Anlise Instrumental

CROMATOGRAFIA
Aula 1: Princpios bsicos

Cromatografia

Introduo definio e histrico

Modalidades
Mecanismos de separao
Teoria bsica

Cromatografia

Tcnicas de separao isolar o composto de interesse dos demais compostos

e impurezas presentes na amostra, possibilitando sua deteco por
instrumentos analticos.
At a metade do sculo XX tcnicas clssicas (precipitao, extrao
destilao).
Avanos nos equipamentos e a descoberta de diferentes modos de separao
cromatogrfica grande parte das separaes passaram a ser feitas por
cromatografia.

Cromatografia x tcnicas clssicas de separao

Possibilidade de automao de todas as etapas da anlise.
Anlises mais rpidas.
Melhor desempenho.
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Cromatografia

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao no qual os componentes a

serem separados so distribudos entre duas fases: uma que permanece estacionria
(FE) e outra que se movimenta atravs dela, denominada fase mvel (FM).
Separao: interao diferencial dos componentes entre a fase estacionria e a fase
mvel.
Fase estacionria
Componentes da
mistura

Fase mvel

Cromatografia
O termo cromatografia foi utilizado pela primeira vez em 1903: Mikhael Tswett

(botnico), na separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes slidos empregando hidrocarboneto como solvente (fase mvel).
Solvente (FM)
Mistura de
pigmentos

CaCO3

Pigmentos
separados

Origem grega: chrom (cor) e graphe (escrever) - o processo de separao no depende da cor,
exceto para facilitar a identificao dos componentes.
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Cromatografia

Critrios usados para classificao das diferentes modalidades de cromatografia:

Disposio da fase estacionria (forma fsica do sistema).

Estado fsico da fase mvel (lquido, gs ou fluido supercrtico) e da fase estacionria

(lquido ou slido).

Mecanismos de separao.

Cromatografia
De acordo com a disposio da fase estacionria forma fsica do sistema de separao:

Colunas
Recheadas

Abertas

Planar
Camada delgada

Papel

d.i.: de 0,02 mm (capilares) a 1,0 m (preparativas)

Comprimento: de 3 cm a 100 m
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Cromatografia
Cromatografia em coluna - classificao de acordo com a natureza da fase mvel e da
fase estacionria:

FM

Lquido (amostra solvel na FM)

Gs (analitos volteis e termoestveis)
Fluido supercrtico (T e P > ponto crtico)

Sistema

Fase mvel

Gs

Colunas

Classificao
universal

FSC

Lquido

FE

Slido
Lquido espalhado sobre um suporte slido
Lquido imobilizado/quimicamente ligado

Fase estacionria

Tipo de cromatografia

Lquido

Gasosa (Gs-lquido CGL)

Slido

Gasosa (Gs-slido CGS)

Fase ligada

Gasosa com FE ligada - CGFL

Slido

Supercrtica com FE slida - CSS

Fase ligada

Supercrtica com FE ligada - CSFL

Lquido

Lquida (Lquido-lquido CLL)

Slido

Lquida (Lquido-slido CLS)

Fase ligada

Lquida com FE ligada - CLFL

8

Cromatografia
De acordo com o mecanismo de separao (processos fsicos, qumicos ou mecnicos):
Mecanismo

Adsoro

Fase mvel

Sistema

Tipo de cromatografia

Gs

Coluna

Gasosa (gs-slido)

FSC

Coluna

Fluido supercrtico-slido

Coluna

Lquida (lquido-slido)

Planar

Camada delgada

Gs

Coluna

Gs-lquido

FSC

Coluna

Fluido supercrtico-lquido

Planar

Papel

Coluna

Lquida (lquido-lquido)

Lquido

Partio

Lquido
Troca inica

Lquido

Coluna

Lquida de troca inica

Bioafinidade

Lquido

Coluna

Lquida de bioafinidade

Excluso
molecular

Lquido

Coluna

Permeao e Filtrao em gel

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Cromatografia

Processo interfacial: ocorre na interface entre a FM e a FE slida.

Fase mvel (gs, lquido ou FSC)

FE slida

Soluto adsorvido

Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, porosas).

ADSORO

Slidos com muitos stios ativos (hidroxilas, pares de eltrons etc).

Solutos polares.
10

Cromatografia

Processo intrafacial: ocorre no interior do filme de FE lquida.

