Vencimiento consulta pblica: 2008.07.

11

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

NCh3162/2.c2008
ISO/TS 11133-2:2003

Microbiologa de los alimentos para consumo humano y

animal - Gua para la preparacin y produccin de medios
de cultivo - Parte 2: Gua prctica para los ensayos de
rendimiento de medios de cultivo

Prembulo
El Instituto Nacional de Normalizacin, INN, es el organismo que tiene a su cargo el
estudio y preparacin de las normas tcnicas a nivel nacional. Es miembro de la
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION
PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos
organismos.
Este proyecto de norma se estudi a travs del Comit Tcnico Microbiologa de los
alimentos, para establecer los criterios y mtodos para los ensayos de rendimiento de los
medios de cultivo.
Este proyecto de norma es idntico a la versin en ingls de la Especificacin Tcnica
Internacional ISO/TS 11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on
performance testing of culture media.
Para los propsitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales
que se indican y justifican en Anexo D.
La Nota Explicativa incluida en un recuadro en clusula 2 Referencias normativas y en
Anexo Bibliografa, es un cambio editorial que se incluye con el propsito de informar la
correspondencia con norma chilena de las normas internacionales citadas en este
proyecto de norma.

NCh3162/2
El proyecto de norma NCh3162/2 ha sido preparado por la Divisin de Normas del
Instituto Nacional de Normalizacin.
El Anexo B forma parte del proyecto de norma.
Los Anexos A, C y D no forman parte del proyecto de norma, se insertan slo a ttulo
informativo.

II

Vencimiento consulta pblica: 2008.07.11

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

NCh3162/2.c2008
ISO/TS 11133-2:2003

Microbiologa de los alimentos para consumo humano y

animal - Gua para la preparacin y produccin de medios
de cultivo - Parte 2: Gua prctica para los ensayos de
rendimiento de medios de cultivo

0 Introduccin
Para realizar anlisis microbiolgicos de alimentos de manera fiable, es imprescindible
utilizar medios de cultivo de calidad probada. Para todos los medios descritos en mtodos
normalizados, es imprescindible definir los criterios de aceptacin mnimos requeridos para
garantizar la fiabilidad de los mismos. Se recomienda que en la determinacin de las
caractersticas de rendimiento de un medio de cultivo se realicen ensayos que se ajusten a
la presente norma. Esto se aplica a:
a) medios deshidratados o listos para su empleo preparados comercialmente;
b) medios de cultivo preparados a partir de sus componentes individuales en el
laboratorio donde son utilizados.
El establecimiento de criterios de rendimiento mnimos ampliamente aceptados debera
conducir a productos comerciales de calidad ms consistente y de este modo reducir el
nmero de ensayos necesarios en el laboratorio donde son utilizados.
Adems los criterios mnimos de aceptacin evaluados mediante los mtodos definidos en
esta norma se pueden utilizar por todos los laboratorios de microbiologa para evaluar las
propiedades productivas, selectivas y/o electivas de un medio de cultivo.
Los requisitos de esta norma son prioritarios en la evaluacin de la calidad de los medios
para el anlisis microbiolgico de alimentos para consumo humano y animal.

NCh3162/2

1 Alcance y campo de aplicacin

Esta norma establece criterios y mtodos para los ensayos de rendimiento de los medios
de cultivo. Esta norma se aplica a:
-

entidades comerciales que produzcan y/o distribuyan medios de cultivo listos para su
uso, reconstituidos semielaborados o deshidratados, a los laboratorios de
microbiologa;

entidades no comerciales que suministran medios a terceros;

laboratorios de microbiologa que preparan medios de cultivo para su propio uso y

evaluan su rendimiento.

2 Referencias normativas
Los documentos referenciados siguientes son indispensables para la aplicacin de esta
norma. Para referencias con fecha, slo se aplica la edicin citada. Para referencias sin
fecha se aplica la ltima edicin del documento referenciado (incluyendo cualquier
enmienda).
ENV ISO 11133-11)

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on

preparation and production of culture media - Part 1: General
guidelines on quality assurance for the preparation of culture media
in the laboratory (ISO/TR 11133-1:2000).

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de las norma internacional sealada anteriormente con norma chilena, y su grado de
correspondencia es el siguiente:
Norma internacional
ENV ISO 11133-1

Norma nacional
En estudio NCh3162/1

Grado de correspondencia
-

3 Trminos y definiciones
Para los propsitos de esta norma, se aplican los trminos y definiciones indicados en
ENV ISO 11133-1:2000 (NCh3162/1).

1)

ENV = European Prestandard.

NCh3162/2

4 Criterios para el control de calidad de rutina

4.1 Criterios de calidad generales
4.1.1 Calidad de los medios de cultivo
La calidad de los medios de cultivo depende de la calidad de sus ingredientes individuales,
su formulacin correcta, la calidad de los procedimientos de preparacin, la eliminacin de
los agentes microbianos contaminantes y las condiciones adecuadas de envasado y
almacenamiento (ver ENV ISO 11133-1) (NCh3162/1).
El fabricante o el que lo produce en el laboratorio debe cumplir con las caractersticas
fisico-qumicas de los medios de cultivo que se especifican en la norma correspondiente.
Adems, la evaluacin de la calidad debe asegurar que el medio de cultivo es conforme
con las condiciones establecidas, incluyendo:
-

cantidad distribuida y/o el espesor;

aspecto, color y homogeneidad;

consistencia del gel;

contenido en humedad;

valor del pH;

capacidad tampn;

contaminacin microbiana.

Los componentes individuales y cualquier suplemento nutritivo o selectivo deben tambin

ser sometidos a procedimientos apropiados de evaluacin de la calidad.
4.1.2 Calidad de los componentes individuales de los medios
Los medios de cultivo descritos en normas internacionales se consideraron satisfactorios,
sin embargo, debido a la variabilidad de su calidad, se puede admitir que los fabricantes
de medios modifiquen la concentracin de algunos ingredientes biolgicos individuales,
como se indica ms abajo:
-

peptonas y extractos de carne o de levadura segn sus propiedades nutritivas;

agar segn sus propiedades de gelificacin;

sustancias tampn;

sales biliares, extracto de bilis y desoxicolato, colorantes antibacterianos, dependiendo

de sus propiedades selectivas;

antibiticos dependiendo de su actividad.

3

NCh3162/2
4.2 Criterios de calidad microbiolgica
4.2.1 Generalidades
Los ensayos de rendimiento microbiolgico se deben realizar sobre una muestra que sea
representativa de un lote del producto final.
4.2.2 Contaminacin microbiana
Se debe analizar una cantidad representativa, dependiendo del tamao del lote del medio
de cultivo, para evaluar la contaminacin microbiana mediante incubacin en condiciones
adecuadas. Se debera establecer, o bien ser especificado por el fabricante, el porcentaje
mximo de placas o recipientes de medios lquidos que puedan presentar contaminacin
para cada medio. Los fabricantes deberan establecer especificaciones basadas en los
componentes de los medios, lmites ligados a los procesos y tipo de envase.
NOTAS
1)

Las muestras a analizar deberan ser como mnimo una placa o tubo, o el 1% de las placas o tubos, desde
el principio y una placa o tubo, o el 1% de las placas o tubos, desde el final del proceso de llenado o
dispensacin. Las placas o tubos se deberan incubar como mnimo durante 18 h a 37C o en las
condiciones de incubacin utilizadas habitualmente para este medio, segn norma especfica.

