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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

FACULTAD DE AGRONOMA E INGENIERA FORESTAL


DIRECCIN DE INVESTIGACIN Y POSTGRADO
PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA AGRICULTURA
MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES

EFECTO DEL NIVEL Y TIPO DE PROTENA DIETARIA EN INDICADORES


ENZIMTICOS DEL ESTRS OXIDATIVO EN JUVENILES DE RBALO
(Eleginops maclovinus).
Tesis presentada como requisito para optar al grado de

Magister en Ciencias Animales

por:

Luis Alberto Molina Abarza

Comit de Tesis
Profesor Gua: Rui Miguel S.
Profesores Informantes:
Fernando Bas
Ivn Pea

Octubre 2012
Santiago-Chile

Agradecimientos

Se agradece al Proyecto de Iniciacin FONDECYT 11080168 por el financiamiento


entregado para la realizacin de la presente tesis.
Al mismo tiempo se agradece enormemente a Mara Jos Rioseco y Rui S por la gran
ayuda prestada durante los anlisis y posterior revisin de los datos obtenidos. Tambin,
agradezco a mis profesores informantes Ivn Pea y Fernando Bas por el apoyo
brindado.
Se agradece a Luis Vargas y su laboratorio en la Universidad Austral de Chile por el
trabajo de histologa en hgados e intestinos de rbalo.

Dedicado a:
Mi madre Vernica, por sus incansables esfuerzos y apoyo incondicional.

NDICE

ABSTRACT. 1
INTRODUCCIN... 2
MATERIALES Y MTODOS 8
-Condiciones experimentales de los peces analizados.. 8
-Muestreo................. 9
-Preparacin de las muestras . 9
-Anlisis bioqumico........ 10
-Anlisis histolgico..... 12
-Anlisis estadstico.. 13
RESULTADOS.. 13
DISCUSIN 27
-Efecto del nivel de protena dietaria en los indicadores de estrs oxidativo....... 29
-Efecto de la utilizacin de lupino en los indicadores de estrs oxidativo. 36
CONCLUSIN.. 38
RESUMEN..... 40
LITERATURA CITADA..... 41
ANEXOS..... 49

Efecto del nivel y tipo de protena dietaria en indicadores enzimticos del estrs oxidativo en
juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus).
Luis Alberto Molina Abarza
Departamento de Ciencias Animales, Facultad de Agronoma e Ingeniera Forestal, Pontificia Universidad
Catlica de Chile. Vicua Mackenna 4860, Macul, Santiago, Chile.

Abstract
Molina-Abarza, Luis. Effect of dietary protein level and protein source in enzyme levels
and other indicators of oxidative stress of Patagonic blennie juvenile (Eleginops
maclovinus). Tesis, Magister en Ciencias Animales, Facultad de Agronoma e Ingeniera
Forestal, Pontificia Universidad Catlica de Chile. Santiago, Chile. 50pp. The aim of this
work was to evaluate the metabolic effect of the utilization of isoenergetic and isolipidic diets
with different levels of fish protein and also the effect of a partial replacement of fish protein by
vegetable protein in juvenile Patagonic blennie (Eleginops maclovinus). The hepatic activity of
antioxidant enzymes (CAT, SOD, GPX, GST, GR and G6PDH) and indicators of tissue
damage (lipid peroxidation, oxidized proteins and hepatic and intestinal histology) were
determined. Patagonic blennie juvenile were randomly distributed into 24 groups of 40 fish
each. Eight experimental diets were randomly assigned to triplicate groups and fed during 14
weeks. Six diets had increasing levels of protein (9, 14, 21, 28, 35 and 42% protein) and
additionally two diets were formulated with 28 and 35% of protein and 20% inclusion of lupin
meal (Lupinus albus). At the end of the experiment the enzymes CAT, SOD, GPX and GST
showed higher activity in the groups fed with lower protein diet- Diets 9P and 14P. Similarly,
TBARS and oxidized proteins analyses in liver samples showed a higher oxidation degree in
fish fed low protein content diets, indicating an oxidative stress in these groups. The GR and
G6PDH activity increased with the protein content and a high activity of CAT was also
observed in fish fed with a high level of protein inclusion, suggesting an increase in metabolic
activity in these groups. Histological analysis of liver and intestine of fish fed with low protein
diets showed nuclei grouped in rosettes with irregular shape in liver and a decrease goblet cell
number and shorter microvilli in intestine, indicating the occurrence of cell damage in both
tissues. As for the use of vegetable protein, the results did not show an increase of oxidative
stress in the two dietary protein levels tested. The parameters studied in this work confirmed
that patagonic blennie juvenile present a high metabolic tolerance to the different diets tested,
showing an increased oxidative stress when fed diets with a very low protein inclusion.
Key words: Eleginops maclovinus, Oxidative stress, Antioxidant enzymes, Lipid peroxidation,
Oxidized proteins.

