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Introducción
Adicional al impacto ambiental que suponen los residuos de pesticidas aplicados en estos
suelos, como es el caso del Carbaryl, se ha determinado que la pérdida de la calidad del
suelo que produce la aplicación de estas sustancias se relaciona directamente con una
disminución de la productividad (INIBAP et. al., 2004), constituyéndose así no solo en un
problema ambiental, sino que también tiene repercusiones económicas y sociales.
El carbaryl es uno de los carbamatos más utilizados para el control de una variedad de pestes
en varios tipos de cultivos de frutas, vegetales, algodón, etc. El mecanismo de acción del
carbaryl es inhibir la colinesterasa, una de las enzimas más importantes en el sistema nervios
de las personas, de vertebrados y de insectos. El carbaryl es relativamente seguro para los
mamíferos, tóxico para algunos microorganismos benéficos, altamente tóxico para peces y
parcialmente tóxico para las aves; particularmente este pesticida es extremadamente tóxico
para las abejas (Xu, 2000).
Si bien en el Anexo 2 del Libro VI, correspondiente a la Norma de Calidad Ambiental del
Recurso Suelo y Criterios de Remediación para Suelos Contaminados, no se incluyen al
carbaryl o al grupo de los carbamatos dentro de la Tabla 3: Criterios de Remediación o
Restauración, dentro del grupo pesticidas regulados para esta actividad (Ministerio de
Ambiente, 2004), es de gran importancia el tratamiento de suelos contaminados con
Carbaryl, para evitar la escorrentía de este pesticida a fuentes de agua, donde sí están
establecidas las concentraciones máximas de este carbamato, conforme a lo revisado
anteriormente; y para evitar la pérdida de calidad del suelo que pueda llevar a un bajo
rendimiento de producción de banano.
Objetivos
General
Específicos
- Comparar los resultados obtenidos para determinar cuál cepa es la más eficiente
biodegradando carbaryl.
- Analizar los resultados y recomendar diferentes aplicaciones a una escala mayor para
la biodegradación de carbaryl en suelos contaminados.
Marco Teórico
Este estudio se basa en la premisa de que en ciertos casos los productos xenobiótico
pueden ser solamente parcialmente degradados, en este caso se identificó que la cepa
50552 degradaba carbaryl a un compuesto más tóxico, el 1-naftol; y se identificó que la
cepa 50581 degradaba el 1-naftol completamente a CO2 y H2O por lo que se propuso el
uso de un consorcio de las dos cepas para la degradación integral de carbaryl
(Chapalamagu et. al,1991).
Medio de Cultivo
Para la determinación de la generación de CO2 se cubren los tubos de ensayo con papel
filtro empapados con una solución 1M de NaOH para retenerlo y realizar las mediciones
respectivas (Chapalamagu et. al,1991).
Resultados y Discusión
Todas los inóculos realizados con la cepa 50581 hidrolizaron el carbaryl a 1-naftol
utilizando el terminal metilcarbamato como fuente única de carbón, pero ninguno lo
degradó por completo, por lo que se inocularon estas muestras de 1-naftol con la cepa
50582 en la cual se detectó emisión de CO2 del sistema (Chapalamagu et. al,1991).
Cuadro 1. Hidrólisis de carbaryl por la cepa 50581 de Cuadro 2. Hidrólisis completa de carbaryl utilizando el
Pseudomonas sp., en negro la concentración de consorcio microbiano de las cepas 50581 y 50552 de
carbaryl, en rayas la concentración de 1-naftol, Pseudomonas sp. (Chapalamagu et. al,1991).
ambas concentraciones determinadas mediante
Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)
(Chapalamagu et. al,1991).
Como producto de este consorcio el autor propone la vía metabólica probable para la
degradación completa de carbaryl (Chapalamagu et. al,1991):
Este estudio identifica tres cepas distintas a las utilizadas por Chapalamagu et. al (1991)
para la degradación de carbaryl, utilizándolo como fuente única de carbón que,
dependiendo de cada una de las cepas, hidroliza el carbaryl vía saliciato a gentisato o
catecohol (Swetha et. al., 2005).
Adicional al carbaryl, las tres cepas utilizan además 1-naftol, salicilato y 4-hidrobenzoato
como fuente de carbón (Swetha et. al., 2005).
