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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ALTERACIONES EN LA NEUROTRANSMISIN GLUTAMATRGICA EN EL


NCLEO ACCUMBENS, COMO UN MARCADOR TEMPRANO EN LA
CONDUCTA DE ADICCIN A LA COMIDA GRASA.
Por
CARLOS RAFAEL VEGA HERRERA

DIRECTOR: Dr. Alberto Camacho Morales


CODIRECTOR: Dra. Ilse Delint Ramrez

Anteproyecto de tesis como requisito para obtener el Ttulo de


QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOLOGO
13/02/2014

DISCIPLINA Y CAMPO DE INVESTIGACIN: Biologa, Neurociencias.

LUGAR DE TRABAJO: Centro de Investigacin De Ciencias de la Salud (CIDICS),


Campus Ciencias de la Salud UANL.

FECHA DE INICIO: Diciembre 2013

DURACIN PROBABLE: 6 meses

INTRODUCCIN
La Organizacin Mundial de la Salud define la obesidad como "una condicin de la
acumulacin anormal o excesiva de grasa en el tejido adiposo, en la medida en que la salud
podra verse afectada". Una forma simple de medir la obesidad es el ndice de masa
corporal (IMC), esto es el peso de una persona en kilogramos dividido por el cuadrado de la
talla en metros. Una persona con un IMC igual o superior a 30 es considerada obesa y con
un IMC igual o superior a 25 es considerada con sobrepeso. A nivel mundial, el 44% de la
diabetes, el 23% de las cardiopatas isqumicas y 7-41% de determinados cnceres son
atribuibles al sobrepeso y la obesidad. Alguna vez considerados problemas de pases con
ingresos altos, la obesidad y el sobrepeso estn en aumento en los pases con ingresos bajos
y medios, especialmente en las reas urbanas. En 2008, 1400 millones de adultos (de 20 y
ms aos) tenan sobrepeso. Dentro de este grupo, ms de 200 millones de hombres y cerca
de 300 millones de mujeres eran obesos. El 65% de la poblacin mundial vive en pases
donde el sobrepeso y la obesidad se cobran ms vidas de personas que la insuficiencia
ponderal. Al menos 2,8 millones de personas cada ao mueren como resultado de tener
sobrepeso u obesidad. La prevalencia de obesidad se ha duplicado entre 1980 y 2008. A
nivel mundial, ms de 40 millones de nios en edad preescolar tenan sobrepeso en 2008.
La obesidad infantil es uno de los ms graves problemas de salud pblica del siglo 21. Los
nios con sobrepeso son propensos a convertirse en adultos obesos. Ellos tienen ms
probabilidades que los nios sin sobrepeso de desarrollar diabetes y enfermedades
cardiovasculares a una edad ms joven, que a su vez se asocian con una mayor probabilidad
de muerte prematura y discapacidad. Para un individuo, la obesidad suele ser el resultado
de un desequilibrio entre las caloras consumidas y las caloras gastadas. En el mundo, se
ha producido un aumento en la ingesta de alimentos hipercalricos que son ricos en grasa,
sal y azcares pero pobres en vitaminas, minerales y otros micronutrientes, y un descenso
en la actividad fsica como resultado de la naturaleza cada vez ms sedentaria de muchas
formas de trabajo, de los nuevos modos de desplazamiento y de una creciente urbanizacin.
(1)
Otras causas indirectas incluyen entornos obesognicas que promueven el exceso de
consumo de alimentos azucarados o grasos, susceptibilidad gentica, disfunciones
biolgicas y los factores psicosociales como la depresin, el bajo nivel socioeconmico o el
abuso de sustancias. El vnculo con el abuso de sustancias, as como las similitudes entre el
comportamiento de las personas que comen en exceso y los que abusan de las drogas o el
alcohol, ha llevado a la sugerencia de que comer en exceso debe ser tratada como una
forma de adiccin a la comida. Comer en exceso es un trastorno neurolgico como la
adiccin a las drogas o el alcohol? Los recientes avances en la neurociencia sugieren que
podra ser, lo que podra tener consecuencias profundas para el tratamiento de las personas
obesas y las polticas de salud pblica para hacer frente a la creciente epidemia de obesidad.
La obesidad no se incluye como un trastorno de la alimentacin en el diagnstico de la
American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
4th Edition (DSM-IV), que las clases de trastornos como "perturbaciones graves en la
conducta alimentaria" de la alimentacin. En la actualidad, los trastornos alimenticios en el
DSM-IV incluyen la anorexia nerviosa y la bulimia nerviosa, pero algunos han propuesto la
inclusin de comer en exceso como un trastorno adictivo en el prximo DSM-V. (2)