2)

Para los planes de muestreo estadstico consultar ISO 2859-1:1999 (NCh44).

4.2.3 Crecimiento
4.2.3.1 Generalidades
Para evaluar cada lote de medio de cultivo completo, los componentes nutritivos o los
suplementos, el crecimiento debe ser evaluado apropiadamente mediante:
a) mtodos cuantitativos; o
b) mtodos semicuantitativos; o
c) mtodos cualitativos.
Las evaluaciones cuantitativas, semicuantitativas o cualitativas se deben realizar por los
mtodos descritos en esta norma o por otra tcnica ampliamente aceptada. Para la
interpretacin de los resultados de los ensayos, es necesario comparar la cantidad de
crecimiento del medio probado con la del medio de referencia. Por lo tanto, el uso de un
medio de referencia especfico es obligatorio para los mtodos cuantitativos (ver norma
especfica o Anexo B).

NCh3162/2
Para los mtodos semicuantitativos o cualitativos, el uso de un medio especfico de
referencia (ver norma especfica correspondiente o Anexo B) o un medio de cultivo que de
una reaccin positiva, ayuda a interpretar los resultados. El medio de referencia debe ser
seleccionado de un lote producido recientemente de reconocida buena calidad o, si se
compara la estabilidad a largo plazo, un lote de otro suministrador o, un medio listo para
su empleo, etc.
Adems, el crecimiento de las cepas objetivo o diana debe presentar un aspecto, tamao
y morfologa tpicos de las colonias y, el crecimiento de las cepas no objetivo o diana debe
ser inhibido parcial o completamente.
4.2.3.2 Productividad
Empleando un instrumento adecuado, se siembran los medios de cultivo slidos,
semislidos o lquidos con un inculo apropiado (ver 5.2.1.1) de la cepa de trabajo de
cada uno de los microorganismos de control definidos.
La productividad debe alcanzar un lmite mnimo definido (ver norma especfica
correspondiente o Anexo B).
Para los mtodos cuantitativos la Relacin de Productividad PR (1) se determina como sigue:

PR =

NS
N0

(1)

en que:

NS

= recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo sometido al

ensayo (obtenido de una o ms placas);

N0

= recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia

definido, obtenido de una o ms placas y, deber ser 100 ufc.

NOTA - La relacin de productividad de un medio no selectivo es al menos 0,7 para los microorganismos que
puedan crecer fcilmente en ese medio. El PR del microorganismo objetivo o diana en un medio selectivo
debera ser al menos 0,1. Estos valores son generalmente alcanzables, sin embargo se pueden aceptar
criterios menos rigurosos para determinadas combinaciones de medios y microorganismos de control
(ver norma especfica correspondiente o Anexo B).

Para mtodos semicuantitativos, las puntuaciones de sectores consecutivos de una placa

inoculada mediante la tcnica ecomtrica se suman para obtener el ndice de crecimiento G I ,
el cual vara segn el medio de cultivo. Por ello es importante compararlos con ndices previos
y/o G I de un medio de referencia y asegurar que las variaciones no son excesivas. Una vez
que se haya adquirido experiencia suficiente con el mtodo, se puede tambin establecer el
intervalo de variacin esperado de cada medio de cultivo.
Las evaluaciones cualitativas deben ser realizadas visualmente, asignando puntuaciones
de crecimiento.
5

NCh3162/2
4.2.3.3 Selectividad
Para la evaluacin cuantitativa de la selectividad se siembran medios de cultivo selectivos
y un medio de referencia con el inculo adecuado (ver 5.2.1.2) del microorganismo de
control definido, usando un instrumento adecuado. La selectividad debe alcanzar valores
definidos (ver norma especfica correspondiente o Anexo B).
El factor de selectividad S F (2), se calcula como sigue:

S F = D0 D S

(2)

en que:

D0

= dilucin ms alta que muestra un crecimiento de al menos 10 colonias en

el medio de referencia;

DS

= dilucin ms alta que muestra un crecimiento comparable en el medio

que se est evaluando.

S F , D0 y DS se expresan en logaritmos decimales.

NOTA - El S F de los microorganismos no objetivo o diana en un medio selectivo debera ser al menos 2. Este valor
es generalmente alcanzable. Sin embargo, se pueden aceptar criterios menos rigurosos para determinadas
combinaciones de medios y microorganismos de control (ver norma especfica correspondiente o Anexo B).

Para los mtodos semicuantitativos y cualitativos, el crecimiento de la(s) cepa(s) no

objetivo o diana debe ser inhibido total o parcialmente.
4.2.4 Caractersticas bioqumicas y fisiolgicas (selectividad y especificidad)
Con el objeto de obtener una descripcin completa del rendimiento de un medio, se
debera establecer la morfologa de las colonias y las caractersticas diagnsticas, junto
con el grado de selectividad.
Las caractersticas esenciales de especificidad se deben definir y cumplir. En el caso de los
medios diferenciales, se debera determinar, con un conjunto adecuado de cepas de control,
la calidad de las caractersticas bioqumicas/fisiolgicas del o de los microorganismos
objetivos o dianas as como el grado de inhibicin de los microorganismos no objetivos
dianas.
4.2.5 Caractersticas para los ensayos de antimicrobianos
La accin antimicrobiana de los antibiticos depende de sus caracterstica de difusin en
el agar y de cualquier efecto antagonista de los componentes presentes. Los medios
utilizados para comprobar la presencia o la ausencia de sustancias antimicrobianas en
muestras de alimentos deberan ser conformes con los mtodos de referencia.

NCh3162/2
4.3 Evaluacin del rendimiento e interpretacin de los resultados
Un lote de medio de cultivo funciona de manera satisfactoria si todos los microorganismos
de control utilizados se comportan segn las especificaciones dadas. Se debe aceptar si
se cumplen tanto los criterios generales como los de calidad microbiolgica.

5 Mtodos para los ensayos de rendimiento de los medios de cultivo

5.1 Generalidades
En esta clasula se describen ejemplos de mtodos de evaluacin cuantitativos,
semicuantitativos y cualitativos para medios slidos y lquidos. En la mayora de los casos,
las tcnicas semicuantitativas y cualitativas cumplen los requisitos relativos a los ensayos
de rendimiento de un lote de medio de cultivo, en el laboratorio en el que es utilizado.
En casos particulares, por ejemplo la evaluacin de un nuevo medio o de un nuevo fabricante,
etc., se deben realizar mtodos de prueba cuantitativos por parte del laboratorio usuario.
Se asume que se conocen las tcnicas microbiolgicas generales y por ello no se
describen los mtodos de manera exhaustiva.
En Anexo B (ver tambin ENV ISO 11133-1) (NCh3162/1) se enumeran los microorganismos
apropiados.
NOTA - En el futuro, el propsito es que cada una de las normas, tanto nuevas como revisadas, para la
deteccin o recuento de microorganismos especficos o de grupos de microorganismos, describan los
microorganismos de control pertinentes que han de utilizar, junto con los criterios de aceptacin para cada
medio de cultivo descrito en esa norma.

En los medios lquidos, las interacciones que conducen al crecimiento con xito de los
microorganismos son ms complejas, de ah que la definicin de los mtodos para los
ensayos de rendimiento es menos sencilla que en el caso de los medios slidos.
En los mtodos de anlisis que incluyen mltiples etapas, por ejemplo la deteccin de
Salmonella, el aislamiento satisfactorio del microorganismo objetivo o diana se produce a
travs de complejas interacciones que tienen lugar en cada una de las etapas de
crecimiento. En este caso se debera demostrar la productividad o selectividad,
respectivamente, del mtodo en su conjunto, utilizando para ello un ensayo de control con
las muestras, cultivos y materiales de referencia apropiados. Esto es adicional para
demostrar que cada uno de los componentes del medio es adecuado para su fin.

