

Dimetro e Fluxo
Bombeamento
Fase Mvel. Pode

afetar tanto a cromatografia como o

processo de ionizao.
10

ESI x APCI x APPI

11

Consideraes sobre
a fase mvel

pH
Solventes e aditivos
Composio: Compromisso entre uma boa
ionizao e uma boa separao cromatogrfica.

12

Consideraes
sobre pH
Modo de ionizao Positivo- Anlise de compostos bsicos
Baixos valores de pH com adio de um cido. EX: cido Frmico ou actico

Modo de ionizao Negativo- Anlise de compostos cidos

Aumento de pH com adio de base. EX: Hidrxido de amnio/soluo de
amnia.

13

Solventes e aditivos
utilizados
Solventes

gua
Acetonitrila
Metanol
Isopropanol

Aditivos

cido Actico
cido Frmico
Hidrxido de Amnia
Acetato de Amnia*
Formato de amnia*
(* = Podem ser utilizados como tampo. As
concentraes no devem exceder
10 mM.)

14

Solventes & Aditivos que

podem ser utilizados com cuidado

TFA - Usado para anlise de protenas e peptdeos.

Causa supresso em ESI(+) em concentraes maiores que 0.1%.
Causa muita supresso em ESI(-).

TEA
Aumento de sensibilidade do sinal de compostos pouco bsicos em
ESI(-).
Ioniza rapidamente com gerao da molcula protonada
[M + H]+ em m/z 102.
Supresso de sinais de compostos menos bsicos em ESI(+).

THF
100% THF = explosivo!!
No deve ser usado com APCI quando se utiliza ar como gs de
nebulizao.

15

Efeito do cido Frmico e TFA

365
2.30e6

100

100

7.52

0.03%
cido
frmico

Sem aditivos
Somente gua
e acetonitrila
%

0
6.00

7.56

7.00

8.00

365
2.19e6

Time
9.00

6
6.00

7.00

8.00

Adio de cido
frmico causa a
diminuio do pH da
fase mvel e aumento
do sinal [M+H]+ em
eletrospray positivo.

Time
9.00
16

Efeito do cido Frmico e TFA

Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3)

100

F1
365
2.30e6

100

7.52

7.56

365
2.30e6

100

0.03%
TFA

0.03%
cido
frmico

Sem aditivos
Somente gua
e acetonitrila
%

365
2.19e6

9.24

0
6.00

7.00

8.00

Time
9.00

6
6.00

7.00

8.00

Time
9.00

0
8.00

Time

10.00
17

Solventes e tampes
no utilizados
Sais no volteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)
Detergentes (supresso inica)
cidos inorgnicos (Sulfrico, fosfrico, etc.)

18

Solventes no compatveis
com tubulao de PEEK
Ataca o PEEK
HNO3 conc.
H2SO4 conc.
Dilata o PEEK(polyetheretherketone)

DMSO
THF
CH2Cl2

19

In-Source CID: V no Cone

Cone de extrao 5V

Cone de amostra 70V

Hexapolo

Dissociao induzida por coliso

ocorre antes da entrada no MS

20

60 V

Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables

Etalon 10 220 (12.126)

3: Scan ES+
2.81e4

214.36

100

Cianazina

%
241.40

96.03
174.16
89.34

103.44
110.23

0
Etalon 10 221 (12.162)
100

131.73
145.55

125.55

186.21 196.16

163.16

205.39
263.34

40 V

279.43

304.36

327.08 337.74 348.20

2: Scan ES+
4.19e4

241.39

214.33

98.15

138.52

113.54

0
Etalon 10 221 (12.144)
100

155.47

196.20205.30

174.02

223.16

249.44

264.53

282.41 291.95 303.39 312.82

330.71

241.39

20 V

343.97

1: Scan ES+
3.82e4

130.81

97.28 108.28

0
90

100

110

120

130

151.06

140

150

171.00 183.04

160

170

180

195.59 205.32

190

200

210

223.14 234.36

220

230

240

253.29 264.47

250

260

270

282.41 292.58

280

290

310.62

300

310

325.69

320

330

345.85

m/z

340

21

Espectrometria de massas
sequencial
080_M ETHAM IDOPHOS 41 (0.752)

Daughters of 142ES+
6.37e5

94

100

Quantificao
125

Confirmao 1
%

112

Confirmao 2
142
143

110
0
80

90

100

110

120

130

140

150

m /z
160
22

Integrao da Validao aos Sistemas

de Qualidade;

23

Integrao da Validao aos Sistemas de Qualidade;

24

Integrao da Validao aos Sistemas de Qualidade

25

Aplicao
Controle de Qualidade
Alimentos, ambiental,
hormolmica:
Matria prima;
Processo
Produto final
Residuos
Contaminantes

Farmacutica:
Drug discovery
Clinical trials
Drug production.

Adulterao: Forense
Falsificao ou
Degradao

QUAIS OS LIMITES DE DETECO E

QUANTIFICAO DESEJADOS??

26

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
GUIAS DE VALIDAO

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Niveis de aoMRL

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

27

Legislao para validao

de metodologia

Resoluo Especifica - RE 899 Guia para validao de mtodos analiticos e

bioanaliticos

FDA- 21 CFR PART 211 - CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR

FINISHED PHARMACEUTICALS Subpart L-Validation 211.222

Commission Decision 2002/657/EC performance and interpretations of results

for analytical methods - veterinary residues

European Directive 91/414/EEC PLANT PROTECTION

Food quality protection Act (FQPA) EUA

28

Traabilidade do mtodo
analtico
Os Mtodos de anlise devem ser rastreveis a um Mtodo
referenciado, nacional ou internacionalmente
internacionalmente..
FOOD CODEX - United States Pharmacopeia

USP UNITED STATES PHARMACOPEIA

EPA -

29

Guias para Validao de Mtodos

USP Chapter <1225>

Validation of Compendial Methods

ICH Guidelines
Q2A, Text on Validation of Analytical procedures
(March 1995)
Q2B, Validation of Analytical Procedures:

Methodology (May 1997)

FDA: 21 CFR PART 211 - CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR

FINISHED

PHARMACEUTICALS Subpart L-Validation 211.222 Method

validation

EURACHEM - 1998 guia para validao de mtodos

EU: Guidelines for the validation of screening methods for residues of

veterinary medicines (initial validation and transfer)- Community reference

laboratories residues -2010
30

Legislao para validao

de metodologia

Fonte:http://www.saude.mg.gov.br/politicas_de_saude/visa/PAMVET.pdf

31

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
APLICVEL
Niveis de aoMRL

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
GUIAS DE VALIDAO

Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

32

Tcnicas de Amostragem
AMOSTRAGEM
Retirada representativa de material para anlise e
controle.
a primeira etapa do controle de qualidade e pode
representar uma grande parte do erro da anlise,
pois a amostra representar o lote.
O que deve ser amostrado?
Como amostrar?
Em que quantidade?
33

Amostras legais- frequentemente a lei

obriga o fabricante a amostrar produto
acabado ou da matria prima.
Normas- Boas prticas de Fabricao e
Controle (RDC 17/2010) ou NBR
ISO/IEC 17025/2005
Todo laboratrio deve ter um plano e
procedimento de amostragem.
(O que, como e quanto ?)
Legislao para casos especficos; ex
Codex Alimentarius ,1993

34

QUANTO?

