AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACION

DEL LACTOCOCCUS A PARTIR DE SUERO LACTEO

PARA PRODUCCIÓN DE NISINA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.

OBTENER MICROORGANISMOS LÁCTEOS (LACTOCOCCUS) A PARTIR

DEL LACTOSUERO PARA LA PRODUCCIÓN DE NISINA MEDIANTE UN
SISTEMA DE BIOPROCESO.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. AISLAR Y SELECCIONAR MICROORGANISMOS LACTOCOCCUS A

PARTIR DE UNA MUESTRA DE LACTOSUERO.
2. ADAPTAR UN PROCESO CON UN SUSTRATO FERMENTABLE
(LACTOSA) PARA EL DESARROLLO DE LACTOCOCCUS.
3. PRESERVAR EL MICROORGANISMO LACTOCOCCUS MEDIANTE
CRIOVIALES CON GLICEROL AL 20%.
MARCO TEORICO

CARACTERISTICAS DEL LACTOCOCCUS

BACTERIA LACTOCOCCUS

Compuestos orgánico
FUENTE DE ENRGIA
Reacciones redox

FUENTE DE CARBONO Lactosa

CATEGORIA Quimiorganotrofos
Lactosa del suero del queso actua como donador y
GRUPO ACEPTOR DE
aceptor.
ELECTRONES
Proceso de fermentación, oxidación parcial
Homofementativo
Auxotrofo
Anaerobio facultativo
METABOLISMO Carecen de catalasa posee peroxidasa y superoxido
dismutasa.
Produce un grupo de antibióticos polipeptídicos llamados
nisinas.
 FORMACION DE NISINA

FORMACION DE LA NISINA
BACTERIOCINA ESPECTRO DE ACCION (A PARTIR DEL METABOLISMO DEL
LACTOCOCCUS)

En la síntesis de la nisina participan un grupo de genes

Es muy eficaz como conservador
ordenados como nisABTCIP, nisRK, y nisFEG que
frente a bacterias Gram-positivas.
regulan la expresión del gen estructural nisA.
No es eficaz con las bacterias
El precursor inactivo NisA es modificado
Gram-negativas.
químicamente por los productos de nisB y nisC que
Es capaz de impedir el desarrollo
deshidratan a los residuos de treonina y serina y
de clostridios y bacilos,
originan la formación de los enlaces tioeter
destruyendo la pared de la espora.
NISINA característicos de los antibióticos.
La sensibilidad a la nisina varía de
Una vez modificado el precursor, este es transportado,
unas bacterias a otras.
procesado y secretado; para proteger a la célula
La dosis mínima de eficacia no es
productora, existen las proteínas NisL y NisFEG que le
siempre la misma.
confieren inmunidad.
CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS

Gráfico.1
Se muestra una tendencia de
crecimiento exponencial del
lactococcus teniendo como
referencia su tasa de crecimiento
de (µmax =0.523h-1) y el tiempo
generacional de (tg =1h) cuyo
tiempo transcurrido es cada 5
horas, partiendo de una
concentración inicial
de1x102ufc/ml, indicando que el
crecimiento de este
microorganismo es lento
tomando como indicativo que
cada hora se duplica por tanto a
las 24 horas se obtendría una
concentración 3.5E9 ufc/ml.
MARCO METODOLOGICO
MUESTREO

 El experimento se realiza en laboratorio de microbiología de la

Facultad de ciencias químicas con muestras de suero lácteo
obtenidas de la fábrica de quesos La Andina en Machachi Ecuador.
 Las muestras de suero lácteo fueron escogidas totalmente al azar y
empacadas en bolsas herméticas selladas y guardadas en un
cooler, con hielo para mantener la muestra fresca. El tiempo
trascurrido entre toma de muestra y análisis es de un día
TECNICA DE AISLAMIENTO PARA
LACTOCOCCCUS.
Preenriquecimiento:
 Se tomaron 10ml de suero lácteo con 90 ml de caldo
Elliker se debe incubar en condiciones de anaerobiosis a
37ºC por 5 días en una estufa, para adaptar a los
microorganismos que se encuentran dañados o
debilitados, ya que son de crecimiento lento.
AISLAMIENTO
 Realizar diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-4 .Tomar cada
tubo de la dilución y sembrar por estriado en el medio Elliker agar
(que tiene un pH de 6.8 antes de esterilizar este medio es el más
selectivo para el aislamiento de lactococcus) por duplicado, las
cajas se incubaran a 37ºC por 5 días, manteniendo las condiciones
de anaerobiosis en una jarra gaspac y se coloco una tira indicadora
para verificar la anaerobiosis.
 Realizar una resiembra con el mismo medio Elliker agar por
duplicado para obtener cepas puras.
SELECCIÓN
 Se debe tomar las colonias que muestran distinta morfología en
función tamaño, forma, borde, elevación, transparencia, color y
velocidad de crecimiento. Pero la selección se basa
específicamente en las colonias que son resistentes a diferentes
concentraciones de caseína a las que serán sometidas las
bacterias en el suero de quesería.
A los lactococcus seleccionados se procede a pasar a suero
de quesería pasteurizado suplementado con caseína
hidrolizada obteniéndose mejores resultados de producción
de nisina a una concentración de 15g por litro y a un pH
menor de 5 después de 24 horas de fermentación según el
Centro de Estudios y de Investigación en Biotecnología
(CIBIOT) Colombia.
PRESERVACIÓN

