CLAE

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA
CENTRO DE CINCIAS DA SADE

DEPARTAMENTO DE CINCIAS FARMACUTICAS
Cromatografia Lquida de Alta

Eficincia Aplicada a Produtos Naturais
JOSEAN FECHINE TAVARES

1
Histria
Conceito:
Partio e Adsoro
Sua definio e procedimento tem cerca de 105 anos.
A grande variedade de combinaes entre as fases
mveis e estacionrias a torna uma tcnica
extremante verstil e de grande aplicao.
Histria
.
Mikhail Semenovich Tswett, 1872 - 1919
Cromatografia foi empregado em 1903 por um botnico russo
Praticamente todo seu trabalho foi dedicado ao estudo de

pigmento vegetais.
A partir da vrios trabalhos na rea permitiu seu aperfeioamento.

3
Histria
ter de
petrleo
mistura de
pigmentos
CaCO3
pigmentos
separados
Histria
Archer Martin (n. 1910)

Premio Nobel de qumica, 1952
Richard Synge (1914-1994)

Premio Nobel de qumica, 1952
Desenvolveram em 1941, a cromatografia de partio.
Desenvolvimento do primeiro tratamento matemtico da

teoria cromatogrfica.
5
Histria
Cromatografia a Gs X Cromatografia a Lquido
A cromatografia a gs (CG ou GC) demonstrou,

desde o seu aparecimento, uma potencialidade
enorme devido sua eficincia, facilidade, baixo
custo e possibilidade de analisar misturas volteis de
alta complexidade.
Molculas volteis e estveis termicamente

6
Histria
Cromatografia a Gs X Cromatografia a Lquido:
A cromatografia a lquido no necessita de

volatilidade, mas sim de solubilidade das amostras na
fase mvel.
A cromatografia a lquido permite, entre outras, a

anlise das seguintes classes principais de compostos:
Protenas, cidos nuclicos, aminocidos, corantes,,
metablitos de plantas, etc.
7
Histria
No final dos anos 60 e subsequente, houve avanos nos estudos

tericos e prticos na cromatografia a lquido, e isso demandou
uma tecnologia muito diferente da empregada at a aquela poca.
Estudo Terico:
Mecanismo de separao cromatogrfica;
Influncia da Temperatura;
Influncia da Presso e fluxo da fase mvel;
Influncia da natureza do solvente puro e das misturas de
solventes usadas na separao e tempo de anlise;
Influncia da natureza da fase estacionria;
Histria
Estudos Prtico:
Uso de partculas na fase estacionria extremamente
pequenas (< 10 micra de dimetro);
Uso de solventes ultra puros;
Uso de diferentes detectores (seletivos e sensveis);
Bombas de alta presso mantendo preciso e exatido
para baixos fluxos e alto fluxos;
A utilizao destas novas fases, associada ao desenvolvimento

instrumental, levou esta tcnica a uma melhor performance em
termos de resoluo, quantificao e deteco em um menor
tempo de anlise.
9
Instrumentos da CLAE
A CLAE uma tcnica que atualmente emprega um

conjunto de equipamentos especiais denominados de
mdulos.
Mdulos bsicos so:

Reservatrio de solventes;
Bomba (para bombear a fase mvel);
Sistema de Introduo da amostra;
Sistema de deteco;
Sistema de registro;
10
Mdulos especiais so:

Desgasificador;
Uso de mais de uma bomba;
Auto-injetor;
Forno;
Sistema de armazenamento de registro (computador)
11
Fonte: http://www.lcresources.com/resources/getstart/2g01.htm
12
Reservatrio
O frasco deve ser de vidro (borosilicato), e ou

dependendo da fase mvel empregada, deve ser de
teflon ou outro polmero conveniente;
Sua tampa deve ter furos de passagem da tubulao da

fase mvel, e de um gs (hlio) para desgasificao. A
linha de solvente, possui obrigatoriamente na sua
extremidade, um filtro de ao inoxidvel
13
Reservatrio
Fonte: http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Equipment_Supplies__
Books/Glassware_Catalog/Chromatography.html
14
Bombas para CLAE
As bombas empregadas em CLAE:

Devem operar a presses de at 500 atm (516
kgf/cm2);
As vazes empregadas vo de 0,005 at 3 ml/min
(CLAE analtica);
Elas no devem ser corrodas pelas fases mveis
empregadas;
15
Bombas para CLAE
Fonte: http://www.shimadzu.com.br
16
Bombas para CLAE
Tcnicas de Bombeamento:
Bombeamento isocrtico: a composio da fase

mvel constante durante toda a anlise
cromatogrfica (corrida)
Bombeamento por gradiente: a composio da

fase mvel varia durante a anlise cromatogrfica
(corrida)
17
Bombas para CLAE
Tcnica de Bombeamento por gradiente:

Gradiente formado a baixas presses;
Gradiente formado a altas presses;
18
Bombas para CLAE
Injetor
Coluna
Gradiente de Baixa Presso
Bomba
Vlvula
(solenide)
D
19
Bombas para CLAE
Injetor
Misturador
Bomba 1
Coluna
Gradiente de Alta Presso
Bomba 1
B
20
Sistema de Introduo da Amostra
A injeo da amostra feita com auxlio de vlvulas especiais que

permitem a introduo, com grande preciso e exatido, de
quantidades mnimas;
Loops (extenso da tubulo que serve como armazenamento)

so calibrados por extenso do tubo e no por volume. Assim,
um loop de 20 L no tem exatamente 20 L;
No injetar volumes entre 50% e 200% do loop. Cerca de 20%

amostra perdida. Preciso ruim.
21
Sistema de Introduo da Amostra no
Injetor Manual
Fonte: http://www.shimadzu.com.br
22
Sistema de Introduo da Amostra no
Injetor Automtico
Permite :
Alto desempenho em termos de
velocidade de injeo da
amostra;
Alta produtividade;
Excelente Repetibilidade, etc.
23
Sistema de Separao (Coluna)
A coluna o corao do
cromatgrafo, pois a parte
principal do equipamento.
Em CLAE temos trs tipos de
colunas:
Pr-coluna;
Coluna de guarda;
Colunas propriamente ditas.
24
Analticas
Preparativas
Partculas de 15-100 m
N baixo/baixa presso
Alta capacidade
Fluxo elevado
Partculas de 2-10 m
N alto/alta presso
Baixa capacidade
Fluxo reduzido
25
Pr-coluna colocado entre a bomba e o

injetor, sua finalidade :
Reter as impurezas da Fase Mvel para preservar a

coluna;
Fonte: http://www.mac-mod.com/tr/plumbing-tr.html
26
Si OH
O
Si OH
O
Si OH
Grupo Silanol
Partcula de slica: Carter cido e polar
A estrutura de uma partcula de slica
27
Fluxo de fase mvel
Fase estacionria
Componente A
Componente B
Mecanismo de Separao em Cromatografia por Partio
28
Fase Normal
Si OH
O
Si OH
O
Si OH
Grupo Silanol
Fase mvel mais polar diminui K. Ex: Hexano < CHCl3 < MeOH <
H2O.
Fase estacionria polar e fase mvel apolar.
29
Fase Reversa
Si
O
Si O
O
Si O
O
Si O
Grupo silanol quimicamente

ligado a um grupo C18, C8,
fenil, ciano, etc.
O grupo quimicamente ligado confere hidrofobicidade partcula de

slica.
Solventes: MeOH, MeCN, THF e H2O
30
Cuidados com a coluna:
Principal: Filtrar a sua amostra e fase mvel.