En el consumo de alimentos y drogas ambos resultan en la liberacin de dopamina en las


regiones mesolmbico y el grado de liberacin se correlaciona con la recompensa subjetiva
de alimentos y el consumo de drogas. Patrones similares de activacin cerebral en respuesta
a la alimentacin y las seales de drogas tambin se ha encontrado. (3)
Nuestro cerebro est programado para responder y buscar recompensas inmediatas. Aunque
la ingesta de alimentos y el peso corporal estn bajo la regulacin homeosttica, cuando la
comida muy apetitosa est disponible, la capacidad de resistir el impulso de comer depende
de autocontrol. No hay regulador homeosttico para comprobar el consumo de drogas
(incluido el alcohol). Hay evidencia creciente de que la interrupcin de la homeostasis de
energa puede afectar a los circuitos de recompensa y que el consumo excesivo de comida
gratificante puede conducir a cambios en el circuito de recompensa que resultan en la
ingesta de comida compulsiva similar al fenotipo visto con la adiccin. La investigacin en
la adiccin ha producido nuevas evidencias que alude a caractersticas comunes
significativas entre los sustratos neurales que subyacen a la enfermedad de la adiccin y al
menos algunas formas de obesidad. (4)
El sistema mesolmbico se compone de reas cerebrales interconectadas, incluyendo el
rea ventral tegmental, la corteza prefrontal medial (mPFC), y el ncleo accumbens
(NAC). En conjunto, estas reas del cerebro que median comportamientos naturales de
gratificacin incluyendo alimentacin, el consumo, la conducta materna, la vinculacin
social, y el comportamiento sexual. (5)

El ncleo accumbens (NAC) es una estructura cerebral localizado en el cerebro anterior


basal de los vertebrados, y ha sido el blanco de las drogas adictivas. Los diferentes
sistemas de neurotransmisores a nivel de los circuitos NAC se han vinculado a los
diferentes problemas de adiccin a las drogas, al igual que el uso compulsivo y la
recada. El sistema del glutamato se ha relacionado principalmente a la recada
despus de la extincin de bsqueda de drogas. El sistema de la dopamina se ha
relacionado principalmente con el uso compulsivo de la droga. La hiptesis de la
homeostasis del glutamato se centra en la dinmica de los niveles sinpticos y
extrasinpticos de glutamato, y su impacto en los circuitos de la corteza prefrontal
(PFC) para el NAC. (6)

DEFINICION DEL PROBLEMA y JUSTIFICACIN:


La obesidad es problema de importancia mundial que est afectando a millones de
personas, que se est relacionando cada vez con diferentes enfermedades. Este trabajo es
una aportacin al conocimiento relacionado con la obesidad clasificndolo como un
trastorno mental y debe ser tratado como una adiccin. Contribuyendo a reforzar la teora
que establece que realmente existe una adiccin a la dieta grasa mediante medicin de la
expresin de los receptores glutamatergicos, que ya est muy bien conocido en las drogas
de abuso.

OBJETIVO GENERAL:
Encontrar patrones de adiccin en la expresin de los receptores glutamatergicos.

OBJETIVOS PARTICULARES:
Alimentar ratones con dieta grasa durante 6 semanas para obtener ratones obesos.
Separar los ratones con comportamiento adictivo, no adictivos y control mediante la prueba
de Preferencia de Lugar.
Obtener el ncleo accumbens del cerebro del ratn y aislar los sinaptosomas.
Comparar la expresin de los receptores glutamatergicos de los ratones adictos, no adictos
y control mediante la tcnica de Western Blot.

HIPOTESIS:
Se espera un porcentaje de adiccin del 70% de ratones adictos y una relacin AMPA /
NMDA en los receptores glutamatergicos.

