Diagnstico de Laboratorio de las Infecciones Virales

Justificacin de un Diagnstico Especfico

A Nivel Individual o de Hato
Coleccin, Empaque y Envo de Muestras
Diagnstico de las Infecciones Virales por Signos Clnicos e Histopatologa
Mtodos de Deteccin de Virus
Deteccin de Virus por Microscopa Electrnica
Deteccin de Virus por Aislamiento
Deteccin de Antgenos Virales
Deteccin de cidos Nucleicos Virales
Secuenciacin de cidos Nucleicos Virales (Secuenciacin Genmica)
Deteccin y Cuantificacin de Anticuerpos Virales Especficos (Diagnstico Serolgico)
Muestras Sricas
Pruebas Inmuno Enzimticas- Pruebas de Inmuno Absorbancia Ligada a Enzimas (ELISA)
Pruebas de (Virus) Seroneutralizacin
Pruebas de Inmunotransferencia (Transferencia Western)
Pruebas de Inmunoflorescencia Indirecta
Pruebas de Inhibicin de la Hemaglutinacin
Pruebas de Inmunodifusin
Pruebas de Anticuerpos Especficos de la Clase IgM
Tecnologas de Nueva Generacin
Interpretacin de Hallazgos de Laboratorio
Interpretacin de hallazgos del Laboratorio de Serologa

Las pruebas para apoyar o establecer un diagnstico especfico de una i infeccin viral son de cinco
tipos generales: (1) las que demuestran la presencia del virus infeccioso; (2) las que detectan
antgenos virales; (3) las que detectan cidos nucleicos virales; (4) las que demuestran la
presencia de la respuesta de anticuerpos (Abs) especficos del agente viral; (5) las que
directamente visualizan (ven) al virus. La mayora de las pruebas de rutina son dependientes de
antgeno (Ag), esto es, que estn diseadas para detectar viriones especficos y ofrecern resultados
negativos an si hubiese otros virus presentes en la muestra. Por esta razn, pruebas independientes
de Ag tales como aislamiento viral o microscopa electrnica an son usadas para identificar agentes
no esperados o desconocidos en una muestra clnica. Los mtodos tradicionales como aislamiento viral
an se usan; sin embargo son demasiado lentos para tener cualquier influencia directa en el manejo
clnico de un caso ndice. Uno de los ejes principales de la evolucin en las ciencias diagnsticas
contina siendo los mtodos rpidos que proporcionan una respuesta definitiva en menos de 24 horas
u, ptimamente, durante el curso del examen inicial del animal. Una segunda rea de inters y en
donde se ha concentrado el esfuerzo es en el desarrollo de pruebas mltiples que puedan escrutar
simultneamente para varios patgenos a partir de una simple muestra. El mejor de estos mtodos
debera cumplir cinco prerrequisitos: velocidad, simplicidad, especificidad diagnstica y bajo costo.
Caractersticas de pruebas para algunos virus de importancia econmica: (1) estn disponibles
comercialmente pruebas diagnsticas estandarizadas y con reactivos de buena calidad, (2) las pruebas
se han miniaturizado para conservar reactivos y bajas costos; (3) se han desarrollado instrumentos
para automatizar las pruebas, a su vez descendiendo los costos; los anlisis computarizados ayudan en
la interpretacin de los resultados tan objetivo como sea posible, adems de facilitar el reporte,
archivado y cobro.
Aunque es menos impresionante en medicina veterinaria en comparacin con la medicina humana (por
razones de retorno sobre inversin [economa], y el rango de pruebas requeridas por las diversas
especies), ha habido una expansin en el nmero de equipos (kits) de diagnstico rpido disponibles
comercialmente. Estas pruebas detectan antgenos virales, permitiendo un diagnstico a partir de una
muestra tomada directamente del animal durante la fase aguda de la enfermedad, o muestran la
presencia de Abs virus-especficos. Las pruebas de inmuno-enzimticas de fase slida (EIAs) o pruebas
de inmuno absorbancia ligada a enzimas (ELISAs), en particular, han revolucionado el diagnstico
virolgico para la deteccin de Abs o Ag, y son ahora los mtodos de eleccin en muchas situaciones.
Para los laboratorios de diagnstico, la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es
ahora ampliamente usada para detectar cidos nucleicos virales en muestras clnicas, ofreciendo una
muy rpida alternativa a otros mtodos de deteccin viral. Las pruebas de PCR cuantitativas, en
particular, facilitan la identificacin muy rpida, sensible y especfica de muchos virus patgenos
conocidos, y la automatizacin de estas pruebas permite el procesamiento de grandes cantidades de
muestras en periodos cortos de tiempo (muestreo grande-rendimiento mayor). Otra ventaja importante
de las pruebas cuantitativas de PCR es que proporcionan un estimado objetivo de la carga viral en la
muestra clnica. Los esfuerzos en la investigacin sobre PCR continan para poder mover los ensayos
del laboratorio al campo, particularmente para los agentes de graves consecuencias con los cuales la
rapidez de un diagnstico es crticamente importante.
La prestacin, por un laboratorio, de un servicio integral para el diagnstico de las infecciones virales
de los animales domsticos representa una formidable empresa. Los virus que causan infecciones de

55

significancia veterinaria estn en ms de 130 gneros diferentes perteneciendo a 35 familias. Adems

de esas cifras, la rpida expansin de virus que pertenecen a los animales de vida silvestre y del
mundo acutico, no es sorprendente que no haya un laboratorio que tenga los reactivos necesarios
especficos disponibles o las habilidades y experiencia necesarias para la deteccin e identificacin de
TODOS los virus de TODAS las especies animales. Por esta razn los laboratorios de diagnstico
veterinario tienden a especializarse [p. ej., en enfermedades de animales para alimentos, animales de
compaa, aves, peces o especies de laboratorio, o en enfermedades causadas por virus exticos
(enfermedades de animales ajenas al pas)]. Contactar al laboratorio para determinar sus capacidades
especficas debera ser el primer paso para enviar los muestras para anlisis. En el Cuadro 5.1 se
proporciona una gua general para las pruebas diagnsticas actualmente usadas en medicina
veterinaria.

Cuadro 5.1 Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Mtodo Principal
Muestras/Hallazgos
Caractersticas
Informacin Visual que lleva a un Diagnstico
Presuntivo
Revisin de la historia
El animal vivo y sus lquidos
Es muy importante diferenciar
de la enfermedad,
corporales/
para eliminar otros diagnsticos
examen clnico,
Valores anormales
presuntivos
pruebas bioqumicas,
hematologa, etc.
Patologa,
Animales, rganos, tejidos,
Aunque es caro y lento, todava
histopatologa,
clulas/
es de importancia en medicina
patologa estructural
Lesiones caractersticas,
veterinaria
cuerpos de inclusin
Deteccin de virus por Tejidos, clulas, secreciones,
Rpido, suficientemente sensible
microscopa electrnica excreciones contenido de las
con muchas enfermedades,
vesculas/
especialmente diarreas; caro
Partculas uniformes de
tecnolgicamente demandante,
morfologa caracterstica
se requiere un experto
generalmente
Deteccin e Identificacin de Antgenos Virales
Mtodos
Tejidos, clulas, secreciones,
Rpido, sensible y especfico.
inmunoenzimticos (p. excreciones/
Reaccin
Son los mtodos ms usados
ej., prueba inmuno
de antgenos virales con
ahora
-enzimtica de captura anticuerpos especficos
de antgenos
Inmunocromatografa,
Sangre, secreciones,
Rpido, sensible y especfico,
pruebas de anticuerpos excreciones/
adecuado para pruebas con
marcados con oro
El antgeno viral es
muestras nicas aplicadas en la
identificado por reaccin con
clnica
un anticuerpo especfico
Inmunofluorescencia
Tejidos y clulas/
Rpido, sensible y especfico. La
El antgeno viral es
localizacin del antgeno en
identificado in situ por
clulas especficas aumenta la
reaccin con un anticuerpo
confianza del diagnstico;
especfico
tcnicamente demandante
Inmunohistoqumica
Tejidos y clulas/
Lento, pero sensible y especfico.
(tincin de
El antgeno viral es
La localizacin del antgeno en
inmunoperoxidasa)
identificado in situ por
clulas especficas aumenta la
reaccin con un anticuerpo
confianza del diagnstico. Se
especfico
debe involucrar a un experto,
aunque es como una extensin
de histopatologa

56

Microscopa electrnica Tejidos, clulas, secreciones y

inmunoelectrnica
excreciones/
Caracteriza y agrega los virus
mediante un anticuerpo
especfico

Cuadro 5.1 (Cont)

Mtodo Principal
Deteccin Directa e
Mtodos de
hibridacin,
incluyendo
hibridacin in situ,
Hibridacin por
transferencia
(Southern) y mtodos
de hibridacin en
papel filtro
(transferencia de
punto)
PCR, PCR con
transcriptasa reversa,
PCR en tiempo real y
amplificacin
isotrmica

Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Muestras/Hallazgos
Caractersticas
Identificacin de cidos Nucleicos Virales
Extractos de tejidos, clulas,
Los mtodos de transferencia
secreciones y excreciones/
de punto son rpidos, simples
Los cidos nucleico virales son
de realizar, muy sensibles y con
identificados por reaccin con
reactivos adecuados muy
sondas especficas de ADN
especficos. En gran parte
sustituye a las reacciones en
cadena de la polimerasa (PCR)

Extractos de tejidos, clulas,

secreciones y excreciones/
Los cidos nucleicos virales son
especficamente amplificados al
usar pares de cebadores y luego
son identificados por diversos
mtodos como anlisis de tamao
de segmentos, sondas de ADN
marcadas, sondas de hidrlisis y
secuenciacin parcial

Secuenciacin
Extractos de tejidos, clulas,
genmica y parcial de secreciones y excreciones/
los virus
Los cidos nucleicos virales son
especficamente amplificados, y
generalmente por PCR y luego son
sometidos a secuenciacin
automtica, empleando solo 10057

Extensin del diagnstico de

microscopa electrnica. Rpido,
sensible y especfico. Caro y
demandante tcnicamente

Algunos mtodos pueden

contaminarse, causando
resultados falsos positivos. Sin
embargo, debido a su increble
sensibilidad y especificidad, son
ampliamente usados bajo
circunstancias en donde es
requerido "el toque de artista."
La automatizacin y los nuevos
mtodos de identificacin de
los productos amplificados
estn llevando a pruebas ms
rpidas, seguras y baratas.
Cuando se combina con
mtodos de amplificacin
genmica automatizados y
anlisis de resultados de bases
de datos, se convierte en la
prueba "estndar de oro" en la
identificacin viral.

300 bases regiones genmicas

seleccionadas.

Huellas de
oligonucletidos y
mapeo por
endonucleasas de
restriccin

Extractos de tejidos, clulas,

secreciones y excreciones/
Los cidos nucleicos virales son
amplificados generalmente por PCR
o por crecer los virus en cultivos
celulares, luego se digieren con
enzimas de restriccin y se aplica la
electroforesis en gel para
determinar los caractersticos
patrones de bandas (cdigo de
barras viral)

Muy lento, caro, difcil de

automatizar y complejo para
analizar. Estos mtodos estn
siendo reemplazados por PCR y
secuenciacin

Cuadro 5.1 (Cont) Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Mtodo Principal Muestras/Hallazgos
Caractersticas
Deteccin y Cuantificacin de Anticuerpos Antivirales (Diagnstico Serolgico)
Inmuno Ensayo
Suero/
Rpida, sensible y especfica; el pilar
Enzimtico (EIA)
Muestras analizadas para la
del diagnstico retrospectivo en
Prueba de Inmuno presencia de anticuerpos
muchos ensayos clnicos y
Absorbancia
especficos, indicando una
epidemiolgicos. En muchos casos,
Enzimtica (ELISA) infeccin reciente o pasada
sueros pareados son necesarios para
confirmar infeccin o vacunacin
reciente.
EIA o ELISA para
Suero/
Rpida, sensible y especfica; se ha
anticuerpos IgM
Muestras analizadas para la
convertido en el pilar del diagnstico
presencia de anticuerpos
serolgico de infecciones recientes
especficos IgM, indicando una en medicina humana, con desarrollo
infeccin reciente
limitado en medicina veterinaria. En
muchos casos una muestra de suero
es suficiente.