Usar uma pr-coluna ou filtro online.
No deixar a coluna armazenada sem fase mvel: usar os
vedadores (end-fittings).
No deixar a bomba sem fase mvel.
Remover cido, tampo e reagentes de pareamento inico
com fase mvel sem aditivos.
31
Sistema de Deteco
O detector o olho do sistema cromatogrfico;
Ele mede as mudanas de concentrao ou a massa dos

compostos da amostra que est deixando a coluna;
A interpretao dos registros dos detectores produz

dados qualitativo e quantitativos sobre a amostra;
32
Sistema de Deteco
Caractersticas de maior importncia dos detectores:

Sensibilidade;
Seletividade;
Exatido e preciso
Classes de Detectores:
Universal;
Seletivos;
33
Sistema de Deteco
Tipos de Detectores:
ndice de Refrao;
Eletroqumicos;
Absoro no UV e no Visvel;
Fluorescncia;
Espectrmetros de Massas;
Ressonncia Magntica Nuclear.
34
Sistema de Deteco
ndice de Refrao:
Medem as mudanas do ndice de refrao do
eluente das colunas.
Eletroqumicos:
Detectores
eletroqumicos se baseiam na
possibilidade de muitos compostos serem oxidados
ou reduzidos quando estiverem na presena de um
potencial eltrico.
35
Detectores de Fluorescncia:
Espectrmetros de Massas:
Medem as mudanas da fluorescncia no efluente das colunas

quando este for exposto a comprimentos de onda
selecionados.
Medem as mudanas de massas a partir da anlise

cromatogrfica (corrida) e as fragmentao dos analitos.
Ressonncia Magntica Nuclear:
Identificam as mudanas de RMN a partir da anlise

cromatogrfica (corrida) dos analitos nas amostras.
36
Instrumentos Da CLAE
Sistema de Deteco
Sada de fase mvel
Lmpada de tugstnio
ou deutrio
(visvel e UV)
Filtro
Clula de fluxo
Detector de
Ultravioleta Simples
(Single wavelenght)
Ou Detector de UV-Vis
de comprimento fixo
Fotodiodo
Feixe de referncia
Entrada de fase mvel
Feixe da amostra
Feixe de referncia
Amplificador 37
Sistema de Deteco
Sada de fase mvel
Grade de difrao
Lmpada de tugstnio
ou deutrio
(visvel e UV)
Clula de fluxo
Detector de
Ultravioleta de
Comprimento Variavel
Fotodiodo
Feixe de referncia
Feixe da amostra
Feixe de referncia
Amplificador
38
Sistema de Deteco
Sada de fase mvel
Luz da amostra que
absorveu em especficos
Lmpada de tugstnio
ou deutrio
(visvel e UV)
Clula de fluxo
Arranjo de Fotodiodos
Detector de UV
com arranjo de
diodos (UV
Photodiode array
detector - PDA) ou
(DAD diode array
detector).
A
Grade de difrao
39
Sistema de Deteco
Determinao da pureza de um pico utilizando o detector de arranjo de diodos
A
40
Sistema de Deteco
Valores de Cutoff no UV para os solventes mais usados em CLAE
Solvente
Metanol
MeCN
THF
1% AcOH
1% (Et)3NH2
10 mM KPO4
(nm)
205
190
230
230
235
190
41
Sistema de Aquisio
Pode ser utilizado um integrador ou

microcomputador para obter o cromatograma.
um
A identificao feita atravs do tempo de reteno.
Em caso de CLAE com arranjo diodos alm do tempo

de reteno, a identificao feita pelo espectro
UV/Visvel de cada componente do cromatograma.
42
Sistema de Aquisio
Cromatogramas
Fonte: http://www.fiery-foods.com/dave/aussiecap.asp
Fonte: http://www.cibnor.mx/servicios/dat/labs/elabmu.php?LAB_CLAVE=10011&FUNC=INFO_GEN
43
Interpretao de Cromatogramas
Tempo Morto: tm
Tempo de Reteno: tr
Nmero de Pratos Tericos: n
Altura equivalente a um prato terico: H
Resoluo: Rs
Fator de Reteno ou Capacidade: k
Fator de Seletividade ou Separao:
44
Tempo Morto (tm) o tempo de eluio de um soluto no retido.
Tempo de Reteno (tr) a medida entre o ponto de injeo e o
mximo do pico.
tr2
tr1
to
1
0
2
2
t (min)
45
Fator de Reteno ou Capacidade (k) - definida como