 Las cepas de Lactococcus aisladas se transfieren a

caldo BHI con glicerol (20% v/v) y se congelaron a -80
ºC hasta su posterior análisis.
RESULTADOS
 PARÁMETROS DE SELECCIÓN
CONC. CONC.
MÍNIMA DE MÁXIMA DE
CEPA pH
CASEÍNA CASEÍNA
2,5g/500ml 12,5g/500ml
LAC-1 X 4
LAC-2 X 4
LAC-3 X 4
LAC-4 X 4
LAC-5 X 4
LAC-6 X 4
LAC-7 X 4
LAC-8 X 4
LAC-9 X 4
LAC-10 X 4
LAC-11 X 4
LAC-12 X 4
 6. DISCUSIONES:
1. Al realizar el experimento sobre la producción de nisina a partir de
lactococcus se pudo determinar que la velocidad de crecimiento del
microorganismo fue lenta, afectando el tiempo de realización del aislamiento y
selección.
2. El sinergismo entre el lactoccocus y lactobacillus genero dificultad en el
aislamiento del microorganismo deseado ya que el lacctobacillus se desarrolla
más rápido que el lactococcus.
3. El metabolismo respiratorio de este microorganismo tuvo inconvenientes,
debido a que varía según las condiciones dadas afectando su crecimiento.
4. Para la realización del aislamiento del microorganismo se necesito de un breve
análisis de diferenciación, ya que a pesar del medio específico (Eliker)
utilizado se obtuvieron lactococcus y lactobacillus que son sinergistas
siendo necesario identificar las bacterias por medio de tinción gram
escogiéndolas de acuerdo a su morfología (cocos gran positivos).
5. Para determinar la selección de la mejor cepa se sometió al microorganismo a
concentraciones máximas 12.5 g/500ml y mínimas 2.5g/500ml de caseína,
mediante este análisis se eligió a las mejores cepas puesto que dicho
microorganismo presenta enzimas que degrada la caseína, incrementando la
velocidad de su crecimiento.
 CONCLUSIONES
1. Se aislaron 15 cepas biotecnológicas (lactococcus) de 10
muestras de suero de quesería.
2. De las 10 muestras de suero analizadas no todas contenían
la cepa de interés, esto depende de la micro flora presente
en cada muestra siendo una de las razones principales para
su limitado crecimiento.
3. El aislamiento tardo un aproximado de 2 semanas por ser
una bacteria de crecimiento lento y microaerofilica ; siendo
necesario el proporcionar de un medio ambiente adecuado
para su crecimiento, medio de anaerobiosis ( jarras gaspac)
4. La selección se la hizo de acuerdo a parámetros específicos
como pH y concentración de caseína, permitiendo evaluar y
seleccionar las mejores cepas debido a su resistencia a
condiciones minimas y maximas de nutrientes.
5. La selección se realizo en base a la concentración de
caseína, tomando como referencia tres concentraciones
siendo una mínima de 2,5g/500ml una optima de 7,5g/500ml
y una máxima 12,5g/500ml.
Se determino que de las cajas sembradas, 12 fueron las
seleccionadas obteniéndose el resultado de 7 cepas
resistentes a las concentraciones mínimas y 6 cepas
resistentes a concentraciones máximas.
La concentración optima para el desarrollo de los
microoranismos (lactococcus) fue a concentraciones de
caseína de 7.5mg/500ml de suero, esto se comprobo al
realizar la selección a diferentes concentraciones se observo
que existio mayor produccion de biomasa y su pH se
encontaraba alrededor de 6 lo cual indica que son los factores
optimos para que exista más crecimiento de este
microorganismo.
Mediante estos parámetros de selección se tomo en cuenta a
los microorganismos lactococcus que sobrevivieron a estas
condiciones extremas de nutrientes y pH, obteniendo 12
mejores cepas resistentes a las concentraciones mínima y
máxima de caseína.
El Lactococcus Lactis produce una bacteriocina denominada
nisina la cual no se pudo propagar y obtener el metábolito
deseado debido al limitado tiempo para lograr la finalización
del proyecto.
 RECOMENDACIONES

1. Se recomienda la toma de varias muestras debido a que este

microorganismo es de difícil aislamiento.
2. Se recomiendo considerar el ambiente de anaerobiosis en
este tipo de microorganismo para su crecimiento.
3. Se debe tomar en cuenta los requerimientos nutricionales así
como su metabolismo de este microorganismo (lactococcus),
debido a que de esto depende poder o no aislarlo.
4. Se recomienda utilizar medios específicos y selectivos para la
obtención de biomasa.
5. Se recomienda utilizar una metodología sencilla y añadir la de
preferencia peptona de caseína ya que la caseína precipita
con el calor esto no sucede con la peptona de caseína, y es
dificultoso al tratarla de calentar con el medio.
6. Se recomienda trabajar con muestras que no hayan sufrido
tratamiento térmico como leche o suero sin pasteurizar ya que
se encuentra una microflora sin stress fácil de manipular.
GRACIAS