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Determinao de Lipdios
O teor de gordura do leite bovino varia em funo da raa do animal; entretanto, 3,5% podem ser
considerados como um valor mdio. O mtodo mais comumente utilizado para a determinao de
lipdios no leite o do butirmetro de GERBER.
Material necessrio para anlise
- butirmetro de Gerber
- Pipeta de 11 ml
- Pipeta de 10 ml
- Pipeta de 1 ml
Reagentes
- cido sulfrico (D = 1,820)
- lcool amlico
Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta adaptada a uma "pera" de borracha, 10 ml de cido sulfrico para
um butirmetro de Gerber (Figura 2). Adicione, lentamente, com uma pipeta, 11 ml da amostra e 1 ml
de lcool amlico (estas adies devem ser feitas sem molhar internamente o gargalo do butirmetro).
Arrolhe e agite at completa dissoluo. Coloque o butirmetro em um banho a 75C (rolha para baixo)
e espere at que haja completa separao da camada oleosa. A seguir, centrifugue a 3.000 rpm durante
5 min em centrfuga de GERBER (Figura 3). Manejando a rolha, coloque a camada amarelo-clara dentro
da haste graduada do butirmetro. O nmero de ml ocupado pela camada oleosa dar diretamente a
porcentagem de lipdios.
Determinao da acidez
A determinao da acidez no leite frequentemente utilizada e, inclusive, considerada como prova de
rotina nas indstrias de laticnios, pois fornece indcios sobre o estado de conservao do produto. No
caso de o leite ter sido ordenhado e estocado de forma inadequada, o nmero de microrganismos
presentes ser bastante elevado, gerando uma acidez acima dos limites considerados normais.
A acidez do leite pode ser expressa das seguintes maneiras:
1) Acidez em graus Dornic (D)
Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipeta de 10 ml
- Erlenmeyer de 50 ml
- Bureta de 25 ml
Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotas
de indicador fenolftalena. Titule com soluo de NaOH 1/9 N at o aparecimento de uma colorao
rsea.
Clculo
V x 10 = acidez D
V = volume de NaOH 1/9 N gasto na titulao
Obs.: - A partir desta titulao (utilizando NaOH 1/9 N) pode-se, tambm, expressar a acidez do leite em
% de cido ltico, fazendo-se os seguintes clculos:
100 ml de sol. de NaOH 1/9 N ---------------- 0,44 g de NaOH
X ml gastos na titulao ---------------- Z g NaOH
1 mol de NaOH reage com 1 mol de cido ltico
40 g de NaOH --------------------------- 90 g de cido ltico
Z g de NaOH ---------------------------- Y g de cido ltico
Para se obter o resultado em porcentagem:
10 ml de leite (quantidade de amostra) -------- Y g de cido ltico
100 ml de leite ----------------------------------- W g de cido ltico
W = % de cido ltico
Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotas
do indicador fenolftalena. Titule com uma soluo de hidrxido de sdio 0,1 N at o aparecimento de
uma colorao rsea.
Clculo
a) em soluo normal
b) em cido ltico
3) Prova do Alizarol
No fornece resultados quantitativos, mas apenas indica se o leite est cido, normal ou alcalino. Este
frequentemente utilizado pela indstria no momento de recepo do leite.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta de 5 ml
- Tubos de ensaio de 20 ml
Reagentes
- Soluo de Alizarol
Procedimento
Transfira, com auxlio de uma pipeta, 5 ml de leite para um tubo de ensaio. Adicione 5 gotas da soluo
de alizarol.
Resultados possveis
- colorao vermelho-tijolo ------------ leite normal
- colorao amarelada ------------------- leite com acidez alta
- colorao azulada ---------------------- leite alcalino
Determinao de conservantes
Como j foi dito anteriormente, um leite ordenhado e estocado em condies no adequadas,
provavelmente apresentar, aps algumas horas, uma contagem microbiana bastante elevada, gerando
no produto uma acidez acima dos limites permitidos pela legislao. Este fato certamente far com que
o produto seja rejeitado ao chegar ao laticnio. Numa tentativa de evitar que isto ocorra, o produtor
pode fazer a adio de substncias que impedem o desenvolvimento microbiano acentuado. Essas
substncias so conhecidas como conservantes. Dentre elas, temos: cido brico e boratos; cido
saliclico e salicilatos; gua oxigenada; formaldedo e antibiticos. Entretanto, deve-se salientar que a
adio de qualquer uma dessas substncias no leite considerada ilegal segundo a legislao vigente
em nosso pas.