a razo entre o nmero de moles do soluto na fase
estacionria (Ns) e o nmero de moles do soluto na fase
mvel (Nm), sendo:
k = Ns / Nm
Fator de Reteno (k) em funo do tempo de reteno

(tr) e do tempo de um soluto no retido (to):
k = (tr to) / to
46
t2
t1
K(1) = (t1-to)/ t0
to
K(2) = (t2-to) / t0
2
1
0
Fator de Reteno (k)
t (min)
Cromatograma ideal em sistema isocrtico k esta entre 1 e 10, e nos casos

mais extremos entre 0,5 e 20.
47
Fator de Seletividade ou Separao () mede a

seletividade da separao para as duas bandas
adjacentes. a relao entre os fatores de reteno.
= k2 / k1
Fatores que afeta a seletividade:
pH da Fase Mvel;
Variaes da fase mvel e/ou estacionria;
Temperatura;
Fora inica, etc.
48
Resoluo (Rs): mede a qualidade da separao.

Leva em conta as larguras das bandas, alm de
seus respectivos tempos de reteno.
49
2(t 2 t1)
Rs
W1 W 2
1.18(t 2 t1)
Rs
W 0.5,1 W 0.5, 2
t1 e t2 so os tempos de reteno da primeira e segunda

bandas adjacentes.
W1 e W2 so as larguras na linha base
W0.5,1 e W0.5,2 so as larguras na linha base medidas a
meia altura
50
Cromatogramas com MeCN:H2O
90%MeCN
70%MeCN
80%MeCN
60%MeCN
51
Cromatogramas com MeOH:H2O
75% MeOH
60% MeOH
Diminui % MeOH: aumento na resoluo. 1 e 2 (bom), mas aumenta o tempo de

anlise (ruim).
Aumenta % MeOH: diminui tempo de anlise (bom), mas diminui resoluo entre
52
1 e 2 (ruim).
Nomograma para estimativa da fase mvel isoeluotrpica
10
20
30
40
50
60
40
50
60
70
70
80
90
100
MeCN:H2O
0 10
20
30
80
90
100
MeOH:H2O
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
THF:H2O
53
Nmero de Pratos (n) - mede a eficincia das condies

cromatogrficas, atravs dos tempos de reteno obtidos e do
alargamento de bandas.
utilizado para medir a performance da coluna, considerando

uma escolha adequada das condies.
n = 16 ( tr / wb )2
n = 5,54 ( tr / w0,5 )2
Altura Equivalente de um Prato (H) a correlao entre o

nmero de pratos tericos e o tamanho da coluna.
54
Clculo da Eficincia da Coluna
Quanto mais largo for um pico em relao ao seu tempo de

reteno, menos eficiente a coluna
Parmetros relacionados eficincia da coluna:
Nmero de pratos tericos (n): Quanto maior, mais eficiente.