5.2 Microorganismos de control

En Anexo B se indican las cepas de referencia apropiadas de los microorganismos objetivo
o diana (productividad) y no objetivo o diana (selectividad) para cada medio de cultivo.
Los microorganismos de control deberan cumplir los requisitos que se dan en
ENV ISO 11133-1:2000, 5.2.2 (NCh3162/1), por ejemplo, cepas robustas, que crecen
dbilmente, bioqumicamente no reactivas o lesionadas, segn corresponda.
7

NCh3162/2
Las recomendaciones respecto a la conservacin y mantenimiento de las cepas de
referencia se dan en ENV ISO 11133-1:2000, Anexo B (NCh3162/1).
5.2.1 Preparacin de los cultivos de trabajo
Los cultivos de trabajo se deben preparar como un cultivo puro en fase estacionaria en un
caldo no selectivo, procedente de las cepas de referencia de reserva.
Se pueden emplear diferentes tcnicas pero se debe garantizar la pureza del inculo y su
normalizacin, lo que permite que se pueda utilizar posteriormente.
NOTA - Se pueden emplear inculos congelados si se puede demostrar que los microorganismos pueden
sobrevivir durante el periodo escogido.

5.2.1.1 Cultivos de trabajo para ensayos de productividad

Para ensayos cuantitativos de medios en placa para los microorganismos deseados, se
usa un nivel de inculo de aproximadamente 102 ufc.
Para ensayos semicuantitativos o cualitativos de medios en placa, es necesario un nivel
de inculo entre 103 ufc y 104 ufc.
Para ensayos de productividad de medios lquidos, se usa un nivel de inculo entre 10 ufc
y 100 ufc.
5.2.1.2 Cultivos de trabajo para ensayos de selectividad
Para ensayos de selectividad de medios de cultivo se inocula en el medio en placa o en tubo,
una suspensin del microorganismo no objetivo o diana que contenga entre 104 ufc y 106 ufc.
5.2.1.3 Condiciones de incubacin
Se incuban los medios de cultivo inoculados de acuerdo con las condiciones descritas en
la norma correspondiente y las dadas en las tablas apropiadas del Anexo B.

5.3 Mtodos para medios de cultivo slidos

5.3.1 Mtodos cuantitativos de siembra en placa
5.3.1.1 Generalidades
El mtodo es general y apropiado para la mayora de los medios de cultivo slidos. Puede
no ser apropiado para ensayar algunos tipos de mohos.
5.3.1.2 Procedimiento
-

Se emplean cultivos de trabajo como los descritos en 5.2.1.

NCh3162/2
-

Se selecciona un nmero apropiado de placas representatrivas de cada lote que va a

ser evaluado y se comprueba que la superficie de cada placa est correctamente seca.
Las placas del medio de referencia se deberan preparar de manera similar
(ver ENV ISO 11133-1:2000, 4.4.4) (NCh3162/1).

Se extiende un inculo del cultivo de trabajo diluido en la superficie de las placas de

ensayo y en las de referencia, para obtener recuentos que entren dentro de los lmites
recomendados en 5.2.1.

NOTAS
1)

Se puede tambin utilizar el mtodo de la gota en superficie de Miles-Misra modificado y otros sistemas
basados en gotas o en siembra en espiral.

2)

Se puede utilizar tambin el mtodo de siembra en profundidad para medios de cultivo empleados
habitualmente para recuento por este mtodo.

Se incuban las placas en las condiciones apropiadas definidas en las normas

individuales.

Se cuentan las colonias presentes en cada placa o en cada gota, segn corresponda.
Se evala el tamao y el aspecto de las colonias.

5.3.1.3 Clculos
Se puede calcular el recuento promedio del medio de cultivo, en funcin del volumen
extendido en las placas y del factor de dilucin. En el caso de los mtodos de siembra por
gotas, se debe tener en cuenta el nmero de gotas y su volumen.
5.3.1.4 Interpretacin de los resultados
Para interpretar los resultados, se debe calcular la relacin de productividad

PR

(ver 4.2.3.2), y cuando sea apropiado, el Factor de Selectividad S F (ver 4.2.3.3).

5.3.2 Mtodo semicuantitativo de siembra en estra basado en la ecometra
5.3.2.1 Generalidades
El mtodo de siembra en estra es adecuado para ensayos de rendimiento de medios de
cultivo slidos y lquidos, pero el mtodo es solo semicuantitativo. Por ello los ndices de
crecimiento se dan a ttulo indicativo y se pueden considerar solo como un ensayo
suplementario para los medios de cultivo slidos.
Cuando se emplea este mtodo, el medio de cultivo que se ensaya debera ser secado de
forma homognea y el procedimiento completo debe estar normalizado de tal forma que
se puedan comparar los resultados de diferentes lotes.

NCh3162/2
5.3.2.2 Procedimiento
-

Las placas de agar se preparan de la manera habitual con unos 15 ml de agar. Los
medios que se utilizan habitualmente para la tcnica de siembra en profundidad,
por ejemplo el Agar para Recuento en Placa (PCA), se pueden ensayar tambin
mediante siembra en superficie en el medio solidificado.

Se utilizan cultivos de trabajo como se describe en 5.2.1.

Las placas se siembran en estras con un asa de 1 L como se indica en Figura 1. Con
el asa se realizan cuatro lneas paralelas a intervalos de aproximadamente 0,5 cm en el
sector A. La siembra en estra se repite en los sectores B y C y se acaba en el
sector D con una sola lnea. Se puede utilizar una plantilla bajo la placa para facilitar la
siembra en estra.

Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubacin establecidos en los mtodos

normalizados.

NOTA - Slo se debe introducir el asa en el cultivo, no el alambre. Es conveniente que el asa se cargue
completamente con el cultivo. El exceso de lquido se debera eliminar presionando tres veces la parte ms
ancha del asa contra el borde del recipiente. Cuando se siembren las placas mediante estras, es conveniente
que el ngulo entre el asa y la superficie del agar est entre 20 y 30. La presin del asa en la superficie del
agar y la rapidez de siembra en estra debe ser constante del principio a fin. Se debera evitar la introduccin
del asa en el caldo de cultivo mientras haya espuma y/o burbujas en su superficie.

Habitualmente se emplea el mismo asa para sembrar en estra todos los sectores, desde
el A hasta el D sin flamear el asa entre las estras. En algunos casos, cuando se espera un
ndice de crecimiento G I inferior para demostrar distintas diferencias, puede ser apropiado
cambiar o esterilizar el asa entre la siembra de los Sectores A y B.

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NCh3162/2

5.3.2.3 Clculo
Despus de la incubacin, se evala el aspecto, el tamao de las colonias y la intensidad
de crecimiento y se calcula el ndice G I . Cada estra que presente crecimiento se marca
con 1. La mxima puntuacin por placa es 16. Si slo hay crecimiento en la mitad de su
longitud, la estra se marca como 0,5. Una estra sin crecimiento o con crecimiento
escaso (menos de la mitad de su logitud), se marca como 0. Las puntuaciones se suman
para obtener el G I . Por ejemplo, si se obtuvo crecimiento en los Sectores A y B y en la
mitad del Sector C, el G I sera de 10.
5.3.2.4 Interpretacin de resultados
El ndice de crecimiento G I obtenido por una cepa objetivo o diana debera ser de 6 como
mnimo para que se pueda concluir que el medio es aceptable. En el caso de medios no
selectivos, el G I es generalmente ms elevado.
Adems, el crecimiento de cepas objetivo o diana debe ser tpico y, el crecimiento de las
cepas no objetivo o diana debe estar parcial o completamente inhibido.