1) gua oxigenada
Fundamento: baseado na seguinte reao:
H2O2 + 2 KI
2KOH + I2
Reagente
- Soluo de iodeto de potssio 40%
Procedimento
Transfira 5 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 2 ou 3 gotas de soluo de KI 40%. O
aparecimento de uma colorao amarelada indicar a presena de H2O2.
2) Antibiticos
Material necessrio para a anlise
- Pipeta estril de 1 ml
- Placas de petri estreis
- Meio de cultura
- Cultura B. subtilis
Procedimento
Colocar 0,5 ml da suspenso de B. subtilis em uma placa de petri estril. Em seguida colocar 15 ml do
meio de cultura, esterilizado e resfriado a +/- 40C. Deixar solidificar. Embeber discos de papel
(previamente esterilizados) em leite e colocar sobre o meio. Repetir o mesmo procedimento, s que
embebendo os discos em leite contendo antibitico. Incubar a 37C/24 horas. Observar a formao do
halo de inibio ao redor dos discos embebidos com leite contendo antibitico.
3) Formol
Fundamento: reao que ocorre entre aldedo e fenol, resultando no aparecimento de uma colorao
salmo.
Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipetas de 1, 2 e 10 ml.
- Tubo de ensaio de 30 ml
- Soluo de floroglucina a 1%
- Soluo de hidrxido de sdio a 10%
Procedimento
Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 1 ml da soluo de floroglucina 1% e 2 ml
da soluo de NaOH 10%. Agite. Na presena de formaldedo, aparecer uma colorao salmo.
4) cido Brico e Boratos
Fundamento: chama de colorao verde, caracterstica do boro.
Material necessrio para a anlise
Reagentes
- Pipeta de 1, 10 e 25 ml.
- Cpsula de porcelana
- Erlenmeyer de 100 ml
- Tubo de vidro dobrado em ngulo reto
- Banho-maria
Procedimento
Mea 25 ml da amostra e transfira para uma cpsula de porcelana. Adicione 3 gotas de soluo de NaOH
10%. Aquea at carbonizao e transfira o resduo para um erlenmeyer. Adicione 1 ml de H2SO4 (D =
1,84). Aquea em banho-maria por 10 minutos. Esfrie e adicione 10 ml de lcool metlico. Adapte, ao
frasco, uma rolha atravessada por um tubo de vidro dobrado em ngulo reto. Aquea o frasco e Inflame
os vapores observando a colorao da chama. Reao positiva chama com colorao verde.
Determinao de espessantes
Existem substncias que podem ser adicionadas intencionalmente ao leite com a finalidade de mascarar
a adio de gua, fazendo com que o mesmo tenha a sua densidade corrigida. Essas substncias so
chamadas de espessantes. Neste grupo, as substncias mais comumente utilizadas e, portanto,
pesquisadas, so: amido, sacarose, urina e gelatina.
1) Amido
Fundamento: esta determinao se baseia no fato de que o amido reage com o iodo produzindo uma
colorao azul.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta graduada de 10 ml
- Tubo de ensaio de 50 ml
Reagentes
- Soluo saturada de iodo
Procedimento
Mea 10 ml da amostra em uma pipeta, transfira para um tubo de ensaio e aquea at a ebulio em
bico de Bunsen. Resfrie em gua com gelo. Adicione 2 gotas de uma soluo saturada de iodo. Na
presena de amido aparecer uma colorao azul.
2) Sacarose
Fundamento: a determinao de sacarose se baseia no fato de que os acares em presena de cidos
concentrados sofrem desidratao produzindo furfurais, os quais se condensam com fenis. Como
resultado dessa reao aparece uma colorao avermelhada.
Material necessrio para a anlise
- Pipeta graduada
- Tubo de ensaio de 50 ml
- Banho-maria
Reagentes
- cido clordrico
- Resorcina
Procedimento
Mea 15 ml da amostra com auxlio de uma pipeta e transfira para um tubo de ensaio de 50 ml.