Existem vrias frmulas estatsticas

Observar o nmero de embalagens (N) antes de comear.

Escolher as embalagens mais separadas, e limpar
externamente.
O nmero de volumes amostrados deve ser N+1, se for
menos que 5 volumes, amostrar todos.
A quantidade de amostra deve ser suficiente para todos os
testes a ser realizados e para guardar amostra de referncia
at 1 ano aps o vencimento

35

NMERO MINIMO DE AMOSTRAS

36

Amostragem
Fatores interferentes no processo de amostragem:
estratgia da amostragem: propriedades do material a ser analisado ex: volatilidade, sensibilidade luz, instabilidade trmica, reatividade
qumica
escolha do equipamento de amostragem - adequado
embalagem para amostra - evitar contaminao cruzada.
Amostras para fins legais, a amostra pode ser lacrada
condio de armazenamento

37

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
APLICVEL
Niveis de aoMRL

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
GUIAS DE VALIDAO

Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

38

VALIDAO
Validao deve demonstrar que o mtodo atende aos critrios aplicveis
para o uso pretendido.
Diferentes propsitos requerem diferentes categorias de mtodos.

Mtodos
qualitativos
Mtodos
Quantitativos

Limite
deteco

Limite
de
deciso

Exatido
recuperao

Preciso

Seletividade
especificidade

Aplicao/
robustez
estabilidade

S= screening methods C = confirmatory methods + = determinao obrigatria

IMPORTANTE: REPLICATAS INDEPENDENTES E NO REPLICATAS DE LEITURAS
OBJETIVO CONHECER A VARIABILIDADE REAL E NO A VARIABILIDADE MINIMA
EURACHEN;1998.

39

Modos de Aquisio - QqQ

Full

scan MS mode
Single ion recording (SIR)
Product ion scan
Precursor ion scan
Neutral loss scan
Multiple reaction monitoring (MRM)
Q1

Fonte

q2

Q3

Detector
40

PARAMETROS ESSENCIAIS PARA VALIDAO DE

MTODOS BIOANALITICOS

FIGURAS DE MRITO OU PARMETROS DE DESEMPENHO

SELETIVIDADE

EXATIDO

LINEARIDADE
PRECISO
LIMITE DE DETECO
LIMITE DE QUANTIFICAO

EFEITO MATRIZ
ESTABILIDADE
ROBUSTEZ

41

ICH/USP Validation
Requirements & Parameters
ICH

USP

Specificity

Linearity and Range

Accuracy

Precision

Limit of Detection

Limit of Quantitation

Robustness

Comission Decision
2002/657/EC

Specificity/seletividade
recovery
Linearity
CC Detection capability
CC decision limit
Range
MRPL- minimum
Accuracy
required performance
Precision
limit
Precision
Repeatability
Aplicabilidade
Intermediate Precision Robustez
Estabilidade
Reproducibility
Linearity (calibration
Limit of Detection
curves)

Limit of Quantitation

Specificity

42

Requisitos para escolha de um mtodo analtico

5.4 Mtodos de Ensaio

Escolha do Mtodo

Objetivo / aplicao
Especificao / limites desejados
Levantamento do estado da arte: STN; Dialog; Infodisk
Existncia de padres e materiais de referncia
Custo / beneficio
Testar especificidade, linearidade, faixa, exatido e preciso
validao
Meio Ambiente
43

Especificidade/ Seletividade
Capacidade do mtodo em determinar o analito na
presena dos componentes da matriz sem
interferncia na anlise.
PARAMETRO DEPENDENTE DA TCNICA E TAMBM SUJEITO AS VARIAES DE
MATRIZES
EC 2002: Analisar em n>20 brancos substancias que possam estar presentes e
verificar presena de interferentes na regio de eluio do analito

Grande Vantagem do
LC-MS/MS!!
INEQUIVOCA !!!
44

MatrixStd203

MS/MS (MRM)
versus SIM

100

H2N

Streptomycin in Honey

NH

HN
OH

HN

NH2
NH

CH3

OH

HN

MRM

MRM of 4 Channels ES+

582.3 > 263.2
3.03e3

HO

OH

O
OH

OH

O
H3C

2.00

4.00

6.00

8.00

MatrixSIR002
100

2.00

10.00
12.00
SIR of 2 Channels ES+
582.3
1.13e5

Alta seletividade e
especificidade
Alta sensibilidade S/R
Reduo de clean up
de amostras

SIM

OH

4.00

6.00

8.00

10.00

Time
12.00 45

Linearidade
Capacidade do mtodo em demonstrar que os
resultados so proporcionais concentrao do
analito.

Y=ax+b

Mnimo 5 pontos para a curva analtica

R e Mtodo dos mnimos quadrados

46

Limite de deteco e quantificao

LD=Menor concentrao que pode ser detectada
y=ax+b

LD = DPa x 3
a

Dpa= desvio padro do branco

N=20 - EC2002
N=10 - Eurachem
N=7 - INMETRO

LQ=Menor concentrao que pode ser quantificada

LD = DPa x 10
a
DPa: desvio padro do intercepto com o eixo do Y de 3
curvas de construdas com concentraes do frmaco
prximas ao limite de quantificao; a a inclinao da
curva.
47

Limite de deteco e quantificao

Comprovar com analise de 10 amostras brancas fortificadas ao

nivel de LD e LQ

48

CC e CC
Limite de deciso : limite no qual e acima do qual se pode
concluir que uma amostra no conforme com uma
probabilidade de erro alfa.

Erro alfa: probabilidade da amostra ensaiada ser conforme, apesar de ter obtido um
resultado no-conforme.(falsa deciso no conforme)

LD = Nivel de conc permitido +/- 1,64*DP

Dpa= desvio padro de n=20
amostras brancas

Limite de deciso :
Exemplo Aflatoxina B1 limite mximo permitido = 2.00ng/Kg
Resultado = 1.97 0.03 = Maximo 2.03 ACEITO OU REJEITO ??
2.00 0.03* 1.64 = 2.0492
ACEITO!!

49

CC e CC
Capacidade de deteco: menor quantidade de uma
substncia que pode ser detectada, numa amostra,
com uma probabilidade de erro beta .