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NCh3162/2
5.3.3 Mtodo cualitativo de siembra en estra
5.3.3.1 Generalidades
El mtodo es apropiado para ensayos suplementarios de rendimiento de medios de cultivo
slidos.
El mtodo es slo cualitativo y por ello las puntuaciones son slo indicativas.
5.3.3.2 Procedimiento
-

Las placas de agar se preparan de la manera habitual con unos 15 ml de agar. Los
medios que se utilizan habitualmente para la tcnica de siembra en profundidad,
por ejemplo el Agar para Recuento en Placa (PCA), se pueden ensayar tambin
mediante siembra en superficie de medios solidificados.

Se utilizan cultivos de trabajo como se describe en 5.2.1.

Los microorganismos de control se siembran en estra en lneas paralelas con un asa

de 1 L, en la superficie del medio de ensayo. Se pueden sembrar varios
microorganismos de control en estras en la misma placa, sin que las estras se crucen.

NOTA - Se pueden emplear otras tcnicas normalizadas de siembra en estra.

Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubacin establecidos en los mtodos

normalizados.

5.3.3.3 Interpretacin de resultados

Se evala el crecimiento de las placas despus de la incubacin como:
-

0 corresponde a crecimiento nulo;

1 corresponde a un crecimiento dbil; y

2 corresponde a un crecimiento bueno.

Los microorganismos objetivo o diana deben tener una puntuacin de 2 y un aspecto,

tamao y morfologa de las colonias tpicas. El crecimiento de los microorganismos no
objetivo o diana debe estar parcial o completamente inhibido (0 1).

5.4 Mtodos para medios de cultivo lquidos

5.4.1 Generalidades
Para determinar la productividad de un medio lquido, se debe utilizar un inculo
adecuado. Los mtodos cuantitativo, semicuantitativo y cualitativo que se describen ms
adelante evalan la productividad y selectividad. Los mtodos propuestos determinan la
cantidad de crecimiento, despus de la incubacin apropiada, mediante la siembra de los
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NCh3162/2
medios lquidos en placa o en estra en medios de agar, realizndose un recuento de
unidades formadoras de colonias (ufc) o calculando una puntuacin a partir del medio
lquido. Para los mtodos cualitativos en medios lquidos se evalan visualmente las
reacciones caractersticas.
5.4.2 Mtodo cuantitativo de dilucin para microorganismos objetivo o diana y no objetivo
o diana
El mtodo es tambin apropiado para la evaluacin de medios de cultivo, caldos o
diluyentes nuevos.
5.4.2.1 Procedimiento
-

Se selecciona un nmero apropiado de tubos o porciones de 10 ml de cada lote de

medio lquido que se va a evaluar.

Siembra de microorganismos objetivo o diana:

Se siembra el caldo a evaluar y el caldo de referencia para cada organismo de control
con un nmero bajo (por ejemplo de 10 ufc a 100 ufc en cada tubo; para la
preparacin del inculo, ver 5.2.1) y se mezcla.

Siembra de microorganismos no objetivo o diana:

Se siembra el caldo a evaluar y el caldo de referencia para cada organismo de control
con un nmero ms alto (>1 000 ufc en cada tubo; para la preparacin del inculo,
ver 5.2.1) y se mezcla.

Siembra de microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana como cultivo

mixto:
Para evaluar cultivos mixtos en medios selectivos se siembra el caldo a evaluar y el
caldo de referencia con un bajo nmero de microorganismos objetivo o diana
(por ejemplo de 10 ufc a 100 ufc por cada tubo; para la preparacin del inculo
ver 5.2.1) y en el mismo tubo con un nmero ms alto de microorganismos no objetivo
o diana (>1 000 ufc en cada tubo; para la preparacin del inculo ver 5.2.1) y se
mezcla.

Siembra de microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana en lquidos de

dilucin y medios de transporte:
Se inoculan los lquidos de dilucin con los microorganismos de control (por ejemplo,
de 100 ufc a 1 000 ufc por cada tubo; para la preparacin del inculo ver 5.2.1) y se
mezcla.

Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubacin establecidos en los mtodos

normalizados.

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NCh3162/2
Los lquidos diluyentes se deberan incubar durante 45 min a temperatura ambiente y
despus sembrar en placa. Los medios de transporte se deberan incubar durante un
tiempo y una temperatura apropiados segn su uso habitual y despus sembrar en placa.
-

Se toma una alcuota o si es necesario una dilucin de cada caldo despus de la etapa
de incubacin y se vuelve a aislar sobre una placa de agar no selectivo como se
describe en 5.3.1.

NOTAS
1)

Para obtener colonias contables en las placas se puede utilizar el mtodo de la gota en superficie de MilesMisra modificado, otros sistemas basados en gotas o siembra en espiral.

2)

Para evaluar cultivos mixtos, se deberan volver a aislar cuando sea posible en placas de agar no selectivo
que permita la diferenciacin de los microorganismos en el cultivo mixto (por ejemplo, agar para recuento
en placa con MUG para contar Escherichia coli y Salmonella spp.). Cuando no sea posible distinguir
cultivos mixtos en agar no selectivo, se deberan utilizar medios de agar selectivos siempre que su
rendimiento se haya evaluado previamente.

5.4.2.2 Lectura, clculo e interpretacin de resultados

Despus de la incubacin, se cuentan las colonias de los microorganismos objetivo o
diana y no objetivo o diana, distinguiendo los diferentes tipos en el caso de cultivo mixtos.
Los clculos e interpretaciones deben corresponder al objeto del examen:
a) interpretacin comparativa entre el caldo de referencia y el caldo a evaluar usando las
cifras de PR y S F como se describi en 4.2.3.2 y 4.2.3.3:
- para los microorganismos objetivo o diana el PR no debe ser <0,1 (la diferencia en
el crecimiento no excede un orden de magnitud);
- para los microorganismos no objetivo o diana S F debe ser al menos igual a 2;
- en los cultivos mixtos el crecimiento de los microorganismos objetivo o diana no
debe ser inhibido por los microorganismos no objetivo o diana, es decir los
microorganismos objetivo o diana deben ser siempre la poblacin dominante.
b) en otros casos es ms apropiado alcanzar recuentos mnimos determinados para los
microorganismos objetivo o diana y recuentos mximos para microorganismos no
objetivo o diana:
- los microorganismos objetivo o diana deben alcanzar 106 ufc/ml a 108 ufc/ml;
- los microorganismos no objetivo o diana no deben superar las 104 ufc/ml en el caldo
selectivo.

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NCh3162/2
c) para los lquidos de dilucin y medios de transporte no se requieren ni un nmero reducido
ni superior de organismos objetivo o diana y/o no objetivo o diana. El nmero de
microorganismos despus de la incubacin en estos medios deben estar entre 50% del
recuento inicial.
NOTA - La calidad de un medio lquido con respecto a las propiedades de crecimiento ptimo se indica de manera
ms adecuada durante la fase de crecimiento inicial. La observacin de la duracin de la fase de latencia y el
crecimiento durante la fase de latencia inicial, proporcionan la informacin ms sensible de la productividad y
selectividad de los microorganismos objetivo o diana y no objetivo o diana respectivamente, en los caldos de prueba
y de referencia. Por lo tanto, si slo se buscan diferencias menores en la calidad de los medios se deberan volver a
aislar los medios lquidos en las placas despus de un perodo corto de incubacin de por ejemplo 6 h o 12 h.

