6.

MATERIALESYMTODOS

6.1 Materiasprimas

En esta investigacin se emplearon como materias primas clices de flor de jamaica,

variedad de la regin Chiautla, y hojas de laurel, procedentes del Estado de Puebla.
stasfueronadquiridasdeshidratadasenlacentraldeabastosdelaciudaddePuebla.

6.2 Mtodos

6.2.1Obtencindeextractosacuososdeflordejamaica
Paraobtenerextractosdeflordejamaica,seuslametodologapropuestaporErsusy
Yurdagel (2006) con las siguientes modificaciones: se emplearon como sistemas
extractantes agua, etanol al 96%, etanol al 96%agua (relacin 50:50 y 70:30 v/v), y
etanolal96%HCl1.5N(85:15v/v).
Para cada una de las soluciones extractantes, en un vaso de precipitados se
colocaron 2.5 g de flor de jamaica previamente triturada en una licuadora, y se
aadieron25mLdelagenteextractante.Lamezclasecubriconpapelaluminioyse
mantuvoenagitacinyatemperaturaambientedurante2h.Posteriormente,sefiltr
en un embudo Bchner a travs de papel Whatman No. 2. El extracto obtenido se
colocenfrascosdeplsticoyserealizaronlasdeterminacionesdeformainmediata.
Alolargodeesteinforme,seharreferenciaaletanolal96%empleado,simplemente
comoetanol.

6.2.2Obtencindelextractoparamicroencapsulacinapartirdelextractoconmayor
capacidadantioxidante
Paralaobtencindelextractoempleadoenlamicroencapsulacinsecolocaron600g
deflordejamaicaen6Ldeagenteextractante.Lamezclasecubriconpapelaluminio

27

y se mantuvo en agitacin y a temperatura ambiente durante 2 h. Despus se

centrifugdurante10mina4500rpm.LuegosefiltrenunembudoBchneratravs
depapelWhatmanNo.2.Posteriormente,sellevacabolaeliminacindedisolvente
en porciones de 500 mL en un evaporador rotatorio (Bchi, 461, Suiza) a 35C. El
extractoconcentradorestanteseafora1.050Lysecubriconpapelaluminiopara
protegerlodelaluz.Seemple1Lparaelprocesodemicroencapsulacinylos50mL
restantesseemplearonenlacaracterizacindelextracto.Elextractosecaracterizen
base a slidos solubles totales (Bx), concentracin de compuestos fenlicos,
antocianinasmonomricastotales,actividadantioxidanteycolor.

6.2.3Purificacindelagomademezquite
Lapurificacindelagomademezquiteseefectuusandomodificacionesalatcnica
desarrolladaporBeristainetal.(2002).Seseleccionaronaquellasporcionesconmenos
impurezas,sepesaron200gdemuestrayseadicionaguadestiladahastaajustaraun
volumende2L.Lamezclasemantuvoenagitacinhastadisolvercompletamentelos
cristales de goma. La solucin obtenida fue filtrada en manta de cielo con el fin de
excluirlasimpurezasmsgrandes;despusfuefiltradaenunembudoBchneratravs
depapelWhatman#4,1y2,hastaeliminarcompletamentelasimpurezas.Lasolucin
filtrada se coloc en bandejas y se almacen en un congelador a 40C durante 24 h
parallevaracaboelprocesodeliofilizacin.Lasmuestrascongeladassecolocaronen
lacmaradeunliofilizador(Labconco,LYPHLOCK6,EE.UU.)parainiciarelprocesode
deshidratacinaunatemperaturadecondensacinde50Cyunapresindevacode
10micronesdeHg,sincalentamientoenplacascalefactoras.Concluidoelprocesode
liofilizacin, se coloc el producto deshidratado en un mortero y se tritur con un
pistilohastaobtenerunpolvofino.