58

Pruebas de suero
(virus)
neutralizacin

Suero/
Las muestras son analizadas
para la presencia de
anticuerpos especficos
indicando una infeccin
reciente o pasada

Inmunotransferenc Suero/
ia (Western
Las muestras son analizadas
blotting)
para la presencia de
anticuerpos especficos
indicando una infeccin
reciente o pasada
Prueba de
Suero/
inmunofluorescenc Las muestras son analizadas
ia indirecta
para la presencia de
anticuerpos especficos
indicando una infeccin
reciente o pasada
Prueba de
Suero/
inhibicin de la
Las muestras son analizadas
hemaglutinacin
para la presencia de
anticuerpos especficos
indicando una infeccin
reciente o pasada
Inmunodifusin

Suero/
Las muestras son analizadas
para la presencia de
anticuerpos especficos
indicando una infeccin
reciente o pasada

Mtodo basado en cultivos celulares;

caro, lento y tcnicamente
demandante. Sin embargo, es la
"prueba de oro" de la serologa,
porque los anticuerpos neutralizantes
correlacionan bien con la proteccin
inmune

Lento, caro y tcnicamente

demandante, principalmente es
usada como prueba confirmatoria

Rpida, sensible, pero sujeta a

reacciones no especficas
incontrolables

Rpida, sensible y especfica;

ampliamente utilizada para
diagnstico retrospectivo para
propsitos epidemiolgicos y
reguladores. Contina siendo el pilar
del diagnstico de enfermedades
virales de las aves y de muchos virus
de mamferos
Rpida, pero carece de sensibilidad y
est sujeta a problemas de
especificidad. Hay muy buenas
pruebas para algunas enfermedades

Cuadro 5.2 Muestras apropiadas para el laboratorio de diagnstico de varios

sndromes clnicos en el animal vivo

59

Sndrome

Muestra

Respiratorio

Hisopado nasal o traqueal; aspirado nasofarngeo, lquido

del lavado traqueal

Entrico

Heces fecales

Genital

Hisopado genital

Ojo

Hisopado de la conjuntiva

Piel

Hisopado de la vescula o escarificacin; biopsia de la

lesin slida

Sistema nervioso central

Lquido cefalorraqudeo

Generalizado

Hisopado nasal a, heces fecales a, leucocitos sanguneos a,

suero, orina

Biopsia

rgano implicado

Cualquier enfermedad

Sangre para serologa

a Dependiendo de la patogenia presumida

b Permitir que la sangre coagule; al suero mantenerlo para pruebas de anticuerpos

JUSTIFICACIN DE UN DIAGNSTICO ESPECFICO

Por qu molestarse en establecer un diagnstico definitivo de laboratorio, de una infeccin viral? En
los primeros tiempos cuando el diagnstico de laboratorio estaba en su infancia, el diagnstico de las
enfermedades relacionadas a infecciones virales se logr principalmente basndose en la historia
clnica y los signos, y/o en patologa macroscpica e histopatologa; las pruebas de laboratorio fueron
vistas como confirmadoras de datos. Ahora esto no es el caso, por muchas razones: (1) el reciente
desarrollo de formatos de pruebas rpidas para identificacin sensible y especfica de infecciones
virales; (2) muchos casos clnicos ocurren como complejos de enfermedades que no pueden ser
diagnosticados basndose solamente en los signos clnicos o la patologa, por ejemplo, los complejos
de enfermedad respiratoria de perros y bovinos; (3) la medicina diagnstica, especialmente lo que
concierne a animales de compaa, que estn demandando diagnsticos antemortem especficos y
seguros; (4) acciones legales/reguladoras para enfermedades de animales de produccin y zoonosis
que requieren identificacin especfica del agente involucrado, la influenza aviar es un ejemplo
relevante actual.

A nivel individual o de Hato

Enfermedades en las cuales el manejo del animal o su pronstico es influenciado por el diagnstico.
Enfermedades respiratorias
(p. ej., en una caseta de engorde de pollos, enfermedad respiratoria aguda en un asilo de perros, fiebre
de embarque en corraletas de engorde), enfermedades diarreicas de neonatos, y algunas
enfermedades muco-cutneas pueden ser causadas por una amplia variedad de agentes infecciosos,
incluyendo virus. La identificacin rpida y segura del agente causal puede ser la base para establecer
un plan de manejo (bioseguridad, vacunacin, tratamiento antimicrobiano) para prevenir prdidas
adicionales en el establo, perrera, caseta, o hato.
Certificacin de libre de infecciones especficas. Para enfermedades de larga duracin (crnicas), como
infecciones por los virus de leucemias de gatos y bovinos, infecciones virales persistentes por el agente
de la diarrea viral bovina y ciertas infecciones por herpesvirus, un certificado de prueba negativa o
historia de una adecuada vacunacin es requerida a menudo como una condicin para la venta, para la
exhibicin en una feria estatal o subasta o para competencias y/o movilizacin internacional.
Inseminacin artificial, transferencia de embriones y transfusin sangunea. Los machos empleados
para la coleccin de semen y hembras usadas en los programas de transferencia de embriones,
especialmente el ganado, y los donadores de sangre de todas las especies son generalmente
escrutados para un rango amplio de virus para minimizar el riesgo de transmisin viral a los animales
receptores.
Zoonosis. Virus como el de la rabia, fiebre del valle del Rift, influenza, encefalitis equinas del este,
oeste, venezolana son TODOS zoonticos, y son de suficiente significancia en salud pblica como para
requerir laboratorios de diagnstico veterinario para establecer la capacidad de una deteccin segura
de estos agentes. La advertencia temprana de la epidemia potencial de influenzavirus mediante el
diagnstico de infeccin y/o enfermedad de un lote de aves en particular o de cerdos afectados,
permite la implementacin de programas de control para erradicar la infeccin y/o la restriccin de la
movilizacin de los animales expuestos. Como un ejemplo, la identificacin de laboratorio del virus de
la rabia en un perro, un zorrillo o un murcilago que haya mordido a un nio proporciona la base para la
decisin del tratamiento.

A nivel Estatal, del Pas o Internacional

60

Conciencia Epidemiolgica y econmica. La prestacin de servicios veterinarios adecuados en cualquier

estado o pas depende del conocimiento de las enfermedades prevalentes, por lo tanto frecuentemente
se hacen estudios epidemiolgicos para determinar la prevalencia y distribucin de infecciones virales
particulares. Tales programas son tambin dirigidos contra enfermedades de virus zoonticos, o
transmitidos por agua, alimentos, roedores o artrpodos. Internacionalmente, la presencia de
enfermedades especficas de los animales en un pas o regin requiere la notificacin a la Oficina
Internacional de Epizootias (Office International des Epizooties, la OIE, sinom., Organizacin Mundial de
la Salud Animal, www.oie.int), la cual registra la ocurrencia de estas enfermedades notificables en los
aproximadamente 175 pases miembros de la organizacin.
Programas de prueba y sacrificio. Para infecciones causadas por virus como el la anemia infecciosa
equina, enfermedad de Marek, herpesvirus bovino-1, pseudorabia, diarrea viral bovina, es posible
reducir sustancialmente la incidencia de la enfermedad o eliminar al agente causal de los hatos o
casetas mediante los programas de prueba y sacrificio. La eliminacin del virus de la pseudorabia de
instalaciones comerciales de cerdos en los Estados Unidos de Amrica (Mxico tambin), son ejemplos
donde las pruebas de laboratorio diferenciales [la as llamada prueba de diferenciacin/discriminacin
de animales infectados de los vacunados (DIVA), que discrimina entre los animales naturalmente
infectados de los vacunados] fueron esenciales en los esfuerzos de erradicacin.
Programas de vigilancia epidemiolgica en apoyo a la investigacin de enfermedades endmicas y
actividades de control. La vigilancia epidemiolgica de las infecciones virales basada en diagnstico de
laboratorio es central en toda la investigacin epidemiolgica, sea para determinar la significancia de
un virus determinado en un nuevo lugar, para revelar la historia natural y ecologa de un virus en un
individuo en una poblacin animal en particular, para establecer prioridades y medios de control, o
para hacer seguimiento y evaluacin de los programas de control.
Programas de vigilancia epidemiolgica en apoyo a la investigacin de enfermedades exticas y
actividades de control. Los pases de Europa, Amrica del Norte, Australia y Nueva Zelandia y Japn
son generalmente libres de muchas enfermedades devastadoras del ganado como fiebre aftosa,
fiebre porcina clsica, peste porcina africana, influenza aviar que todava son endmicas en otras
partes del mundo. Sin embargo, ocurren con alarmante regularidad incursiones peridicas de estas
temidas enfermedades exticas en reas previamente libres y es muy grande el impacto econmico
que provocan. Por lo tanto es de la mayor importancia que el diagnstico clnico de una infeccin viral
de grandes consecuencias deba ser confirmado rpida y ciertamente. Muchos pases mantienen o
participan en el uso de laboratorios especializados con biocontencin dedicados al diagnstico rpido y
seguro y a la investigacin de virus altamente catastrficos que causan enfermedades animales
exticas econmicamente devastadoras.
Prevencin de enfermedades virales de los animales nuevas, emergentes y re-emergentes. La continua
vigilancia epidemiolgica
De las poblaciones animales para evidencia de virus nuevos, enfermedades nuevas, y nuevas
epidemias es esencial si las nuevas amenazas deban ser tratadas rpida y comprehensivamente. Los
virus nuevos y nuevas asociaciones de virus-enfermedad continan siendo descubiertos, virtualmente
cada ao. La vigilancia por clnicos veterinarios sagaces tambin como laboratoristas y epidemilogos
es esencial para el pronto reconocimiento de tales eventos.

COLECCIN, EMPAQUE Y ENVO DE MUESTRAS

La oportunidad para detector u virus depende de la atencin dada por el clnico en la colecta de
muestras. Claramente, tales muestras deben ser tomadas del sitio exacto, del animal ms
apropiado y en el momento correcto. El momento ms adecuado para la deteccin viral es tan
pronto como sea posible despus de que el animal present los primeros signos clnicos, debido a
cantidades mximas de virus (ttulos) estn generalmente presentes en la aparicin de los signos y a
menudo decrecen en los das siguientes. Las muestras tomadas para deteccin de virus como ltimo
recurso cuando por das o semanas los tratamientos empricos han fallado son casi invariablemente un
esfuerzo intil y un gasto de recursos de laboratorio. Similarmente, la coleccin y conservacin
incorrecta de las muestras, y un envo inadecuado de las mismas, disminuir la calidad del xito
preciso del laboratorio de diagnstico.
El sitio del cual la muestra es colectada ser influenciado por los signos clnicos y el conocimiento de la
patogenia del agente sospechado (Cuadro 5.2). En la infeccin respiratoria viral del ganado, por
ejemplo, las muestras ms importantes que deberan ser colectadas incluyen hisopados nasales y
traqueales o lquido de lavados transtraqueales de animales vivos, y tejido del pulmn y linfonodos de
los animales muertos; muestras de sangre completa de este tipo de casos son a menudo de poco valor

61

porque el agente causal (virus sincitial respiratorio bovino, herpesvirus bovino-1, coronavirus bovino,
etc.) pueden no producir concentraciones detectables en ese tipo demuestra (viremia). Igualmente,
para los casos entricos de rutina (diarrea) las heces seran la muestra primaria en becerros con
infecciones por rotavirus, coronavirus o torovirus, la muestra de sangre completa es de mucha ayuda
solamente si el virus de la diarrea viral bovina es la causa probable. El tiempo en la colecta de
muestras tambin es crtico, particularmente en los casos entricos, porque la deteccin de rotavirus
podra no ser posible si han pasado ms de 48 horas de la aparicin de los signos clnicos. Las pruebas
de PCR pueden extender el periodo de muestreo por su alta sensibilidad analtica y su habilidad para
detectar cido nucleico viral a pesar de que el virus ya est bloqueado por Abs neutralizantes, pero
este largo periodo de deteccin no elimina la necesidad de intentarlo a tiempo. Adems, la deteccin
de cidos nucleicos de manera tarda por la prueba del PCR, aumenta la probabilidad de resultados
falsos positivos, y que el virus detectado por el PCR no sea el agente causal de enfermedad de los
animales afectados.
Las muestras de tejidos deberan siempre ser tomadas del cualquier parte del cuerpo en donde sean
observadas las lesiones, sean por biopsia quirrgica o en la necropsia, debido a que es crtico para que
los hallazgos del laboratorio puedan conciliar con las lesiones que fueron manifiestas en el animal
afectado. As las muestras separadas deberan ser partidas entre material que ser fijado (formalina u
otro fijador) y material que permanecer sin fijar para las pruebas de deteccin viral como tincin por
inmuno-histoqumica, tcnica directa de anticuerpos fluorescentes, pruebas de PCR, aislamiento viral.
Debido a la fragilidad de muchos virus, las muestras destinadas para el aislamiento siempre debern
ser mantenidas en fro y humedad, lo cual consume algo de tiempo. En la coleccin de muestras como
los hisopos, la discusin se har sobre el medio de transporte. Estos medios de transporte consisten en
solucin tamponada de sales a la que se le han agregado protenas (p. ej., gelatina, albmina, o suero
fetal bovino) para proteger al virus de la inactivacin y antimicrobianos para prevenir la multiplicacin
de bacterias y hongos. Un medio de transporte destinado a bacterias o micoplasmas no debera ser
usado para el muestreo de virus a menos que se haya demostrado que no es inhibitorio para la prueba
viral. Muestras separadas debern ser tomadas para los ensayos bacterianos. En general, las
muestras correctamente tomadas y mantenidas para aislamiento viral sern aceptables para pruebas
de deteccin de antgenos y cidos nucleicos. Un ejemplo de un kit que contiene materiales adecuados
para la colecta y transporte de muestras, se puede ver en la Figura 5.1.
Figura 5.1 Equipo para la correcta colecta y
transporte de muestras para maximizar las
oportunidades de obtener diagnsticos de
laboratorio vlidos a partir de una muestra clnica.
Los laboratorios pueden proveer de tales equipos,
los cuales contienen materiales para la colecta de
muestras y para un envo adecuado que cumpla los
estndares de transportacin. Los artculos
incluidos pueden ser: caja de envo (unicell); bolsa
aislada, paquetes de refrigeracin; bolsas para
muestras ziploc de 250-500 gr de capacidad;
frascos con formol (pequeo y mediano); papel
absorbente suficiente para capturar todo el lquido
de la caja de envo; tubos para colectar suero;
tubos para colectar sangre (con EDTA); agujas para
sangrar; jeringas; pinzas; bistures; Solucin salina
tamponada; alcohol 70%; torundas; formatos de
historia clnica; etiquetas de envo; plumn de tinta

Las muestras debern ser enviadas al laboratorio de pruebas, tan pronto como sea posible. Con los
servicios de paquetera disponibles en la actualidad a travs del mundo, los servicios de transporte
nocturnos han disminuido grandemente el tiempo para la deteccin de agentes, y tambin han
aumentado grandemente la tasa de diagnsticos exitosos (tasa de deteccin de patgenos). Las
muestras no debern ser congeladas sino solamente mantenidas en fro (temperatura de
refrigeracin, 4 C), si la entrega al laboratorio ser en varios das. Mientras que la viabilidad no es
muy necesaria para las pruebas de PCR y deteccin indirecta de antgenos, el mantener las muestras
bajo ptimas condiciones para el aislamiento viral, aumentarn la oportunidad de deteccin tambin
para esas tcnicas. Las muestras NUNCA se mandarn al laboratorio sin una detallada historia
clnica del animal y/o del hato de donde se tomaron dichas muestras. Las historias clnicas ayudan al
personal del laboratorio en la seleccin de las pruebas ms apropiadas para las muestras recibidas y
permiten un dilogo con el clnico sobre muestras adicionales si son necesarias. Similarmente, una
detallada y segura descripcin de la naturaleza y distribucin de las lesiones en los animales afectados
es importante, si las muestras no son enviadas para evaluacin histopatolgica, independientemente

62

de las muestras hayan sido tomadas por biopsia quirrgica o en la necropsia. El empacado y etiquetado
e identificacin de las muestras puede ser algo banal, pero poniendo mucha atencin a estos detalles
maximiza que la probabilidad de llegada de las muestras al laboratorio sea la adecuada adems de
prevenir sanciones legales por el envo incorrecto de materiales peligrosos. El remitente debe conocer
perfectamente las reglas de transporte local, las cuales son un reflejo de las reglas internacionales de
transporte areo, en relacin al empacado de muestras para diagnstico. Aunque algunas muestras
deben ser enviadas localmente por transporte terrestre, a menudo estos envos pueden ser
parcialmente transportados por aire en cortas distancias, an sin el conocimiento del empleado de la
oficina de paquetera. Las muestras deberan ser protegidas de fracturas durante el trnsito y deberan
ser mandadas en refrigeracin (no congeladas), con paquetes fros (refrigerantes especiales).
Siempre que sea posible, el muestreo debe incluir muestras que permitan el uso de varias pruebas
diagnsticas, as como una sola prueba proporcionar un resultado inequvoco en todos los casos.

DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES POR SIGNOLOGA, LESIONES

MACROSCPICAS E HISTOPATOLOGA
La evaluacin macroscpica (signos y lesiones) e histopatolgica de los tejidos de los animales con
presuntivas enfermedades virales son mtodos de diagnstico importantes y de mucha ayuda. Si las
muestras de la biopsia/necropsia son colectadas para diagnstico histopatolgico de infecciones
virales, entonces las muestras de tejidos deben colocarse en un fijador adecuado, rutinariamente
formol al 10%. Si se van a solicitar procedimientos especiales, como microscopa electrnica o cortes
congelados para tincin inmuno-histoqumica, se debera consultar al laboratorio para los
procedimientos y detalles para el manejo de estos materiales. Es crtico que una minuciosa, y clara
historia clnica y descripcin de las lesiones en los animales afectados deba acompaar a las muestras
enviadas.
El gran beneficio de la patologa es que proporciona una confirmacin inequvoca de enfermedades
especficas virales, especialmente cuando se hace en paralelo con pruebas de laboratorio apropiadas
para la virologa. En contraste, la mera demostracin de un virus en particular, o la seroconversin
(aumento del ttulo de anticuerpos) de un animal a ese virus, no es necesariamente prueba de agente
causal. As la demostracin de un virus especfico combinada con signos clnicos y lesiones compatibles
en los animales afectados fuertemente refuerza la confianza en un diagnstico especfico.
Similarmente, la identificacin de lesiones caractersticas en un animal sin deteccin asociada del virus
relevante deber estimular a la realizacin de esfuerzos adicionales de laboratorio para confirmar o
refutar el diagnstico tentativo.

MTODOS PARA LA DETECCIN DE VIRUS

Deteccin de Virus por Microscopa Electrnica (ME)
Quiz el mtodo ms obvio de deteccin/identificacin de virus es la visualizacin directa del mismo
por ME (Figura 5.2). La morfologa de la mayora de los virus es suficientemente caracterstica para
identificar la imagen como un virus y para asignar a u n virus desconocido a la familia correcta. En el
contexto de un caso particular (p. ej., deteccin de parapoxvirus en una lesin ulcerosa en la teta de
una vaca), el mtodo puede ofrecer un diagnstico inmediato y definitivo. Los virus no cultivables
pueden tambin pueden ser detectados por ME. A finales de la dcada de 1960, la ME fue el medio
para el descubrimiento de muchas nuevas familias virales de virus previamente clasificados como no
cultivables, principalmente, norovirus, astrovirus y torovirus y miembros desconocidos de familias
reconocidas como adenovirus y coronavirus. An ahora, los virus no cultivables como los del gnero
Anellovirus (torque-tenovirus) han sido identificados por ME en muestras de humanos y una diversidad
de animales.
Pueden ser aplicados dos procedimientos generales para la deteccin de virus por ME: la tincin
negativa para ME y la ME de corte delgado. Para los procedimientos de tincin negativa, los viriones
en una matriz lquida son colocados en un soporte slido diseado para ese propsito. Luego son
aplicadas tinciones de contraste y los virus son directamente visualizados por ME. La ME de corte
delgado puede ser usada directamente en las muestras de tejido fijadas de los animales afectados o
de cultivos celulares infectados de un virus no identificado, que generalmente contienen inclusiones
virales. La mayor limitacin de la ME es su baja sensibilidad como herramienta diagnstica, adems
de la necesidad de un equipo muy caro y un microscopista altamente calificado. Para detectar las
partculas por tincin negativa en la ME, la matriz lquida deber contener aproximadamente 10 6 (un
milln) de viriones por mL. Tales concentraciones generalmente son sobrepasadas en el material clnico
tales como heces y lquido de las vesculas, o en cultivos celulares infectados, pero no en el moco
respiratorio, por ejemplo. La agregacin de partculas virales por Abs especficos (microscopa inmuno-

63

electrnica, MIE) puede aumentar la sensibilidad y

proporcionar identidad provisional del agente. Para la ME de
corte delgado, la mayora de las clulas en el tejido de la
muestra deben contener virus si estos son propensos a ser
visualizados. Los procedimientos de rutina de ME han sido
reemplazados por procedimientos ms sensibles y ms
baratos como las pruebas de captura de antgeno y las
tcnicas de inmuno-tincin, pero debido a que la ME es un
procedimiento independiente del agente, todava sigue en
uso en casos especializados y en instalaciones con el equipo
necesario y con expertos.
Figura 5.2 Diagnstico por microscopa
electrnica. La morfologa de la mayora de los virus
es suficientemente caracterstica para asignar a un
virus desconoci8doa su familia correcta. En el
ejemplo, la tincin negativa directa de un lquido
vesicular revela muchas partculas de herpesvirus,
permitiendo emitir un diagnstico presuntivo de
rinotraquetis infecciosa bovina.
Aumento X 10,000.

Deteccin de Virus por Aislamiento

A pesar de la explosin de las nuevas tcnicas de
diagnstico el mismo da de las enfermedades virales por
demostracin del antgeno o el cido nucleico virales en las
muestras, el aislamiento viral en cultivo celulares permanece como un procedimiento importante.
Tericamente al menos, un solo virus viable presente en una muestra puede crecer en cultivos
celulares, as para aumentarlo y de esa manera producir suficiente material (virus) para permitir una
caracterizacin detallada posteriormente. El aislamiento viral contina siendo la prueba de oro
estndar comparada contra cualquiera de los nuevos mtodos, pero las pruebas de deteccin de
cidos nucleicos, particularmente las pruebas de PCR cuantitativas, estn retando ese paradigma.
Hay varias razones por las cuales el aislamiento viral contina como una tcnica estndar en muchos
laboratorios no comerciales. Hasta hace poco era la nica tcnica que poda detectar lo inesperado,
esto es, identificar a virus no sospechados, o quiz descubrir enteramente a un nuevo agente.
Inclusive, an esos laboratorios bien equipados para diagnsticos rpidos pueden tambin inocular
cultivos celulares para intentar aislar un virus. Las tcnicas metagenmicas (genomas de agentes
ambientales) y de secuenciacin profunda pueden detectar agentes desconocidos (los llamados
patgenos mineros escondidos), pero muy pocos laboratorios fue de los subsidiados para
investigacin tienen recursos necesarios para la aplicacin rutinaria de esta tecnologa. El cultivo es el
mtodo ms fcil de producir una gran cantidad de virus activo para exmenes ulteriores por mtodos
moleculares (secuenciacin genmica, variacin antignica, etc.). Los laboratorios de investigacin y
referencia, en particular, estn siempre en la bsqueda de nuevos virus en el contexto de las
enfermedades emergentes; tales virus requieren una caracterizacin adecuada, como se demostr
recientemente con la rpida evolucin de las cepas de influenzavirus (pandemia de 2009). Ms sin
embargo, grandes cantidades de virus deben se desarrolladas en cultivos celulares para producir
antgenos y reactivos de diagnstico como los anticuerpos monoclonales (MAbs). Hasta hace muy poco,
el desarrollo de una vacuna ha sido dependiente de la disponibilidad de virus crecidos en cultivos,
aunque esto puede rpidamente cambiar en el futuro con la sofisticacin creciente de la tecnologa de
ADN recombinante.
La eleccin de la estrategia de un cultivo celular para el aislamiento primario de un virus desconocido a
partir de muestras clnicas todava es muy emprica. Los cultivos primarios de tejidos fetales de la
misma especie generalmente proporcionan los substratos ms sensibles para el aislamiento de virus.
Las lneas celulares establecidas (cultivos de lnea) derivadas de las especies homlogas son, en la
mayora de los casos, una alternativa aceptable. Conforme ha aumentado el inters en las
enfermedades de los animales de vida silvestre, muchos laboratorios han tomado el reto de tener los
cultivos celulares necesarios que coincidan con las especies afectadas. Las estrategias para los casos
desafiantes tienden a reflejar la creatividad y los errores del virlogo en el diagnstico y del laboratorio,
aunque los signos clnicos que mostraron los animales afectados sugieran cual virus podra estar
presente. La mayora de los laboratorios tambin seleccionan una lnea celular que se conoce sirve

64

para desarrollar muchos tipos de virus, en el caso de que un agente inesperado est presente. Los
cultivos celulares de artrpodos son empleados frecuentemente como un sistema paralelo para el
aislamiento de los arbovirus (virus transmitidos por artrpodos). An en los mejores sistemas de
cultivos celulares disponibles, algunos virus como los papilomavirus no crecern en las condiciones
tradicionales de las clulas cultivadas. Sistemas especiales de cultivo como el de rganos y explantes
de tejido pueden ser valiosos, pero se debe contactar al laboratorio para determinar sus capacidades
porque se necesitan mtodos sofisticados y personal experto.
Histricamente, cuando los mtodos estndares han fallado en lo que parece una enfermedad
infecciosa, la inoculacin en el putativo animal hospedero natural se ha usado para definir la
naturaleza de la infeccin problema y para ayudar al eventual aislamiento del agente. Esta prctica ha
sido muy abandonada, por los costos y por las condiciones de bienestar animal. Algunos laboratorios
especializados tendrn la capacidad de inocular ratones mamones, un sistema que ha sido muy valioso
para el aislamiento de arbovirus que resisten el desarrollo en cultivos celulares. Los huevos
embrionados de gallina se siguen empleando para el aislamiento de influenzavirus A, aunque los
cultivos celulares [clulas Madin-Darby de rin de perro (MDCK)] son ahora comnmente usadas.
Muchos virus aviares se replican mejor en huevos que en clulas derivadas de tejidos embrionados de
pollo, y por eso hay una carencia de lneas celulares ampliamente disponibles para los procedimientos
rutinarios de aislamiento viral. De acuerdo al virus de inters, la muestra ser inoculada en la cavidad
amnitica, o en la cavidad alantoidea, el saco de la yema o en la membrana corioalantoidea y en raras
ocasiones de manera intravenosa en los vasos de la membrana corioalantoidea y del embrin. La
evidencia del crecimiento viral puede ser observado en la membrana corioalantoidea (p. ej., por lceras
causas por poxvirus), pero otros medios tambin son usados para detectar tal crecimiento (p. ej.,
muerte del embrin, hemaglutinacin, inmunofluorescencia o tincin inmuno-histoqumica de los
antgenos virales, o ELISA de captura de antgeno).
En los intentos para aislar virus se requiere una gran atencin de los clnicos hacia los detalles de la
colecta de las muestras y su transporte, porque el xito depende de que el laboratorio receptor tenga
una muestra conteniendo un virus viable. El contacto con el labora5torio de pruebas antes de la
coleccin de la muestra es fuertemente recomendado a manera de clarificar la estrategia de muestreo,
asegurar los requerimientos de envo, y en alertar al laboratorio con el nmero y tipo de muestras que
han sido remitidas. El tener cultivos celulares disponibles para el momento de llegada de la muestra
puede aumentar el xito del aislamiento. No hay mayor cosa en una emergencia que el aislamiento del
virus; cada virus posee su propio reloj biolgico y ningn tipo de preocupacin acelerar el ciclo de
replicacin. Para virus como los alfaherpesvirus, un aislamiento exitoso puede ser evidente como efecto
citoptico en las clulas de cultivo inoculadas en 2-3 das, mientras que para otros es
considerablemente ms lento y requerirn repetir una serie de pases. En general, el tiempo de
deteccin depender de los procedimientos del laboratorio para la identificacin del virus en los
sistemas de cultivo. Por ejemplo, los virus no citopticos de diarrea viral bovina pueden ser detectados
por aislamiento viral tan pronto como 3 das post-inoculacin o tan tarde como 3 semanas,
dependiendo de cmo lo haga el laboratorio. Los procedimientos de rutina para detectar e identificar
un virus en cultivos celulares inoculados incluyen la tincin de inmunofluorescencia o de inmunohistoqumica de la monocapa infectada, ELISA de captura de antgenos, pruebas de deteccin de cidos
nucleicos como PCR, hemadsorcin o quiz ME d tincin negativa para aislamientos desconocidos.