Fase mvel (gs, lquido ou FSC)
Suporte
slido

Soluto absorvido na FE lquida

Fase estacionria lquida

Filmes espessos de FE lquida.

ABSORO (PARTIO)

Grande superfcie lquida exposta fase mvel.

Interao elevada entre a FE lquida e o analito (alta solubilidade).
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Cromatografia

+
- +

- - + + + +

Trocador
aninico

Fase mvel (soluo inica - tampo)

+ + -

nions do soluto (ctions - trocador catinico)

Grupos inicos ligados fase

estacionria

Grupos sulfnicos (-SO3-)

cidos carboxlicos (-COO-)
Aminas quaternrias (-NR3+)

Adsoro reversvel e diferencial de analitos inicos ou ionizveis sobre grupos

trocadores de ons presentes na superfcie da FE (resina de troca inica).

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Cromatografia

Fase mvel lquida (alterao do pH ou fora

inica para eluio da molcula de interesse)

Suporte
slido

Molcula complementar especfica presente na amostra

Grupos biolgicos especficos Substratos/enzimas
Protenas/acares e protenas celulares
ligados ao suporte

Grupos com especificidade biolgica ligados ao suporte retiram da fase mvel somente
os grupos complementares, deixando passar todos os demais. Aps isolamento, a

molcula de interesse eluda da coluna por meio de mudanas nas propriedades da

fase mvel.
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Cromatografia

Mecanismo de separao essencialmente MECNICO

Fase mvel lquida
Molculas de soluto de diferentes tamanhos
Partcula porosas de FE (gel de dextrano, agarose ou poliacrilamida)
Molculas menores conseguem penetrar nos poros das partculas de FE, e ficam retidas.
Macromolculas com tamanho suficientemente grande no entram nos poros e so arrastadas
rapidamente pela fase mvel.

Separao de protenas, enzimas, polmeros, carboidratos e outras

molculas de peso molecular elevado.
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Cromatografia

Escolha a tcnica cromatogrfica mais adequada para cada uma das aplicaes a
seguir, indicando o mecanismo envolvido.
a) Anlise de hidrocarbonetos de baixa massa molar (volteis e estveis termicamente)
em amostras de combustveis.
b) Anlise de polmeros para determinao da massa molar aps a sntese.
c) Isolamento de uma protena presente em clulas sanguneas.
d) Separao de uma mistura de frmacos de carter neutro, presentes na formulao
de um medicamento.
e) Determinao de aminas bioativas (triptamina, tiramina, feniletilamina e histamina)
em amostras de alimento.

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Cromatografia
CROMATGRAFO ANALTICO - MDULOS FUNDAMENTAIS
Sistema de propulso
de fase mvel

Bomba de alta presso (cromatografia lquida) ou a prpria

presso do gs (cromatografia gasosa).

Mdulo de injeo

Introduo de parte da amostra diretamente no fluxo da

fase mvel.

Coluna
cromatogrfica

Contm a FE - onde ocorre a separao cromatogrfica.

Detector

Dispositivo que gera um sinal eltrico proporcional

quantidade de analito eluda.

Registrador ou
computador

Registra e processa o sinal do detector em funo do tempo

de anlise: CROMATOGRAMA.
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Cromatografia
CROMATOGRAMA (SINAL x TEMPO DE ANLISE): representa o resultado final do

Idealmente, cada composto separado aparece

como um nico pico cromatogrfico, com
tempo de reteno tR caracterstico e rea
proporcional a sua concentrao na amostra.

Sinal (resposta)

processo de separao cromatogrfica.

tR

10

Tempo (min)

15

20

17

Cromatografia
O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o
TEMPO DE RETENO AJUSTADO tR

Tempo mdio que as molculas de soluto ficam retidas na FE.

Tempo de reteno tR
o tempo necessrio, a partir da
injeo da mistura na coluna, para
que o composto chegue at o
detector.

tM = tempo de retardamento da FM
(primeiro pico no cromatograma tempo de eluio de um composto
que no interage com a FE).