28

6.2.4Obtencindelmicroencapsulado
Enunvasodeprecipitadossepesaron1,2,3,4y5gdegomademezquitepurificaday
se aadieron 100mL de extracto de flor de jamaica. La mezcla se agit mediante un
agitador magntico hasta disolver por completo la goma de mezquite. Despus se
midieronlosslidossolublestotales(Bx)(RefractmetroATAGO,Japn)acadaunode
loscincosistemas.Posteriormentelamezcladeextractolquidogomafuealimentada
enunsecadorporaspersin(Bchi,MinispraydrierB290,Suiza)araznde100.04
mL/min,aunatemperaturadelairedeentradade1802Cytemperaturadeairede
salidade1042.34C.Lapotenciadelaspiradorfuedel100%,yladelabombafuedel
35%,yelniveldelimpiadordelaespreafuede1.

6.2.5Almacenamiento
Los microencapsulados se almacenaron en una incubadora (Lab Line Instruments,
ImperialIII),a25Cenausenciadeluz,porunperiododecincosemanas.

6.2.6Cuantificacindecompuestosfenlicos
Los compuestos fenlicos totales se determinaron por el mtodo de FolinCiocalteau
(Singleton y Rossi, 1965). El reactivo FolinCiocalteau es una mezcla de cidos de
coloracinamarilla(fosfowolfrmicoyfosfomolbdico).Estoscompuestossereducenal
interaccionar con los compuestos fenlicos dando origen a xidos de coloracin azul
(xidosdewolframioymolibdeno),loscualesexhibenunaampliaabsorcindeluz,con
un mximoa 765nm. La intensidad de la absorcin de luza esa longitud de onda, es
proporcionalalaconcentracindecompuestosfenlicos.

6.2.6.1Determinacinenextractosdeflordejamaica
Enunmatrazaforadode50mLseaadieron50Ldeextractoy2.5mLdereactivode
FolinCiocalteau. Se mezclaron perfectamente y despus de 3 min, se incorporaron 5
mL de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20%; en seguida, se afor a 50 mL con agua

29

destilada y se mezcl perfectamente. Despus de 30 min se midi la absorbancia a

765nm usando un espectrofotmetro UVVisible (Varian Cary 100 Conc., EE.UU.). El
blanco usado se prepar siguiendo el procedimiento anterior, slo que sin aadir la
muestra.

6.2.6.2Determinacinenelextractoempleadoenlamicroencapsulacin
En un matraz aforado de 50 mL se colocaron 5 L del extracto usado en la
microencapsulacin,ysesiguilametodologadeacuerdoalaSeccin6.2.6.1.

6.2.6.3Determinacinenmicroencapsulados
Para llevar a cabo la cuantificacin en los microencapsulados, se pesaron 0.1 g de
extracto en polvo en un tubo de ensayo y se aadieron 3 mL de agua; la mezcla se
cubriconpapelparafilmyseagithastadisolvercompletamenteelextractoenpolvo.
Posteriormente se tomaron 150 L de muestra lquida y se colaron en un matraz
aforadode50mLysesiguilametodologayamencionada(Seccin6.2.6.1).

6.2.6.4Clculos
Elvalordeabsorbanciaobtenidoparacadaunadelasmuestrasevaluadas,sesustituy
enlaecuacindelacurvaestndardecidoglicoquesemuestraenlafigura6.1;en
dondeyesigualalaabsorbanciayxesigualalaconcentracin.
Elcontenidodecompuestosfenlicosseexprescomomiligramosequivalentes
de cido glico en 100mL de extracto de flor de jamaica, mientras que para los
extractos en polvo (microencapsulados) se expres como miligramos equivalentes de
cidoglicoen1gdeslidossolublesdejamaica.
EnelApndiceAseencuentraunejemplodeclculodelaconcentracindelos
compuestosfenlicos,enlosextractosyenlosmicroencapsulados.

30

0.7
0.6
Absorbancia

0.5
0.4
0.3

y=0.1261x 0.0181
R=0.9963

0.2
0.1
0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

cidogalico(mg/L)

Fig.6.1.Curvaestndardecidoglico(Jimnez,2008).