Medio de Cultivo
Las cepas aisladas fueron cultivadas en 150 ml de medio salino minimal en erlemeyer de
500 ml a 30 ºC a pH de 7,5. Para las cepas C4 y C5 los componentes del medio salino
minimal fueron los siguientes: 6 g K2HPO4, 4.1 g KH2PO4, 1 g NH4NO3, 100 mg
MgSO4.7H2O, 1mg MnSO4, 1 mg CuSO4.5H2O, 5 mg FeSO4.7H2O, 1 mg H3BO3, 5 mg
CaCl2.2H2O, 1 mg ZnSO4, 1 mg NaMoO4. Para la cepa C6 la composición es la misma
añadiendo 8 g de K2HPO4 y 1 g de KH2PO4; el medio fue suplementado con 0.1% de
hidrocarburo o 0.25% de glucosa como fuente de carbón. El crecimiento fue monitoreado
mediante espectrofotometría a 540 nm (Swetha et. al., 2005).
Dos gramos (2 g) de suelo contaminado con 0.1% de carbaryl fueron inoculados con cada
una de las cepas cultivadas en medio salino minimal. Se les permitió desarrollarse por
cuatro días y luego eran recultivadas cada 48 horas (Swetha et. al., 2005).
Resultados y Discusión
Cuadro 6. Cambios espectrales dependientes de tiempo para las reacciones de (A) carbaryl hidroxilasa y (B)
dioxigenasa de gentistato. Las flechas para arriba indican la generación de metabolitos, mientras que las flechas
para abajo indican la metabolización del sustrato (Swetha et. al., 2005)
Nota: Esta investigación esta más enfocada al aislamiento de dos plásmidos de la cepa
RC100 de Arthrobacter sp. involucrados en la degradación de carbaryl.
Medio de Cultivo
La cepa aislada fue cultivada en medio minimal con 1.0 mM de carbaryl, así como medio
minimal con 1 mM de salicilato y medio minimal suplementado con 0.2% de glucosa,
0.4% de bactotriptona y 0.2% de almidón, a una temperatura de 30ºC y a un pH de 7
(Hayatsu et. al., 1998).
Resultados y Discusión
El estudio reporta que la cepa RC100 de Arthrobacter sp. inoculada en medio minimal con
0.4 mM de carbaryl fue capaz de degradarlo completamente en 48 horas luego de haber
sido cultivada; en la muestra testigo se observó también una pequeña degradación del
carbaryl, atribuible a hidrólisis química (Hayatsu et. al., 1998).
Medio de Cultivo
Esta cepa fue inoculada en 50 ml de medio salino minimal con 50 µg/ml de carbaryl e
incubada a 37 ºC. El cultivo, recolectado durante una fase avanzada de crecimiento
exponencial fue inoculada en tres matraces con medio salino minimal suplementado con
carbaryl, éstas a su vez fueron incubadas a 30ºC. El crecimiento de la cepa fue
monitoreado constantemente en intervalos regulares vía Densidad Óptica a 600 nm (Bahig
et. al., 2008).
Resultados y Discusión
De las bacterias aisladas, la cepa AA101 de Citrobacter sp. mostró la mayor taza de
degradación de carbaryl por lo que fue seleccionada para los ensayos de biodegradación.
Se siguió el crecimiento del inóculo de carbaryl y de glucosa vía Densidad Óptica a 600 nm
y se encontrón que existe una diferencia significativa en el crecimiento entre los dos
medios; esto puede ser debido a la diferencia en la disponibilidad de la fuente de carbón
(Bahig et. al., 2008).
Se reportó que el crecimiento de esta cepa inoculada en medio salino minimal con
carbaryl como única fuente de carbón fue considerablemente lento y bajo (Bahig et. al.,
2008).
Cuadro 10. Crecimiento de Citrobacter AA101 en Cuadro 11. Análisis espectral del sobrenadante del
medio salino minimal con carbaryl como fuente única crecimiento de Citrobacter AA101 en medio salino
de carbono (serie de cuadros), medio salino más minimal con carbaryl al momento del inóculo, a 3 a 6 y a
glucosa (serie de rombos), cultivo de nutrientes 9 días después, incubado a 37ºC. La flecha a 276 nm
(serie de triángulos) y medio salino sin fuente de indica el pico de absorción de carbaryl (Bahig et. al.,
carbono como testigo (serie de X), todos incubados 2008).
a 37ºC (Bahig et. al., 2008).
Comparación de los casos de estudio
Antes de comenzar con la comparación de las diferentes especies utilizadas, las cuales han
sido revisadas previamente, es de importancia establecer que el objetivo de este estudio es
identificar la mejor opción para una biodegradación completa de carbaryl a CO2+H2O.
