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CULTIVO DE YEMAS Y MERISTEMOS, VIA ORGANOGENESIS DIRECTA.

ESTABLECIMIENTO DE ROSAS Y PIAS

OBJETIVOS
Dominar la etapa (I) o fase de establecimiento de rosas y pias, va organognesis
directa, mediante el cultivo de yemas y meristemos.
Continuar adquiriendo habilidades en el trabajo de cultivo de tejidos, especialmente en
siembra de material vegetal.
RESUMEN

En esta prctica se establecieron cultivos de organognesis directa, en el cual se

escogieron las yemas y meristemos no desarrollados de los tallos de la rosa y el
meristemo de la pia, y primordios foliares de pia luego de eso se sometieron a un
proceso de desinfeccin con tres soluciones, hipoclorito de sodio, alcohol al 70% y
solucin jabonosa, este ciclo de desinfeccin se llevo a cabo en diferentes reas de
laboratorio desde rea no estril hasta cmara de flujo laminar, ya desinfectados los
explantes, se realizo la siembra en cmara de flujo laminar.

INTRODUCCION
La organognesis es un evento morfogentico que se caracteriza por su desarrollo
unipolar, en otras palabras, es la formacin de un primordio unipolar a partir de una
yema con el subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, la organognesis
directa es la formacin directa de rganos sobre la superficie del explante cultivados
intactos. Este no requiere de la formacin de callos.
El establecimiento de los tejidos vegetales en las condiciones "in vitro" es una etapa
decisiva, para obtener cultivos exitosos, es necesario seleccionar adecuadamente el
explante, el mtodo de desinfeccin, el medio de cultivo y mantener una asepsia total
durante todo el proceso de extraccin y siembra del explante seleccionado; as mismo

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debern seleccionarse adecuadamente las condiciones ambientales para el crecimiento

de los mismos.
El trabajo en el cuarto de siembra deber realizarse de forma rpida y precisa. En el
momento de la siembra en los medios de cultivo se debe tener extremo cuidado y
mantener las mximas normas de asepsia que minimicen el riesgo de contaminacin por
manipulacin.

MARCO TEORICO

La organognesis directa es la formacin de rganos directamente del explante si la

necesidad de pasar por una fase de formacin de callos.
La organognesis ha sido la base fundamental de la multiplicacin vegetativa y dentro
de ella pueden diferenciarse dos vas: la formacin de las yemas axilares y la formacin
de yemas adventicias.

Formacin de yemas axilares

Esta tcnica se basa en la formacin de brotes a partir de las yemas que se encuentran
en las axilas de las hojas o primordios de hojas, los cuales son divididos y subcultivados
repetidamente. (Hu y Wang 1983). Este mtodo, a pesar de no ser el ms rpido, ha
sido el ms utilizado para la propagacin comercial debido en primer lugar a la facilidad
con que se ha establecido en la mayora de las especies y en el segundo lugar a la
estabilidad gentica de las plantes regeneradas siendo el sistema de regeneracin en el
cual se reportan los menores ndices de variacin gentica. Sus desventajas es que sus
coeficientes de multiplicacin en comparacin con otros sistemas de regeneracin es
muy bajo, y escasa automatizacin del procesos productivo.

Formacin de yemas adventicias

Es la formacin de Novo de yemas a partir de meristemos preexistentes o tejido no

meristematico, las cuales se originan de una o de un pequeo grupo de clulas, cuando
se cultivan los explantes en medios con concentraciones elevadas de citoquininas. Con
esta tcnica es posible producir un mayor nmero de platas por unidad de tiempo en
comparacin con el mtodo de yemas axilares y a la vez presenta mayores

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posibilidades de mecanizacin-automatizacin, existiendo ya varios ejemplos de

bioreactores para su produccin.

MATERIALES
Esta prctica fue realizada en el laboratorio de Biotecnologa vegetal de la Universidad
Francisco de Paula Santander sede Campos Elseos en donde se tuvo como objetivo, lograr el
establecimiento de rosa y pia a partir del cultivo in vitro de yemas y meristemos,
respectivamente.
Materiales

Tijeras
Cuchillo de cocina
Bistur
Mechero de alcohol
Agua destilada estril
Frascos de vidrio

Reactivos
Alcohol 70%
Hipoclorito de sodio 3%
Equipos
Cmara de flujo laminar horizontal

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METODOLOGIA

FASE PREPARATIVA
1. Se escogern las yemas de rosa y se separan los segmentos con yemas
axilares, con la ayuda de tijeras o escalpelo. Sumergir en solucin antioxidante.
1a. Se limpian y rebajan los cogollos de pia con la ayuda de escalpelo y cuchillo de
cocina.
2.
a.
b.
c.

Se preparan las soluciones desinfectantes: (c/u en un frasco de vidrio)

Solucin jabonosa
Alcohol al 70%
Hipoclorito de sodio al 3%

3. Se realizo el proceso de desinfeccin:

Para las yemas de rosas:
Se sometieron a 5 min en una solucin jabonosa, seguido de 3 enjuagues con agua
destilada estril; luego de ello, las yemas se llevaron al rea estril donde se sumergi
durante 5 min en la solucin de alcohol al 70%, seguido de enjuague 3 veces con agua
destilada estril, y por ltimo se sumergi en hipoclorito de sodio al 3% durante 8 min.
Esto se llevo a la cabina de flujo laminar donde se enjuago 3 veces nuevamente las
yemas para su debida desinfeccin.