5.4.3 Mtodo semicuantitativo del tubo nico para microorganismos objetivo o diana, no
objetivo o diana y mixtos
5.4.3.1 Procedimiento
-

Se selecciona un nmero apropiado de tubos o de porciones de 10 ml de cada lote

que se va a probar (ver 4.2.2).

Siembra de organismos objetivo o diana y no objetivo o diana como cultivo mixto:

Se siembra un tubo de caldo de prueba con unas 10 ufc a 100 ufc de microorganismos
objetivo o diana y en el mismo tubo se siembra un nmero mas alto de microorganismos
no objetivo o diana (>1 000 ufc por cada tubo) y se mezcla.

Siembra de microorganismos no objetivo o diana:

Se siembra un tubo de caldo de prueba por microorganismo con un nmero ms alto
(>1 000 ufc) y se mezcla.

Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubacin establecidos en los mtodos

normalizados.

Se toman 10 L del cultivo mixto y se vuelven a aislar en una placa del medio
selectivo especfico para el microorganismo objetivo o diana.

Se toma un asa (10 L) del cultivo del microorganismo no objetivo o diana y se vuelve
a aislar en una placa de un medio no selectivo (por ejemplo TSA).

Se incuban ambas placas en condiciones apropiadas durante un tiempo adecuado,

como se indica en las normas individuales.

5.4.3.2 Clculo e interpretacin de los resultados

La productividad del medio lquido evaluado es satisfactoria si en la placa de agar
selectivo han crecido como mnimo 10 colonias del microorganismo objetivo o diana.
La selectividad del medio lquido evaluado es satisfactoria si en la placa agar no selectivo
no hay crecimiento (o menos de 10 ufc) del microorganismo no objetivo o diana.
15

NCh3162/2
5.4.4 Mtodo cualitativo del tubo nico
5.4.4.1 Generalidades
El mtodo es adecuado para ensayos de rendimiento de medios de cultivo lquidos. El
mtodo es solo cualitativo y por ello las puntuaciones son solo indicativas. Los medios
turbios, por ejemplo caldo de tetrationato, no se pueden evaluar por este mtodo.
5.4.4.2 Procedimiento
-

para probar el rendimiento de medios de cultivo lquidos se siembran directamente los

cultivos de trabajo en el medio que se est probando empleando un asa de 1L;

se utilizan los tiempos y temperaturas de incubacin establecidos en los mtodos

normalizados individuales.

5.4.4.3 Interpretacin de los resultados

La evaluacin cualitativa se debe realizar visualmente asignando puntuaciones de
crecimiento, por ejemplo de 0 a 2.
Para tubos y frascos
-

0 corresponde a una turbidez nula;

1 corresponde a una turbidez muy ligera;

2 corresponde a una turbidez elevada.

La puntuacin de un microorganismo objetivo o diana debe ser 2.

NOTAS
1)

A veces, el crecimiento de los microorganismos se puede observar slo como una agregacin o depsito
de clulas en el fondo del tubo o del frasco. En este caso una agitacin cuidadosa puede mejorar la
evaluacin y la interpretacin.

2)

Tambin se pueden evaluar por este mtodo otras caractersticas como la formacin de gas, cambio de
color, etc.

6 Documentacin de los resultados de los ensayos

6.1 Informacin suministrada por el fabricante
El fabricante o proveedor del medio de cultivo debe suministrar, bajo peticin, las
caractersticas especficas de crecimiento microbiolgico e informacin general relativa al lote
especfico del medio de cultivo, ver ENV ISO 11133-1:2000, 4.1.1 (NCh3162/1).

16

NCh3162/2
6.2 Trazabilidad
Todos los datos de los ensayos de rendimiento de rutina deberan ser documentados de
una manera apropiada y conservados durante un perodo de tiempo suficiente de acuerdo
con el sistema de calidad seguido. Se recomienda el empleo de hojas de control para
documentar y evaluar los resulatados de los ensayos (ver Anexo A).

17

NCh3162/2

Anexo A
(Informativo)

Ejemplo de ficha para registrar los resultados de los ensayos de los medios
de cultivo preparados por el laboratorio usuario
Tabla A.1 - Ejemplo de una ficha
Ficha de control para ensayos internos de la calidad de los medios de cultivo
Volumen preparado:

Fecha de vertido:

Nmero de lote
interno:

(y Suministrador:

Lote

Cantidad:

Fecha/firma:

Suministrador:

Lote

Cantidad:

Fecha/firma:

Valor de pH esperado:

Ph medido:

Calidad confirmada:
S
No

Defectos:

Fecha/firma:

Cantidad que se espera llenar

Observado

Calidad confirmada:
S
No

Defectos:

Fecha/firma:

Observado

Calidad confirmada:
S
No

Defectos:

Fecha/firma:

Limpidez esperada / presencia Observado

de

Calidad confirmada:

Defectos:

Fecha/firma:

defectos pticos

Medio de cultivo:
Medio
deshidratado
referencia):
Suplemento:
Comentarios sobre el proceso:
Control de calidad fsico

y/o espesor de la capa:

Color esperado:

Estabilidad esperada del agar /

No

Observado

Calidad confirmada:
S
No

Defectos:

Fecha/firma:

Nmero de placas o tubos Resultado:

probados:
Incubacin:

Calidad confirmada:

Nmero de placas o

Fecha/firma:

Tubos contaminados:

Crecimiento microbiano - Productividad

Mtodo de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:
S
No

Fecha/firma:

Crecimiento microbiano - Selectividad

Mtodo de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:
S
No

Fecha/firma

Crecimiento microbiano - Especificidad

Mtodo de control:

Cuantitativo

Cualitativo

Cepas:

Resultado:

Calidad confirmada:
S
No

Fecha/firma:

Visto bueno del lote

Fecha/firma:

consistencia / humedad
Contaminacin microbiana

Criterios:

No

Incubacin:
Medio de referencia:
Criterios:

Incubacin:
Medio de referencia:
Criterios:

Incubacin:
Medios de referencia:
Visto bueno del lote
Detalles de almacenamiento

18

No

NCh3162/2

Anexo B
(Normativo)

Microorganismos de control recomendados para medios de cultivo utilizados habitualmente (se da informacin del
medio de cultivo, condiciones de cultivo, microorganismos de control, nmero de la coleccin del cultivo de los
organismos de control y las reacciones esperadas)
Las Tablas B.1 a B.6 han sido establecidas teniendo en cuenta las cepas de control empleadas en la Farmacopea Europea y las
recomendaciones de la Farmacopea para medios de cultivo en microbiologa de alimentos (grupo de trabajo del ICFMH). Estos criterios sern
incluidos en las normas especficas cuando se preparen o revisen en el futuro (normas nuevas o revisiones). Un lote de medio validado es un
lote de medio que ha mostrado un rendimiento satisfactorio. Se permite el empleo de cepas equivalentes de otras colecciones de referencia
(por ejemplo NCTC, CIP). Todos los medios citados estn descritos en normas EN e ISO.
Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos

Medio

Tipo

Baird Parker

Sa)