6.2.7Evaluacindeantocianinasmonomricastotales
Ladeterminacindeantocianinasmonomricastotalessellevacabodeacuerdoala
metodologadescritaporGiustiyWrolstad(2001).stasebasaenlastransformaciones
estructuralesquesufrenlasantocianinasmonomricasconuncambioenelpH;estos
compuestosadquierenlaconformacindecatinflavilio(colorrojointenso)apH1y
laformahemicetal(incolora)apH4.5.

6.2.7.1Determinacinenextractosdeflordejamaica
Para las determinaciones en los extractos de flor de jamaica, en un tubo ensayo se
colocaron7mLdesolucinbufferpH=1yenotrotubo,secolocaron7mLdesolucin
buffer pH=4.5 (ver Apndice B para la preparacin de las soluciones buffer).
Posteriormente, se aadieron 200 L de extracto de flor de jamaica a cada tubo, se
cubrieronconpapelparafilmyseagitaron.Paracadasolucin,semidilaabsorbancia
a520nm(longituddeondademximaabsorbanciadelasantocianinas)ya700nm
en un espectrofotmetro UVvisible usando agua destilada como blanco. La
absorbanciafinalsecalculdeacuerdoalasiguienteecuacin:

31

(Ec.1)

El valor de absorbancia calculado se sustituy en la Ec. 2 para obtener la

concentracindeantocianinasmonomricastotalesenlamuestra:

(Ec.2)

Donde PM y , corresponden al peso molecular y la absortividad molar de la

antocianinaquepredominaenlamuestra;yFDeselfactordedilucin(vol.total/vol.
extracto).
Dadoquenoseconocelaabsortividadmolardelpigmentopredominanteenla
jamaica,seemplearonlosdatoscorrespondientesalacianidina3glucsido(PM:449.2
g/moly:26900),yaqueeslaantocianinamscomnenlanaturaleza.

6.2.7.2Determinacinenelextractoempleadoenlamicroencapsulacin
En un tubo ensayo se colocaron 7mL de solucin buffer pH=1 y en otro tubo, se
colocaron 7 mL de solucin buffer pH=4.5. Posteriormente, se aadieron 100 L del
extracto empleado en la microencapsulacin y se sigui la metodologa antes
mencionada(Seccin6.2.7.1).

6.2.7.3Determinacinenmicroencapsulados
Para las determinaciones en los microencapsulados, se pesaron 0.1 g de extracto en
polvoenuntubodeensayoyseaadieron3mLdeagua;lamezclasecubriconpapel
parafilm y se agit perfectamente hasta disolver el extracto en polvo; despus, se
tomaron800Lyseaadieronauntuboensayocon7mLdesolucinbufferpH=1.Se
tomaronotros800Lyseaadieronaotrotubocon7mLdesolucinbufferpH=4.5
deacuerdoalametodologaantesmencionada(Seccin6.2.7.1).

32

Elresultadoobtenidoseexprescomomiligramosequivalentesdecianidina3
glucsido en 100 mL de extracto de flor de jamaica y en los extractos en polvo
(microencapsulados) se expres como miligramos equivalentes de cianidina3
glucsidoen1gdeslidossolublesdejamaica.
En el Apndice A se encuentra un ejemplo de clculo de la concentracin de
antocianinas monomricas totales en los extractos de flor de jamaica y en los
microencapsulados.

6.2.8Medicindelacapacidadantioxidante
LaactividadantioxidantesedeterminmediantelametodologaABTSdesarrolladapor
Reetal.(1999)ymodificadaporKuskoskietal.(2004).

6.2.8.1PreparacindelradicalABTS+
La formacin del radical ABTS+ se realiz mediante la reaccin de persulfato de
potasio (2.45 mM) con ABTS (2,2azinobis(3etilbenzotiazolin6cido sulfnico))
(7mM). Para esto, se colocaron 0.0033 g de persulfato de potasio y 0.0194 g del
reactivoABTSenunfrascoyseaadieron5mLdeaguadestilada.Lamezclaseagit
perfectamente y el frasco se cubri con papel aluminio dejndolo reposar 16 h en
oscuridadyatemperaturaambiente.