Para las yemas de pia:

Se sometieron a 5 min en solucin jabonosa, y se enjuagaron 3 veces con agua

destilada estril. Se llevaron al rea estril y se sumergi en solucin de alcohol al 70%
durante 5 min, se enjuago con agua destilada estril 3 veces. Seguidamente se
sumergi en solucin de hipoclorito de sodio al 70 % durante 6 min, por ltimo se
pasaron a la cabina de flujo laminar y se enjuago 3 veces con agua destilada estril.

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FASE DE ESTABLECIMIENTO
Una vez terminado la fase de desinfeccin de los explantes se procedi a entrar al
rea donde se encuentra la cabina de flujo laminar, antes de entrar all fue
necesario lavar de nuevo las manos y los antebrazos y utilizar una bata que
previamente fue esterilizada. Todas estas medidas se aplicaron para obtener un nivel
de asepsia mayor y evitar que se presente contaminacin durante la siembra de los
explantes.
Dentro de la cabina de flujo laminar, efectu con ayuda de los instrumentos de
diseccin, y sobre papel estril, la diseccin de la yema o la obtencin del meristemo,
corte e implante en el medio de cultivo apropiado, colocar la yema en la posicin
correcta.

Luego de haber realizado la siembra de cada yema en los respectivos medios, cierre
los frascos, salga de la cabina. Selle con envoplast y rotule cada frasco; ubique en el
cuarto de crecimiento con las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo
del explante.

ELKIN LAS FOTOS ME LAS DIO ALEJANDRA PONGA DE NOSOTROS SI NO TIENE

DEJE ESTAS

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CUESTIONARIO

1. Cules son las condiciones ambientales que deben ser reguladas para el crecimiento
de los explantes sembrados? Detalle en qu condiciones quedaron creciendo los
explantes que usted sembr.
MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es la combinacin slida o lquida de nutrientes y agua. Usualmente
incluye sales inorgnicas, carbohidratos y vitaminas y aminocidos. A menudo se
denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algn regulador de crecimiento y
ocasionalmente con otras sustancias varias. Los nutrientes son esenciales para el
crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no
puede vivir ni in vitro ni in vivo. Tambin se debe aadir azcares al medio de cultivo, ya
que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotrficas cuando se
desarrollan en estas condiciones.
pH
Cuando se prepara un medio de cultivo, despus de aadir todos sus componentes, se
procede a ajustar el pH final al valor deseado, aadiendo NaOH 0.1 N o HCl 0.1N al
medio. Una vez ajustado el pH se procede a esterilizar el medio. El pH final del medio
de cultivo es un factor importante por diversas razones:
Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificacin de los agentes gelificantes
aadidos a los medios slidos
Si la evolucin del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir su
licuacin.
El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de
cultivo
El valor del pH puede afectar a la absorcin de determinados nutrientes por parte del
explante (la absorcin de iones NO3-aumenta con la acidez del medio)

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El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a
la actividad de muchos enzimas.
LA TEMPERATURA
La temperatura a la que est expuesto el explante cultivado in vitro afecta a la mayora
de procesos fisiolgicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar. En
general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que se produce el
crecimiento ptimo. Este intervalo puede variar en funcin del genotipo, del rgano del
que se ha obtenido el explante, de la poca del ao, de la edad de la planta madre, del
fotoperodo, etc. Una complicacin adicional se produce por el hecho de que puede
existir interaccin entre la temperatura ptima de crecimiento y otros factores como la
luz, la composicin del medio.
Determinar la temperatura ptima de crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un
proceso muy laborioso que, adems, exige gran cantidad de cmaras de cultivo
reguladas de forma diferente. Afortunadamente, y para la mayora de situaciones, se
pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubacin que oscilan
entre los 20 y 280C.
LA LUZ
La luz, definida como una forma de energa radiante que se nos manifiesta mediante la
visin es, en realidad, parte de un fenmeno fsico ms amplio: la energa radiante
(radiacin), que puede ser descrito segn dos modelos diferentes: el modelo
ondulatorio (radiacin electromagntica) y el modelo corpuscular. Como quiera que slo
una parte de la energa radiante (la luz y algunas de las radiaciones infrarrojas y
ultravioletas prximas) tiene influencia conocida sobre el desarrollo de las plantas, a
veces, se usa el trmino luz para referirse a ese conjunto de radiaciones cuando en
realidad se refiere al conjunto de radiaciones electromagnticas con efectos fisiolgicos.
La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos
auttrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro.
Del proceso de desinfeccin depende el xito de la produccin de callos. Sueles
suceder que con las altas tcnicas de asepsia, se logra retirar de los cortes la capa
de contaminacin que presenta el material vegetal luego el interior que queda esta
libre de patgenos, que brindndoles las condiciones adecuadas dan origen a una
plntula.