Deteccin de Antgenos Virales

La deteccin directa de antgenos (Ags) virales en una muestra clnica puede ser logrado tan rpido
como 15 minutos con algunas pruebas inmunolgicas, o el procedimiento puede llevar varios das si la
preparacin de la muestra y su tincin est involucrada. Los virus viables generalmente no son
requeridos en la muestra para una prueba de deteccin de antgeno positiva, pero el tiempo de colecta
si es importante con las pruebas que intentan el aislamiento. La sensibilidad analtica vara entre las
diversas modalidades de pruebas, que van desde la deteccin de solo una clula infectada hasta
pruebas que requieren ms de 105 (cien mil) unidades de antgeno por unidad de volumen. El avance
que revolucion este tipo de pruebas fue el desarrollo de los MAbs. Estos reactivos son altamente
especficos en su unin al Ag y, una vez desarrollados, proporcionan un suministro prcticamente
inagotable del mismo material para pruebas consistentes (seguras).
El lado oscuro de las pruebas de deteccin de Ags es que muchos de ellos estn alterados o
enmascarados por la fijacin del tejido. Es ms, son agentes especficos, as una prueba para el
parvovirus canino no podr detectar la presencia del coronavirus canino en la muestra, lo cual
requerir un prueba especfica separada y adicional.

Tincin de Inmunofluorescencia
65

La inmunofluorescencia o tincin de anticuerpos fluorescentes es una prueba de deteccin de Ag que

es usada primariamente en cortes de tejidos congelados, improntas celulares o cultivos de clulas, las
muestras de tejidos fijadas con formol generalmente no son de ayuda con este procedimiento. El Ag es
detectado mediante la unin a la muestra de Abs especficos especialmente modificados (conjugados).
La modificacin es el marcaje del Ab con el fluorocromo que absorbe luz ultravioleta de una longitud
de onda definida, y que emite luz en una longitud de onda mayor. La luz emitida es detectada
pticamente con un microscopio especial equipado con filtros especficos para la longitud de onda de
emisin del fluorocromo. Este fluorocromo puede ser unido directamente al Ab especfico
(inmunofluorescencia directa) o puede estar unido a una molcula de anti-globulina un antianticuerpo (inmunofluorescencia indirecta) Figura 5.3 A). El mtodo indirecto aumenta la sensibilidad
de la prueba, pero tambin aumenta el fondo inespecfico.

Figura 5.3 (A)

Inmunofluorescencia.
Izquierda: Mtodo directo.
Derecha: Mtodo indirecto.
(B) Inmunohistoqumica.
Izquierda: Mtodo directo.
Derecha: Mtodo indirecto

La tincin de inmunofluorescencia requiere de equipo especializado, incluyendo un criostato

(micrtomo de congelacin) para realizar los cortes congelados junto con un microscopio fluorescente
para la deteccin de los anticuerpos adheridos. La inmunofluorescencia ha probado ser de gran valor
en la identificacin de Ags en las clulas infectadas tomadas de animales o cultivos celulares
inoculados con muestras de los animales enfermos. Para ciertas enfermedades virales, las muestras
que poseen clulas infectadas pueden ser fcilmente colectadas de la membrana mucosa del aparato
respiratorio superior, del aparato genital, ojo, o piel, simplemente por pasar un hisopo o hacer una
escarificacin en el rea infectada con razonable firmeza. Las clulas tambin estarn presentes en el
moco aspirado de la nasofaringe o en los fluidos de otros sitios, incluyendo lavados traqueales o
bronquiales, o de lquido pleural, abdominal o cefalorraqudeo. Las infecciones respiratorias con
parainfluenzavirus, orthomyxovirus, adenovirus y herpesvirus son particularmente susceptibles para un
rpido diagnstico (menos de tres horas) por tincin de inmunofluorescencia. El mtodo tambin puede
ser aplicado a tejidospor ejemplo, biopsias para el diagnstico de enfermedades por herpesvirus, o de
la necropsia del encfalo de un mapache que mostraba signos neurolgicos como resultado de una
infeccin con el virus del distemper canino o del virus de la rabia (Figura 5.4).

Tincin Inmunohistoqumica (inmunoperoxidasa)

En principio, la tincin inmuno-histoqumica es muy similar a la tincin de inmunofluorescencia de los
Ags virales, pero con algunas diferencias importantes (Figura 5.3B). El marcador empleado en la
tincin inmuno-histoqumica es una enzima, generalmente la peroxidasa de rbano. La enzima
reacciona con un substrato para producir un producto final coloreado que puede ser visualizado en las
clulas infectadas con un microscopio ptico ordinario. La muestra de tejido ser fijada en formol, lo
cual permite analizar la muestra das o semanas despus de la colecta, sin la necesidad de bajas
temperaturas de conservacin. Otra importante ventaja de esta tcnica es que implica un proceso de
amplificacin en el que el producto de reaccin aumenta con la incubacin, mientras que la tincin de
inmunofluorescencia genera una seal de tiempo real que no hace ms fuerte al alargar el periodo de
incubacin. Es ms, los porta-objetos teidos por inmuno-histoqumica pueden ser guardados por
largos periodos para varias observaciones, mientras que los de inmunofluorescencia se deterioran ms
rpidamente. La inmunofluorescencia tiene la ventaja de la rapidez; la tincin por inmuno-histoqumica
de los tejidos fijados con formol requiere ms de 24 horas de fijacin para dar sus resultados. Quizs el
mayor beneficio de la tincin por inmuno-histoqumica es que facilita la comparacin de la distribucin
del virus y su localizacin celular en los cortes de tejidos para determinar si o no la distribucin del Ag
coincide con alguna lesin que est presente (Figura 5.5).

66

Figura 5.4 Tincin directa de anticuerpos fluorescentes

de encfalo de para el virus de la Rabia. Cortes
congelados de encfalo de bovino, que mostraba signos
neurolgicos anormales fueron fijados en acetona fra y
teidos con un reactivo comercial que contiene tres
anticuerpos monoclonales especficos para el
nucleocpside del virus de la rabia. Los anticuerpos fueron
marcados con fluorescena. La tincin positiva se pueden

Figura 5.5 Tincin de inmuno-histoqumica de un tejido

infectado con el virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDv).
Una muestra de rin fijada en formol de un becerro
enfermo reaccion con el anticuerpo monoclonal 15.c.5. La
unin fue detectada usando un suero de cabra anti-ratn
marcado con peroxidasa de rbano. El substrato para la
enzima fue 3-amino-9-etilcarbazol. La tincin de clulas
obscuras es positiva al antgeno BVDv.

Pruebas inmuno EnzimticasPruebas de Inmuno Absorbancia ligada a Enzimas

Las pruebas inmunoenzimticas (EIAs) a menudo referidas como pruebas de inmuno absorbancia
ligada a enzimas (ELISAs) han revolucionado los procedimientos de pruebas de diagnstico. Las
pruebas pueden ser diseadas para detectar Ags o Abs. Aunque las EIAs tienen una mayor
sensibilidad relativa, se requiere que las muestras tengan ms de 10 5 partculas virales por mL para
obtener reacciones positivas con muchas pruebas. Este nivel de sensibilidad hace que estas pruebas
sean altamente valiosas, particularmente cuando se analizan grupos, en donde cualquier animal
positivo define el estado del hato. Las pruebas pueden ser realizadas con una simple muestra en la
clnica veterinaria o con varios cientos de muestras al mismo tiempo, usando sistemas automticos en
laboratorios centrales. Algunos comnmente algunos usados son para la deteccin de Ags con kits
especiales para el virus de leucemia felina, parvovirus canino, diarrea viral bovina, e influenzavirus.
Hay muchos tipos diferentes de pruebas EIAs que difieren en sus propiedades geomtricas, sistemas
detectores, sistemas de amplificacin y sensibilidad. No es posible discutir todas las pruebas, pues los
principios bsicos de ellas aplican a todas.
La mayora de EIAs son inmuno-ensayos enzimticos de fase slida; el Ab capturado est adherido a
un subtrato slido, tpicamente los pozos de placas de microtitulacin de poliestireno o polivinilo. El
formato ms simple es una EIA directa (Figura 5.6). el virus o Ags virales solubles de la muestra se les
permite unirse a los anticuerpos capturados. Despus de la unin los comp0onentes son lavados, y un
Ab antiviral marcado con la enzima conjugado (el Ab detector) es aadido, diversas enzimas pueden
ser adheridas al Ab detector, pero la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina son las ms
comnmente usadas. Despus de otro lavado, un substrato orgnico apropiado para la enzima en
particular es aadido y la lectura se har basada en el cambio de color que enseguida aparece. El
producto coloreado de la reaccin de la enzima con su substrato puede ser detectado visualmente o
ledo en un espectrofotmetro para medir la cantidad de Ab unido al Ag capturado. El producto de la
reaccin enzimtica puede ser modificado para producir una seal fluorescente o quimioluminiscente
para aumentar la sensibilidad. Con todas esas pruebas, la validacin debe hacerse para determinar los
valores de corte de la prueba, los cuales definen la sensibilidad y especificidad diagnstica de la
prueba.
Las EIAs indirectas son ampliamente usadas por su gran sensibilidad analtica, pero el aumento de la
sensibilidad generalmente conlleva a una prdida de especificidad. En este formato de la prueba, el Ab
detector no est marcado pero si un segundo anti-anticuerpo antiglobulina (especie-especfica) es
aadido como el Ab indicador (Figure 5.6). Alternativamente, una protena A de Staphylococcus spp.,
marcada, la cual se puede unir a la estructura Fc de la IgG de muchas especies de mamferos, puede
ser usada como el indicador en pruebas de inmunoenzimticas indirectas. Los MAbs han facilitado
especialmente el desarrollo de pruebas de EIAs, porque proporcionan un aporte consistente de
reactivos con alta sensibilidad y especificidad para las pruebas comerciales. Sin embargo, cualquier
variacin (variacin antignica del virus blanco) en los epitopos especficos reconocidos por los MAbs
especficos pueden llevar a una prdida de unin y carecer la prueba de sensibilidad ofreciendo

67

resultados falsos negativos. Las EIAs han

formatos para el uso en clnicas
muestras de un solo animal (Figura 5.7).

sido
adaptadas
a
veterinarias
para

Figura 5.6 Prueba inmuno-enzimtica (EIA, tambin llamada de

Inmuno Absorbancia Enzimtica, ELISA) para la deteccin de virus
y/o antgeno viral. Izquierda: Mtodo directo. Derecha: Mtodo
Indirecto usando un anticuerpo biotinilado; avidina marcada con una
enzima (p. ej., peroxidasa) y el substrato de la enzima y un

Figura 5.7 Un artculo de prueba inmuno-enzimtica comercial para

uso en la clnica en un solo animal. Este equipo es para la deteccin
simultnea del virus de la leucemia felina (FeLv), prueba de antgeno
(Ag) y para detectar anticuerpos (Abs) contra el virus de la
inmunodeficiencia felina FIv) en el suero, plasma o sangre completa de
felinos. La deteccin del antgeno FeLv grupo-especfico es un
diagnstico de infeccin por el FeLv y la deteccin de anticuerpos
especficos al FIv son indicadores de infeccin. La prueba utiliza un
anticuerpo monoclonal para la p-27 del FeLv, un antgeno inactivado
del FIv y controles positivos y negativos. Una mezcla de conjugado que
contiene anticuerpo conjugado con una enzima para la p-27 y un
antgeno conjugado con una enzima. Cuando el conjugado y la
muestra son mezclados, el conjugado del anticuerpo monoclonal se
unir al antgeno p-27 (si est presente). La mezcla muestraconjugado es luego agregada al dispositivo y fluir por la matriz
punteada. La matriz con anticuerpo anti p-27 (marca de FeLv)
capturar al complejo de p-27 y anticuerpo conjugado, mientras que la
matriz con el antgeno de FIv (marca de FIv) capturar al complejo de
anticuerpo anti-FIv y antgeno conjugado. Entonces el dispositivo
estar activado, luego es lavado, y los reactivos del substrato

Inmunocromatografa
La inmunocromatografa simplemente refiere a la migracin del Ag o complejos Ag-Ab por filtros matriz
o en un formato de flujo lateralpor ejemplo, usando tiras de nitrocelulosa. En la mayora de los

68

formatos, un Ab marcado se une a un Ag de inters. Los complejos Ag-Ab son entonces inmovilizados
en una matriz de soporte por un Ab no marcado unido a la matriz. Todos los controles son incluidos en
la membrana (positivo y negativo), y los resultados son vistos como manchas coloreadas o bandas,
porque uno de los reactivos de prueba es un conjugado con oro coloidal o substancias cromognicas.
Este formato de prueba es especialmente conveniente para prueba de pacientes en cuidados
intensivos, como el proceso de prueba es simple y cada unidad de prueba contiene los controles
positivo y negativo para validad la seguridad de dicha prueba.