Erro beta: probabilidade da amostra ensaiada ser no conforme, apesar de ter

obtido um resultado conforme.

CD = Limite de deciso
calculado +/- 1,64*DP

50

Sensibilidade

Depende da inclinao
da curva de calibrao.

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

Mtodo (a)

S in a l

Descreve o quanto a
resposta muda com
mudanas na
concentrao do analito

45

Mtodo (b)
1

Concentrao
51

52

Exatido = Trueness
Determinada aps estabelecer a linearidade e
seletividade do mtodo com MRC
No mnimo, 9 (nove) determinaes entre o
intervalo linear do procedimento, ou seja:
3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta
3 (trs) rplicas cada.
EC2002= SEIS (6)
REPLICATAS
NAS CONC: 0.5 ; 1 E 1.5
DO LIMITE MAXIMO
PERMITIDO

Exatido = trueness e no acurcia segundo ISO 3534-1 e o Eurachem

53

CRITRIOS DE ACEITAO PARA

RECUPERAO
CONCENTRAO

FAIXA

<= 1 g/kg

- 50% a +20%

> 1 g/kg a 10
g/kg

-30% a +10%

>= 10 g/kg

-20% a +10%

Fonte: Freitas, A. 2008

54

SISTEMA DE IDENTIFICAO PARA CONFIRMAO POR

PONTOS

Fonte: CD 2002/657/EC

55

Espectro de Massas: abundncia isotpica

Pico monoisotpico
Pico do Carbono 13

56

Espectro de Massas: abundncia isotpica

25%

Para se estimar o nmero de

carbonos em uma molcula: dividir
a intensidade de A+1 por 1.1
(abundncia do Carbono 13 na
natureza).

25 / 1.1 = 23,7
~ 23 tomos de carbono
na molcula

57

Espectro de Massas: abundncia isotpica

Br - CH3
15 uma
79Br-CH

3=

94
81Br-CH = 96
3

Informaes:
Relao m/z
Presena dos istopos
Diferena de massa entre os sinais

58

Espectro de Massas: abundncia isotpica

Cloro
Peso atmico = 35,453
Mistura de 35Cl (75,77%) e 37Cl (24,23%)

CH3Cl

59

Padro isotpico: Cloro

Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)
50.0

100

84.0

100

CH2Cl2

CH3Cl

86.0

%
52.0

87.9

0
40

mass
42

44

46

48

50

117.9

100

52

54

56

58

0
74

60

119.9

mass
76

78

80

82

84

86

88

90

94

96

153.9

100

CCl4

151.9

CHCl3
%

92

155.9

%
121.9

157.9

123.9

0
108

mass
110

112

114

116

118

120

122

124

126

128

130

132

0
145

150

155

160

165

60

Requisitos para escolha de um mtodo

analtico

PRECISO

Ferramentas para obteno - ISO 5725:

ANOVA: Repetibilidade; Reprodutibilidade

Cartas de Controle

61

Preciso

ISO 5725 ANOVA

Preciso: disperso dos resultados

Repetitividade (r)
r= Mesmo analista e mesma instrumentao.
Verificada com 9 determinaes do intervalo linear
3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs)
rplicas cada ou mnimo de 6 determinaes a 100% da
concentrao do teste

EC2002= 6 REPLICAS em 0.5,1 e 1.5 do Limite

Mximo Estabelecido X, DP E CV

e Preciso Intermediria (R)

Varia pelo menos um dos fatores
recomendado dias e analistas

62

Preciso Repetitividade e Preciso Intermediria

Fonte: Freitas, A. 2008

63

Preciso de mtodos quantitativos

CRITRIOS DE ACEITAO EC2002/657
concentrao

Reprodutibilidade CV(%)

1g/Kg

45 Horwitz

10 g/Kg

32 Horwitz

100 g/Kg

23

1000 g/Kg

16

equao de Horwitz:
CV= 2 (1-0.5logC)
onde C expresso como expoente de 10
ex: 1mg/g=10-3 ento C=-3
O CV intra-laboratoriais deve estar dentro de 1/3 a 2/3 dos valores da reprodutibilidade.

Fonte: Commission decision 2002/657/EC

64

Mxima tolerncia permitida para variao

intensidades relativas de ons para tcnicas de
espectrometria de massas.
Intensidade
relativa (%do pico
base)

EI-GC-MS
(relative)
%

CI-GC-MS , GC-MS,
LC-MS, LC-MSn
(relative) %

>50 %

+/- 10

+/- 20

>20% a 50%

+/- 15

+/- 25

>10% a 20%

+/- 20

+/- 30

<= 10%

+/- 50

+/- 50

Fonte: Commission decision 2002/657/EC

das

65

ROBUSTEZ
Fatores que devem ser considerados na
determinao da robustez do mtodo.
Preparo das Amostras

Estabilidade das solues analticas

Tempo de extrao
Variao do pH da fase mvel
Variao na composio da fase mvel

Cromatografia Lquida

Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura
Fluxo da fase mvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Cromatografia Gasosa

Temperatura
Velocidade do gs de arraste
potencial de sada da cela
Modo de ionizap
de coliso

Espectrometria de massas

Voltagem do potencial do
orificio ou cone

Voltagem do capilar

Janela de tempo de reteno e

dwell time (tempo do ciclo do
Energia de fragmentao
massas)JTR=media 10 brancos
+/- 3*dp

66

IMPORTANTE

Como so os interferentes analticos?

-Componentes da formulao, corantes, revestimento, etc;
-Solventes, sais, reagentes usados durante o teste;
-Produtos de degradao do ativo; (estabilidade do ativo)
-Produtos de degradao do placebo;
-Substncias relacionadas; (conformidade qumica)
-Impurezas

67

Estabilidade

No compatvel tempo
Curta durao
Compatvel tempo
No compatvel tempo
Mdia durao

Redefinir
tempo de
Estudo de
Estocagem

Compatvel tempo
Longa durao
Iniciar o Estudo

No compatvel tempo
68

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
APLICVEL
Niveis de aoMRL

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
GUIAS DE VALIDAO

Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

69

DETECO DE OUTLIERS

Outlier valor discrepante dos demais.