Resposta do detector

tR = tR - tM
tR'
tR
tM

10

Tempo (min)

15

20

18

Cromatografia
Embora no seja diretamente mensurvel, outro parmetro fundamental de reteno
o VOLUME DE RETENO AJUSTADO VR
Volume de fase mvel eludo enquanto o analito est retido na FE.
vazo da faze mvel

(tR = tR tM) x FC VR = VR - VM
Volume de reteno VR
Volume de fase mvel necessrio para eluir o analito.
VM = volume de fase mvel necessrio para um composto no retido sair da coluna, representa o
volume de FM contido no interior da coluna cromatogrfica.
Medidas de tempo e volume utilizadas para fins qualitativos (para identificao dos
compostos) e para o clculo dos demais parmetros cromatogrficos (Resoluo, seletividade e
eficincia) que, do ponto de vista prtico, so os fatores que governam o sucesso da separao
cromatogrfica.
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Cromatografia
RELAO ENTRE RETENO E A CONSTANTE DE DISTRIBUIO(KC)
Coluna: srie de estgios hipotticos independentes onde ocorre o equilbrio entre o
analito dissolvido na FE e na FM.

[A]S
KC
[A]M

KC = constante de distribuio
[A]S = concentrao do analito na FE
[A]M = concentrao do analito na FM

Afinidade pela FE

[A]S

MENOR RETENO
Afinidade pela FM

[A]M
20

Cromatografia
Fator de reteno ou fator de capacidade (k)
Razo entre as massas de analitos contidas na FE e na FM ou razo entre os tempos que
o analito passa na FE e na FM.

mS t'R

mM t M

Expressando o equilbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invs da

concentrao:
m
k
[A]S S
mS
VS

[A]S
V
m
V
KC
KC S S M
[A]M
mM mM VS

mM
V
M
[A]M

VM
Razo entre os volumes
de FM e FE na coluna

KC = k x
k = KC/

O fator de reteno depende da constante termodinmica

de distribuio e da razo de fases da coluna.
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Cromatografia
Seletividade ou fator de separao ()
Para que ocorra a separao entre dois analitos necessrio que eles sejam retidos
diferencialmente pelo sistema, isto , que este seja seletivo.
A SELETIVIDADE () expressa a
diferena de reteno entre dois
picos adjacentes.

Como

k = tR / tM

t'R 1

t'R 2

k1 tM

k 2 t M

Obs.: tR1 > tR2

k1

k2

Como k funo das afinidades dos analitos pela FM e FE, a escolha correta
destas determina a seletividade do sistema.
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Cromatografia
Uma outra medida da separao de dois compostos adjacentes a RESOLUO (RS).

tR2 tR1
tR2 tR1
1,177

R S 2
wh 1 wh 2
wb 1 wb 2
tR2
t
tR1

tM
wh2

INJEO

wh1

Tempo

wb1

wb2

tR1 e tR2 = tempos de reteno de dois picos adjacentes envolvidos no clculo;

wb1 e wb2 = largura dos picos na base, em unidades de tempo;
wh1 e wh2 = largura dos picos a meia-altura, em unidades de tempo.
23

Cromatografia
RESOLUO (RS)

24

Cromatografia
EFICINCIA de sistemas cromatogrficos
o parmetro mais utilizado por fabricantes
de equipamentos e colunas.
Capacidade de eluio com o mnimo de
disperso do analito.
Tempo

A migrao do analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento de sua

banda.
Problemas do alargamento excessivo de picos:

Picos

mais largos e de menor

intensidade = menor detectabilidade.

Separao deficiente de analitos com

retenes prximas.
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Cromatografia
Quantificao da eficincia
Supondo a coluna como uma srie de
estgios hipotticos e separados onde
ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e
a FM:

Cada estgio de equilbrio

chamado de PRATO TERICO.

O nmero de pratos tericos (N) de uma coluna pode ser

calculado a partir do cromatograma por:
2

tR
tR

N 1 6
5 ,5 4 5

wh
wb

tR
wb

Coluna mais
eficiente
26

Cromatografia
O nmero de pratos pode ser afetado por vrios fatores, incluindo as condies de
anlise, o tamanho da amostra, o tipo de soluto e, principalmente, o comprimento da
coluna.