Deteccin de cidos Nucleicos Virales

El desarrollo en el rea de la tecnologa de deteccin de cidos nucleicos en los ltimos aos ha
relegado a algunas tcnicas a los anales de la historia con respecto a su uso en las pruebas de
diagnstico. Por ejemplo, las tcnicas de hibridacin clsicas no son susceptibles de ser empleadas
para pruebas de rutina, especialmente con los requerimientos rigurosos de los estndares de control.
La mayora de los cambios dramticos en la tecnologa de la deteccin de cidos nucleicos ha sido la
evolucin de las pruebas de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), e igualmente la importante
estandarizacin de los procedimientos de extraccin de cidos nucleicos. Adems, de los rpidos
avances en la tecnologa de la secuenciacin de nucletidos, sntesis de oligonucletidos, y el
desarrollo de bases de datos genticos que permiten baratos anlisis de secuencias que han
reemplazado procedimientos menos rigurosos para la comparacin de las cepas virales y sus
aislamientos. La tecnologa actual permite la amplificacin de poblaciones de virus por PCR con la
secuenciacin directa de los productos amplificados a partir de muestras clnicas sin la posible
introduccin de un sesgo potencial dado por el cultivo celular. Ms recientemente el desarrollo ha
permitido la deteccin y caracterizacin de agentes desconocidos (metagenmica viral). Con el
desarrollo de la nanotecnologa, uno podra anticipar el futuro de la deteccin barata de unidades de
cidos nucleicos que sera fiable detectar agentes infecciosos cuando sea usada en las clnicas o en el
campo, sin la necesidad de personal altamente entrenado.
Los mtodos de deteccin de cidos nucleicos son invaluables cuando se trata de: (1) virus que no
pueden ser cultivados fcilmente; (2) muestras que contienen virus inactivados como resultado de una
prolongada conservacin, fijacin del tejido o transporte prolongado; (3) infecciones latentes en las
cuales el genoma viral permanece latente y el virus infeccioso est ausente; (4) el virus ha hecho
complejos con Abs como se encontrara en las fases finales de una infeccin aguda o durante algunas
infecciones virales persistentes. Sin embargo, la sensibilidad aadida dada por la amplificacin del
cido nucleico viral puede actualmente crear nuevos problemas. A diferencia de la situacin de las
bacterias patgenas, generalmente ha sido el caso que la sola deteccin de un virus patgeno en una
lesin, o de un animal clnicamente enfermo, siempre se ha considerado como evidencia de su papel
etiolgico (relacin causal). Como los mtodos de deteccin han estado aumentando la sensibilidad y
las pruebas incluyen ms agentes, las preguntas de agentes virales pasajeros son ahora ms
pertinentes. Por lo tanto, con virus como el de la lengua azul, el cido nucleico viral puede ser
detectado en la sangre de rumiantes previamente infectados varios meses despus de que el virus
infeccioso se haya eliminado. Es ms, un ejemplo con el herpesvirus bovino 1, la deteccin de cidos
nucleicos virales no indica si estn presentes como consecuencia de una infeccin aguda, reactivacin
de una infeccin latente o por la vacunacin.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La prueba de PCR es un mtodo in vitro para la sntesis enzimtica de secuencias especficas de ADN
usando dos oligonucletidos iniciadores (cebadores, primers), generalmente de unos 20 residuos (20mers), que hibridizan en las cadenas opuestas y flanquean la regin de inters del ADN blanco; la
primer pareja de cebadores son algunas veces referidos como de avance y regreso (Figura 5.8). Los
cebadores son necesarios para proporcionar a la polimerasa de ADN un substrato sobre el cual sern
agregados nuevos nucletidos, y para dirigir la reaccin a la regin especfica del ADN para su
amplificacin. Los iniciadores tambin pueden ser diseados para colocar marcas en los productos
amplificados para propsitos de deteccin. Se han empleado programas de cmputo para el diseo de
grupos de cebadores ptimos y para predecir los parmetros (tiempo/temperatura) para las reacciones.
En donde hay desajustes conocidos de bases mal alineadas o desajustes previos entre el cebador y las
secuencias blanco, los iniciadores pueden ser preparados para ser degradadosgrupos de cebadores
con diferentes bases en un lugar determinado. Esto puede aumentar la sensibilidad diagnstica de la
prueba, as como ms variantes genticas podran ser detectadas. Para el PCR, las reacciones son
realizadas en un termociclador bajo condiciones cuidadosamente controladas de fuerzas inicas,
temperatura, concentracin de cebadores y de nucletidos. Los ciclos repetitivos incluyen
desnaturalizacin del molde (ADN original) por calentamiento, alineacin de cebadores y extensin por
la polimerasa de ADN de los cebadores alineados, resultando en la acumulacin exponencial de
segmentos de ADN especficos que son definidos por los extremos 5 de los cebadores. Los productos

69

de la primera extensin sintetizados en un ciclo sirven como moldes en el siguiente, de esa manera el
nmero de copias de ADN blanco aproximadamente se duplica en cada ciclo; unos 20 ciclos
proporcionan alrededor de un milln de copias amplificadas.

Figura 5.8 Amplificacin de parte de

una secuencia de ADN por la reaccin en
cadena de la polimerasa. Los cebadores
oligonucletidos deben primero ser
hechos segn la secuencia de cualquiera
de los segmentos de ADN que sern
amplificados. Luego el ADN debe ser
desnaturalizado por calentamiento, los
cebadores pueden hibridizar a las
secuencias complementarias en la banda
opuesta de ADN. En la presencia de
polimerasa termo-resistente y trifosfatos
de desoxinucletidos dos nuevas copias
de la regin deseada sern producidas.
Los ciclos de fusin, alineamiento y
extensin son rpidamente repetidos;
cada vez, la cantidad de ADN blanco se
duplicar. Despus de los primeros
ciclos, virtualmente todos los moldes
consisten de las regiones cortas
escogidas para amplificacin. Despus de
30 ciclos, que toma unas 3 horas, la

Desde la introduccin del concepto PCR en 1983, ha habido numerosos cambios a virtualmente todas
las facetas del proceso. La incorporacin de una polimerasa de ADN termoestable permiti la
desnaturalizacin a altas temperaturas y la separacin de filamentos de los productos sintetizados, con
lo cual se elimin la necesidad de reponer la polimerasa en cada ciclo. El uso de una polimerasa
termoestable tambin increment la especificidad de la reaccin, porque los ciclos pueden ser
realizados bajo condiciones ms estrictas de alineacin, especficamente, la alineacin en altas
temperaturas reduce el mal acoplamiento de los pares de bases que conllevaran a resultados falsos
positivos. Con la intencin de aumentar la sensibilidad de la prueba, fue desarrollado un procedimiento
de PCR anidado. En este procedimiento, un grupo de cebadores se usa para una amplificacin inicial
de un rea blanco y el producto de la primera reaccin se convierte en el molde para una segunda
prueba de PCR en la cual nuevos iniciadores se acoplarn a una regin interna del primer par de
cebadores. Esta amplificacin del producto ya amplificado aumenta grandemente la sensibilidad de la
prueba, pero tambin las oportunidades de resultados falsos positivos por la contaminacin de los
materiales de prueba del producto inicialmente amplificado. Posteriores desarrollos de la tecnologa del
PCR cuantitativo ha reducido notablemente el uso de procedimientos de anidado.
El desarrollo del mtodo de la reaccin de la cadena de la polimerasa con la transcriptasa reversa (RTPCR) para detectar secuencias de ARN fue un gran avance en la biologa celular y el diagnstico viral.
Para el RT-PCR, el ARN primero es transcrito a ADNc (ADN complementario) usando una polimerasa de
ADN capaz de usar ARN como molde, como la transcriptasa reversa de los retrovirus. Una reciente
enzima de transcriptasa reversa ha sido desarrollada recientemente que permite la sntesis de una
cadena de ADNc a temperaturas altas, la cual aumenta la sensibilidad y especificidad analticas de la
reaccin. En las pruebas de un solo tubo de RT-PCR, todos los componentes para ambas reacciones son
colocados en el tubo de reaccin al inicio de la prueba. El paso de la sntesis del ADNc es seguido
inmediatamente por la reaccin de PCR. En este formato de prueba, no hay oportunidad para los
productos de una reaccin que tengan contaminacin cruzada con otros, debido a que el tubo de
reaccin nunca es abierto sino hasta que finaliza el protocolo del anlisis. Los avances como el de la
prueba de un solo tubo incrementan grandemente la credibilidad de los resultados de prueba al
virtualmente eliminar los problemas de contaminacin del laboratorio.
Mtodos para la Deteccin de Productos Amplificados

70

Al inicio de la era de las pruebas de PCR, los productos amplificados fueron detectados por analizar los
productos de reaccin por separacin en gel. Los productos amplificados de un tamao determinado
eran visualizados usando substancias fluorescentes que se unen a los oligonucletidos separados en
los geles de agarosa. Una banda de un tamao apropiado era tomada como una prueba positiva para
la presencia del Ag en una muestra. Los mtodos se fueron desarrollando para aumentar la sensibilidad
de deteccin de bandas en los geles., pero an con el aumento de la sensibilidad, este procedimiento
de deteccin tuvo un gran defectoel tubo de reaccin tena que abrirse varias veces para asegurar el
estado de la muestra. Muchas reas de los laboratorios se contaminaron con los productos de la
reaccin amplificada, muchos falsos positivos se presentaron frecuentemente despus de que se
analizaron subsecuentes muestras. Se hicieron muchos actos heroicos para evitar el problema de
dichos falsos positivos, pero la sospecha de un resultado positivo permaneci prevalente y an
perduran. Afortunadamente, la tecnologa proporcion una respuesta para poder dominar las pruebas
de PCR: las pruebas de PCR en tiempo real (Figura 5.9). Este gran avance de la tecnologa fue realizado
por el desarrollo del termociclador con un fluormetro que poda medir con seguridad (cuantificar) la
acumulacin de productos del PCR (amplicones) en el tubo de reaccin como se hace hasta ahora
esto es, en tiempo real. El producto es medido por aumentos en la intensidad de la fluorescencia
generada por varias molculas reporteras fluorescentes, incluyendo uniones a ADN no especfico (SYBR
Green I), a sondas de TaqMan (Figura 5.9 A), y balizas moleculares como ejemplos. Una vez que los
reactivos son agregados al tubo de prueba, stos no necesitan abrirse nuevamente, as se evita
cualquier oportunidad para la contaminacin del laboratorio. Los sistemas de deteccin en tiempo real
tambin son ms sensibles que los mtodos estndar en sistemas de geles, y la especificidad aadida
es lograda mediante el uso de sondas de deteccin de la reaccin, debido a que su seal es generada
solamente si la secuencia de la sonda es capaz de unirse a la secuencia blanco.

Figura 5.9 (A) El mecanismo qumico

de la sonda TaqMan. Estas sondas
dependen de la actividad de la actividad
nucleasa 5-3 de la Taq polimerasa de
ADN para escindir a una sonda doble
marcada durante la hibridacin de la
secuencia blanco complementaria.
(B) Datos cuantitativos de la PRC de
tiempo real. Las curvas de reaccin de
prueba para asegurar sus condiciones,
usan diluciones de un transcrito de ARN
(control de nmero de copias) de un
segmento clonado de pneumovirus
canino. Las lneas verticales representan
el valor Ct, el cual es el nmero de ciclos
de PCR requeridos para que la seal
fluorescente cruce un valor determinado.
La sonda TaqMan fue marcada con FAM

Otra ventaja del sistema de tiempo real es que el proceso puede ser cuantitativo. Bajo condiciones
ptimas, la cantidad del amplicn aumenta por un factor de 10 con cada 3.3 ciclos de amplificacin
(Figura 5.9B). Con estos sistemas, la generacin del producto es registrado en cada ciclo. La cantidad
de producto generado en una reaccin puede ser comparado con el nmero de copias control y, con
controles de extraccin adecuados en el sistema, una medida directa de la cantidad de secuencias
iniciales pueden ser determinadas. En humanos, por ejemplo, esta caracterstica tiene un valor
particular en las respuestas de seguimiento sobre el tiempo de tratamientos medicamentosos para
infecciones con virus de hepatitis C e inmunodeficiencias (VIH). Una variacin posterior en las pruebas
de PCR que est siendo muy usada es el PCR mltiple. En este mtodo, dos o ms pares de cebadores

71

especficos para secuencias blanco diferentes son incluidos en la misma reaccin de amplificacin. De
esta manera, las pruebas pueden ser hechas para varios agentes al mismo tiempo y en el mismo tubo
de anlisis, por lo tanto ahorrando tiempo y costes. Con las pruebas de PCR mltiple en tiempo real,
varias sondas con diferentes molculas fluorescentes pueden ser detectadas simultneamente. Este
tipo de aplicacin es muy til en la evaluacin de muestras de complejos de enfermedad, como la
enfermedad respiratoria aguda de los perros. Los problemas de sensibilidad de la prueba deben ser
considerados en este formato, porque varias reacciones deben competir por reactivos comunes en el
tubo de anlisis, de esta manera un agente puede formar un gran nmero de copias que enmascararn
a otro con pocas copias.
Ventajas y Limitaciones de la Tecnologa de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Dada la explosin en el uso y disponibilidad de las pruebas de PCR en anlisis virolgicos, debern
hacerse ciertas consideraciones en relacin a los potenciales beneficios y limitaciones de estas
pruebas. La prueba del PCR es especialmente til en la deteccin de virus que son difciles de crecer en
cultivos, como ciertos virus entricos: adenovirus, papilomavirus, astrovirus, coronavirus, norovirus y
rotavirus. El PCR puede ser usado con cualquier muestra que sea apropiada para aislamiento viral, la
decisin para realizar PCR como opuesta a otro mtodo de deteccin viral estar basado en velocidad,
costo y capacidad del laboratorio. Estas pruebas pueden ser preferidas para la identificacin inicial de
virus zoonticos como el de la rabia, ciertos poxvirus o influenza virus, para minimizar el riesgo de
exposicin del personal de laboratorio porque la amplificacin del virus infeccioso no es necesaria para
la deteccin.
Una limitante del PCR o d cualquier tcnica de amplificacin de cidos nucleicos puede ser la matriz en
la cual la muestra blanco est embebida. El material en la muestra matriz puede inhibir las enzimas en
las cuales la prueba est basada, lo cual ha sido una fuente constante de preocupacin cuando se
manejan muestras fecales y en algunos casos muestras lcteas. Es necesario incluir controles de
extraccin en este tipo de muestras a manera de detectar problemas con el proceso de amplificacin
por s mismo (ms que la falta de un molde especfico). Es ms, las pruebas de PCR y la simple
amplificacin de cidos nucleicos son agente especficos, as ninguna seal se generar si los
cebadores no concuerdan (no se alinean) con la secuencia de algn virus presente en la muestra. En
las primeras pruebas directas de PCR, y especialmente con el PCR anidado, los resultados falsos
positivos eran una gran preocupacin como resultado de la alta contaminacin en el laboratorio que
ocurra con el producto amplificado. Con la disponibilidad de los formatos de PCR de tiempo real en un
solo tubo, este problema ha sido ampliamente superado, aunque la correcta elaboracin de los
protocolos de pruebas de PCR se mantiene como un proceso con grandes retos tecnolgicos. La
elaboracin de pruebas de PCR de tiempo real est en continua mejora con kits de reactivos,
instrumentacin actualizada, protocolos de extraccin estandarizados y definidos procedimientos de
operacin de laboratorio y estos formatos de prueba para la deteccin de cidos nucleicos se ha
convertido en el pilar de las pruebas de laboratorio. Sin embargo, la interpretacin de la prueba sigue
requiriendo evaluacin de que un resultado particular (positivo o negativo) sea biolgicamente
relevante, el cual entonces requiere una revisin global de la historia, signos clnicos y lesiones en el
individuo del cual se obtuvo la muestra.