Afetam exatido e preciso do mtodo

Teste de Dixon (ou teste Q)

Popular devido simplicidade

Estatstica do teste:

Teste de Grubbs
Recomendado pela ISO
Estatstica do teste

D=

valor suspeito - valor mais prximo

maior valor - menor valor

valor suspeito - mdia

G=
desvio padro

Teste de Cochran
Testa se a varincia de um conjunto de valores outlier em relao s
varincias de outros conjuntos
Estatstica: C= (maior varincia)/(soma das varincias)
70

Expresso do Resultado Final

Clculo da Incerteza na mdia

ST
U x tn 1;0,025.
n

Onde :
Ux = Incerteza na mdia
ST = Desvio Padro total
n = nmero total de determinaes
t (n(n-1;0,025) = Varivel de t de Student

Expresso do Resultado Final

Onde :
Resultado =

X Ux

xi
X i 1
n
71

CRITRIOS DE ACEITAO

Os critrios para a adequao da variabilidade depende da

porcentagem em relao a variabilidade do processo de produo
REGRA GERAL
Variao menor que 10% - MTODO MUITO ADEQUADO
Variao entre 10 e 30% - MTODO ADEQUADO
Variao maior que 30% - MTODO REQUER MELHORIAS CUSTO/BENEFICIO

A preciso determinada em cada concentrao no deve exceder 10% do

coeficiente de variao (CV) exceto para o LLOQ que no deve exceder 20% do
CV. Commisision Decision 2002/657/EC
Ou 15% pela ANVISA
72

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
APLICVEL
Niveis de aoMRL

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
GUIAS DE VALIDAO

Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

73

Monitoramento
Cartas de Controle

CLCULO DOS LIMITES DE

CONTROLE

LSCX= X + A2R
LICX = X - A2R
LSCR = D4R
LICR = 0 (n = 6)

Ref: IMAN -1995

74

CEP - Controle Estatstico de Processo

Viso Contnua

ANOVA
Preciso e Incerteza
Viso Pontual
751996
Ref:Ponzetto

Ciclo de vida do Mtodo Analtico e requisitos de validao

em cada etapa - normas e guias aplicveis
ASTM E 1488-96

Necessidade
De Novo Mtodo
LEGISLAO
APLICVEL
Niveis de aoMRL

Estado da Arte
X
Aplicao
AMOSTRAGEM

Testes
Preliminares
PLANEJAMENTO
GUIAS DE VALIDAO

Descrio
do mtodo ISO-78-2

ISO 5725
Commission
Decision 2002/657

Validao:
FIGURAS DE
MERITO
ISO 11843
Robustez
ASTM E 1169

Dixon

Cochran

Resultados
Aceitos
CRITRIOS
DE
ACEITAO

Reportar
Resultados
Comparar
novas
Metodologias

Correlao
Entre situaes/
Matriz

ILS
Proficincia
( E 1601 )

Monitoramento

Cartas de
controle

Pesquisar
Causas de
Variao

Requer
Otimizao

Comparao
com
Especificao

76

Estatstica
Chamar o especialista em estatstica depois que o experimento foi
feito pode ser o mesmo que pedir a ele para fazer um exame
post-mortem. Talvez ele consiga dizer de que foi que o
experimento morreu.
R. A. Fisher

77

78

79

 Um modo utilizado de clculo

m
19,6 20,0
0,4
t

2,81
s
0,350
0,1322
7
n

comparado com t6=2,447 . Como t maior do que t6, rejeitamos

Ho.
Devido a disponibilidade dos computadores, calcula-se a
probabilidade de encontrar um valor maior ou igual a t=2,81.
Esse chamado valor-p e igual a 0,031 (ou 3,1%). Ento, a
probabilidade de encontrar t=2,81 menor do que 5% e Ho
rejeitada

80

81

Varincias homogneas

GL= n1+n2 2

82

Fazer os clculos, usando as equaes do slide anterior.

Dados: t critico= 1,812 (NC 99%)

83

84

TESTES DE SIGNIFICNCIA
Clculo de t Tipo 2, com varincias diferentes:

t calc

x1 x 2
2

s1
s2

n1
n2
Ho :

x1 x2

= o menor entre n1-1 e n2-1

85

TESTES DE SIGNIFICNCIA
Clculo de t Tipo 3:

t calc

n
sd

d = mdia das diferenas entre os

pares de valores

sd = desvio padro das diferenas

entre os pares

Ho : d = 0
= nmero de pares - 1

86

 Teste t pareado
Exemplo: Dois mtodos A e B foram comparados para a
determinao de concentraes de paracetamol de dez
tabletes de lotes diferentes

Mdia
DP

A
84,63
84,38
84,08
84,41
83,82
83,55
83,92
83,69
84,06
84,03
84,06
0,338

B d= diferena
83,15
1,48
83,72
0,66
83,84
0,24
84,2
0,21
83,92
-0,1
84,16
-0,61
84,02
-0,1
83,6
0,09
84,13
-0,07
84,24
-0,21
83,9
0,16
0,338
0,57

Os mtodos podem ser

considerados iguais?
Calcule manualmente!!

87

 Teste t pareado
Exemplo: Dois mtodos A e B foram comparados para a
determinao de concentraes de paracetamol de dez
tabletes de lotes diferentes
Teste-t: duas amostras em par para mdias

Mdia
DP

A
84,63
84,38
84,08
84,41
83,82
83,55
83,92
83,69
84,06
84,03
84,06
0,338

B d= diferena
83,15
1,48
83,72
0,66
83,84
0,24
84,2
0,21
83,92
-0,1
84,16
-0,61
84,02
-0,1
83,6
0,09
84,13
-0,07
84,24
-0,21
83,9
0,16
0,338
0,57

Mdia
Varincia
Observaes
Correlao de Pearson
Hiptese da diferena de mdia
gl
Stat t
P(T<=t) uni-caudal
t crtico uni-caudal
P(T<=t) bi-caudal
t crtico bi-caudal

A
84,06
0,114
10
-0,423
0
9
0,882
0,200
1,833
0,401
2,262

B
83,90
0,114
10

88

ANOVA

Preciso e Incerteza
Viso Pontual
COMPARAO DE MAIS QUE 2 FATORES
Ref:Ponzetto 1996
89

ANOVA

PARA QUE SERVE A ANOVA??

A Analise de varincia ou ANOVA, embora exija o

calculo de varincias, na realidade compara mdias de
tratamento..

A comparao se faz por meio do teste F .

90

ANOVA

PARA QUE SERVE A ANOVA??

A anlise de varincia ento uma extenso do teste t

de Student que compara duas e s duas mdias.

No caso de apenas dois tratamentos pode-se usar tanto
o teste t como a analise de varincia.
O valor calculado de t igual a raiz quadrada de F,
calculado na anlise de varincia.
A ANOVA permite que o pesquisador compare
qualquer numero de mdias
91

ANOVA

QUAL A LGICA DA ANALISE DE VARIANCIA??

mais fcil entender a lgica atravs de um exemplo:
Veja a tabela a seguir, onde as mdias esto na ltima linha da
tabela.