RPFA

Microorganismos
Estafilococos
coagulasa
positivos

Estafilococos
coagulasa
positivos

Medio de
referencia

Mtodo de
control

Criterios

S. aureus ATCC 6538

S. aureus ATCC 25923b)

TSA

Cuantitativo

PR0,5

48 h/ 37C

E. coli ATCC 25922 8739b)

Cualitativo

Especificidad

24 h -48 h/
37C

S. epidermidis ATCC 12228b)

Cualitativo

Productividad

24 h -48 h/
37C

S.aureus ATCC 6538 6538 P

S. aureus ATCC 25923b)

TSA

Cuantitativo

Norma

Funcin

Incubacin

Cepas de control

EN ISO
6888-1

Productividad

24 h -48 h/
37C

Selectividad

EN ISO
6888-2

Reacciones caractersticas

Colonias negro/gris con

halo claro (reaccin de
aclaramiento de la yema de
huevo)
Inhibicin
total
Colonias negro/gris sin
reaccin de aclaramiento
de la yema de huevo
PR 0,5 Colonias negro/gris con
halo de opacidad
(contina)

19

NCh3162/2
Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuacin)
Medio

Cloranfenicol u
OGA
(OGY)

Tipo

Microorganismos

Levaduras/
Mohos

Norma

ISO 7954

E. coli ATCC 25922 8739b)

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Cualitativo

24 h -48 h/
37C
3-5 das/
25C

S.epidermidis ATCC 12228b)

Cualitativo

Productividad

3-5 das/
25C
72 h/ 30C

Selectividad

72 h/ 30C

Productividad
Selectividad

24 h - 48 h/
30C
48 h/ 37C

E. coli ATCC 25922 8739b)

B. subtilis ATCC 6633
L. sake ATCC 15521b)
Ped. damnosus ATCC 29358
Lc. lactis ATCC 19435b)
E.coli ATCC 25922 u 8739b)
B. cereus ATCC 11778
B. cereus ATCC 11778b)

Especificidad

Funcin

Incubacin

Cepas de control

Selectividad

48 h/ 37C

Especificidad
Productividad

Selectividad
MRS

MYP

Oxford

Bacteria
cido
lctica

Bacillus
cereus

Listeria
monocytogenes

ISO 15214

EN ISO
7932
(NCh3116)

EN ISO
11290
(NCh2657/2)

C. albicans ATCC 10231

A. niger ATCC 16404b)
P. cyclopium ATCC 16025
S. cerevisiae ATCC 9763b)

Cuantitativo
Lote de
medio SDA
(Sabouraud
Dextrosa
Agar) u OGA
o Agar
cloranfenicol
Cualitativo
Lote de
medio MRS
ya validado
-

Cuantitativo

TSA

Cuantitativo

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

Cualitativo

48 h/ 37C

B. subtilis ATCC 6633b)

Productividad

48 h/ 37C

TSA

Cuantitativo

Selectividad

48 h/ 37C

L. mono 1/2a ATCC 19111

L. mono 4b ATCC 13932b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)
E. faecalis ATCC 29212 u 19433
C. albicans ATCC 10231

Cualitativo

Cualitativo

Criterios

Reacciones
caractersticas
-

Inhibicin
total
Colonias negro/gris sin
halo de opacidad
PR 0,5 Colonias caractersticas
segn cada especie

Inhibicin
total
PR 0,5 Colonias caractersticas
segn cada especie
Inhibicin
total
PR 0,7 Colonias rosas con halo
de precipitacin
Inhibicin
total
Colonias amarillas sin
halo de precipitacin
PR 0,5 Colonias de gris a
negro con halo negro
Inhibicin
total
(contina)

20

NCh3162/2
Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuacin)
Medio

Tipo

PALCAM

TS(C)

VRBG

VRBL

CTSMAC

MicroNorma
organismos
EN ISO
Listeria
11290
monocytogenes (NCh2657/2)
Clostridium
perfringens

Enterobacterias

Coliformes

Escherichia
coli O157

EN ISO
7937
(NCh3061)

ISO 7402
ISO 8523

ISO 4832

ISO 16654

Mtodo de
control
Cuantitativo

Cualitativo

Lote de
medio TS(C)
ya validado
-

Cuantitativo

Cualitativo

Inhibicin
total
Colonias blancas

E. coli ATCC 25922 u 8739

S. typhimurium ATCC 14028

TSA

Cuantitativo

PR 0,5

Incubacin

Cepas de control

Productividad

48 h/ 37C

Selectividad

72 h/ 30C

L. mono 1/2a ATCC 19111

L. mono 4b ATCC 13932b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)
E. faecalis ATCC 29212 19433
Cl. perfringens ATCC 13124
Cl. perfringens ATCC 12916

Productividad

20 h/ 37C
atmsfera
anaerobia
Selectividad TSC 20 h/ 37C
atmsfera
Especificidad TS anaerobia
Productividad
24 h/ 37C

Reacciones
caractersticas
PR 0,5 Colonias gris-verdosas a
negro con halo negro
Inhibicin
total
PR 0,7 Colonias negras

Medio de
referencia
TSA

Funcin

E. coli ATCC 25922 u 8739

b)

Cualitativo

Selectividad

24 h/ 37C

E.faecalis ATCC 29212 19433b)

Cualitativo

Productividad

24 h/ 30C

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

TSA

Cuantitativo

Selectividad

24 h/ 30C

E. faecalis ATCC 29212 19433b)

Cualitativo

Especificidad

24 h/ 30C

Ps. aeruginosa ATCC 27853

Cualitativo

Productividad

24 h/ 37C E. coli O 157:H7 ATCC 43894

43895b)
(no txicas)

TSA

Cuantitativo

Selectividad

24 h/ 37C

S.aureus ATCC 6538 25923b)

Cualitativo

Especificidad

24 h/ 37C

E. coli ATCC 11775 25922b)

Cualitativo

Criterios

Colonias de rosado a
rojo con o sin halo de
precipitacin
Inhibicin
total
PR 0,5 Colonias prpura con o
sin halo de precipitacin
Inhibicin
total
Colonias de incoloras a
beige
PR 0,5 Colonias transparentes
con
un
aspecto
amarillento
plido
marrn y un dimetro de
aproximadamente 1 mm
Inhibicin
total
Colonias rosadas
(contina)

21

NCh3162/2
Tabla B.1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (conclusin)
Medio

Tipo

BGBLB

Lc)

Microorganismos
Coliformes

Funcin

Incubacin

Cepas de control

ISO 4831

Productividad

24 h - 48 h/
30C

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

24 h - 48 h/
30C
24 h - 48 h/
30C

E. faecalis ATCC 29212

19433b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)

Selectividad

Productividad

24 h - 48 h/
44C

E. faecalis ATCC 29212

19433b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)

Selectividad

24 h - 48 h/
44C

Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

Selectividad
LST

EC

Coliformes

Escherichia
coli

ISO 4831

ISO 7251

Productividad

a)

S = medio slido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mnimo).

c)

L = medio lquido.

C. freundii ATCC 43864

-

C. freundii ATCC 43864

NOTA - Para los medios de cultivo slidos es posible tambin utilizar un mtodo en placa semicuantitativo.