6.2.8.2Determinacinenextractosdeflordejamaica
Elextractodeflordejamaicafuediluidoenetanolabsolutoendiferentesproporciones
dependiendodelagenteextractante,conelfindeproducirunporcentajedeinhibicin
delradicalABTS+entreel20yel80%concluidalareaccin;yaqueesteintervalo,se
encuentradentrodelacurvaestndardelantioxidantedereferenciaTrolox(Fig.3.2).
ElporcentajedeinhibicinsecalculdeacuerdoalaEc.3quesemuestraenlaseccin
6.2.8.6.

33

Para el extracto con agua se us una dilucin 1:13 (v/v), para el extracto con
etanolseempleunadilucin1:12(v/v),paraelextractoconetanolagua50:50seus
unadilucin1:11(v/v);paraelextractoconetanolagua70:30seempleunadilucin
1:12(v/v)yparaelextractoconetanolHClseempleunadilucin1:11.

6.2.8.3Anlisis
Se diluyeron 150 L de radical ABTS+ con 15 mL de etanol absoluto en un vaso de
precipitadocubiertoconpapelaluminio,paraobtenerunaabsorbanciade0.700.02,
a754nmenunespectrofotmetroUVvisible(longituddemximaabsorbancia).
En seguida, en una celda de cuarzo se colocaron 980 L de la solucin radical
ABTS+etanol, y al alcanzar una absorbancia de 0.7 0.02, se tom como la
absorbanciainicial;posteriormente,enlamismacelda,seaadieron20Ldelextracto
diluido en etanol absoluto. La mezcla se agit cuidadosamente y se dio inicio a la
reaccin a 754 nm. Concluida la reaccin (7 minutos despus) se llev a cabo la
medicindelaabsorbancia,lacualsetomcomoabsorbanciafinal.

6.2.8.4Determinacinenelextractoparamicroencapsulacin
Elextractosediluyenetanolenunarelacin1:50(v/v)ysecolocenundispositivo
Vortexdurantedosminutos.Lamezclafuecentrifugada(Hermle,Z383K,Alemania)a
4500 rpm durante tres minutos y se realiz el anlisis siguiendo la metodologa ya
mencionada(Seccin6.2.8.3).

6.2.8.5Determinacinenmicroencapsulados
Para las determinaciones en los microencapsulados se pesaron 0.1 g de extracto en
polvoenuntubodeensayoyseaadieron3mLdeagua;lamezclasecubriconpapel
parafilm y se agit hasta disolver completamente el extracto en polvo. La muestra
lquida se diluy en etanol en una relacin 1:30 (v/v) y se coloc en un dispositivo
Vortex durante dos minutos. Las mezclas fueron centrifugadas (Hermle, Z383K,

34

Alemania) a 4500 rpm durante tres minutos y se realiz el anlisis de acuerdo en lo

mencionadoenlaSeccin6.2.8.3.

6.2.8.6Clculos
Elporcentajedeinhibicindelradicalsecalculdeacuerdoalasiguienteecuacin:

100

(Ec.3)

Donde:
Abs.Inicial:Absorbanciainicial.
Absfinal:Absorbanciafinal.

El porcentaje de inhibicin obtenido se sustituy en la ecuacin de la curva

estndar del antioxidante de referencia Trolox (6hidroxi2,5,7,8tetrametilcromo2
cidocarboxlico) (Fig.6.2).

%deinhibicindelradicalABTS

90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
y=5.045x+2.3627
R=0.9992

30.0
20.0
10.0
0.0
0

10

12

14

16

ConcentracindeTrolox(M)

Fig.6.2.CurvaestndardelantioxidantedereferenciaTrolox(Jimnez,2008).