Adicione 1 ml de cido clordrico e 0,1 g de resorcina. Agite e aquea em banho-maria por 5 minutos. Na
presena de sacarose, aparecer uma colorao avermelhada.
MTODO DE
ANLISE
Densidade
Lactodensmetro
Acidez
Dornic
Lipdios
Butirmetro
Resduo seco
Disco de
Ackermann
Ponto de
congelamento
Crioscopia
Amido
Reao c/ iodo
Sacarose
Formol
Condensao de
furfural + fenol
Reao de aldedo
+ fenol
H2O2
Reao com KI
cido Brico
Anlise da chama
Antibitico
Crescimento de
microrganismos
INDICAO
Fraude por adio
de gua ou
desnatagem
Estado de
conservao do
leite
Fraude por adio
de gua ou
desnatagem
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Fraude por adio
de gua
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao
Estado imprprio
de conservao
LIMITES
1,028 - 1,032
16 20D
3% mnimo
8,5% mnimo
-0,54 - 0,56C
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido
No permitido
PROVAS ENZIMTICAS
A pesquisa da peroxidase e fosfatase, duas enzimas normalmente presentes no leite, til no sentido de
fornecer informaes a respeito do processo de pasteurizao, indicando se o mesmo foi ou no
realizado adequadamente.
A peroxidase uma enzima que tem capacidade de desdobrar a gua oxigenada. destruda quando o
leite submetido s temperaturas de 70 a 80C, dependendo do tempo de aquecimento. Portanto, a
peroxidase ser inativada, caso a temperatura de pasteurizao tenha sido ultrapassada o que tornar o
leite inadequado ao consumo, bem como, produo de queijo.
A fosfatase, enzima que inativada nas temperaturas de pasteurizao, no deve ser detectada em leite
adequadamente pasteurizado. Caso contrrio (fosfatase positiva) deve-se suspeitar de uma relao
tempo/temperatura insuficiente no processo de pasteurizao, ou ento, de uma mistura de leite
pasteurizado com leite cru.
de costume, tambm, se pesquisar em leite, outra enzima: a redutase. A pesquisa da redutase fornece
indicaes quanto ao estado de higienizao do leite, sendo, portanto, uma prova bastante utilizada (no
Brasil) para se fazer a classificao do leite em tipo "A", "B" e "C", uma vez que tal classificao feita
basicamente em funo da populao microbiana do produto. A prova de redutase fundamentada na
capacidade que apresentam os microrganismos de reduzir o azul de metileno. Deve-se salientar que o
tempo de reduo inversamente proporcional ao nmero de microrganismos presentes no leite.
1) Prova de Redutase
Material necessrio para a anlise
Reagente
- Tubo de ensaio de 30 ml
- Pipeta de 1 e 25 ml
Procedimento
Em um tubo de ensaio estril, coloque 20 ml de leite e adicione 0,5 ml de soluo aquosa de azul de
metileno 2,5%. Feche o tubo, misture e leve a estufa a 37oC, at completa descolorao. Observar o
tempo decorrido desde a mistura do leite com o corante at o completo descoramento. Qualificar o
leite de acordo com a seguinte tabela:
Excelente
Bom
Aceitvel
Mdio
Mau
Pssimo
2) Prova de fosfatase
Esse teste pode ser realizado por meio de kit especfico facilmente encontrado no mercado
especializado. As recomendaes de uso feitas pelo fabricante devem ser rigorosamente observadas.
Leites adequadamente pasteurizados devem apresentar resultados negativos para a fosfatase.
3) Prova de Peroxidase
Material necessrio para a anlise
Reagente
- Tubo de ensaio de 20 ml
- Pipeta de 2 e 10 ml
- Soluo de guaiacol 1%
- gua oxigenada de 10 vol.
Procedimento
Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio, adicione 2 ml de soluo de guaiacol e 2 a 3 gotas
de gua oxigenada. Agite. O aparecimento de uma colorao salmo indica que o leite no foi aquecido
alm de 75C por mais de 15 minutos.
INDICAO
Condies de
pasteurizao
Condies de
pasteurizao
Estado de higienizao
RESULTADOS ESPERADOS
Positivo
Negativo
Tempo mnimo de 3 horas
e 30 minutos para leite
tipo "B"
Anlises Microbiolgicas
COLHEITA E PREPARO DA AMOSTRA PARA ANLISES MICROBIOLGICAS
Para a colheita de leite cru de lates ou de tanque de resfriamento deve-se proceder a homogeneizao
do leite com equipamentos adequados e em seguida passar o leite para frasco esterilizado.