22

Medio de
referencia
-

Norma

Mtodo de
Criterios
control
SemiTurbidez 2+
cuantitativo Gas en 1/3 de
la campana
Durham
Cualitativo
Ausencia de
crecimiento
SemiTurbidez 2+
cuantitativo Gas en 1/3 de
la campana
Durham
Cualitativo
Ausencia de
crecimiento
SemiTurbidez 2+
cuantitativo Gas en 1/3 de
la campana
Durham
Cualitativo
Ausencia de
crecimiento

Reacciones
caractersticas
Produccin de gas y
turbidez

Produccin de gas y
turbidez

Produccin de gas y
turbidez

NCh3162/2
Tabla B.2 - Medios no selectivos para recuento de microorganismos
Medio
PCA

Tipo
a)

Microorganismos
Flora total

Norma
ISO 4833

Funcin
Productividad

a)

S = medio slido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mnimo).

Incubacin
72 h/ 30C

Medio de
referencia
TSA

Cepas de control
b)

E. coli ATCC 25922 8739

S. aureus ATCC 6538
6538P
B. subtilis ATCC 6633b)

Mtodo de
control
Cuantitativo

Criterios

Reacciones caractersticas

PR 0,7

Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos

Medio

Tipo

EE

La)

Microorganismos
Enterobacterias

Norma

Funcin

ISO 7402
ISO 8523

Productividad

Selectividad
HalfFraser

Listeria
monocytogenes

EN ISO
11290-1

Productividad

Selectividad

Incubacin

Cepas de control

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

o S. typhimurium ATCC
14028
24 h/ 37C
+ E. faecalis ATCC 29212
19433b)
24 h/ 30C
L. mono 1/2a ATCC 19111
o L. mono 4b ATCC 13932b)
+ E.coli ATCC 25922 u 8739b)
+ E. faecalis ATCC 29212
19433b)
24 h/ 30C E. coli ATCC 25922 8739b)
24 h/ 37C

E. faecalis ATCC 29212

19433

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Semicuantitativo

Semicuantitativo
Semicuantitativo

Semicuantitativo

Reacciones
caractersticas
>10 col. en VRBG Colonias de rosado a
rojo con o sin halo de
precipitacin
Inhibicin total
Criterios

>10 col. en
Oxford o PALCAM

Colonias de gris a
negro con halo negro

Inhibicin total en
TSA
<100 colonias en
TSA

(contina)

23

NCh3162/2
Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuacin)
Medio

Tipo

Fraser

ITC

Park &
Sanders

Preston

Microorganismos
Listeria
monocytogenes

Yersinia
enterocolitica

Campylobacter

Campylobacter

Norma

Funcin

Incubacin

Cepas de control

EN ISO
11290-1

Productividad

48 h/ 37C

Selectividad

24 h - 48 h/
37C

L. mono 1/2a ATCC 19111

o L. mono 4b ATCC 13932b)
+ E. coli ATCC 25922
8739b) +E.faecalis ATCC
29212 19433b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)

ISO
10273

ISO
10272

ISO
10272

Productividad

48 h/ 25C

Selectividad

48 h/ 25C

Productividad

Ver norma

Selectividad

Ver norma

Productividad

18 h/ 42C

Selectividad

18 h/ 42C

E. faecalis ATCC 29212

19433
Y. enterocolitica ATCC 23715
9610b)
+ E. coli ATCC 25922 8739b)
+Ps. aeruginosa ATCC 27853b)
Ps. aeruginosa ATCC 27853b)
P. mirabilis ATCC 29906
C. coli ATCC 43478*
o C.jejuni ATCC 33291
29428*
+E. coli ATCC 25922 u 8739b)
+P. mirabilis ATCC 29906b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)
P. mirabilis ATCC 29906
C. coli ATCC 43478b)
o C. jejuni ATCC 33291
29428b)
+ E. coli ATCC 25922 u 8739b)
+P. mirabilis ATCC 29906b)
E. coli ATCC 25922 u 8739b)
P.mirabilis ATCC 29906

Reacciones
caractersticas
Colonias de gris a
negro con halo negro

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Semicuantitativo

Semicuantitativo

Semicuantitativo

SemiInhibicin total en
cuantitativo
TSA
Semi>10 col. en medio Colonias caractersticas
cuantitativo Karmali u otro medio segn cada medio
elegido
(ver norma)

Criterios
>10 col. en
Oxford o PALCAM

Inhibicin total en
TSA
<100 colonias en
TSA
>10 col. en CIN o
SSDC

Colonias caractersticas
segn cada medio
(ver norma)

SemiInhibicin total en
cuantitativo
TSA
Semi>10 col. en medio Colonias caractersticas
cuantitativo Karmali u otro medio segn cada medio
elegido
(ver norma)

Semicuantitativo

Inhibicin total en
TSA

(contina)

24

NCh3162/2
Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuacin)
Medio

Tipo

PSB

Microorganismos
Yersinia
enterocolitica

Norma

Funcin

ISO
10273

Productividad

Selectividad
MKTTn

Salmonella

ISO 6579

Productividad

Selectividad

Rappaport
Vassiliadis

RVS

Salmonella

Salmonella

EN 12824

ISO 6579

Medio de
referencia
3-5 das/
Y. enterocolitica ATCC 23715
25C
9610b)
+ E. coli ATCC 25922 8739b)
+Ps. aeruginosa ATCC 27853b)
3-5 das/
Ps. aeruginosa ATCC 27853b)
25C
P.mirabilis ATCC 29906
24 h/ 37C S. typhimurium ATCC 14028b)
o S. enteritidis ATCC 13076b)
+E.coli ATCC 25922 u 8739b)
+Ps. aeruginosa ATCC
27853b)
24 h/ 37C E. coli ATCC 25922 u 8739b)
Incubacin

Productividad

24 h/
41,5C

Selectividad

24 h/
41,5C

Productividad

24 h/
41,5C

Cepas de control

E.faecalis ATCC 29212

19433
S. typhimurium ATCC 14028b)
o S. enteritidis ATCC 13076b)
+E. coli ATCC 25922 u 8739
+Ps.aeruginosa ATCC 27853
E. coli ATCC 25922 u 8739b)
E. faecalis ATCC 29212
19433
S. typhimurium ATCC 14028
o S. enteritidis ATCC 13076b)
+E.coli ATCC 25922 8739b)
+Ps.aeruginosa ATCC 27853*

Mtodo de
control
Semicuantitativo

Criterios
>10 col. en CIN o
SSDC

Semicuantitativo
Semicuantitativo

Inhibicin total en
TSA
>10 col. en XLD u
otro medio de
eleccin

Semicuantitativo

Inhibicin total en
TSA
<10 col. en TSA

Reacciones
caractersticas
Colonias caractersticas
segn cada medio
(ver norma)
Colonias caractersticas
segn cada medio
(ver norma)

Semicuantitativo

>10 col. en BGA u Colonias caractersticas

otro medio de
segn cada medio
eleccin
(ver norma)

Semicuantitativo

Inhibicin total en
TSA
<10 col. en TSA

Semicuantitativo

>10 col. en XLD u

otro medio de
eleccin

Colonias caractersticas
segn cada medio
(ver norma)
(contina)

25

NCh3162/2
Tabla B.3 - Medios de enriquecimiento selectivos (conclusin)
Medio

Selenitocistina

Tipo

Microorganismos

Salmonella

Norma

EN 12824

Funcin

Incubacin

Cepas de control

Selectividad

24 h/
41,5C

E.coli ATCC 25922 u 8739b)

Productividad

Selectividad

a)

L = medio lquido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mnimo).