Introduccin
Los peces, al igual que otros organismos de respiracin aerbica, presentan una
incompleta reduccin del oxgeno a nivel celular, la cual tiende a formar diversos radicales
libres, denominados especies reactivas del oxgeno, ERO. Las ERO pueden comportarse
como prooxidantes y las formas ms comunes son el anin superxido (O2-.), el perxido
de hidrgeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH.), aunque existen tambin otros radicales
que pueden contribuir a la oxidacin. En condiciones normales, cerca de 1% diario de
ERO escapa al control de las defensas antioxidantes del organismo y repercute en
diversos daos a nivel celular (Berger, 2005). La reactividad de las ERO se debe a que
son molculas cargadas elctricamente en donde el ltimo orbital tiene un electrn
desapareado, lo cual les confiere inestabilidad fsica (Sierra et al., 2004). Esta
inestabilidad las obliga a buscar y capturar electrones desde otras molculas para
neutralizarse. Generalmente el primer ataque oxidante es neutralizado por los
mecanismos antioxidantes del organismo, sin embargo muchas veces esta primera
defensa no es totalmente eficiente y se forma otro radical libre, ocurriendo la generacin
de una cadena de creacin de radicales libres (Percival, 1996). Se pueden distinguir dos
orgenes principales en la generacin de ERO: endgenas (metabolismo, cadena
respiratoria Morel y Barouki, 1999) o exgenas (efecto de xenobiticos Ferreira et al.,
2008b; efectos nutricionales Sitj-Bobadilla et al., 2005) - figura. 1.

Fuentes

Figura 1. Fuentes que pueden gatillar el aumento en la produccin de ERO a nivel intracelular. Adaptado de (Morel y
Barouki, 1999).

Dependiendo de la cantidad y duracin de la exposicin a ciertos radicales libres, existe


una respuesta celular particular en el organismo. Por un lado, la generacin de radicales
libres en dosis bajas pueden favorecer la proliferacin celular. Por otro lado, si la dosis es

intermedia, puede causar detencin del crecimiento o senescencia y, si hay una gran
produccin de ERO, se puede causar la muerte celular, tanto por necrosis como por
apoptosis (Sierra et al., 2004. Figura 2).
Cuando el aumento del contenido intracelular de EROs, sobrepasa las defensas de la
clula, ya sea por un exceso en la generacin de ERO o porque los mecanismos de
defensa antioxidante naturales contra ellas es deficiente, se produce estrs oxidativo
(EO). El EO puede afectar a varias molculas biolgicas, tales como lpidos, protenas y
cidos nucleicos, generando dao molecular (Pervical, 1996). Adems, se ha estudiado
que el EO se presenta en diversos estados patolgicos en los cuales se altera la
funcionalidad celular, contribuyendo o retroalimentando el desarrollo de enfermedades
degenerativas (Gutteridge y Halliwell, 1999). El EO fue definido por Sies (1991) como un
disturbio en el equilibrio oxidante-antioxidante favorable al primero que puede provocar
enfermedades potenciales. Efectivamente, el exceso de radicales generados durante el
metabolismo celular es la principal causa de mutaciones que podran generar
enfermedades neurodegenerativas y cncer (Thannickal y Fanburg 2000). As mismo, se
ha relacionado al EO con una disminucin en la respuesta del sistema inmune (Walsh et
al., 1995; Beiqing et al., 1996).
A nivel celular, el lugar de produccin y de ataque de las ERO puede ser tambin variable.
De hecho, varias molculas pueden migrar hacia otras zonas desde su sitio de
generacin, transportando as el radical y/o accin oxidante desde un tejido hacia otro
tejido objetivo (Sies, 1997).
El dao celular resultante de una situacin de estrs oxidativo puede ser visible en
diferentes rganos, pero en particular se observa en el hgado, por su alta actividad
metablica y donde se reflejan altas actividades enzimticas (Trenzado et al., 2006).