35

Losresultadosdeactividadantioxidanteseexpresaroncomomolequivalente
a Trolox en 100 mL de extracto y en los extractos en polvo (microencapsulados) se
expres como mol equivalente a Trolox en 1g de slidos solubles de jamaica. En el
Apndice A se encuentra un ejemplo de clculo detallado para obtener el valor
correspondiente a la actividad antioxidante en los extractos y en los
microencapsulados.

6.2.9Purificacindeantocianinas
La purificacin de antocianas se realiz siguiendo la metodologa descrita por
RodriguezSaonayWrolstad(2001)conlafinalidaddeeliminarciertoscompuestos(Fig.
6.3).

Fig.6.3.Purificacindeantocianinas.

En una probeta se midieron 12.5 mL de extracto de flor de jamaica; ste se

colocenunmatrazdebolayempleandounevaporadorrotatorio(Bchi,461,Suiza),
sellevacabolaeliminacindeldisolventea35Cencondicionesdevacio(56cmde
Hg).Concluidalaconcentracin,elconcentradoseredisolvialvolumeninicialusando
agua destilada (12.5 mL). Este procedimiento se realiz para todos los extractos, a
excepcindelextractoconagua.
Posteriormente,atravsdeuncartuchoC18 (matrizC18unidaasilica:SepPak
de300mg,marcaWaters)(Figura6.3),sehicieronpasardosvolmenesdemetanoly

36

tres de agua cida (0.01% de HCl en agua destilada v/v) con la finalidad de
acondicionarelcartucho.Despussehicieronpasarporelcartucho250Ldelextracto
concentradoyenseguidaselavcondosvolmenesdeaguacidaydosvolmenesde
metanol acido (0.01% v/v HCl en metanol); el residual conteniendo nicamente
metanol cido se recuper en un matraz de bola y el metanol fue eliminado en un
evaporadorrotatorioaunatemperatura35Cencondicionesdevaco(56cmdeHg).
Finalmente,lasantocianinaspurificadasseredisolvieronen500Ldeaguadestilada,
se filtraron a travs de una membrana de 45 m y se inyectaron en el HPLC
(CromatografaLquidadeAltaResolucin).

6.2.10Determinacindelperfilantocinico
Laidentificacindeantocianinassellevacabomediantecromatografalquidadealta
resolucin(HPLC)enuncromatgrafo(Waters,600controller,EE.UU.)conarreglode
diodosyUV(Waters,996photodiodearmydetector,EE.UU.).Elprocesamientodela
informacin cromatogrfica se efectu con el sistema Waters Empower2. Con
modificacionesalametodologadesarrolladaporLeeyWrolstad(2004),laseparacin
decompuestosserealizenunacolumnaC18defasereversa(LiCrospher,100RP18,
Alemania)de25x0.4cmdelongitud,5mdetamaodepartcula,aunflujode1.5
mL/min. El volumen inyectado fue de 50L. La separacin se realiz en gradiente
isocrtico utilizando una mezcla de acetonitrilo (grado HPLC) y una solucin de cido
frmico al 4.5% en agua (grado HLPC), de acuerdo a las condiciones mostradas en la
tabla6.1.Ladeteccinsellevacaboa520nm.

Tabla6.1.CondicionesdeanlisisparalaseparacindeantocianinasporHPLC.
Tiempo(min) %deAcetonitrilo %decidofrmicoal4.5%
0
10
90
11
13
87
21
100
0

37

6.2.10.1Clculos
Paralacuantificacindelasantocianinasidentificadasenloscromatogramas,sehizo
unarelacinapartirdelosdatosobtenidosporelestndarylosdatosobtenidosen
esteestudio.
Los resultados obtenidos de la concentracin total de las antocianinas
identificadas,seexpresaroncomomiligramosdeclorurodecianidina3Oglucsidoen
100 mL de extracto de flor de jamaica. En el Apndice A se muestra un ejemplo del
clculo detallado para la cuantificacin de las antocianinas identificadas en el perfil
antocinico.