26

E.faecalis ATCC 29212

19433
24 h/ 37C S. typhimurium ATCC 14028b)
o S. enteritidis ATCC 13076b)
+E.coli ATCC 25922 u 8739b)
+Ps.aeruginosa ATCC 27853b)
24 h/ 37C
E.coli ATCC 25922 u 8739b)
E.faecalis ATCC 29212
19433

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Semicuantitativo

Semicuantitativo

Semicuantitativo

Criterios
Inhibicin total en
TSA
<10 col. en TSA

Reacciones
caractersticas
-

>10 col. en BGA u Colonias caractersticas

otro medio de
segn cada medio
eleccin
(ver norma)
<100 colonias en
TSA

NCh3162/2
Tabla B.4 - Medios de enriquecimiento no selectivos

La)

Microorganismos
Staphylococcus

ISO 6888

Productividad 24 h/ 37C

Brucella

Campylobacter

ISO 10272

Productividad

Peptona
salina

Lquidos de
dilucin

ISO 6887

Diluyente

Thioglicolato

TSYEB

Medio

Tipo

BHI

Norma

ISO 7937
Clostridium
(NCh3061)
perfringens
Listeria
ISO 11290
monocytogenes

Funcin

Incubacin

2-5 das/
25C
45 min/
20C-25C

Cepas de control
S. aureus ATCC 25923b)

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Cualitativo

Criterios

Reacciones
caractersticas

Turbidez de 1 a 2

Cualitativo

Turbidez de 1 a 2

TSA

Cuantitativo

C. coli ATCC 43478

C. jejuni ATCC 33291 29428b)
E. coli ATCC 25922 8739b)
S. aureus ATCC 25923

Productividad 24 h/ 37C

Cl. perfringens ATCC 13124b)

Cualitativo

50% col./T0
(50% del
recuento original
Turbidez de 1 a 2

Productividad 24 h/ 25C

L. mono a ATCC 19111

L. mono 4b ATCC 13932 b)

Cualitativo

Turbidez de 1 a 2

a)

= L medio lquido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mnimo).

Tabla B.5 - Medios de aislamiento selectivos

Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Funcin

Incubacin

Cepas de control

Butzler
modificado

Sa)

Campylobacter

ISO 10272

Productividad

24 h - 72 h/
42C

C. coli ATCC 43478

CCDA
Karmali
Preston
Skirrow

Medio de Mtodo de
referencia
control
Cualitativo

Criterios
Buen
crecimiento (2)

C. jejuni ATCC 33291 29428b)

Selectividad

24 h - 72 h/
42C

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

S. aureus ATCC 25923

Cualitativo

Inhibicin total
o parcial (0-1)
Inhibicin total
(0)

Reacciones
caractersticas
Colonias
caractersticas
segn cada
medio
(ver norma)
Colonias no
caractersticas
(contina)

27

NCh3162/2
Tabla B.5 - Medios de aislamiento selectivos (conclusin)
Medio

Tipo

Micro-organismos

Norma

CIN

Yersinia
enterocolitica

ISO 10273

SSDC

Funcin

Incubacin

Productividad 24 h/ 30C

Selectividad

24 h/ 30C

Cepas de control
Y. enterocolitica ATCC 23715
9610b)

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

Medio de
Mtodo
referencia de control
Cualitativo

Cualitativo

Cualitativo

Cualitativo

S. aureus ATCC 25923

Agar verde
brillante
(BGA)

XLD

Salmonella

EN 12824/
ISO 6579

Productividad

24 h - 48 h/
37C

S. typhimurium ATCC 14028b)

Buen
crecimiento (2)

Inhibicin total
o parcial (0-1)
Inhibicin total
(0)
Buen
crecimiento (2)

S. enteritidis ATCC 13076

Selectividad

24 h - 48 h/
37C

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

E. faecalis ATCC 29212 19433

a)

S = medio slido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mnimo).

28

Criterios

Inhibicin total
o parcial (0-1)
Inhibicin total
(0)

Reacciones
caractersticas
Colonias
caracteristicas
segn cada
medio
(ver norma)
Colonias no
caractersticas
Colonias
caractersticas
segn cada
medio
(ver norma)
Colonias no
caractersticas
-

NCh3162/2
Tabla B.6 - Medios de aislamiento no selectivos
Medio

Tipo

Microorganismos

Norma

Funcin

Incubacin

Cepas de control

Agar
nutritivo

Sa)

Enterobacteriaceae

ISO 7402
ISO 8523
EN 12824
ISO 6579
ISO 10273

Productividad

24 h/ 37C

E. coli ATCC 25922 u 8739c)

EN ISO
11290

Productividad

Salmonella

Agar
TSYEA

Yersinia
enterocolitica
Listeria
monocytogenes

Medio de
referencia
-

Mtodo de
control
Cualitativo

Buen crecimiento (2)

Reacciones
caractersticas
-

Cualitativo

Buen crecimiento (2)

Criterios

24 h/ 37C S. typhimurium ATCC 14028c)

a)

S = Medio slido.

b)

Cepas a emplear por el laboratorio (mnimo).

c)

Cepas de libre eleccin segn el mtodo utilizado.

24 h/ 30C

Y. enterocolitica ATCC
23715 9610c)

24 h/ 37C

L. mono a ATCC 1911

L. mono 4b ATCC 13932b)

29

NCh3162/2

Anexo C
(Informativo)

Bibliografa
[1]

EN ISO 6887-1

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of

test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination - Part 1: General rules for the
preparation of the initial suspension and decimal dilutions.

[2]

EN ISO 8261

Milk and milk products - General guidance for the preparation

of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for
microbiological examination.

[3]

prEN ISO 6887-2

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of

test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination - Part 2: Specific rules for the
preparation of meat and meat products.

[4]

prEN ISO 6887-3

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of

test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination - Part 3: Specific rules for the
preparation of fish and fishery products.

[5]

prEN ISO 6887-4

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of

test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination - Part 4: Specific rules for the
preparation of products other than milk and milk products,
meat and meat products, and fish and fishery products.

[6]

ISO 7218:1996

[7]

ISO 2859-1:1999

Microbiology of food and animal feeding stuffs - General

requirements and guidance for microbiological examinations
Sampling procedures for inspection by attributes -- Part 1:
Sampling schemes indexed by acceptance quality limit (AQL)
for lot-by-lot inspection.

[8]

Corry JEL, Curtis GDW, Baird RM, 1995 Culture Media for Food Microbiology.
London: Elsevier Science, Volumen 34.

[9]

Anon. 1998 Int. J. Food Microbiol. 45, 65.

30

NCh3162/2
NOTA EXPLICATIVA NACIONAL
La equivalencia de las normas internacionales sealadas anteriormente con norma chilena, y su grado de
correspondencia es el siguiente:
Norma internacional

Norma nacional

Grado de correspondencia

EN ISO 6887-1

No hay

EN ISO 8261

No hay

prEN ISO 6887-2

No hay

prEN ISO 6887-3

NCh3033/3.Of2006

prEN ISO 6887-4

No hay

ISO 7218:1996

NCh2047.Of1999

ISO 2859-1:1999

NCh44.Of2007

Idntica
No equivalente
Modificada

31

NCh3162/2

Anexo D
(Informativo)

Justificacin de los cambios editoriales

Tabla D.1 Cambios editoriales
Clusula/subclusula
0, 6 lnea
0, 9 y 11 lneas;
1 y 4.2.3.1

32

Cambios editoriales

Justificacin

Se reemplaza esta especificacin La norma es de alcance nacional.

tcnica por la presente norma
Se reemplaza esta especificacin La norma es de alcance nacional.
tcnica por esta norma