ANTECEDENTES
En la actualidad, el DSM-IV define la dependencia de sustancias que cumplen con tres o
ms de los siguientes siete criterios: tolerancia, abstinencia; sustancia tomada en cantidades
mayores o por ms tiempo de lo previsto; persistente el deseo de reducir la ingesta o
esfuerzos infructuosos para limitar o controlar el uso; gran cantidad de tiempo dedicado a la
obtencin, uso o recuperacin de la sustancia; abandono de las actividades sociales,
laborales o recreativas debido al uso, y el uso continuo a pesar de un "problema fsico o
psicolgico recurrente causado o exacerbado por la sustancia". Joan Ifland, presidenta de la
Fundacin refinado Adiccin a la Comida Research, una organizacin de beneficencia con
sede en Texas, EE.UU., han aplicado estos criterios a la sobrealimentacin de los alimentos
refinados por las personas que son clasificados como "adictos a la comida. Como tal, ellos
argumentan que estas personas cumplen con los criterios del DSM-IV para la dependencia
de sustancias. Hay tambin pruebas neurolgicas que apoyan para su discusin a partir de
las similitudes de comportamiento observadas entre comer en exceso y la dependencia de
sustancias, los resultados neurobiolgicos de los modelos animales, los estudios de
neuroimagen en humanos y la investigacin gentica de la susceptibilidad a la obesidad. (2)
La evidencia sugiere que ciertos estilos de comer, como comer en exceso, comer
compulsivo y comer en exceso crnico, se asemejan a la conducta de las personas adictas a
las drogas. De hecho, las similitudes entre algunas formas de comer en exceso y la adiccin
a las drogas pueden derivar del mismo desequilibrio en ciertas vas neuronales que median
la motivacin para comer determinados alimentos o tomar drogas, y los que controlan estos
impulsos. El sistema de recompensa de dopamina es fundamental para este comportamiento
dirigido a un objetivo: actividades placenteras como comer, el sexo o el consumo de drogas
desencadenan la liberacin de dopamina en un rea del cerebro medio llamada el ncleo
accumbens. Esta liberacin de dopamina seala que estas actividades son vale la pena
repetir. (2)
Otras ideas sobre las bases neurolgicas de la obesidad provienen de estudios
realizados en animales de consumo excesivo de azcar. Despus de perodos de ayuno,
el acto de atracones de azcar provoca niveles excesivos de dopamina y la liberacin de
opioides en el cerebro que se asocian con el consumo patolgico. Del mismo modo, la
administracin crnica de una dieta alta en azcar reduce la actividad de la dopamina
en la va de recompensa lmbico; un cambio tambin se asocia con un aumento en los
umbrales necesarios para entregar recompensa tal como se mide por la estimulacin
elctrica del cerebro. Esta evidencia sugiere que las ratas expuestas crnicamente al
azcar desarrollan un estado de deficiencia de recompensa similar a la observada en
los casos de adiccin a las drogas. La interrupcin brusca del consumo crnico de
azcar tambin produce sntomas conductuales similares a abstinencia de la herona
en los animales, como castaeteo de dientes y los indicadores de ansiedad. Muchas de
las observaciones realizadas en modelos animales han sido apoyadas por estudios de
neuroimagen humanos. La resonancia magntica funcional (fMRI) durante la presentacin
de los alimentos claves para las personas con trastornos que comen compulsivamente, por
ejemplo, se encontr patrones de activacin en las regiones del cerebro similares a los
observados en las personas adictas que responden a las seales relacionadas con las