Figura 2. Efecto de la cantidad de radicales libres producidos sobre la actividad celular. (Adaptado de Sierra, et al., 2004)

Entre las sustancias de defensa antioxidante de primera accin se encuentran a las


enzimas antioxidantes (Cadenas, 1997). Las enzimas claves con accin de proteccin
contra las ERO son: la Superxido dismutasa (SOD), la Catalasa (CAT) y las enzimas
dependientes del glutatin: Glutatin peroxidasa (GPX), Glutatin reductasa (GR) y
Glutatin-S-transferasa (GST) (Rudneva, 1997; Shallaja y DSilva, 2003; van der Oost et
al., 2003; Trenzado et al., 2006). Estas enzimas presentan una diferente velocidad de
respuesta, siendo la SOD la primera en generar una accin antioxidante actuando
conjuntamente con la CAT (Kono y Fridovic, 1982; McCord y Fridovich, 1999). La
actividad de estas enzimas ha sido asociada a la defensa antioxidante en diversos
estudios y al mismo tiempo como buenos indicadores de estrs oxidativo en trucha
arcoris (Oncorhynchus mykiss), (Stephensen et al., 2002); en turbot (Scophthalmus
maximus), en halibut (Hippoglossus hippoglossus) y dorada (Sparus aurata) (Tocher et al.,
2002a); en salmn del atlntico (Salmo salar) (Tocher et al., 2002b); en pez gato
(Rhamdia quelen), (Braun et al., 2008) y en esturin (Acipenser naccarii), (Daz et al.,
2010).
En relacin a los modos de accin de estas enzimas, la SOD acta mediante la
conversin del anin superxido (O2-.) en perxido de hidrgeno (H2O2) y la CAT
metaboliza el H2O2 en O2 y agua. Sin embargo, las ERO H2O2 y O2-., bajo ciertas
circunstancias, pueden llegar a formar radicales hidroxilos (OH-). Este radical es muy
reactivo, pudiendo atacar protenas y lpidos, originando productos de estrs oxidativo
como el malondialdehido MDA (Almroth, 2008), el cual es comnmente detectado en las
pruebas de sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS). A su vez, la GPX, acta
de manera similar a la CAT, catalizando la reduccin de perxidos (ROOH) y
lipoperxidos, incluyendo el OH-, en alcoholes (ROH) y agua, a travs de la oxidacin del
glutatin (GSH). El glutatin es una molcula que se encuentra normalmente dentro de la
clula y acta como un tampn antioxidante. Cuando el GSH ha sido oxidado y se
encuentra en su forma de glutatin oxidado (GSSG) puede volver a su estado reducido
mediante la accin de la enzima GR (Morel y Barouki, 1999), siendo esta enzima esencial
para el ciclo redox del GSH. Una razn alta de GSH/GSSG favorece la proteccin contra
el estrs oxidativo y adems es un buen indicador de proteccin antioxidante. Finalmente,
la GST es otra importante enzima antioxidante que acta mediante la conjugacin
cataltica y oxidacin del glutatin reducido (GSH) para ejercer su accin de defensa
frente a los radicales libres y xenobiticos (Morel y Barouki, 1999).

Para que ocurra la reaccin de las enzimas antioxidantes, es necesaria la presencia del
NADPH, en su forma reducida, el cual es mayoritariamente producido por la enzima
G6PDH (Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa). Por este motivo, esta enzima, adems de su
accin en diferentes vas metablicas (Kletzien et al., 1994), es igualmente considerada
un indicador de la ocurrencia de estrs oxidativo, al participar indirectamente en la accin
de proteccin de las enzimas dependientes del glutatin (Halliwell y Gutteridge 1999). La
interaccin entre las enzimas antioxidantes, enzimas de soporte, ERO y productos de
oxidacin se puede observar en la figura 3.

Oxidacin ADN
Oxidacin protenas

Oxidacin lpidos

Figura 3. Interaccin entre enzimas antioxidantes (cuadro azul), enzima de soporte (cuadro gris), molculas
oxidadas (texto rojo) y ERO a nivel intracelular. Adaptado de Almroth 2008.