Resultados y Discusión
Temperatura
pH del
Cepa Medio Composición de
medio
Incubación
10 g NaCl
Pseudomonas sp.
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
(cepa 50552)
5 g de almidón
10 g NaCl
Pseudomonas sp.
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
(cepa 50581)
5 g de almidón
10 g NaCl
Consorcio cepas
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
50552-50581
5 g de almidón
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
1mg MnSO4
1 mg CuSO4.5H2O
Pseudomonas Salino
5 mg FeSO4.7H2O 30ºC 7.5-8
cepa C4 Minimal
1 mg H3BO3
5 mg CaCl2.2H2O
1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
Pseudomonas Salino
1mg MnSO4 30ºC 7.5-8
cepa C5 Minimal
1 mg CuSO4.5H2O
5 mg FeSO4.7H2O
1 mg H3BO3
5 mg CaCl2.2H2O
1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
1mg MnSO4
1 mg CuSO4.5H2O
5 mg FeSO4.7H2O
Pseudomonas Salino
1 mg H3BO3 30ºC 7.5-8
cepa C6 Minimal
5 mg CaCl2.2H2O
1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
8 g de K2HPO4 y 1 g de
KH2PO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
1 mM salilciliato
Arthrobacter sp. 0.2% glucosa
Minimal 30ºC 7
cepa RC100 0.4% bactotriptona
0.2% de almidón
0.5 g (NH4)2SO4
0.2 g MgSO4.7H2O
Citrobacter sp. Salino 0.05 g CaCl2
30ºC 6.8
cepa AA101 Minimal 2.44 g Na2HPO4
1.5 g de KH2PO4
1mM fenol
(Bahig et. al., 2008), (Chapalamagu et. al.,1991), (Hayatsu et. al., 1998), (Swetha et. al.,
2005)
En primer lugar, tomando en cuenta los componentes que se requieren para la preparación
del medio de cultivo para la incubación de las diferentes cepas degradadoras de carbaryl, la
opción más favorable sería optar por las cepas de Pseudomonas sp. de la investigación de
Chapalamagu et. al. (1991) o por la cepa de Arthrobacter sp. del estudio llevado a cabo por
Hayatsu et. al. (1998); sobre todo si se tiene en mente una escalada del bioprocesos para
biomagnificación o tratamiento de grandes volúmenes de suelo contaminado a través de
landfarming, considerando el componente económico del proyecto.
Comparación de resultados
La cepa que menos se acerca al comportamiento deseado es Citrobacter sp. cepa AA101, en
el mismo estudio se concluye que, aunque relativamente fue la cepa que mayor crecimiento
tuvo entre todas las cepas que fueron capaces de crecer en un medio con carbaryl como
única fuente de carbón, el crecimiento en una muestra de 50 mg de carbaryl, el crecimiento
fue lento y bajo (Bahig et. al., 2008). Además no se indica que haya sido capaz de degradar
completamente la cantidad de carbaryl a la que estuvo expuesta; por este motivo queda
descartada como la cepa ideal para nuestro objetivo de bioremediación de suelos
contaminados con este carbamato.
Por otro lado, tenemos el caso de las tres cepas de Pseudomonas sp. (C4, C5 y C6), que a
pesar de que tuvieron un crecimiento favorable en exposición a la mayor cantidad de carbaryl
de todas las alternativas revisadas (20 mg), y que en la discusión se la reporta como una de
las mejores alternativas para aplicaciones de biodegradación (Swetha et. al., 2005), no se
indica explícitamente si cualquiera de estas cepas fue capaz de degradar completamente todo
el carbaryl presente, a pesar de que la ruta metabólica sugiere una degradación completa a
CO2+H2O, ni el tiempo en el que lo haría. Como referencia, se ha definido en el estudio que
las tres cepas entran a un crecimiento estacionario a las 20 horas de haber sido inoculados
(Swetha et. al., 2005), sin embargo esto no confirma explícitamente que se haya degradado
todo el carbaryl. Para su aplicación en el proceso de bioremediación de suelos contaminados
con carbaryl, se debería confirmar esta información.