drogas. Las personas obesas tambin comparten varias caractersticas de personalidad con
los toxicmanos. (2)
El consumo de alimentos, ms que comer por hambre, y algunas drogas son impulsados
inicialmente por sus propiedades de recompensa, lo que en ambos casos implica la
activacin de vas de la dopamina (DA) mesolmbica. Alimentos y drogas de abuso activan
vas DA diferente. La alimentacin activa el circuito de recompensa del cerebro, tanto a
travs de la palatabilidad (implica los opioides endgenos y cannabinoides) y a travs de
aumentos en la glucosa y las concentraciones de insulina (implica los aumentos de DA),
mientras que las drogas activan este mismo circuito a travs de sus efectos farmacolgicos
(a travs de efectos directos sobre las clulas DA o indirectamente a travs de los
neurotransmisores que modulan las clulas DA como los opiceos, la nicotina, el cido aminobutrico o cannabinoides). (4)
El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central (SNC)
y ejerce sus efectos a travs de la activacin de varios subtipos de receptores. El glutamato
media la transmisin sinptica excitatoria rpida entre las neuronas a travs de los
receptores ionotrpicos de -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoazolepropionicacid (AMPA), Nmetil-D-aspartato (NMDA) y los receptores de kainato. Adems, el glutamato ejerce un
papel modulador importante del tono excitador rpido establecido por los receptores
ionotrpicos por la activacin de la familia receptores de glutamato metabotrpico
(mGluR). Receptores ionotrpicos y metabotrpicos de glutamato interactan en el ajuste
fino de las respuestas neuronales en diferentes condiciones de actividad y su colocalizacin indica que el glutamato modula la neurotransmisin y la excitabilidad neuronal
en las mismas sinapsis. (7)
En el caso especfico de la cocana, se ha demostrado que la exposicin aguda y crnica de
drogas aumenta la relacin de los receptores de AMPA y NMDA corrientes mediadas en
diferentes reas del cerebro, lo que sugiere un aumento de la eficacia sinptica en las
entradas excitadoras. Junto con los cambios en el AMPA y del receptor de NMDA mediada
por la transmisin, la exposicin al frmaco altera la plasticidad sinptica dependiente de
mGluR. mGluRs-I y-II mGluRs han sido implicados en estos fenmenos, as como en la
adaptacin del comportamiento evocada-drogas. (8)

MATERIAL Y MTODOS:
Se utilizara un grupo de 25 ratones durante 6 semanas.
20 ratones sern alimentados con dieta grasa (45% grasa) y dieta control (10% grasa).
Tendrn libre acceso a las dietas que estarn colocadas en compartimientos, cada uno
separados a los extremos de la jaula donde se encontrara el ratn colocado individualmente.
Los 5 ratones restantes se utilizaran como controles y solo sern alimentados con dieta
control.
Se pesara el consumo de cada dieta cada tercer da durante el experimento. Al igual el peso
del ratn al principio y al final del experimento para medir el incremento de peso.
Pasadas las 6 semanas se realizara la prueba de condicionamiento de lugar, que es utilizada
para evaluar la condicin de adiccin del ratn.
Prueba de condicionamiento de lugar
La prueba se lleva a cabo en un total de 14 das
1er da. Pre condicionamiento
Se coloca al ratn en el compartimiento que se encuentra en medio de la cmara clara y la
oscura con las puertas cerradas. Las cmaras no contienen dieta alguna.
Despus se abren las puertas y el ratn tiene libre acceso a las dos cmaras, se mide el
tiempo que permanece en cada una durante 20min.
El ratn naturalmente tiene preferencia por estar en lugares oscuros con sus excepciones.

Da 2 al 13. Entrenamiento
Los ratones alimentados con comida grasa son separados en grupos segn su preferencia de
permanecer ms tiempo en la cmara oscura o clara.

Cada ratn permanecer durante 6 das en la cmara clara y al igual 6 das en la cmara
oscura con la puerta cerrada durante 30min, tendr acceso a dieta grasa en el
compartimiento al que permaneci por menor tiempo y dieta control al compartimiento que
permaneci por ms tiempo. A los ratones control se les colocara igualmente dieta control
en la cmara clara y oscuro durante los 12 das, no tendrn acceso a dieta grasa durante el
experimento.
Da 14. Preferencia de lugar
Se coloca al ratn en el compartimiento que se encuentra en medio de la cmara clara y la
oscura con las puertas cerradas. Las cmaras no contienen dieta alguna.
Despus se abren las puertas y el ratn tiene libre acceso a las dos cmaras, se mide el
tiempo que permanece en cada una durante 20min.
Se evala el cambio de tiempo en comparacin con el primer da de pre condicionamiento.
Si el ratn cambio de preferencia y ahora permanece en la cmara que originalmente no era
de su agrado se le puede considerar al ratn como adicto.
Aislamiento de sinaptosomas
Despus de finalizada la prueba de preferencia de lugar, se sacrifican los ratn por
dislocacin cervical. Se extrae el cerebro mantenindolo con solucin salina y en hielo.
Despus se procede a separar el ncleo accumbens que se encuentra en el rea tegmental
ventral.