Por essa razo, a comparao entre diferentes colunas feita usando-se a medida da
altura equivalente a um prato (H):

H=L/N

sendo L=comprimento da coluna

Coluna mais
eficiente

Exemplo:

Coluna 1 (L:5 cm) N=10.000 pratos H=0,0005 cm

Coluna 2 (L:15 cm) N=18.000 pratos H=0,0008 cm
27

Cromatografia
Variveis que afetam a EFICINCIA da coluna
Existem vrios fatores que provocam o alargamento de picos, e consequentemente,
perda de eficincia das separaes, e a relao entre estes fatores e a altura
equivalente a um prato representada pela equao de van Deemter:

B
H A C

= velocidade linear da FM = L / tM

A alargamento dos picos devido aos

mltiplos caminhos seguidos pelas molculas
da amostra. (colunas recheadas)

Colunas com d.i. pequenos.

Partculas pequenas e uniformes.
Recheio homogneo.

28

Cromatografia
Variveis que afetam a EFICINCIA da coluna
B difuso molecular do soluto na FM.
Quanto maior o tempo que o soluto
permanece na FM, maior o valor de B.
Inversamente proporcional velocidade linear
da FM.

H (m)

C velocidade de transferncia de molculas

do soluto da FE para a FM. Quanto maior a
espessura do filme lquido de FE, maior o
termo C e menor a eficincia. Diretamente
proporcional velocidade linear da FM.

Aumentar a vazo da FM.

Diminuir a vazo da FM.

Empregar FE com filmes finos.

H = A + B/ + C
C

Hmnimo
A
B/
tima

Velocidade linear da FM (m s-1)

29

Cromatografia
Simetria de pico Fator de assimetria (As)
Quando o formato do pico cromatogrfico se desvia do perfil descrito por uma
distribuio gaussiana ele denominado assimtrico.
O fator de assimetria (As) calculado
a 10 % da altura do pico.

Picos assimtricos prejudicam a resoluo e a repetibilidade das

separaes cromatogrficas.

30

Cromatografia
Relao entre RESOLUO, SELETIVIDADE e EFICINCIA
Como o objetivo principal da separao cromatogrfica resolver os compostos da
amostra, para se otimizar uma separao devem-se considerar os parmetros que
influenciam a resoluo, que so eficincia, seletividade e reteno relativa dos picos.

Equao geral da RESOLUO

N
RS
4

k 2 1

1
2

Eficincia N
Distribuio dos compostos dentro da coluna k
Seletividade

Otimizao da separao
1. Modificar o fator de reteno (k)
Cromatografia gasosa: programao de temperatura do forno da coluna.
Lquida: trocar a FM; aumentar a temperatura do forno da coluna; variar a composio da FM.

2. Modificar o fator de separao ()

Trocar a FE (coluna).

3. Modificar a eficincia (N)

Alterar a vazo.
Trocar a coluna por outra mais longa, ou com dimetro menor.
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Cromatografia
Efeito do aumento da eficincia e da seletividade na resoluo

N
32

Cromatografia
O cromatograma apresentado a seguir foi obtido a partir da separao de quatro agrotxicos
por cromatografia lquida de alta eficincia. O pico nmero 1 referente acetona que, neste
caso, no apresenta interao com a FE. Calcule o TEMPO DE RETENO AJUSTADO, FATOR DE
RETENO e EFICINCIA para todos os agrotxicos, e a SELETIVIDADE e RESOLUO para os
dois compostos mais retidos.

wb5= 0,9 min

wb4= 0,7 min
wb3= 0,5 min
wb2= 0,4 min
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Cromatografia

Dentre as colunas listadas na tabela a seguir, qual apresenta a maior eficincia?

Coluna

Comprimento
(cm)

Nmero de
pratos

85

115.000

4.800

15

9.000

100

3.200

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Fundamentos de Cromatografia. Carol H. Collins, Gilberto L. Braga e

Pierina S. Bonato; Campinas, SP: Editora da UNICAMP, 2006.

Princpios de Anlise Instrumental. Douglas A. Skoog,

F. James Holler e Timothy A. Niemam; 5.ed., Porto

Alegre, RS: Bookman, 2002.

Fundamentos de Qumica Analtica. Douglas A.

Skoog, Donald M. West, F. James Holler e Stanley R.

Crouch; 8.ed., So Paulo, SP: Thomson, 2005.

Anlise Qumica Quantitativa. Daniel C. Harris; 6.ed.,

Rio de Janeiro, RJ: LTC, 2005.
35

Aula 2 Cromatografia gasosa

Aula 3 Cromatografia lquida

36