Existen tambin otros indicadores no enzimticos de estrs oxidativo, tales como el grado
de peroxidacin de lpidos (LPO) y el grado de oxidacin de protenas (PROTOX). Ambos
son indicadores de dao celular y se han utilizado en diferentes especies de peces como
herramientas efectivas para confirmar un estado de estrs oxidativo (Parvez y Raisuddin,
2005; Ferreira et al., 2005; 2007; 2008a; 2008b).
La oxidacin de cidos grasos poliinsaturados (LPO), an siendo un proceso complejo de
mltiples etapas, est comprendida por 3 etapas principales conocidas como: Iniciacin,
Propagacin y Trmino (Halliwell y Gutteridge, 1989). El proceso de oxidacin comienza
por el ataque de los radicales libres a los cidos grasos poliinsaturados (PUFAs, por su
sigla en ingls). Comnmente esta etapa de iniciacin parte con la formacin de un radical
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carbonado, mediante la accin de un radical hidroxilo que sustrae un hidrgeno a la


cadena lateral del cido graso. La etapa de propagacin se caracteriza por la generacin
de una cadena de reacciones auto-oxidativas en el cido graso. Finalmente, en la etapa
trmino, se observa la oxidacin completa del acido graso. La LPO puede determinarse a
travs de la cuantificacin de las especies reactivas del cido tiobarbitrico (TBARS, por
su sigla en ingls), mediante la determinacin de la concentracin del malondialdehido
(MDA).
En cuanto a las protenas tisulares, estas pueden ser oxidadas directamente por la accin
de las ERO y tambin por la accin de otras molculas secundarias que resultan de la
accin de radicales libres con lpidos, carbohidratos y cidos nucleicos (Levine et al.,
1994, Grune, 2000). La oxidacin de protenas ocurre en las cadenas laterales, en
especial en los aminocidos Pro, Arg, Lys y Thr, resultando en la formacin de grupos
carbonilos. Estos grupos carbonilos son capaces de generar dao a las protenas,
mediante una reaccin secundaria por el lado nucleoflico de los residuos Cis, His y Lys
con aldehdos, como el MDA, producidos en la lipoperoxidacin (Dalle-Donne et al.,
2002). De esta forma la determinacin de protenas oxidadas mediante cuantificacin de
grupos carbonilos puede ser un buen indicador de dao tisular por efecto oxidativo
(Levine et al., 1994). Este indicador ha sido utilizado en diferentes especies de peces,
tales como Zoarces viviparus (Almroth et al., 2005), Mugil cephalus y Platichthys esus,
(Ferreira et al., 2005), Diplodus sargus, (Ferreira et al., 2008).
En diversos estudios se ha reportado la presencia de EO asociada a una menor
performance productiva (Yuan et al., 2007; Manju et al., 2008; Zhu et al., 2008), siendo su
determinacin uno de los factores a considerar en el reemplazo nutricional en dietas para
peces (Kiron et al., 2004; Wing-Keong et al., 2004; Menoyo et al., 2005; Sitj-Bobadilla et
al., 2005). De esta forma, conocer la capacidad de respuesta metablica y de crecimiento
de un pez frente a una situacin de estrs oxidativo es cada vez ms importante cuando
se considera estudiar especies nuevas y con potencial para la acuicultura.
El rbalo (Eleginops maclovinus) es actualmente considerado un candidato a la
diversificacin de especies cultivadas en la acuicultura chilena. Es un nototnido
endmico en Chile que se distribuye natural y ampliamente desde Valparaso a
Magallanes sobre la costa del pacfico (Pequeo, 1989; Ojeda et al., 2000). Se trata de un
pez pelgico de baja profundidad y su biomasa llega a ser dominante en muchos de los
estuarios del sur de Chile (Pequeo, 1989). Se ha clasificado como una especie de buen
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crecimiento en su hbitat natural (Brickle et al., 2005), registrndose en base a estudios


con otolitos crecimientos anuales de 168 mm (Licandeo et al., 2006). Actualmente, el
rbalo es una especie con importancia econmica solamente a nivel de la pesca artesanal
(SERNAPESCA 1999, citado por Valenzuela, et al., 1999), habiendo demostrado tambin
una modesta aceptacin de mercado en otros pases, tales como Estados unidos,
Espaa, Suecia, Francia y Japn, donde ha sido ocasionalmente exportado (Fundacin
Chile, 2009). La informacin disponible respecto a los hbitos alimenticios del rbalo no
permite precisar el tipo de rgimen de esta especie en su hbitat natural, ya que entre los
investigadores hay informacin contradictoria, proponiendo un rgimen omnvoro,
herbvoro e incluso carnvoro para esta especie (Guzman

y Campodnico, 1973;