Buffer A sin Tritn. Buffer B sin sacarosa, Tritn 1%. Diluir pastilla en 1mL, solo dura 15
das viable la pastilla. Pastilla de inhibidores, 200uL por cada 10mL.

Se obtienen las fracciones que se encuentran en la sinapsis: perisinapsis, somas, Densidad


postsinaptica (PSD). Se procede a realizar la prueba de Western Blot para cada fraccin.

Western Blot
Se hace cuantificacin de protenas para cada una de las fracciones, para despus igualar las
concentraciones de protenas que se van a cargar en el gel.
Las muestras preparadas con laembli buffer sern cargadas en el gel de poliacrilamida de
8%.
Se trataran de cargar en cada gel muestras que procedentes de ratones adictos, no adictos y
control para su comparacin.
Despus de cargar las muestras en el gel, se hace el corrimiento en la cmara de
electroforesis a 90mV por 1hr aproximadamente.
Terminada la electroforesis se procede a hacer la trasferencia a una membrana de
Nitrocelulosa dejando la trasferencia en hielo durante 2hrs a 130 o 12hrs a 30mV.
Despus de que se han trasferido las protenas a la membrana se retira de la cmara
desechando el gel, y se bloquea la membrana con TBS-Tween BSA 5% por una hora a
temperatura ambiente.
Ya bloqueada la membrana se incuba con los anticuerpos de inters:
-

NR2A

NR2B

GLUR1

mGLUR2-3

NR1

Actina

Los anticuerpos primarios se diluyen con TBS-Tween BSA 1% y el respectivo anticuerpo


secundario con TBS-Tween BSA 5%, durante una hora a temperatura ambiente o a 4C por
12hrs.
Despus de aplicar el anticuerpo primario se realizan 4 lavados de 5 min con TBS-Tween, y
para el anticuerpo secundario 3 lavados de 5 min con TBS-Tween y uno con TBS.
Despus de realizados los lavados se revelan las membranas usando una solucin
quimioluminiscente en el equipo Chemidoc, donde se obtienen imgenes de la expresin de
las bandas de las protenas de inters.
Al final las bandas se analizan con un programa que mide la densidad de pixeles de cada
una de las bandas y se compara con el control de carga, en este caso utilizare la actina.
La prueba de Western Blot me servir para analizar los patrones de expresin de los
receptores glutamatergicos. Por ejemplo la relacin NMDA/AMPA que se observa en la
adiccin y los receptores metabotrpicos.

LITERATURA CITADA:
1. World Health Organization (WHO). http://www.who.int/en/
2. Natalia M. Lee, Adrian Carter, Neville Owen & Wayne D. Hall. 2012. The
neurobiology of overeating. EMBO Rep. 13(9): 785790.
3. Ashley N. Gearhardt, MS, MPhil; Sonja Yokum, PhD; Patrick T. Orr, MS, MPhil;
Eric Stice, PhD; William R. Corbin, PhD; Kelly D. Brownell, PhD. 2011. Neural
Correlates of Food Addiction. Arch Gen Psychiatry. 2011; 68(8): 808-816.
4. Nora D. Volkow, Gene-Jack Wang, Dardo Tomasi, Ruben D. Baler. 2013. The
Addictive Dimensionality of Obesity. Volume 73, Issue 9, Pages 811-818.
5. Kyle K. Pitchers, Susanne Schmid, Andrea R. Di Sebastiano, Xu Wang, Steven R.
Laviolette, Michael N. Lehman, Lique M. Coolen. 2012. Natural Reward
Experience Alters AMPA and NMDA Receptor Distribution and Function in the
Nucleus Accumbens. PLoS One; 7(4): e34700.
6. Gabriel C Quintero. 2013. Role of nucleus accumbens glutamatergic plasticity in
drug addiction. Neuropsychiatr Dis Treat. 2013; 9: 14991512.
7. N Hovels, F Sotty, L.P Montezinho, P.S Pinheiro, K.F Herrik, and A Mrk. 2012.
Therapeutic Potential of Metabotropic Glutamate Receptor Modulators. Curr
Neuropharmacol; 10(1): 1248.
8. Camilla Bellone and Manuel Mameli. 2012. mGluR-dependent synaptic plasticity in
drug-seeking. Front Pharmacol; 3: 159.