Para leite beneficiado deve-se colher o leite em suas embalagens prprias e ntegras sendo que em
qualquer caso, a amostra deve ser mantida sob refrigerao at o momento das anlises que devem ser
realizadas o mais rpido possvel. Todo o material a ser utilizado em anlises microbiolgicas deve estar
rigorosamente limpo e esterilizado.
Planos de amostragem
Pode-se trabalhar com amostra indicativa ou com amostra representativa, sendo a primeira quela
composta por um nmero de unidades amostrais inferiores ao estabelecido em plano de amostral
constante na legislao especfica.
A amostra representativa aquela constituda por um determinado nmero de unidades amostrais
estabelecidos de acordo com o plano de amostragem determinado em legislao. Assim, para amostras
representativas, estabelecida, no caso do leite fludo, a colheita aleatria de 5 (cinco) amostras do
mesmo lote deve-se utilizar os quadros 1, 2, 3,4 e 5 conforme o microrganismo analisado e quando
tratar-se de amostra indicativa utilizar o valor de m constantes nestes mesmos quadros como padro
microbiolgico aceitvel.
Preparo das diluies das amostras
A partir da amostra integral, prepara-se a diluio -1 pipetando-se 1ml de leite em 9ml de soluo salina
0,85%; a partir da diluio 10 -1 (1:10) prepara-se as diluies necessrias, 10 -2 (1:100), 10 -3 (1:1000), e
assim sucessivamente transferindo 1ml da amostra para tubos contendo 9ml de soluo salina a 0,85%,
sempre homogeneizando.
Figura: Preparo das diluies (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:
http://www.sbrt.ibict.br).
Crescimento de aerbios mesfilos em gar Padro para Contagem (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Esquema representando a semeadura em duplicata de cada diluio (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Figura: Esquema de semeadura e crescimento de aerbios mesfilos (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
.
Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br
Semeadura para coliformes totais em CVLB em triplicata e Resultado positivo para coliformes totais em CVBL com turvao e formao de gs nos tubos de
Durham (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Quadro 2. Critrios microbiolgicos para Coliformes totais ou Coliformes a 30/35oC em leite fludo.
.Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br
.Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br
Resultados positivos para coliformes termotolerantes no caldo EC com formao do anel vermelho (A) e formao de gs em tubo de Durham no caldo
triptona (B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:
http://www.sbrt.ibict.br).
Aspecto de leite com fermentao natural sem contaminao por microrganismos deteriorantes (A) e com fermentao por microrganismos psicrotrficos
(B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Procedimento
As trs diluies selecionadas devem ser semeadas em gar padro para contagem (PCA) previamente
distribudo nas placas (aproximadamente 15 ml), utilizando o plaqueamento em superfcie com auxlio
de ala de Drigalsky espalhando todo o inculo por toda a superfcie do meio at que todo o excesso de
lquido seja absorvido. O volume a ser semeado de cada diluio de 0,1ml, tambm em duplicata e a
incubao deve ser em temperatura baixa que pode ser de 7C/10dias, de 18C/45 horas ou de
21C/25horas com as placas invertidas. Para a contagem, deve-se seguir o mesmo procedimento
utilizado para aerbios mesfilos, porm multiplicar o resultado por 10 (dez) para levar em conta o
volume dez vezes menor inoculado no plaqueamento em superfcie. O nmero de psicrotrficos no
deve exceder a 10% do total de aerbios mesfilos.
CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA (*)
Princpio
A contagem de estafilococos coagulase positiva pode ser feita com dois objetivos, sendo um relacionado
sade pblica para confirmar o envolvimento desta bactria em surtos de intoxicao alimentar, e
outro com o controle da qualidade higinico sanitria do processo de produo do leite e derivados, e
neste caso da bactria serve como indicador de manipulao inadequada e falhas na higienizao de
equipamentos.