Gosztonyi, 1979; Pequeo, 1979; Pavs et al., 2005; Licandeo et al., 2006). Asimismo, no
existe informacin publicada en cuanto a sus requerimientos en macronutrientes en
condiciones de cultivo. Los resultados zootcnicos del proyecto en que se inserta el
presente estudio demostraron que los juveniles de rbalo presentan una necesidad
proteica de 35,5% MS para alcanzar una tasa de crecimiento especifica (TCE) mxima.
Adems, se demostr que para niveles de inclusin protena de 28% y 35%, valores
cercanos a las necesidades proteicas, no se observa un efecto significativo en el
crecimiento cuando se utiliza 20% de lupino como fuente proteica alternativa a la harina
de pez. Por otro lado, se observ en ese mismo estudio que la digestibilidad del alimento,
protena y energa, disminuyen cuando el nivel de protena en la dieta es inferior a 21%.
Estos resultados estaran de acuerdo con Gosztonyi (1979), quien afirma que el rbalo
tiene un rgimen alimenticio predominantemente herbvoro. Adems, el bajo nivel de
protena determinado para obtener un mximo crecimiento, sugiere que el rbalo se
acerca a una especie omnvora/herbvora (Wilson, 2002). No obstante, posibles efectos
prejudiciales de la utilizacin de dietas desbalanceadas no son detectados al nivel del
crecimiento o de la digestibilidad, pero s ocasionan alteraciones al nivel histolgico (Uran,
2008) o promueven una situacin de estrs oxidativo. Hasta el momento, el efecto de la
utilizacin de diferentes niveles de protena y el efecto de la utilizacin de diferentes dietas
isoenergticas, con diferentes niveles de protena, en la histologa intestinal es, hasta el
momento, desconocido. Asimismo, un posible efecto de proteccin a la oxidacin celular
resultante de la utilizacin de fuentes proteicas vegetales es igualmente desconocido.
Efectivamente, se demostr que algunos compuestos presentes en muchos vegetales
podran actuar como antioxidantes (Moure et al., 2001) y su efecto en juveniles de rbalo
no ha sido todava probado.
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El objetivo del estudio fue estimar la respuesta de las enzimas antioxidantes e indicadores
de dao tisular en juveniles de rbalo alimentados con dietas que diferan en el porcentaje
de inclusin de protena de pescado. Adicionalmente, determinar la respuesta de estos
mismos parmetros frente a la utilizacin de lupino blanco (Lupinus albus) como
reemplazante proteico a dos niveles distintos de inclusin proteica de la dieta. Finalmente,
se analiz el efecto de las dietas en histologa heptica e intestinal de rbalo para evaluar
el dao oxidativo generado. La ocurrencia de una regulacin nutricional de estos
indicadores permitir a futuro estimar un posible efecto negativo o benfico de una dieta
especfica para el cultivo de esta especie, permitiendo adems prever posibles efectos en
el crecimiento, sistema inmune, entre otros (Zhu et al., 2008).
Materiales y Mtodos
Condiciones experimentales de los peces analizados
El material biolgico analizado en el presente trabajo fue obtenido al final de la realizacin
de un experimento de crecimiento con juveniles de rbalo, conducido en las instalaciones
de Fundacin Chile, subestacin de Quillaipe, Regin de Los Lagos, en los meses de
diciembre 2009 a febrero 2010.
Para realizar este experimento, se utilizaron juveniles de rbalo con un peso inicial de
411.3g acondicionados en un sistema flujo continuo de agua de mar con estanques
circulares de fibra de vidrio, de 350 L de capacidad. Antes de iniciar el experimento, 960
peces fueron aclimatados al sistema de cultivo durante un mes y alimentados con una
dieta comercial. La distribucin de los peces se realiz de forma aleatoria en 24
estanques (40 peces/estanque), con un flujo de agua de 10L/min en cada estanque. La
temperatura del agua fue de 14C 1.5C y el fotoperiodo de 12h luz/12h oscuridad,
siendo estos parmetros controlados y mantenidos a lo largo del experimento. La
alimentacin se realiz manualmente, dos veces al da a la saciedad visual aparente,
durante 14 semanas, segn lo descrito por S et al., 2006.
De las dietas entregadas, seis presentaban niveles crecientes de protena (9%, 14%,
21%, 28%, 35% y 42% de protena en la dieta) y adicionalmente dos dietas fueron
formuladas con 28% y 35% de protena, con una inclusin de harina de lupino (Lupinus
albus) al 20%. Las ocho dietas experimentales eran isoenergticas e isolipdicas, (anexo