TRATAMENTO
A
B C D
25 31 22 33
26 25 26 29
20 28 28 31
23 27 25 34
21 24 29 28
23 27 26 31

92

ANOVA

QUAL A LGICA DA ANALISE DE

VARIANCIA??
D para concluir observando os dados da tabela que os
tratamentos A,B,C e D conduzem a medias diferentes?
Isto seria inferncia , e para fazer inferncia preciso aplicar um
teste estatstico.
A resposta das diferentes unidades a um mesmo tratamento
varia ao acaso devido aos fatores, conhecidos e desconhecidos,
que no foram controlados no experimentos.

93

Procedimento para a anlise de varincia

(ANOVA)
Uma anlise de varincia s deve ser feita se forem
satisfeitas algumas pressuposies :
os erros so variveis aleatrias e independentes
A varincia constante
A distribuio dos erros normal ou
aproximadamente normal
Vamos aprender os clculos da ANOVA ....
94

Procedimento para a anlise de varincia (ANOVA)

As quantidades calculadas so apresentadas numa tabela de ANOVA:

Causa de
variao

GL

SQ

QM

Tratamentos

(k-1)

SQTr

QMTr

Resduos

(n-k)

SQR

QMR

Total

(n-1)

SQT

Quando o valor calculado de F for maior que o valor critico, rejeite a hiptese das mdias
serem iguais.
95

ANOVA Exemplo da interpretao

Coeficiente de variao:
Para se ter idia da disperso( preciso) dos dados em relao a
grandeza da mdia, o pesquisador deve dividir o desvio padro
pela mdia. Dados muito dispersos so pouco precisos, ou seja,
quanto maior a varincia dos dados, menor a preciso.
Ento, por definio, coeficiente de variao, que se indica por
CV, a razo entre o desvio padro e a mdia geral
Na analise de varincia, o desvio padro dado pela raiz quadrada
do quadrado mdio do resduo, QMR.
Ento CV = s/ Media
0,1087

no exemplo CV= RQ 4,693 /19,5 =

Em geral se apresenta o CV em % CV= 10,9 %

96

RESUMO
Grupo
A
B
C
D

ANOVA
Fonte da variao
Entre grupos
Dentro dos grupos
Total

Contagem
5
5
5
5

Soma
328,4
326,4
323,6
340,5

SQ
33,29
75,08

gl
3
16

108,37

19

Mdia Varincia
65,68
4,587
65,28
2,607
64,72
5,587
68,10
5,990

MQ
11,095
4,693

F valor-P F crtico
2,364
0,109
3,24

sr2= 4,693 e sR2= (11,095-4,693)/5= 1,280

t(19)=2,093 ao nvel de 5%
rep= 2,093 (2*4,693)= 6,412
repro= 2,093 [2.(4,693+ 1,280)]= 7,234

97

ANOVA

Coeficiente de determinao:
Observe os resultados da tabela de anlise de varincia e
entenda que:
a soma de quadrados total (SQT) mede a variao total
ou seja,a variao dos valores observados em torno da mdia
geral.
A soma de quadrados dos tratamentos mede a variao
devida aos tratamentos
A soma de quadrados de resduo mede a variao
aleatria.

98

ANOVA

Coeficiente de determinao:
Por definio, coeficiente de determinao, que se indica por
R2 , a razo entre a soma de quadrados de tratamentos e a
soma de quadrados total.
R2= SQTr
SQT
Portanto R2 uma medida da proporo da variao total
explicada pela variao de tratamentos.
Como o valor de R2 varia entre 0 e 1, pode ser interpretado
como uma porcentagem.

99

ANOVA Exemplo da interpretao

Tratamento
A
10
11
15
13
16
Ma= 13

Causa de
variao

GL

Tratamento 1

B
25
26
28
24
27
Mb=26

R2=SQTr/SQT = 0,9215
Concluso: 92,15% da
variao explicada pela
variao de tratamento

SQ

QM

P-valor

422,5

422,5

93,89

1,07E-05

Resduo

36

Total

458,5

4,5

100

101

Ferramentas para estudo das

diferentes matrizes -

Quimiometria : PCA
Caracterizao das amostras e correlao com origem

102

EXEMPLOS DE APLICAO
Aplicaes da Espectrometria de Massas em
Quantificao e Caracterizao de Matrizes Biolgicas

Captulo 1
Desenvolvimento e validao de mtodos LC-MS/MS para
determinao de cortisol em plasma e leite bovinos para estudo
de bem-estar animal
Exame de Qualificao
Mestrado

Aluna: Andria de Melo Porcari

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin
Campinas, 04 de novembro de 2011

103

Por que Cortisol?

Hipotlamo
Stress
CRH
(corticotropin releasing hormone)

+
Glndula
Pituitria

ACTH
(adrenocorticotropina)

+
Glndula
Adrenal
Rev Endocr Metab Disord., 2007, 8, 365

Cortisol
104

 Por que Cortisol?

S
T
R
E
S
S

MANEJO

B
E
M
E
S
T
A
R

AMBIENTE

105

105

 Como cortisol dosado?

Cortisol
362,5 g mol-1

11-deoxicortisol
346,5 g mol-1

Saliva Humana

Corticosterona
346,5 g mol-1

?
=

Leite de Vaca

MTODO REFERENCIA : ELISA

DESENVOLVIDO PARA SALIVA HUMANA

106

Como cortisol dosado?

Por outro lado:
Espectrometria de Massas (MS)
(MS
- Seletividade / Especificidade
- Sensibilidade
- Anlises Mltiplas (vrios analitos)
-Confiabilidade Analtica
MRM

Cromatografia
Lquida

APPI
(Atmospheric
Pressure Photo
Ionization)

Clin. Biochem., 2008, 41, 736; J. Pharm. Biomed. Anal., 2008, 48, 1174.
Steroids, 2008, 73, 1345.

107

Deteco do cortisol: APPI

Entrada
HPLC

Gs
nebulizante

Mecanismo I (quando PI < hn)

M + hn = M+.+eM+.+ S [M+H]+ + [S-H]-.

Bloco
aquecido
Entrada
de dopante

Lmpada

Gs secante
hn

Seletividade

Mecanismo II (quando PI > hn)

D + hn = D+.+eD+. + D = [D-H]. + [D+H]+
M + [D+H]+ D +[M+H]+

Capilar

Eficincia de ionizao (esterides)

Menor supresso inica
Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 2763; Introduction to Mass Spectrometry.
Instruments, applications and strategies for Data Interpretation. 4th Ed, 2008, England. John Wiley & Sons Ltda.