Tcnicas de Microarreglos (Microchip)

Otro avance tecnolgico que est impactando el campo del diagnstico es la llegada de los
microarreglos o microchips. El microchip para la deteccin de cidos nucleicos es una matriz slida
sobre la cual se han impreso puntos, cada uno conteniendo varios cientos a miles de
oligonucletidos. Cada vez ms, estos nucletidos pueden representar secuencias conservadas de
virtualmente todos los virus representados en varias bases de datos genticas, o pueden ser
personalizados para representar solo viriones de especies involucradas en un sndrome especfico,
como la enfermedad respiratoria aguda de bovinos. La base de esta prueba es la captura por estos
nucletidos de secuencias de cidos nucleicos conjugados (marcados) amplificados aleatoriamente a
partir de muestras clnicas. La unin (pegado) de las secuencias conjugadas es detectada por una
revisin con rayos laser del chip y programas de cmputo para evaluar la fuerza de unin. A partir de la
posicin en el mapa (gentico) de los oligonucletidos que reaccionan, el programa identifica las
especies virales en la muestra clnica. Este tipo de prueba fue usado para determinar que el virus
responsable del sndrome severo agudo respiratorio (SARS) era un coronavirus. Con el conocimiento de
las secuencias de oligonucletidos que se unen a un agente desconocido, los cebadores pueden
sintetizarse para determinar eventualmente la secuencia de nucletidos completa de una nueva
especie viral. El bajo costo de la sntesis de oligonucletidos, desarrollo de aparatos lectores con laser,
las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos y el desarrollo de programas de cmputo han hecho
que esta tecnologa est disponible en laboratorios especializados. Una variacin de esta tcnica es la
re-secuenciacin de microarreglos. Estos arreglos consisten de un grupo de sondas superpuestas, las

72

cuales pueden diferir entre ellas en una sola base. La fuerza de unin de las sondas individuales en la
familia proporciona informacin de la secuencia gentica del producto amplificado. Con la tecnologa
actual, la metodologa de microarreglos solamente est disponible en laboratorios de referencia
especializados y esto no puede ser utilizado en los laboratorios de diagnstico de rutina. En el formato
estndar, esta tcnica probablemente no detectara una nueva familia de virus de una base de datos
comn no representada, porque los oligonucletidos para un nuevo agente no pueden estar incluidos
en el microchip.

Amplificacin de Genes por Mtodos Isotrmicos

Para la amplificacin de cidos nucleicos, es necesario desplazar continuamente al producto recin
sintetizado para que otra copia de esa secuencia se pueda producir. Con el PCR, el desplazamiento de
la cadena es realizado con temperatura: con una temperatura mxima de 95 C las bandas de ADN se
desnaturalizan (separan), permitiendo la adhesin de nuevos cebadores. La amplificacin isotrmica es
una tcnica que no requiere de ciclos de temperatura y equipo que acompaa al PCR. Dos tcnicas
usando polimerasas diferentes para obtener la amplificacin de la secuencia han sido desarrolladas
para la amplificacin isotrmica: Amplificacin de Secuencias-Basadas en cidos Nucleicos (nucleic acid
secuence-based amplification, NASBA) y Amplificacin Isotrmicas Mediada por Asas (loop-mediated
isothermal amplification, LAMP). Si estas tcnicas muestran importantes ventajas sobre el PCR, uno
podra esperar de una gran disponibilidad de estas pruebas.

SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS (GENOMAS VIRALES)

Quiz ningn rea en la biologa molecular ha avanzado tan rpidamente como la secuenciacin de
cidos nucleicos. Con la velocidad y la capacidad tcnica se ha logrado abaratar costes, de manera que
la secuenciacin directa de genomas virales completos es ahora algo muy comn de hacer. Las viejas
tcnicas como el mapeo de restriccin y las huellas de oligonucletidos que fueron usadas para
detectar diferencias genticas entre los aislamientos virales han sido desplazadas por la metodologa
de la secuenciacin.
En el rea del diagnstico, se han descubierto nuevos virus por tcnicas que tienen la ventaja de la
amplificacin de cidos nucleicos aleatoriamente y la secuenciacin de bajo coste. Hay varias tcnicas
bsicas con numerosas modificaciones que son muy detalladas para discutirlas individualmente. En
general, el proceso incluye la amplificacin al azar de muestras de cido nucleico enriquecidas o
muestras de cido nucleico total, seguido por la secuenciacin de todos los productos amplificados. El
proceso trabaja mejor si los cidos nucleicos del la clula hospedera pueden ser eliminados de las
muestras por un tratamiento con nucleasas o por substraccin de las secuencias del hospedero por
hibridacin la secuencias de clulas normales inmovilizadas en estructuras (soportes) slidas. No se
requiere de conocer previamente la secuencia viral, y por lo tanto no hay necesidad de aplicar
reactivos para un virus determinado. El anlisis por computadora del material obtenido puede
identificar secuencias que estn relacionadas a una familia viral especfica. El mtodo usado es para
construir el genoma completo, si eso se desea, y ser dependiente del nmero y tamao de las
secuencias identificadas, pero los mtodos estn disponibles para caminar en el genoma completo a
partir de una sola secuencia viral (sentido 5-3). Con estos tipos de protocolos de deteccin de cidos
nucleicos, muchos virus desconocidos pueden ser descubiertos y caracterizados sin los requerimientos
que se emplearon como la propagacin en cultivos de tejidos.

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE ANTICUERPOS ESPECFICOS DE VIRUS

(DIAGNSTICO SEROLGICO)
La deteccin de una respuesta inmune a un agente infeccioso ha sido basada, principalmente, en la
determinacin de la respuesta de anticuerpos (Abs) del hospedero al agente (viral) de inters. Este
enfoque mide solamente una parte de la respuesta inmune adquirida (inmunidad humoral); las tcnicas
para una medida eficaz de la respuesta inmune mediada por clulas no est disponible para uso
rutinario o es muy cara. Para muchos problemas, la medida de las respuestas de Abs se mantiene como
una medida valiosa para definir el estado infeccioso de los animales. Las pruebas serolgicas pueden
ser usadas para: (1) definir si un animal ha sido infectado por un virus en particular; (2) determinar si
un virus (u otro patgeno) est relacionado a cierto problema clnico; (3) determinar si un animal ha
respondido a la vacunacin. Para el diagnstico serolgico de una enfermedad aguda viral en un
animal, la metodologa clsica ha sido las pruebas de sueros pareadosesto es, un suero de la fase
aguda y otro de la fase convaleciente del mismo animal, al observar un cambio en el ttulo (cuatro
diluciones o ms) de Ab virus especficos.
El suero de la fase aguda es tomado tan pronto como sea posible durante la enfermedad; la muestra de
la fase convaleciente generalmente es tomada al menos dos o ms semanas despus. Dada esta lnea

73

de tiempo, el diagnstico basado con este enfoque se dice que es retrospectivo. En aos recientes
este mtodo ha sido complementado por mtodos serolgicos para detectar Abs IgM especficosen
muchas enfermedades virales un diagnstico presuntivo puede hacerse basado en la deteccin de Abs
IgM con una sola muestra srica de la fase agudapor ejemplo, la infeccin de equinos con el virus del
oeste del Nilo.
Para asegurar si un animal ha estado infectado con cierto virus, las pruebas serolgicas pueden ser
ms adecuadas que tratar de detectar al virus por s mismo. Por ejemplo, el anlisis serolgico es
usado para sealar a los caballos que han sido infectados con el virus de la anemia infecciosa equina,
al ganado para el virus de la leucemia bovina y las cabras para el virus de la encefalitis artritis caprina.
En estos casos, el nmero de clulas infectadas en animales crnicamente enfermos puede ser
demasiado baja an para la deteccin mediante PCR, pero dicha infeccin generalmente estimula una
respuesta de Abs que es fcilmente detectada por varias pruebas. Los anlisis serolgicos son tambin
ampliamente usados durante los programas de erradicacin y en la certificacin de ani8males para la
movilizacin y el comercio.
El uso de pruebas serolgicas para asegurar la eficacia de la vacunacin puede ser un aspecto
importante en un programa de manejo de las enfermedades infecciosas. En muchos pases, la compra
de la vacuna puede ser realizada por el propietario de los animales. Las pruebas de Abs de animales
seleccionados pueden indicar al veterinario con mucha significacin si el programa de inmunizacin,
que el productor est realizando, se ha hecho de manera correcta. Conforme los programas de
erradicacin se hacen ms populares para las enfermedades de los animales de produccin, las
vacunas marcadoras son ms frecuentemente usadas y las llamadas pruebas serolgicas DIVA pueden
distinguir si una respuesta de Abs es causada por la vacuna o por una infeccin natural. Para las
infeccione con herpesvirus como el herpesvirus bovino 1, es esencial determinar si la respuesta de Abs
es el resultado de la infeccin, porque dicha infeccin invariablemente lleva a la latencia. La
introduccin de animales infectados de manera latente a un hato negativo puede ser la causa de un
brote de la enfermedad, por esta razn las vacunas marcadoras con delecin de genes fueron
desarrolladas para facilitar la diferenciacin de los animales vacunados de los infectados.

Muestras Serolgicas para Pruebas Serolgicas

Para la mayora de las prueba serolgicas, el suero sanguneo es la muestra de eleccin. Sin
embargo, algunas pruebas han sido validadas usando plasma en lugar del suero. Es necesario
establecer contacto con el laboratorio de diagnstico de manera que sealen la muestra adecuada,
para evitar el remuestreo del animal si esa es el nico material aceptable. Los Abs en el suero son muy
estables en condiciones ambientales moderadas. En los protocolos estndar el suero debe mantenerse
en refrigeracin (4-6 C), el congelado no es necesario a menos de que se tarden varias semanas entre
el muestreo y el anlisis. Los Abs pueden ser detectados tambin a partir de muestras de sangre seca
en papel filtro y guardada por meses antes de hacer las pruebas.
Como con otros aspectos de las pruebas de diagnstico, los avances tecnolgicos continan
modificando la manera de cmo son detectados los anticuerpos a virus especficos. En la mayora de
los casos, las tecnologas ms recientes son aplicadas a las pruebas que tienen algn potencial
comercial. En la medicina veterinaria, hay muchas pruebas para agentes (virus) que pueden ser de
menor importancia pero muy tiles en ciertas situaciones. Las pruebas para estos agentes pueden ser
las primeras que se desarrollaron con tecnologa vieja. Como los virus de los animales de vida silvestre
estn teniendo mayor importancia en la sensibilizacin del pueblo, ser necesario desarrollar pruebas
serolgicas adicionales, porque las pruebas para los animales domsticos no pueden usarse en ellos.