1. Composicin y anlisis proximal de las dietas).

Muestreo
Durante los dos das subsecuentes al trmino del experimento de crecimiento, pasadas 6
horas desde la primera alimentacin del da, 2 peces fueron aleatoriamente muestreados
desde cada estanque (6 peces por tratamiento para anlisis de actividad enzimtica). Los
peces fueron anestesiados mediante inmersin en agua de mar con benzocana (BZ-20,
Laboratorios Veterquimica, Santiago, Chile), a una concentracin del 0.03% y sacrificados
mediante golpe craneal, siguiendo los procedimientos indicados para prctica de
eutanasia descritos en el Manual de tratamiento y utilizacin de peces en
experimentacin, del Canadian Council on Animal Care (2003). Posteriormente se
extrajeron las muestras tisulares retirando el hgado y una porcin de msculo sin piel
desde la regin anterior dorsal. Se muestrearon adicionalmente 2 peces por tratamiento
destinados a un anlisis histolgico. El material biolgico muestreado fue rpidamente
congelado en nitrgeno lquido y luego almacenado a -80C para posterior anlisis
bioqumico o fijado en formalina, para proceder a su anlisis histolgico.
Preparacin de Muestras
Hgados:
Para efectuar el anlisis de los indicadores de estrs oxidativo enzimticos y de dao
tisular, una porcin de hgado de cada tratamiento (siempre mantenida en hielo) fue
homogeneizada en tampn de homogeneizacin, en una proporcin de 1:10, durante 2
minutos, en un homogeneizador de vidrio potter-elvehjem. El tampn utilizado fue tampn
Tris HCl 100 mM, Tritn 0,1% X-100 y Na2EDTA 0,1 mM, pH 7.8. Luego se realiz una
centrifugacin del homogeneizado a 15.000g durante 20 minutos, a 4C. El sobrenadante
obtenido fue alicuotado en varios microtubos y nuevamente almacenado a -80C para
posterior anlisis enzimtico siendo el pellet depositado en el fondo del microtubo
centrifugado descartado.
Msculo:
Para muestras de msculo se sigui el mismo procedimiento antes descrito, sin embargo
por la mayor dureza del tejido, la homogeneizacin fue realizada en un homogeneizador
de tipo Ultra-turrax.

Anlisis bioqumico
Se determin la actividad de las enzimas: CAT, SOD, GPX, GR Y GST e indicadores de
dao tisular: LPO y PROTOX en los homogeneizados obtenidos de tejido heptico. Para
los homogeneizados de msculo, se midieron solamente indicadores de dao tisular, LPO
Y PROTOX. La metodologa para cada indicador es detallada a continuacin.
La actividad de la enzima Catalasa (CAT, EC 1.11.1.6) fue determinada segn Aebi, 1974
y Ferreira et al., 2008b. Se midi el consumo de H2O2 a 240 nm siendo el coeficiente de
extincin 40 Lmol1 cm1. El volumen del medio de reaccin en la microplaca fue 300ul y
contena 67.5 mM L1 de buffer KPi, pH 7.5, y 12.5 mM L1 de H2O2. La reaccin se inici
mediante la adiccin del medio de reaccin a la microplaca que contena la muestra. La
actividad de CAT se expresa en nmol min1 mg protena heptica-1.
La actividad de la enzima Superxido Dismutasa (SOD, EC 1.15.1.1) fue determinada
segn Ferreira et al., 2005; 2007, por un mtodo indirecto que envuelve la inhibicin de la
reduccin del Citocromo C. En este mtodo, la SOD compite con el Citocromo C por el
anin superxido generado en la reaccin entre base purnica xantina y enzima xantina
oxidasa. La actividad de la SOD se mide como el grado de inhibicin del Citocromo C, a
550 nm (McCord y Fridovich, 1969). La actividad se expresa en unidades de SOD mg
protena heptica1, donde 1 unidad de SOD corresponde al 50% de inhibicin de la
reaccin de la xantina oxidasa. La actividad obtenida fue comparada contra estndares de
SOD con concentracin conocida.
La Glutatin peroxidasa (GPx, EC 1.11.1.9) se determin segn lo descrito por Bell et al.,
1986, utilizando el kit de Cayman para GPx (N 703102), el cual determina la actividad de
esta enzima indirectamente por una reaccin acoplada con la enzima Glutatin Reductasa
(GR). El glutatin oxidado (GSSG), producido por la reduccin de un hidroperxido con la
GPx, es reciclado a su estado reducido por la GR en presencia de NADPH. La oxidacin
de NADPH a NADP+ es acompaada por una diminucin en absorbancia a 340nm. La
actividad de la GPx se expresa en nmol de NADPH oxidado min-1 mg protena heptica-1.
La Glutatin Reductasa, (GR, EC 1.6.4.2) fue medida mediante el kit para GR de Cayman
(N 703202). Esta enzima cataliza la reduccin NADPH-dependiente del Glutatin
Oxidado (GSSG) a glutatin reducido (GSH). Este kit comercial de GR determina la

