Mtodos de Conservacin

Introduccin
Congelacin
Debido a que la actividad metablica de una clula se reduce considerablemente
por mantenimiento a muy baja temperatura, la congelacin es una tcnica de
eleccin, ya sea para cortos o largos perodos de tiempo. A esto ha contribuido
tambin la mayor disponibilidad de nitrgeno lquido (-196 C) y el mejoramiento
de los equipos de refrigeracin. La tcnica involucra el crecimiento del cultivo
hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son ms
resistentes a los daos por congelacin y descongelacin, que las de fase
exponencial.
Tambin es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congelacin,
debido a que, cuando parte de las clulas se lisan se liberaran sustancias
crioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas sobrevivientes.
Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente
crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El
ms empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como dimetilsulfxido,
glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de malta, han
sido tambin empleados.
La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico) y sellada antes
de colocarla bajo nitrgeno lquido. Uno de los problemas de esta tcnica se
refiere a la velocidad de congelacin.
Muchos estudios son coincidentes en sealar que una velocidad de congelacin
lenta y una rpida descongelacin rinden los mayores nmeros de clulas viables.
Se encontr que dependiendo de la naturaleza de las clulas, existe una velocidad
de congelacin ptima en cada caso para obtener una mxima sobrevida.
Como criterio general se puede decir que, lo ms ampliamente usado es el
enfriamiento a 1 C min-1 (ya que una rpida congelacin causa ruptura de
membranas) hasta -20 C y luego un rpido descenso.
En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70 C,
ya que a temperaturas ms altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si
son intracelulares son letales para las clulas.
En caso de nitrgeno lquido, la conservacin podra prolongarse por aos,
asegurando una buena provisin del mismo y disponiendo de equipos con
sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de temperatura.
Liofilizacin
La liofilizacin est considerada como el mtodo ms adecuado para la
preservacin de microorganismos. La tcnica involucra el congelamiento de un
cultivo seguido por un secado bajo vaco, lo cual resulta en la sublimacin de agua
de la suspensin celular. La ventaja es que la mayora de los organismos
sobreviven al secado y el cultivo es fcilmente mantenido an a temperatura
ambiente sin prdida significativa de viabilidad.
La liofilizacin es apropiada para la conservacin de la mayora de las bacterias,
encontrndose que las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas

cuando se las liofiliza y mantiene en condiciones similares. Tambin se emplea en

la conservacin de esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras.
Sin embargo, no es adecuada para clulas animales, algas y hongos en fase de
micelio.
La tcnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las clulas
son usualmente ms resistentes) resuspendiendo las clulas con un medio
crioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotas
de suspensin celular son transferidas a una ampolla, la cual es congelada a
aproximadamente -40 C y deshidratada mediante una sublimacin en vaco. Este
debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado contina hasta
llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada bajo
vaco. Se debe evitar la formacin de radicales libres que se producen por
exposicin de las clulas al oxgeno, ya que estn asociados con prdida de
viabilidad; de all la importancia de mantener el vaco.
El medio empleado en la liofilizacin es un factor importante en el proceso.
Entre los agentes recomendados estn la leche descremada en concentraciones
del 10 al 20%; suero equino, mezclas de suero, glucosa y extrato de levadura;
suero fetal bovino, etc. En algunos casos el efecto protector de la leche
descremada es mejorado por el agregado de solutos tales como cido ascrbico o
tiourea.
La sacarosa se ha empleado para reemplazar la leche descremada, y para
mejorar su performance se le adiciona glutamato de sodio y bacto casitone u otro
componente nitrogenado.
Normalmente la liofilizacin produce daos en las clulas, siendo los mismos en
algunos casos reversibles, por lo cual stas necesitan un tiempo de recuperacin
que es variable en funcin del tipo de dao producido.
En la reconstitucin de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobrevida de los
microorganismos si en lugar de agua destilada se agrega caldo nutritivo o el
mismo medio que se us para el crecimiento inicial de las clulas; de esta forma al
mantenerse elevada la presin osmtica durante la rehidratacin se logra que la
misma proceda en forma lenta.
Se encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacin tiene
una fase de retardo extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea para el
crecimiento un medio de igual composicin que el que da ptimo desarrollo pero
disminuyendo su concentracin original entre un 25 y un 50%.
En general no es posible determinar para cada grupo de organismos el mtodo de
conservacin ideal, por lo que se trata de emplear el ms adecuado. De todos, la
liofilizacin es el ms utilizado, aunque algunos organismos muestran las tasas de
mortandad. En este caso la alternativa es la congelacin, a pesar de que las cepas
mantenidas de esta forma son difciles de transportar.