Pruebas Inmuno-EnzimticasPruebas de Inmuno Absorbancia Ligada a

Enzimas
Las pruebas inmunoenzimticas (EIAs, ELISA) son los mtodos serolgicos de eleccin para la
determinacin de Abs cualitativos (positivo o negativo) o cuantitativo (mediante titulacin), porque son
rpidas, relativamente baratas y pueden no requerir la produccin de viriones infecciosos si antgenos
recombinantes son empleados. En las pruebas EIAs, con el formato para la deteccin de Abs, el
antgeno viral est adherido a una matriz slida. El suero es agregado y, si Abs contra el antgeno
estn presentes en la muestra, se pegarn a l. En las pruebas directas de EIA, la unin de los Abs es
detectada por un anticuerpo anti-especie conjugado con una enzima. Al agregar el substrato de la
enzima, se desarrolla una reaccin de color que puede ser determinada visualmente o con un
espectrofotmetro. Los controles que se corren con la muestra definen si la prueba es aceptable y
cuales muestras se sealarn como positivas. Las pruebas EIAs basadas en cintica ofrecen la ventaja
que los ensayos cuantitativos pueden estar basados en una simple dilucin del suero. El producto de la

74

reaccin enzimtica es determinado muchas veces en un corto periodo de tiempo. Hay programas de
cmputo que convierten la tasa de desarrollo del producto a la cantidad de Ab adherido al antgeno.
Una de las desventajas de la EIA directa es que es especie especfica. Una prueba desarrollada para
determinar Abs contra el virus del distemper canino para perros, no puede ser empleada para
determinar la presencia o ausencia de Abs al mismo virus en un len. Para obviar este problema, se
han desarrollado pruebas de EIA competitivas o de bloqueo. En este formato de prueba, un Ab que se
une al antgeno de inters (generalmente un MAb) esta conjugado con la enzima. Los Abs no marcados
(muestra de suero) se puede unir al mismo sitio del MAb compitiendo entre ambos por solo un sitio de
unin. Una reduccin en la unin de MAb conjugado indica que la muestra con tena Abs especficos
(Figura 5.10). en este formato de prueba, las especies animales de los anticuerpos no marcados no son
un factor de error. El diagnstico de la sensibilidad y especificidad de las pruebas de EIA, sean directas
o indirectas, ha sigo aumentado por el desarrollo de los MAbs y la produccin de antgenos
recombinantes.
En un formato de estas pruebas que es ampliamente usado pueden ser realizadas en el consultorio del
mdico, el suero de prueba puede fluir por el papel filtro que tiene tres reas circulares impregnadas
con el antgeno, dos de las cuales ya han interactuado con sueros positivos y negativos
respectivamente (Figura 5.7). Una vez que el suero ha fluido por el dispositivo y se ha realizado un
lavado, un Ab secundario anti-especie conjugado a una enzima es agregado y el papel filtro es
enjuagado otra vez antes de la adicin del substrato de la enzima. El resultado es ledo como un
Figura 5.10 Prueba inmuno enzimtica competitiva (ELISAc) para
anticuerpos contra el virus de la encefalitis artritis caprina (CAEv).
Las muestras de suero no diluidas son agregadas por duplicado a pozos
cubiertos de antgeno (virus) de una prueba ELISAc comercial para buscar
anticuerpos anti-CAEv. Despus de la remocin del suero de prueba, un
anticuerpo especfico para el antgeno CAEv acoplado con peroxidasa de
rbano es agregado. El anticuerpo detector es removido despus de la
incubacin, y un substrato es agregado para detectar la presencia de
anticuerpos detectores pegados. Si hay anticuerpos especficos para el CAEv
en el suero de prueba, estos anticuerpos se pegarn al antgeno evitando
que el anticuerpo detector se una al antgeno. Una muestra positiva mostrar
menos producto de la enzima (color) que los controles negativos. Los valores
cambio de color en el crculo de prueba, el
contra
el cambio
de color
enreaccin
el control
de cual
corte es
son comparado
determinados por
la lectura
de la intensidad
de la
en
un espectrofotmetro,
aunque
la inspeccin
visual puede
generalmente
positivo y obvio en el no cambio en el negativo.
As las pruebas
para
un solo paciente
son
detectar muestras positivas.

relativamente caras comparadas con la economa de las pruebas para los sueros de cientos de
animales en una sola prueba en un laboratorio automatizado. Hay grandes ahorros en tiempo y
esfuerzos para enviar muestras al laboratorio, adems del hecho de que las decisiones pueden ser
hechas mientras el cliente y el paciente siguen en el consultorio, hacer pruebas a un animal son
atractivas y tiles en el manejo clnico inmediato de animales con enfermedades crticas.

Pruebas de Sero (Virus) Neutralizacin

As como el aislamiento es considerado la prueba de oro para la deteccin de virus comparada contra
otras pruebas, la prueba de sero (virus) neutralizacin histricamente ha sido tambin la prueba de oro
estndar, cuando est disponible, para la deteccin y cuantificacin de Abs especficos de virus. Los
Abs neutralizantes tambin son de gran inters porque se considera que hay una correlacin directa de
los Abs in vivo. Para la prueba de Abs neutralizantes, hay dos procedimientos generales disponibles: el
mtodo de suero constantevirus variable y el mtodo virus constantesuero variable. Aunque
el mtodo suero constantevirus variable puede ser una prueba ms sensible, es raramente usada
porque utiliza relativamente grandes cantidades de suero, lo cual no puede ser realizado fcilmente. La
base de las pruebas de neutralizacin es la unin del Ab al virus infeccioso, a manera de prevenir que
el virus inicie una infeccin en la clula susceptible. El crecimiento del virus es detectado por su
habilidad de matar a la clula (efecto citoptico) o por su habilidad de producir antgenos en las clulas
infectadas que son sealados por inmunofluorescencia o inmunohistoqumica. La cantidad de Ab en la
muestra es determinado por la serie de dilucin y el reto de cada una de estas diluciones con una
cantidad estndar de virus (mtodo virus constantesuero variable). La ltima dilucin que muestre
neutralizacin del virus es definida como el punto final y el ttulo del suero es la recproca del punto
final de dilucin; por ejemplo, un punto final de 1:160 es igual a un ttulo de 160. Las desventajas de las
pruebas de seroneutralizacin son muy lentas de realizar, requieren de la produccin de virus
infeccioso para la prueba y tienen un costo, generalmente creciente, para el mantenimiento de

75

las instalaciones de cultivo celular requeridas para la prueba. Estas pruebas tienen el beneficio de ser
independientes de especie y, como tales, son muy empleadas en estudios de animales de vida
silvestre. Con los nuevos agentes infecciosos, una prueba de seroneutralizacin puede ser operacional
a las pocas semanas de haber aislado al virus, mientras que las pruebas de EIA su desarrollo requiere
meses o aos para poder validarlas.

Inmuno-transferencia (Western Blotting)

Las pruebas inmuno-transferencia (Western blotting) de manera simultnea pero independiente miden
Abs contra varias protenas del agente de inters. Estas pruebas tienen cuatro pasos clave. Primero, el
virus concentrado es solubilizado y las protenas constituyentes son separadas en discretas bandas
segn su masa molecular (Mr), con una electroforesis en dodecil-sulfato de sodio y en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE). Segundo, las protenas separadas son transferidas electroforticamente
(blotted) a nitrocelulosa para inmovilizarlas. Tercero, el suero de la prueba (Abs) se vierte sobre la
membrana en donde estn las protenas. Cuarto, su presencia es demostrada usando Abs anti-especie
conjugados con un istopo (radio marcado) o con una enzima. De esta manera la inmuno-transferencia
permite la demostracin de Abs a alguna o a todas las protenas de un virus dado, y pueden ser usadas
seguir (monitorear) la presencia de Abs a diferentes antgenos a diferentes tiempos de la infeccin.
Aunque este procedimiento no es rutinariamente empleado en el diagnstico de viriones, la tcnica fue
muy importante para la identificacin de protenas inmunognicas en muchos virus. Similarmente,
dicha prueba es usada en el anlisis de muestras para la presencia de protenas de priones en tejidos
de rumiantes. Las pruebas de western blotting son una prueba cualitativa ms que cuantitativa, y no
son fcilmente estandarizadas de un laboratorio a otro. Por esta razn los formatos de pruebas
preferidos son ELISA y pruebas masivas.

Pruebas de Inmunofluorescencia Indirecta

Las pruebas de inmunofluorescencia indirecta son usadas para la deteccin y cuantificacin de Abs;
especficamente, son pruebas que emplean clulas infectadas por el virus (generalmente son portaobjetos, P-O) como una matriz para capturar los Abs especficos al virus de inters. Series de diluciones
del suero de prueba son aplicados a pozos individuales con el substrato celular y generalmente un Ab
anti-especie conjugado con una molcula fluorescente es posteriormente aadido como Ab detector de
la unin. Los P-O son ledos en un microscopio de fluorescencia y sealados como positivos si las
clulas muestran un patrn fluorescente consistente con la distribucin del antgeno viral empleado. La
prueba es rpida (menos de 2 horas) y puede ser usada para determinar el isotipo del Ab reactor si
estamos empleando un suero anti-isotipo especfico como la IgM anti-canino. La fluorescencia no
especfica puede ser un problema, particularmente con animales que han sido sobre-vacunados y
podran tener Abs anti-clulas que se podran unir a clulas no infectadas y enmascarar la fluorescencia
especfica anti-virus. Los P-O para ciertos agentes virales pueden ser comprados, as que los
laboratorios pueden ofrecer esta prueba sin necesidad de tener virus infeccioso o cultivos celulares
infectados en sus instalaciones.

Pruebas de inhibicin de la Hemaglutinacin (HI)

Para esos virus que aglutinas eritrocitos (glbulos rojos) de una u otra especie, tales como muchos
arbovirus, influenzavirus virus de las parainfluenzas, las pruebas de inhibicin de la hemaglutinacin
han sido ampliamente usadas. Sirven para dete3ctar y cuantificar Abs en el suero de los animales, los
mtodos son sensibles, especficos, simples, baratos y fciles de realizar. A pesar de todos los avances
tecnolgicos, las pruebas de HI permanecen como el pilar para determinar las respuestas de Abs
especficos a los virus de influenza A. El principio de la prueba es simplelos virus se adhieren a
eritrocitos mediante receptores en su superficie. los Abs antivirales se unen a esos receptores y
bloquean la hemaglutinacin. El suero es diluido de manera seriada en los pozos de la microplaca (o en
tubos), generalmente en diluciones dobles, y a cada pozo se le agrega una cantidad constante de virus,
generalmente 4-8 unidades hemaglutinantes. La recproca de la dilucin ms alta que inhiba la
hemaglutinacin de la cantidad estandarizada de virus, representa el ttulo de inhibicin de la
hemaglutinacin del suero (Figura 5.11). se debe ser muy cuidadoso en la interpretacin de muchos
muestreos serolgicos primarios basados en las pruebas de HI, particularmente con paramyxovirus, as
como con inhibidores no especficos de la aglutinacin que producen muchos resultados falsos positivos
en algunos de estos estudios.

Inmunodifusin
Histricamente, las pruebas de Agar Gel Inmuno Difusin (AGID), fueron usadas para el diagnstico
especfico de una gran cantidad de infecciones y enfermedades virales, incluyendo lengua azul, fiebre
porcina clsica, influenza, anemia infecciosa equina (prueba de Coggins), y leucemia bovina. Estas
pruebas son muy simples de realizar, utilizan materiales baratos, y no requieren la produccin de
material infeccioso para el anlisis de laboratorio. A menudo, son usados extractos celulares y an

76

extractos de tejidos de los animales infectados como reactivo de prueba. Las pruebas AGID son
relativamente rpidas, fcilmente controladas, pero carecen de sensibilidad al compararlas con las
pruebas de EIA. Es ms, son estrictamente cualitativas (proporcionando una respuesta de SI/NO) y no
pueden ser automatizadas (Figura 5.12). la mayora de estas pruebas pueden ser reemplazadas por las
pruebas de EIA.

Pruebas de Anticuerpos IgM Especficos de Clase

Un diagnstico rpido basado en Abs contra una infeccin o enfermedad viral puede ser realizado con
suero de la fase aguda al demostrar Abs virus especficos de la clase IgM. Debido a que estos Abs IgM
aparecen pronto despus de la infeccin, pero descienden a muy bajos niveles en 1-2 meses y
generalmente desaparecen totalmente en unos 3 meses, ellos son indicadores de infeccin reciente (o
crnica). El mtodo ms comnmente empleado es el de captura de Abs IgM, en el cual el antgeno
viral est adherido a un substrato slido como un pozo de microplaca de titulacin. Al suero de prueba
se le permite reaccionar con este substrato y los Abs IgM capturados por el antgeno y luego
detectados con un Ab anti-IgM conjugado que reaccione con la especie de la cual la muestra fue
obtenida.

Figura 5.12 Prueba de Inmunodifusin en agar gel gar gel para la

deteccin de anticuerpos de agentes virales como BTv, EIA, EHD e
influenzavirus A.
Pozos espacialmente definidos se hacen en una matriz semi-slida
de agar o agarosa. En el pozo central se coloca el antgeno de
prueba (Ag). Suero con anticuerpos (AS) hacia el virus de inters
son colocados alternadamente en pozos alrededor del pozo central.
Los sueros de prueba son colocados (1, 2, 3) en los pozos
restantes. Las placas son incubadas por 24-48 horas para permitir
el desarrollo de lneas visibles de precipitacin entre el antgeno y

Tecnologas de Nueva Generacin

Con las novedades en los estudios de cidos nucleicos, los avances tecnolgicos para la deteccin de
reactivos est en rpida evolucin, y gran nmero de potencialmente novedosas plataformas para
ensayos serolgicos han sido desarrollados aunque no han sido completamente validados para el uso
de diagnstico de rutina. Una tecnologa que ha demostrado particularmente ser promisoria en el
campo
de
la
clnica
e
investigacin
es
el
xMAP,
desarrollado
por
Luminex.
(http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/ ver el video) El xito de esta
plataforma de pruebas refleja la madurez de las tecnologas existentes que fueron combinadas para
proveer un sistema de deteccin de reactivos verstil. El xMAP combina una plataforma de citometra
de flujo, micro-esferas marcadas individualmente, un procesador de seales digital y reacciones de
acoplamiento qumico estndar para ofrecer un sistema que pueda ser empleado para detectar
protenas o cidos nucleicos (Figura 5.13). las micro-esferas portan un nico colorantes (hay ms de
100 diferentes) que emiten seales fluorescentes que identifican las pelotitas individuales acopladas
con un ligando especfico. Para la deteccin de Abs, el antgeno de inters es acoplado a una pelotita
especfica. Las esferas son expuestas al suero problema y el Ab adherido es detectado por otro Ab antiespecie marcado con un colorante reportero. Las micro-esferas son analizadas por citometra de flujo
en donde con rayos laser se excitan a los colorantes de las esferas y los colorantes reporteros.
Mltip0les esferas para cada antgeno son analizadas en cada prueba, proporcionando lecturas
independientes de la reaccin.
Una ventaja distintiva de este sistema es su capacidad mltiple. Tericamente, cien o ms antgenos
diferentes pueden ser evaluados por la reactividad de los Abs en una sola prueba. Para tener una
mxima sensibilidad y especificidad, son necesarios antgenos recombinantes para eliminar protenas
extraas que reduciran la densidad del antgeno especfico sobre las esferas y aumentar la reactividad
de fondo no especfica que puede confundir la interpretacin de la prueba. Las ventajas de este
sistema basado en esferas son: (1) utiliza pequeos volmenes; (2) puede ser mltiple; (3) se ha
reportado que tiene ms sensibilidad que las pruebas estndares de ELISA; (4) puede ser ms barato
que muchas pruebas serolgicas; (5) puede ser ms rpido que las pruebas de ELISA, particularmente
cuando se buscan Abs para varios antgenos. Como un ejemplo, esta plataforma de pruebas es ideal
para hacer escrutinio de respuestas de Abs a varios antgenos que son seguidos y cuyos volmenes de
muestra son a menudo limitados. Esta plataforma tambin proporciona pruebas de DIVA y podra ser
aplicado para el control de importantes enfermedades reguladas como la fiebre aftosa. Como un
ejemplo, los antgenos recombinantes representan las protenas de capsides presentes en las vacunas