Procedimento
Utiliza-se o meio gar Baird-Parker (IN 62/2003). Antes de o uso fundir e resfriar a 50C; adicionar para
cada litro do meio base 50 ml de emulso de gema de ovo a 50% e 3 ml de soluo aquosa de telurito de
potssio a 3,5% esterilizada por filtrao; homogeneizar bem e distribuir em placas, submetendo teste
de esterilidade (incubar a 35C/24h); o plaqueamento deve ser por superfcie inoculando-se 0,1ml de
cada diluio selecionada, inclusive 0,1ml da amostra integral (sem diluio); incubar as placas
invertidas a 36C 1 por 30-48 horas; selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias; contar as
colnias tpicas, negras brilhantes com anel opaco, rodeado por um halo claro transparente,
destacando-se sobre a opacidade do meio; contar tambm as colnias atpicas, acinzentadas ou negras
brilhantes sem halo ou com apenas um dos halos.
Crescimento de colnias tpicas de estafilococos em gar Baird-Parker (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Aps a seleo de 3-5 colnias tpicas e atpicas de cada placa, semear em tubos contendo caldo
crebro-corao (BHI), incubados a 35C por 24 horas; a partir deste caldo deve-se efetuar a prova para
pesquisa da presena de coagulase.
Para a pesquisa da presena de coagulase deve-se transferir 0,2 ml de cultivo para tubos contendo
0,5ml de plasma de coelho oxalatado; incubar a 35C por 6 horas e verificar a presena de coagulao
(reao positiva); quando negativa reincubar at 12 horas.
Prova da coagulase para estafilococos sendo A um resultado positivo (coagulao) e B negativo. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises
Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
(*) a IN 51/2002 no prev a contagem de estafilococos coagulase positiva em leite fludo, mas sim, nos derivados do leite.
Procedimento
Adicionar 25 ml da amostra em 225 ml de caldo lactosado (pr-enriquecimento) e manter em
temperatura de 35C/18-24h; aps esta fase de pr-enriquecimento, transferir 1,0mL para 10,0mL de
caldo tetrationato (TT) e 1,0mL para 10,0mL de caldo selenito cistina (SC) incubando ambos a
35C/24h0, que corresponder fase de enriquecimento seletivo; aps esta fase deve-se proceder ao
plaqueamento diferencial em meios de cultura especficos e para isso deve-se inocular uma alada do
caldo TT em placas contendo gar entrico de Hektoen (HE), gar bismuto sulfito (BS) e gar xilose lisina
desoxiciolato (XLD); repetir esse procedimento com o caldo SC e incubar todas as placas invertidas a
35C/24he verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella.
Para identificar as colnias tpicas devem-se observar as morfologias desenvolvidas nos meios de
crescimento:
- gar HE: colnias transparentes verde-azuladas com ou sem centro preto;
- gar BS: colnias marrons ou pretas com ou sem brilho metlico;
- gar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto.
Meios de cultura utilizados no plaqueamento diferencial e crescimento de Salmonella. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises
Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
Quando presentes, pelo menos duas colnias tpicas devero ser semeadas em gar Lisina Ferro (LIA) e
gar Trplice Acar Ferro (TSI), incubados a 35 C/ 24h, e verificando-se reao tpica para Salmonella
(Figura 14). Para a identificao das culturas positivas podem ser submetidas ao kit API 20E para de
Salmonella ou realizarem-se as provas bioqumicas tradicionais. Deve-se ter de Salmonella spp. em leite
fludo.
Confirmao preliminar de colnias tpicas de Salmonella em LIA e TSI. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para
Qualidade do Leite Fludo, disponvel em: http://www.sbrt.ibict.br).
BIBLIOGRAFIA
INSTITUTO ADOLFO LUTZ, So Paulo. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. So Paulo, 2005, 371p.
ROSSI, ELIZEU ANTONIO, Prticas de anlise e processamento de leite: material didtico destinado s
aulas prticas da disciplina de tecnologia de laticnios -1 edio. - Araraquara: [s.n.], c2010. 1 CDROM; 4 3/4pol.
Instruo Normativa No. 62/2004. Oficializa os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas
para
Controle
de
Produtos
de
Origem
Animal
e
gua.
Disponvel
em:
http://extranet.agricultura.gov.br/sislegisconsulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=28
Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, Centro de
Apoio ao Desenvolvimento Tecnolgico da Universidade de Braslia CDT/UnB, 2007, disponvel em:
http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=