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Es importante eliminar cualquier patgeno presente en el explante porque el

crecimiento de bacterias y hongos, disminuye el crecimiento de tejidos vegetales o
pueden producir toxinas que afecten el desarrollo normal.
Debemos tener en cuenta los tiempos en los que los explantes deben permanecer en
cada solucin desinfectante pues si los explantes permanecen ms tiempo del
establecido en las soluciones desinfectantes, podra causar a los explantes la muerte
de los meristemos.
2. Qu tipo de crecimiento debe esperarse de acuerdo al explante usado y a la
composicin del medio de cultivo? (seale la composicin del medio utilizado).que
factores podran afectar ese crecimiento? Explique su respuesta.
De acuerdo al explante se debe esperar la formacin de tallos.
Los factores que afectan el crecimiento son:
Contaminacin del medio
Contaminacin endgena
Contaminacin exgena
El tamao del explante
El origen del explante.
Mal manejo del protocolo de desinfeccin.
Mal manejo de la cabina de flujo laminar a la hora de la siembra.

3. proponga y elabore un esquema o diagrama con todo el proceso de

micropropagacion de rosas, a partir de yemas axilares. Especifique, por separado,
medios de cultivo, mtodos de desinfeccin, condiciones ambientales de crecimiento y
otros factores que considere de inters particular, en cada fase de la propagacin
masiva

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1.
FASE 0: PREPARACIN DE LA PLANTA DONDE SE REALIZARA LA
MUESTRA
Es de gran importancia mantener a las plantas madre en un perodo de tiempo, en un
invernadero, en condiciones ptimas. Se toman las partes ms jvenes de la planta
los cuales van hacer utilizados como explantes. Se separan las yemas axilares y se
sumergen en solucin antioxidante.

2.

FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO

Despus de la desinfeccin de las yemas, se lavan con agua y jabn , se sumergen en

una solucin de hipoclorito de sodio, a una concentracin final del 1%, bajo la accin de
una bomba de vaco por 15 min, se llevan a la cmara de flujo laminar donde se lavan
tres veces con agua destilada estril. El material as preparado se corta en segmentos
de 1 cm aproximadamente, los cuales se sumergieron rpidamente en una solucin de
alcohol al 70% y luego se sembraron en el medio de cultivo.

3.

FASE II: MULTIPLICACIN DE LOS BROTES

(Medio de cultivo)Para la determinacin del medio nutritivo adecuado en el

establecimiento del cultivo se realizan pruebas usando las sales MURASHIGE y
SKOOG (MS), suplementadas con tiamina 0,4 mg/l, mioinositol 100 mg/l, sacarosa (30
g/l). As mismo se puede probar diferentes combinaciones de sustancias de crecimiento
(benciladenina BA, cido naftalenoactico ANA, cido 2,4 diclorofenoxiactico 2,4-D).
Para el desarrollo de los brotes se emple el medio MS suplementado con
combinaciones de BA y ANA.

4.

FASE III: ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO

En la etapa de enraizamiento se utilizaron medios libres de sustancias de crecimiento

con sacarosa 20 y 30 g/l. Para el crecimiento de los brotes, los cultivos se llevaron a

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medio fresco y la incubacin fue realizada bajo luz continua (5000 lux) a temperatura
controlada de 27 1C.

5.

FASE IV: ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS

La aclimatacin en condiciones de vivero se realiza utilizando como sustrato una

mezcla de suelo y turba en una proporcin 1:1 y abonada con un fertilizante comercial
para buscar una buena adaptacin a campo.

DISCUSIONES
En sta prctica se pudo aplicar el conocimiento adquirido en una prctica anterior,
donde se obtuvieron los meristemos de rosa y pia; para esta prctica, los meristemos
ya se traan expuestos desde casa ocasionando as un primer punto para la
contaminacin: ya que el meristemo era expuesto al medio ambiente.
Siendo los brotes, el resultado a obtener de este cultivo, se presume que entre los
componentes del medio se hallara alguna auxina y citocinina, en mayor concentracin
esta ltima pues por ser el explante un meristemo, ya tiene una carga previa de la
primera.
En algunos frascos de rosa se dio gran crecimiento, mientras que en los meristemos de
pia no se observo crecimiento solo mucha contaminacin y fenolizacion esto puede
atribuirse a cortes mal realizados.

CONCLUSIONES
Del presente informe se puede concluir que la pia es una especie relativamente de
difcil obtencin de brotes y muy fcil contaminacin esto es debido a la inexperiencia
del uso del laboratorio como tal, y a muchos errores cometidos durante sus procesos de
siembra. Mientras que la de rosa se puede concluir que es una especie ms fcil de
obtener pero de igual facilidad de contaminacin esto se debe a lo anterior mencionado
con la pia.

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BIBLIOGRAFIA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGRIMENSURA
http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Auxinasgiberelinasycitocininas.pdf

ANEXOS

EXPLANTES PRIMERA SEMANA

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EXPLANTES TERCERA SEMANA

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EXPLANTES CUARTA SEMANA

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EXPLANTES SEGUNDA SEMANA

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