6.2.11Humedad
Lahumedaddelosmicroencapsuladossedeterminporsecadoydiferenciadepesos
deacuerdoalmtodo934.06delaA.O.A.C(2000).

6.2.12Evaluacindelcolorenextractosymicroencapsuladosdeflordejamaica
La medicin de los parmetros colorimtricos en los extractos de flor de jamaica se
llev a cabo en un colormetro (GardnerColor, Gardner System 05, Alemania)
empleando un aditamento de transmitancia de acuerdo a lo descrito por Kramer
(1973). Para la determinacin, se calibr el equipo con una placa negra y una placa
blanca. En una celda de cuarzo para transmitancia, se colocaron 20 mL de muestra
directadelextractoysemidieronlascoordenadascolorimtricascorrespondientesala
escala de Hunter: L (luminosidad), a (variacin verde a rojo) y b (variacin azul a
amarillo).Conbaseenlosparmetrosdescritos,secalcullapureza(C)yeltono(H)
pormediodelassiguientesfrmulas:

tan

(Ec.4)

(Ec.5)

38

Paralosextractosenpolvo(microencapsulados),lamedicindelosparmetros
de color se llev a cabo mediante pruebas de reflectancia y transmitancia. Para la
primera,seutilizunaceldadecuarzoparareflectanciaendondesecolocaron0.7gde
muestra.Paralasegunda,fuenecesariodisolver0.1gdepolvoen7.5mLdeagua;esta
solucin se coloc en la celda de cuarzo para transmitancia y se llevaron a cabo las
determinaciones ya mencionadas. Con base en las coordenadas colorimtricas
obtenidas, se calcul la diferencia neta de color entre el punto inicial y final del
almacenamientodelosmicroencapsuladosdeacuerdoconlasiguienteecuacin:

(Ec.6)

Donde:
,

:Valorescorrespondientesalpuntoinicialdelalmacenamiento

, , :Valorescorrespondientesalpuntofinaldelalmacenamiento

6.2.13MedicindelpH
ElpHdelosextractosdeflordejamaicasemidiporinmersindirectadelelectrodo
deunpotencimetroJemway3310(ReinoUnido).

6.2.14Obtencindeextractoetreo
Esteprocesoseefectudeacuerdoalmtodo963.15delaA.O.A.C(2000).Sepesaron
5gdemuestraenuncartuchodecelulosaparaextraccinysecolocaronenelsistema
deextraccinSoxhlet.Comodisolventeseushexano(100mL),mismoqueseaadia
un matraz Soxhlet puesto previamente a peso constante. Se arm el sistema de
extraccin,seencendilaplacadecalentamientoysedejhervirdurante46horas.
Concluida la extraccin, se apag el sistema y se evapor el disolvente; se elimin la
humedad colocando el matraz en una estufa a 50C. Finalmente, el matraz fue

39

colocado en un desecador y fue pesado para hacer el clculo correspondiente al

rendimientousandolasiguientefrmula:

(Ec.7)

Donde:
Pfmatraz:pesofinaldelmatrazSoxhlet(g)
Pimatraz:pesoinicialdelmatrazSoxhlet(g)
Pesomuestra:pesodelamuestradelaurel(g)