108

 Pe r g u nta s

Perguntas veterinrias:
1. Cortisol em plasma e leite bovinos se correlacionam?
2. Ordenha mecanizada aumenta o nvel de cortisol nas vacas?
6 vacas

Incio da ordenha
Plasma
Leite

Final da ordenha
Plasma
Leite

Faculdade de Medicina
Veterinria e Zootecnia
J. Dairy Sci., 2011, 94, 4406

109

 Perguntas veterinrias:
1. ELISA (kit de saliva humana) usado para dosar leite bovino
fornece os mesmos resultados que LC-MS/MS?
2. Mastite subclnica altera o nvel de cortisol no leite?
Mastite subclnica: inflamao de glndula mamria causada por infeco
bacteriana. Clulas de defesa migram para a glndula mamria para combater
a infeco, aumentando a contagem de clulas somticas no leite (CC)
Grupo (+)
28 vacas
COM
mastite subclnica
Leite
ELISA
Kit de saliva humana
J. Dairy Sci., 2011, 94, 4406

Grupo (-)
28 vacas
SEM
mastite subclnica
Leite

LC--MS/MS
LC

ELISA
Kit de saliva humana
110

Experimental Sistema LC-MS

Cortisol:
m/z 363327 e 363 121
5500 QQ-Trap- AB Sciex
Fonte: APPI (criptnio
10 ev)
Dopante: Tolueno (100 mL
min-1)
Modo: Positivo (MRM)
Voltagem fonte: 830 V
Temperatura: 350oC
Curtain gas: 15 psi (N2)
Gs nebulizante: 20 psi
(N2)
Gs auxiliar: 20 psi (N2)
Gs de coliso: 9 u.a. (N2)
Analyst, 1998, 123, 2649

Cortisol-9,11,12,12-d4 (Padro Interno):

m/z 367 331 e 367 121

Mecanismo II (quando PI > hn)

D + hn = D+.+eD+. + D = (D-H) + DH+
M + DH+ D + MH+

111

Sistema LC-MS
Plasma
Zorbax Eclipse XDB- C18,
4,6 x 150 mm, 3,5mm
40 mL de injeo

HPLC Agilent
1200 Series

Tempo
(min)
0.00
2.00
2.50
2.51
8.00
8.10
11.50

Fluxo
(mL min-1)
800
800
800
1200
1200
1200
1200

% (v/v)
H2O
5.0
5.0
0.0
0.0
0.0
5.0
5.0

% (v/v)
MeOH
95.0
95.0
100.0
100.0
100.0
95.0
95.0

Leite
PFP (2)
4,6 x 150 mm, 5 mm
20 mL de injeo
Tempo
(min)
0.00
2.00
4.00
4.10
7.00
7.01
8.00
8.10
10.50

Fluxo
(mL min-1)
800
800
800
800
800
1200
1200
1200
800

% (v/v)
H2O
60.0
30.0
15.0
0.0
0.0
0.0
0.0
60.0
60.0

% (v/v)
MeOH
40.0
70.0
85.0
100.0
100.0
100.0
100.0
40.0
40.0

Injetor: 4oC
Acetona: lavagem da agulha
Forno: 40oC

112

Experimental Cromatogramas Tpicos

D4-Cortisol
(m/z 367>121)

2.0e5

Mtodo Plasma
Soluo Fisiolgica 6% BSA,
dopada com
Cortisol (1,6 ng mL-1 ) e
D4-cortisol (5,0 ng mL-1)

1.5e5

Intensidade / cps

D4-Cortisol
(m/z 367>331)

1.0e5

Cortisol
(m/z 363>121)

1.92

5.0e4

Cortisol
(m/z 363>327)

1.0e4
0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

Tempo / min

2.4

2.8

3.2

3.6

113

 Preparo de Amostra - PLASMA

200 mL de
plasma

500 mL de
MTBE

Vortex (1 min)
Centrfuga
(5min, 10 mil
rpm)

Vortex (30 s)
Centrfuga

Banho de Gelo
Seco + Etanol
(congela fase
aquosa)

Fase aquosa
descartada
Clin. Biochem.,2004, 37, 357.

(5min, 10 mil
rpm)

Fase orgnica
recolhida

Banho de Gelo
Seco + Etanol
(congela fase
aquosa)

Fase aquosa
descongelada

Fase
orgnica
recolhida

500 mL de
MTBE

Fase orgnica
recombinada, seca em N2
e re-suspensa em 200 mL
de fase mvel
114

Va l i d a o d o s M t o d o s

Estudo da Faixa Linear 0,1 a 20,0 ng mL-1

Capacidade do mtodo de fornecer resultados diretamente proporcionais
1.4
concentrao
do analito
Calibrao para cortisol 363.1 > 327.3:
y = 0.06104 x + 2.74607e-4
(r = 0.99600) (ponderao: 1 / x2)

rea Analito / rea PI

1.2

0.8

Plasma

0.6

0.4

0.2

0
0

10

12

14

16

Concentrao de cortisol / ng mL-1

18

20

22

115

Va l i d a o d o s M t o d o s

Especificidade Mtodo Plasma

9000
8000

Critrio: interferncias branco < 20% LOQ

Intensidade / cps

7000
6000
5000
4000

3000

1.92

2000
1.74

0.0

2.60 2.77
2.872.91
3.08

1.67

1000

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

Tempo / min

2.4

2.8

3.28

3.2

3.55

3.6

116

 Limite Inferior de Quantificao (LIQ)

Mtodo Plasma
7.0e4

Menor quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada

quantitativamente com preciso e exatido aceitveis

Intensidade / cps

6.0e4

5.0e4

Cortisol (0,1 ng mL-1) em

soluo extraida (BSA 6%
em Soro fisiolgico) e
D4-cortisol (5 ng mL-1)

1.93

4.0e4

3.0e4

2.0e4

1.0e4

2.11

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

Tempo / min

2.4

2.8

117 3.2

3.6

117

Va l i d a o d o s M t o d o s

Limite Inferior de Quantificao (LIQ)

Menor quantidade de um analito que, aps dopagem, pudesse ser
diferenciado da concentrao endgena em uma amostra real, com
3.8e4
preciso e exatido aceitveis
Cortisol (0,15 ng mL-1 ) e
D4-cortisol (5,0 ng mL-1 )
em MeOH

Intensidade / cps

3.0e4

2.0e4

S/N > 10

1.0e4

6.0
118
0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

Tempo / min

5.0

6.0

118
7.0

Va l i d a o d o s M t o d o s

Faixa de Trabalho (concentrao de cortisol)

0,1 ng mL-1
Plasma
0,25 ng mL-1 -CQbaixo
0,4 ng mL-1
0,8 ng mL-1
Padro Interno:
1,6 ng mL-1
5 ng mL-1 de
D4-cortisol
3,2 ng mL-1
4,8 ng mL-1-CQmdio
6,4 ng mL-1
9,6 ng mL-1-CQalto
12,8 ng mL-1
119

Va l i d a o d o s M t o d o s

Efeito de Matriz
B

Efeito Matriz 100 100

A

A= rea mdia do pico da soluo padro (N=5)

B = rea mdia do pico da matriz no dopada reconstituda em soluo padro (N=5)