En cuanto a las dos cepas restantes de Pseudomonas sp. (50581 y 50552) se identificó que
individualmente no degradan completamente el carbaryl: la cepa 50581 lo degrada hasta 1-
naftol en la fase de crecimiento exponencial, luego al entrar a la fase estacionaria comienza a
metabolizar el 1-naftol a un metabolito no identificado. La cepa 50552 por sí misma no
degrada carbaryl en absoluto, fue aislada por su capacidad de degradar 1-naftol, producido
por la cepa 50581 en la fase de crecimiento exponencial, a CO2+H2O. Además se identificó la
especificidad de estas cepas para la degradación de carbaryl, ya que no mostraron
crecimiento en otro tipo de carbamatos (Chapalamagu et. al.,1991). La única forma en que
estas dos cepas contribuyen a nuestro objetivo de bioremediación de suelos contaminados
con carbaryl, es el uso de un complejo de los dos microorganismos para lograr metabolizar
completamente este pesticida, pero esto puede suponer una dificultad en la escalada para la
aplicación en landfarming, tal como se ha planteado.
Por último, tenemos el caso de la cepa RC100 de Arthrobacter sp., la cual fue capaz de
degradar 0.4mM de carbaryl (80.4 g) en 48 horas luego de haber sido inoculada. Adicional a
esta respuesta tan acelerada, se determinó que esta cepa, debido a la codificación de dos
plásmidos específicos, degrada el carbaryl a 1-naftol, y puede seguir degradándolo
directamente a CO2+H2O, sin necesidad de crear un consorcio para complementar la ruta
metabólica (Hayatsu et. al., 1998).
El uso de las otras tres cepas de Pseudomonas sp. dependería de la confirmación cuantitativa
de la taza de degradación del pesticida en cuestión y del tiempo requerido, un punto en
contra de esta opción es el costo de la preparación de los medios de cultivo, pero al parecer
por la cantidad de carbaryl utilizada en los ensayos, puede ser la opción más efectiva, aunque
debe ser comprobada cuantitativamente su taza de degradación.
Conclusiones
Habiendo revisado los aspectos más importantes del desarrollo de las diferentes opciones
analizadas para proponerlas para el tratamiento de carbaryl en suelos contaminados en la
industria bananera, se estableció que la mejor opción es el uso de la cepa RC100 de
Arthropobacter sp. debido a los resultados mostrados en cuanto a la taza más eficiente de
degradación de este carbamato en comparación a las revisadas en los demás estudios y a la
relativa sencillez de los componentes del medio de cultivo, lo que supone una inversión
menor en la escalada para un proceso de bioremediación de suelos.
El uso del consorcio de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp. también mostró ser
efectivo para la degradación de carbaryl, y a pesar de que el medio de cultivo es que
supondría una menor dificultad, sobre todo para la escalada, no se lo aconsejó como la
alternativa principal debido a la dificultad que podría suponer el aislamiento de estas dos
cepas específicas. Otro punto en contra es la especificidad que han desarrollado estas dos
bacterias para la degradación específica de carbaryl, ya que no fueron efectivos al momento
de degradar otros carbamatos, lo cual contrasta con la habilidad mostrada por las demás
cepas para crecer en otros carbamatos como fuente única de carbón y energía, lo cual crea
una condición ideal para el tratamiento de suelos expuestos a fumigaciones cíclicas.
La bibliografía revisada coincide, en que con respecto a los parámetros críticos para el
desarrollo de bacterias degradadoras de carbaryl en laboratorio, se debe mantener una
temperatura de 30ºC y un pH entre 6.8 y 8, como única fuente de carbono y energía se
utilizó el carbaryl, pero en algunos casos, principalmente en el medio de cultivo de las cepas
C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp. se añadieron más elementos constituyentes, lo cual supone
un costo elevado en la escalada del bioproceso, por lo que se priorizó la atención a las
especies cuyo medio de cultivo era más sencillo.
Recomendaciones
Se recomienda en primer lugar realizar un estudio taxonómico de las cepas analizadas, que
nos permita identificar a qué especie pertenecen y tener un conocimiento más amplio de sus
características, para poder confirmar o replantear los resultados y conclusiones realizados en
este trabajo.
Bibliografía
- Bahig, A., Aly, E., Khaled, A., Amel, K., 2008, “Isolation, Characterization and
Application of bacterial population from agricultural soil at Sohag Province, Egypt”
Sohag University, Egipto.
- Hayatsu, M., Hirano, M., Nagata, T., 1998, “Involvement of Two Plasmids in the
Degradation of Carbaryl by Arhthrobacter sp. Strain RC100” National Institute of
Food, Tukuba, Japón.
- Xu, S., 2000, “Environmental Fate of Carbaryl” Environmental Monitoring & Pest
Management. Sacramento, Estados Unidos.