6.2.15Obtencindelaceiteesencialpordestilacinporarrastredevapor
Para este proceso se emple un sistema de destilacin por arrastre de vapor de la
UDLAP. La extraccin se llev a cabo de acuerdo a la metodologa empleada por
Viveros (2008). El recipiente inferior (aquel en contacto con la parrilla) se llen con
aguadestiladahastaocupar2/3partesdelmismo;posteriormentesecolocaron150g
de laurel en el frasco de vidrio superior del equipo; alrededor de dicho recipiente se
coloc una tela de asbesto para lograr un mejor calentamiento. Para iniciar la
destilacin, se encendi la parrilla de calentamiento asegurando durante todo el
procesoquehubierasuficienteaguaenelrecipienteinferioryquestaseencontrara
enebullicin.Concluidoelproceso(3h)seapagelequipoysedejenfriar;lamezcla
obtenidasedejreposar.Elaguafueliberadapordiferenciadedensidadespormedio
delavlvuladelfrascoinferioryelaceiteesencialpurofuerecolectadoenunfrascode
vidrio;stefuealmacenadoa4C,protegindolodelaluz.
Unavezrecuperadalacantidadsuficientedeaceiteesencialdelaurel,stefue
centrifugado a 4500 rpm a 4C durante 20 minutos; enseguida se llevaron a cabo las
determinacionescorrespondientesasucaracterizacinfisicoqumica.

40

6.2.16Densidad
Ladensidaddelaceiteesencialdelaurelsedeterminmedianteelusodeunmatraz
aforadode5mL.stesellenconelaceiteysecolocenunbaoconaguadestiladaa
25C durante 15 minutos. La densidad se calcul mediante la relacin masa/volumen
(Ec.8)utilizadaporViveros(2008):

(Ec.8)

6.2.17ndicederefraccin
Paraladeterminacindelndicederefraccindelaceiteesencialdelaurela25C,se
utiliz un refractmetro Abbe (ATAGO, Japn) de acuerdo a lo propuesto por Stirton
(1964).

6.2.18Evaluacindelcolordelaceiteesencial
Se evalu el color del aceite esencial de laurel en un colormetro (GardnerColor,
GardnerSystem05,Alemania)empleandounaditamentodetransmitancia.Paraesto,
secalibrelequipousandounaplacanegrayunaplacablanca.Despus,secolocaron
6.5 mL del aceite en una celda de cuarzo para transmitancia y se obtuvieron los
parmetroscolorimtricosL,ayb(Kramer,1973).

6.2.19Preparacindelinculoparaladeterminacindelaactividadantimicrobiana
(Pruebadesensibilidadalosantimicrobianos)
Para la llevar a cabo las pruebas microbiolgicas se usaron cepas de los
microorganismos Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Escherichia coli ATCC 35218,
obtenidasdelacoleccindecepasdelLaboratoriodeMicrobiologadeAlimentosdela
UDLAP.ParaelS.aureusseprepararon100mLdecaldoBHI(InfusinCerebroCorazn)
y para el E. coli se prepararon 100 mL de caldo Caso (caldo soya), los cuales fueron
esterilizados en un autoclave (Yamato Scientific America Inc., SM300, E.E.U.U) de

41

acuerdoalascondicionesrecomendadasporelfabricante:121Cduranteuntiempode
15 minutos a 15 lb de presin. Posteriormente, las cepas se inocularon en los caldos
conunaazadayfueronincubadasa35Cduranteunperiodode1824h,enelcualla
presenciadeturbidezenloscaldosindicelcrecimientodelmicroorganismo.Unavez
crecidoelmicroorganismo,seprepararoncuatrocajaspetricon15mLdeagarnutritivo
previamente esterilizado de acuerdo a las condiciones mencionadas anteriormente, y
sedejaronsolidificar.

6.2.20 Evaluacin de la actividad antimicrobiana (prueba de sensibilidad a los

antimicrobianos)
Para las determinaciones de la efectividad antimicrobiana se sigui la metodologa
propuesta por Galas y Ceriana (2001). Se sembraron los microorganismos de forma
masivaenlascajaspetriconagarnutritivo:endoscajaspetrisesembrelS.aureusy
enlasotrasdoselE.coli.Posteriormente,secortarondiscosdepapelfiltrode1cmde
dimetroyseempaparoncon2mLdelaceiteesencialdelaurel;stossecolocaronpor
triplicado en cada una de las cajas petri que contenan el agar nutritivo.
Posteriormente,seincubarona35Cdurante24hyseobservlapresenciadeunhalo
deinhibicindecrecimientodelmicroorganismo.