77

inactivadas del virus de la fiebre aftosa junto con protenas virales no estructurales pueden ser
acoplados a diferentes esferas para analizar el perfil de Abs de un animal sospechoso. En solamente
una prueba, el anlisis puede proporcionar evidencia de vacunacinrespuesta al antgeno de capsides
solamenteo de una infeccin naturalse observaran respuestas a ambos tipos de protenas. Uno
podra imaginar que este tipo de pruebas basadas en esferas marcadas como un western-blot
cuantitativo, en que puede ser determinada la reactividad a varios antgenos. Conforme progresen los
programas de erradicacin de las enfermedades virales de los animales de produccin, es muy
probable que los requisitos para el tipo de pruebas DIVA definitivamente aumenten. La desventaja para
la deteccin de Abs es la necesidad de antgenos recombinantes para obtener una sensibilidad
aceptable y los altos costos asociados a las reacciones mltiples.

Figura 5.13 Pruebas mltiples para detectar citocinas. La factibilidad de este tipo de pruebas mltiples reside
en la habilidad para hacer miro-esferas nicas marcadas con substancias fluorescentes y con grupos reactivos de
superficie que pueden ser usados para unir varios ligandos. Para las pruebas de citocinas, grupos de micro-esferas son
cubiertas con anticuerpos especficos para citocinas en un panel de escrutinio. Las micro-esferas son mezcladas y
reaccionan con la muestra. La unin es detectada por anticuerpos anti-citocina con un marcaje fluorescente. La
identificacin fluorescente de las micro-esferas y la seal fluorescente de los anticuerpos unidos son ledas en un
dispositivo clasificador de clulas usando rayos laser para la excitacin de los colorantes. Las marcas especficas de
las micro-esferas permiten un anlisis cuantitativo de ms de 100 diferentes reactivos en una sola muestra. (Courtesy

INTERPRETACIN DE LOS HALLAZGOS DE LABORATORIO

Como con cualquier dato de laboratorio, la significancia de los resultados especficos obtenidos del
laboratorio de virologa debe ser interpretada a la luz de la historia clnica del animal de donde se tom
la muestra. Hasta cierto punto la significancia de cualquier resultado tambin est influenciada por el
tipo de virus que fue detectado. Una prueba de anticuerpos fluorescentes positiva a rabia de un
murcilago (vampiro) encontrado en la recmara de un nio provocara una respuesta de salud pblica
en la ausencia de datos clnicos, mientras que una prueba serolgica positiva al virus de la leucemia
bovina de una vaca con un feto abortado es un hallazgo poco relevante si el animal es de una regin
endmica. Con las pruebas mltiples de PCR, puede ser posible detectar varias especies de virus,
bacterias y micoplasmas a partir de un perro con enfermedad respiratoria aguda, provocando la
pregunta, qu es significativo? La presencia del virus es debida a una vacunacin reciente,
reactivacin de un herpesvirus o simplemente huellas del agente etiolgico? Claramente, varias
fuentes de datos deben ser integradas por el clnico para llegar a una estrategia coherente de
tratamiento. Sin embargo, es tambin claro que la velocidad, nmero, fiabilidad de las pruebas de
deteccin de virus han cambiado la forma en la cual los clnicos usan los resultados de las pruebas de
laboratorio, y estos resultados estn teniendo un gran impacto en las decisiones de tratamiento y
manejo. Cuando se intenta interpretar la significancia de la deteccin de un virus especfico en una
muestra clnica, uno podra ser guiado por las siguientes consideraciones.
El sitio del cual el virus fue aislado. Por ejemplo, uno podra estar muy confiado en relacin a la
significancia del herpesvirus equino-1 detectado en los tejidos de un feto equino abortado a los 9
meses de gestacin con tpicas lesiones macro y microscpicas. Sin embargo, la recuperacin
(aislamiento) de un enterovirus de las heces de un lechn no necesariamente es significativo, porque
tales virus a menudo estn asociados con infecciones inaparentes.

78

La circunstancia epidemiolgica bajo la cual es virus fue aislado. La interpretacin de la significancia de

un aislamiento viral resulta muy importante si el mismo virus ha sido aislado en varios casos de la
misma enfermedad en la misma zona y tiempo.
El carcter patognico del virus detectado. El conocimiento de que el virus detectado casi siempre
asociado a una enfermedad francaesto es, raramente se encuentra como un pasajero
engendrando la confianza de que el hallazgo es significativo.
La identidad del virus especfico. La deteccin del virus de la fiebre aftosa en cualquier rumiante en un
pas libre debera, por s misma, ser la causa de una gran alarma. Similarmente, la identificacin del
virus de la hepatitis del ratn en una colonia libre, o la presencia del herpesvirus koi entre peces
ornamentales altamente valiosos deberan disparar una respuesta sanitaria importante.

Interpretacin de los hallazgos del laboratorio de Serologa

Un aumento significativo (convencionalmente, cuatro veces o ms) en el ttulo de Abs entre las
muestras sricas de la fase aguda a la convaleciente es la base, aunque en retrospectiva, de relacionar
a un virus especfico con un caso clnico de una enfermedad particular. Sin embargo, uno debe siempre
estar advertido del estado de la vacunacin del animal, como sero-respuesta a la vacunacin,
especialmente con biolgicos de virus modificados, porque puede ser indistinguible de la que ocurre
despus de la infeccin natural. La demostracin de Abs en una sola muestra de suero puede tener
valor diagnstico de infeccin actual en un animal no vacunado (p. ej., con retrovirus y herpesvirus),
porque estos virus establecen infecciones de larga duracin. Sin embargo, en tales circunstancias no
hay seguridad de que el virus persistente fuese el responsable de la enfermedad bajo consideracin.
Las pruebas diseadas para detectar Abs IgM proporcionan evidencia de infeccin reciente o actual. Un
resumen de las fortalezas y debilidades de varios mtodos alternativos para el diagnstico serolgico
de las infecciones virales est en el cuadro 5.1. la determinacin de Abs antivirales en el cordn
umbilical o en la sangre venosa de recin nacidos que no han mamado proporciona una base para el
diagnstico especfico de infecciones in utero. Este enfoque fue usado, por ejemplo, para mostrar que
el virus de Akabane era el agente causal de la hidranencefalia artrogriposis en becerros. Debido a que
el paso transplacentario de las inmunoglobulinas no ocurre en la mayora de los animales domstico, la
presencia de Abs IgG o IgM en la sangre de animales que no han mamado es indicador de infeccin
fetal.

Sensibilidad y Especificdad
La intyerpretacin y valor de una prueba serolgica particular es crticamente dependiente de un
entendimiento de dos parmetros clave: la sensibilidad diagnstica y la especificidad diagnstica. La
sensibilidad diagnstica de una prueba dada es expresada como un porciento y es el nmero de
animales con la enfermedad (o infeccin) en cuestin que han sido identificados como positivos por la
prueba, dividido entre el nmero total de animales que tienen la enfermedad (o infeccin) (Cuadro 5.3).
Por ejemplo, una EIA determinada usada para el escrutinio de una poblacin de bovinos para
determinar la presencia de Abs anti el virus de la leucemia bovina, puede tener una sensibilidad
diagnstica del 98%esto es, de cada 100 animales infectados probados, solo 98 sern diagnosticados
correctamente y 2 sern no detectado (la tasa de falsos negativos es del 2%). En contraste, la
especificidad diagnstica de una prueba es una medida del porciento de los animales sin la
enfermedad (o infeccin) que proporciona un resultado negativo. Por ejemplo, la misma prueba EIA
para determinar Abs anti el virus de la leucemia bovina puede tener una especificidad diagnstica del
97%esto es, que de cada 100 bovinos no infectados, 97 sern diagnosticados correctamente como
negativos, pero 3 sern incorrectamente sealados como infectados (la tasa de falsos positivos es del
3%). Mientras que la sensibilidad y especificidad diagnsticas son porcientos intrnsecamente fijados a
la prueba diagnstica particular y la poblacin de animales usada para validar la prueba; el valor
predictivo de una prueba est afectado grandemente por la prevalencia de la enfermedad (o infeccin)
en la poblacin probada. As, la misma EIA usada para determinar a una poblacin de alto riesgo con
una prevalencia del 50% a la leucemia bovina, el valor predictivo de la prueba ser alto, pero si es
usado para analizar a una poblacin con una prevalencia del 0.1%, la gran mayora del 3.1% de los
animales que fueron positivos a la prueba, de hecho sern falsos positivos y se requerir un
seguimiento con una prueba confirmatoria con mucho mayor especificidad. Esta ilustracin llamativa,
dirige la atencin a la importancia de la seleccin de las pruebas diagnsticas con un objetivo en
particular en mente. Una prueba con alta sensibilidad diagnstica es requerida cuando el
objetivo es para detectar una infeccin grave o cuando la erradicacin es la meta, en la cual los casos
positivos no deben ser obviados. Un prueba generalmente basada en una independencia tecnolgica)
con muy alta especificidad diagnstica es requerida para la confirmacin de que el diagnstico es
correcto.

79

La sensibilidad analtica de una prueba inmunolgica es la habilidad para detectar pequeas cantidad
de Abs (o antgeno). Por ejemplo, las pruebas de EIAs y seroneutralizacin generalmente muestran
substancialmente mayor sensibilidad analtica que las pruebas de AGID. Las mejoras en la sensibilidad
analtica pueden ser obtenidas por el uso de reactivos ms puros y una instrumentacin ms sensible.
Sin embargo, la especificidad analtica de una prueba inmunolgica es una medida de su capacidad
para discriminar la presencia de Abs dirigidos a un virus en vez de a otro. Esta cualidad est
influenciada principalmente por la pureza de los reactivos clave, especialmente el antgeno cuando se
estn buscando Abs o el anticuerpo cuando se buscan antgenos.

Me lo contaron y lo olvid. Lo vi y lo entend. Lo

hice y lo aprend
Proverbio chino

Cuadro 5.3 Clculos de Precisin de Pruebas Serolgicas

Tabla de Pruebas
Resultados de Prueba de Referencia

Resultados de la
Nueva Prueba

Sensibilidad

Especificidad

Valor Predictivo
Positivo

80

+
-

VP

FN

FP
VN
La sensibilidad de una prueba es la probabilidad de un resultado
positivo cuando es empleado en una poblacin infectada
(comparada con una prueba de referencia o "estndar de oro").
Despus de insertar los resultados de la prueba en la tabla de 2x2
(como se muestra), la Sensibilidad de la prueba se determinar al
calcular: VP/VP+FP
La especificidad de una prueba es la probabilidad de un resultado
negativo cuando es empleado en una poblacin no infectada
(comparada con una prueba de referencia o "estndar de oro").
Despus de insertar los resultados de la prueba en la tabla de 2x2
(como se muestra), la Especificidad de la prueba puede ser
determinada al calcular: VN/VN+FN
El valor predictivo positivo de una prueba es la probabilidad de que
un animal est infectado cuando arroja resultados positivos. En la
prctica, los valores predictivos solamente seran calculados a
partir de estudios de cohorte o estudios que legtimamente reflejen
el nmero de individuos en esa poblacin que estn infectados con
la enfermedad de inters en ese momento. Esto se hace porque los
valores predictivos son altamente dependientes de la prevalencia
de la infeccin. Despus de insertar los resultados en la tabla de
2x2 (como se muestra) el Valor Predictivo Positivo de la prueba
puede ser determinado al calcular: VP/VP+FP

El valor predictivo negativo de una prueba es la probabilidad de

que un animal no est infectado cuando arroja resultados
negativos. Esta medida de precisin slo debera de usarse si se
Valor Predictivo
dispone de la prevalencia de los datos. (Ver nota en la definicin de
Negativo
Valor Predictivo Positivo). Despus de insertar los resultados en la
tabla de 2x2 (como se muestra) el Valor Predictivo Negativo de
la prueba puede ser determinado al calcular: VN/VN+BN+FN
FP= nmero de muestras falsas positivas; FN= nmero de muestras falsas negativas;
VP= nmero de muestras positivas realmente; VN= nmero de muestras negativas
realmente

Tomado de Fenners Veterinary Virology fourth edition 2011

Edited by N. James MacLachlan and Edward J. Dubovi
Elsevier & Academic Press
Traducido con fines didcticos por Nicols Alejandro De Miguel Valera
Catedrtico titular de Virologa Veterinaria
Universidad Veracruzana
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Veracruz, Ver.
2013

81