Plasma

Leite

Cortisol
(ng mL-1)

Efeito de Matriz*
(%)

Cortisol
(ng mL-1)

Efeito de Matriz*
(%)

0,25

9,1 + 0,50

0,15

2,2 + 0,18

4,8

5,4 + 0,13

1,0

-4,3 + 0,32

9,6

-5,5 + 0,18

5,0

4,8 + 0,41

* Mdia + I (N=5)
J. Liq. Chromatogr. & Rel. Tech., 2010, 33, 1067

120

Va l i d a o d o s M t o d o s

Preciso intra- corrida e inter-corrida

Plasma
Intra-corrida (N=5)

Inter-corrida (N=10)

Cortisol
(ng mL-1)
(nominal)

Mdia + I
(ng mL-1)

CV%
(%)

Exatido
(%)

Mdia + I
(ng mL-1)

CV%
(%)

Exatido
(%)

0,10

0,09 + 0,011

9,9

100,0

0,12 + 0,012

16,9

114,5

0,20

0,20 + 0,021

9,6

111,0

0,21 + 0,021

10,5

106,3

4,80

4,37 + 0,064

2,3

91,4

4,34 + 0.096

2,0

90,3

9,60

10,00 + 0,277

2,2

107,5

10,23 + 0,320

2,9

106,6

121

Resultados
Experimento I Efeito da ordenha / Comparao Plasma e Leite
Cortisol - PLASMA
Mdia + I
(ng.mL-1)

CV%

Mdia + I

Vaca

(ng.mL-1)

CV%

2.34 + 0.351

7.44

0.34 + 0.021

3.04

11.6 + 2.64

11.04

1.28 + 0.103

3.61

4.42 + 0.289

3.16

0.65 +0.062

3.9

7.09 + 1.858

12.68

0.78 + 0.041

3.1

5.23 + 1.301

12.14

0.89 + 0.041

2.69

11.27 + 1.548

6.65

0.65 + 0.041

2.41

1.84 + 0.578

14.96

0.23 + 0.021

6.17

11 + 2.93

12.87

1.21 + 0.021

0.91

3.72 + 0.991

12.84

0.41 + 0.021

3.25

13.98 + 4.310

14.94

1.08 +0.062

2.56

14.21 + 3.489

11.86

0.7+0.041

3.12

4.68 + 1.239

1.37

0.51+0.082

7.37

Faixa: 1.84 14.21 ng mL-1

Incio

Final

Final

Incio

Vaca

Cortisol - LEITE

Faixa: 0.23 1.28 ng mL-1

122

Resultados

Experimento I Efeito da ordenha

16

[cortisol] / ng mL-1

12

Plasma

8.24+5.227

14

Leite

6.99 + 3.591

10
8
6
4
2

0.77+0.298

0.69+0.368

Incio (-1)

Final (+10)

Tempo

[Cortisol]incio = [Cortisol]final para plasma (P=0,616) e leite (P=0,385)

[Cortisol]plasma > [Cortisol]leite

Pergunta: que teste estatistico poderia ser

usado para esta comparao??
123

Resultados

Experimento I
14

y = 9.442x - 0.5489
R = 0.99, P<0.000

Leite
[cortisol] / ng.mL-1

12
10
8
6
4
2
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

Plasma
[cortisol] / ng.mL-1

H correlao linear entre plasma e leite

124

Resultados
ELISA

Experimento II Efeito da Mastite Subclnica

1.2
1
0.8

Negativo
Positivo

0.6
0.4
0.2
0
0

10

15

Amostra

20

LC-MS/MS

0.9

[cortisol] / ng mL-1

[cortisol] / ng mL-1

1.4

0.8
0.7
0.6
0.5

Negativo

0.4

Positivo

0.3
0.2
0.1
0
0

10

15

Amostra

20

25

30

125

Resultados
1.2
Experimento
II Efeito da Mastite Subclnica
0.87+0.131
[cortisol] / ng mL-1

1
0.56+0.162

0.8

Negativo

0.46+0.047

0.6

Positivo

0.32+0.072
0.4
0.2
0

LC-MS/MS

Mtodo

ELISA

[Cortisol]positivo< [Cortisol]Negativo para LC-MS/MS e para ELISA

Saliva
Humana

?
=

Leite de
Vaca

ELISA superestimou em mdia 82% da

concentrao obtida por LC-MS/MS
126

Concluses

Analticas

Desenvolvimento de dois mtodos LC-MS/MS para dosagem de cortisol em

plasma e leite bovinos;
Mtodos que utilizam baixos volumes de amostra;
O uso de matriz simulada (BSA para o plasma) e quantificao frente a curva
no extrada possibilitaram bons resultados analticos;

Veterinrias

No h diferena entre os nveis de cortisol do incio e do final da ordenha;

Plasma tem concentrao de cortisol maior que leite;
A concentrao de cortisol em plasma correlaciona-se linearmente com a
concentrao de cortisol em leite;
Animais com mastite subclnica apresentam menor nvel de cortisol que
animais sadios (tanto por LC-MS/MS quanto por ELISA)
ELISA de saliva humana aplicado a leite bovino superestima em mdia 82% a
concentrao obtida por LC-MS/MS
127

Cloranfenicol
Listado no Anexo IV da EU Council Regulation 2377/90
Substncia proibida para uso em produtos de origem animal desde 1994.
No exite MRL estabelecido para qualquer alimento.

128

Condies de LC

Coluna Waters Symmetry C8, 4.6 x 50mm, 3.5m

Fluxo 1.0 ml/min, Split 2:1
Fase mvel
Solvente A 0.1% de cido Frmico em H2O
Solvente B 0.1% de cido Frmico em CH3CN

Volume de injeo 50l

0 min

100% A

0.1min

75% A, 25% B

6 min

44% A, 56% B

Tempo total = 12 min

129

Espectro de MS
MS
30JULYCAP_04 13 (0.440) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (12:15)

Scan ES1.46e5

321

100

323

325
255 257

283

357

384

m/z
220

240

260

280

300

320

340

360

380

400
130

Espectro de MS/MS
MS/MS CE = 12
30JULYCAP_03 2 (0.068) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (2:32)

Daughters of 321ES321 6.50e5

100

321 257

257
152
194

176

237 249

m/z
120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320
131

Espectro de MS/MS
MS/MS CE = 18
30JULYCAP_01 6 (0.203) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (2:18)

Daughters of 321ES5.24e5

152

100

321 152

176
257

194
127

148

321

m/z
120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320
132

Espectro de MS/MS
MS/MS CE = 18
30JULYCAP_02 50 (1.692) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (27:50)