Depende das dimenses da coluna
Altura equivalente a um prato terico (H): Quanto menor,
mais eficiente. Independe das dimenses da coluna
55
n = 5.54 (tr/W1/2)2
W1/2
tr
to
H=L/n
h/2
onde L o
comprimento da coluna.
56
Fatores que influenciam a eficincia (n)
Tamanho da coluna.
Forma e tamanho das partculas de slica.
Volume e massa da amostra
Temperatura
Fluxo da fase mvel ( grficos de Van Deemter)
57
CL e EM
120
m/Z
120
210
215
252
232
343
345
254
210
154
232
Coluna
cromatogrfica
Espectrmetro de
massa
343
345
252
154
254
58
Aplicaes da CL-EM
4h aps administrao em ratos
59
Aplicaes da CL-EM
Determinao de cido Aristolquico
60
61
APLICAES
62
Exerccio
Que explicao voc daria, comparando as 2 figuras abaixo, na
separao dos medicamentos (Dados: Coluna C18 com 25cm de
comprimento com 4mm de dimetro interno com 5m de
tamanho de partcula)
63
Exerccio
Tendo em vista a equao abaixo se diminusse de Wt/2 A
eficincia da separao aumentaria ou diminuiria? (Dados tr =
4 e Wt1/2 = 16)
N = 5.54 (tr/W1/2)2
W1/2
t
to
r
h/2
64

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Cromatografia Lquida de Alta

JOSEAN FECHINE TAVARES

Cromatografia foi empregado em 1903 por um botnico russo

Praticamente todo seu trabalho foi dedicado ao estudo de

A partir da vrios trabalhos na rea permitiu seu aperfeioamento.

Archer Martin (n. 1910)

Richard Synge (1914-1994)

Desenvolveram em 1941, a cromatografia de partio.

Desenvolvimento do primeiro tratamento matemtico da

Cromatografia a Gs X Cromatografia a Lquido

A cromatografia a gs (CG ou GC) demonstrou,

Molculas volteis e estveis termicamente

Cromatografia a Gs X Cromatografia a Lquido:

A cromatografia a lquido no necessita de

A cromatografia a lquido permite, entre outras, a

No final dos anos 60 e subsequente, houve avanos nos estudos

A utilizao destas novas fases, associada ao desenvolvimento

A CLAE uma tcnica que atualmente emprega um

Mdulos bsicos so:

Mdulos especiais so:

O frasco deve ser de vidro (borosilicato), e ou

Sua tampa deve ter furos de passagem da tubulao da

As bombas empregadas em CLAE:

Bombeamento isocrtico: a composio da fase

Bombeamento por gradiente: a composio da

Tcnica de Bombeamento por gradiente:

Gradiente de Baixa Presso

Gradiente de Alta Presso

A injeo da amostra feita com auxlio de vlvulas especiais que

Loops (extenso da tubulo que serve como armazenamento)

No injetar volumes entre 50% e 200% do loop. Cerca de 20%

Pr-coluna colocado entre a bomba e o

Reter as impurezas da Fase Mvel para preservar a

Partcula de slica: Carter cido e polar

A estrutura de uma partcula de slica

Fluxo de fase mvel

Mecanismo de Separao em Cromatografia por Partio

Grupo silanol quimicamente

O grupo quimicamente ligado confere hidrofobicidade partcula de

Cuidados com a coluna:

Principal: Filtrar a sua amostra e fase mvel.

O detector o olho do sistema cromatogrfico;

Ele mede as mudanas de concentrao ou a massa dos

A interpretao dos registros dos detectores produz

Caractersticas de maior importncia dos detectores:

Medem as mudanas da fluorescncia no efluente das colunas

Medem as mudanas de massas a partir da anlise

Ressonncia Magntica Nuclear:

Identificam as mudanas de RMN a partir da anlise

Pode ser utilizado um integrador ou

A identificao feita atravs do tempo de reteno.

Em caso de CLAE com arranjo diodos alm do tempo

Fator de Reteno ou Capacidade (k) - definida como

Fator de Reteno (k) em funo do tempo de reteno

Fator de Reteno (k)

Cromatograma ideal em sistema isocrtico k esta entre 1 e 10, e nos casos

Fator de Seletividade ou Separao () mede a

Fatores que afeta a seletividade:

Resoluo (Rs): mede a qualidade da separao.

t1 e t2 so os tempos de reteno da primeira e segunda

Diminui % MeOH: aumento na resoluo. 1 e 2 (bom), mas aumenta o tempo de

Nmero de Pratos (n) - mede a eficincia das condies