Daughters of 323ES3.05e5

152

100

323 152

176

151

194
129

257 259
249

148

323

m/z
120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320
133

Transies de MRM
Electrospray Negativo
Monitoramento de 4 transies de MRM

Transition

MRM

Dwell Time Cone Voltage

Collision Energy

Quantification

321 152

0.08s

80V

16eV

1st Confirmation

321 257

0.08s

80V

10eV

2nd
Confirmation

323 152

0.08s

80V

16eV

Internal
Standard

326 157

0.08s

80V

16eV

134

Cromatogramas de LC-MS/MS
Standard 0.05 g/kg
05Sep_05 Sm (Mn, 1x2)
100

Padro interno

%
0
05Sep_05 Sm (Mn, 1x2)
100

MRM of 4 Channels ES323 > 152

1.56e3

3.20

2a transio de confirmao

%
1
05Sep_05 Sm (Mn, 1x2)
100

MRM of 4 Channels ES321 > 257

1.44e3

3.20

1a transio de confirmao

%
1
05Sep_05 Sm (Mn, 1x2)
100

MRM of 4 Channels ES321 > 152

2.31e3

3.20

Transio de Quantificao

%
1

MRM of 4 Channels ES326 > 157.1

7.74e3

3.17

2.40

2.60

2.80

3.00

3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

4.40

4.60

Time
135

MRM versus SIR?

Matriz de camaro com adio de 1g/kg
02Sep_09
100

SIR of 2 Channels ESS/N:PtP=22.54

323
5.50e4

SIR (MS)

0.95

1.99

1.02
1.51 1.73

0.48

2.30 2.58 2.93

1.30

0.58

3.20

1
02Sep_09

SIR of 2 Channels ES321

2.23e5

1.99

100

3.56 3.60 3.94 4.09

S/N:PtP=17.38
0.55

0
0.50

0.94 1.08 1.48 1.62

1.00

1.50

2.31 2.58

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

Time
136

MRM versus SIR?

Matriz de camaro com adio de 1g/kg
02Sep_10
100

MRM (MS/MS) Analysis

MRM of 3 Channels ESS/N:PtP=113.17

323 > 152
3.25
4.33e3

%
3.21
0.68

0
02Sep_10
100

3.78

MRM of 3 Channels ESS/N:PtP=163.95

321 > 152
6.91e3
3.24

0
0.50

3.33

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

Time
137

Curva de Calibrao em matriz de camaro

Compound name: Chloramphenicol
Correlation coefficient: r = 0.999858, r^2 = 0.999715
Calibration curve: 2.99162 * x + 0.0106534
Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None
2.42

Response

0.00
0.000

0.200

0.400

0.600

ug/Kg
0.800
138

DOCUMENTAO DA VALIDAO

PROTOCOLO DE VALIDAO
O protocolo de validao e um documento que descreve o
procedimento de validao a ser adotado, bem como seus
critrios de aceitao, de acordo com as particularidades do
mtodo a ser testado.
Este documento deve ser aprovado antes do inicio dos testes.
Seu uso e aprovao prvios constituem boas prticas de
laboratrio e devem ser adotados por todos os laboratrios que
pretendem validar seus mtodos analticos.

Protocolo
139

DOCUMENTAO DA VALIDAO

O PROTOCOLO DEVE CONTER

Mtodo a ser testado e seu objetivo
Parmetros avaliados
Critrios de aceitao
Descrio do POP analtico
Campos de elaborao, conferncia e aprovao

Protocolo
140

DOCUMENTAO DA VALIDAO

O RELATRIO DEVE CONTER

Mtodo a ser testado e seu objetivo
Parmetros avaliados
Critrios de aceitao
Descrio do POP analtico
Campos de elaborao, conferncia e aprovao
EXEMPLO

RELATRIO DE
VALIDAO

RELATRIO
141

Validao de metodologias
analticas

Requisitos mnimos
RE899
Controle de
Robustez Qualidade
Exatido
Especificidade

Literatura disponvel

Linearidade

Treinamento

Intervalo

Tempo analtico
Material de consumo para
anlises
Padres

Repetibilidade
Preciso
Intermadiria
LIQ

Pessoal

Documentao protocolos e relatrios

LD

Ref: Fernanda Bido, tese mestrado IPT- USP

142

ESTATISTICA:
a arte de torturar seus dados at eles
confessarem o que voc quer!!

143

Resumo das Tcnicas Estatsticas Aplicveis

Objetivo
Preciso repetitividade
reprodutibilidade
Compatibilidade das mdias entre
si
Comparao de mdias com um
valor ou entre si

Tcnica Utilizada
Analise da Varincia
Teste F de Snedecor
Prova de significncia t

Compatibilidade entre diferentes

situaes com diferentes amostras

Prova de emparelhamento

Verificar interferentes
Exatido
Rejeio de valores

Planejamento Experimental
Programa Interlaboratorial
Dixon, Grubbs, Cochran, Bartlet,
Huber
Carta de controle

Comparar com especificaes

144

CONCLUSO
ESPECTROMETRIA DE MASSAS PERMITE ALTO GRAU DE
CONFIANA E ESPECIFICIDADE
IDENTIFICAO DE FORMA INEQUIVOCA
MTODO DE CONFIRMAO NOS PROCESSOS DE
VALIDAO
triplos quadrupolos permitem a obteno de menores LD, de forma
que podem ser mais adequados em casos de compostos com
menores LMR.
distino entre compostos isobricos de interesse ou provenientes da
matriz, quando estes produzem um espectro de massas com ons fragmentos
distintos.
Equipamentos de alto custo?
Problema ? No!
TRABALHOS EM COLABORAO!!
145

Bibliografia

Miller ,JC; Miller JN ;Estadstica para Qumica Analtica Segunda

Edio Addison Wesley Iberoamericana 1993
ASTM D3244-97 Standard Practice for Utilization of Test Data to
Determine Conformance with Specifications
Guidelines for the validation of screening methods for residues of
veterinary medicines (initial validation and transfer)- Community
reference laboratories residues -2010 disponivel em :
http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/Guideline_
Validation_Screening_en.pdf
ANTIGNAC,J.P. LE BIZEC B. MOMTEAU, F. Validation of analytical
methods based on mass spectrometric detection accordingo to
2002/657/EC european decision guideline and application; Anal.
Chim. Acta v 483, p325-334 2003
The fitness for purpose of analytical methods(1998) A laboratory
guide to method validation and related topics, Eurachem guide,1st
English edn,1.0 LGC(Teddington)Ltda
146

You are all invited to attend the 4th Brazilian

MS Conference !!

147

AGRADECIMENTOS

A vocs pela
presena!

equipe de quantificao do Laboratrio Thomson: Rosy, Andria ,Phellipe e

Christina
E ao Prof Marcos Eberlin.

148

O IV BrMASS AGRADECE A TODOS OS PATROCINADORES DOS

CURSOS