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actividad de la glutatin reductasa midiendo la tasa de oxidacin del NADPH. La actividad


de la GR se expresa en nmol de NADPH oxidado min-1 mg protena heptica-1.
La enzima Glutatin S-transferasa (GST, EC 2.5.1.18) se determin segn Habig et al.,
1974 y siguiendo las adaptaciones de Ferreira et al., 2006; 2008a. Se utiliz glutatin
(GSH) 10 mM, en tampn fosfato 0.1 M, pH 6.5, y 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 60
mM preparado en etanol justo antes del anlisis. Para la determinacin de la GST se
prepar un medio de reaccin que consisti en tampn fosfato, GSH y CDNB en una
proporcin de 4.95: 0.9: 0.15, respectivamente. La actividad total de la GST es
determinada por la medicin de la conjugacin del CDNB con el glutatin reducido y esta
conjugacin del CDNB es acompaada por un aumento en absorbancia a 340nm a lo
largo del tiempo. La actividad de GST se expresa en nmol min-1 mg de protena heptica-1.
El grado de lipoperoxidacin (LPO) fue determinado mediante el mtodo de las especies
reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS), especficamente registrando la cantidad de
malondialdehido (MDA) presente en las muestras, siguiendo el procedimiento de Ferreira
et al., 2008b. Para la determinacin de MDA, los sobrenadantes de los homogeneizados
de hgado y msculo fueron incubados con cido tricloactico (TCA) al 100% y agitados
en un vortex durante 1 minuto. Posteriormente fueron centrifugados a 5000rpm durante 20
minutos. El sobrenadante obtenido fue incubado a 100C por 30 minutos con cido
tiobarbitrico (TBA) al 1%, NaOH 0.05 M L-1 y BHT 0.025% segn Ferreira et al., 2008b.
La absorbancia fue registrada a 532 nm. La LPO se expresa en equivalentes de MDA mg
de protena-1.
Para la determinacin de protenas oxidadas (PROTOX) se utiliz el procedimiento
descrito por Ferreira et al., 2008b. Esta metodologa consiste en marcar los grupos
carbonilos de las muestras con di-nitro-fenil-hidrazina (DNPH). Para ello, cada muestra
fue incubada con DNPH 10 mM L-1 en HCl 2 M L-1, durante 1 hora, a temperatura
ambiente y en oscuridad. De cada muestra se gener un blanco, el cual fue incubado slo
con HCl, a 2 M L-1. Posteriormente, en muestras y blancos se procedi a precipitar la
protena aadiendo TCA al 20%. En seguida, despus de una centrifugacin a 10.000g, a
4C, por 10 minutos, se elimin el sobrenadante y el pellet de protena depositado fue
lavado mediante su resuspensin en etanol/etioloacetato (1:1). El homogeneizado
obtenido fue centrifugado a 10.000g, por 10 min a 4C, con el objetivo de retirar el DNPH
no ligado a los grupos carbonilos. El pellet de protena resultante fue luego solubilizado en
guanidina hidrocloride 6 M L-1, en tampn KPi 20 mM L-1, pH 2.3, e incubada a 37C hasta
11

una completa disolucin del pellet. Finalmente, el contenido en grupos carbonilo fue
cuantificado mediante la absorbancia de las muestras a 370nm. Los resultados son
entregados en nmoles de DNPH incorporado mg de protena-1, basado en un coeficiente
de extincin molar de 22.000 L M-1cm-1.
Para estandarizar las mediciones de los indicadores, se determin contenido de protena
en las muestras mediante el mtodo de Bradford (1976), usando albumina de suero
bovino (BSA) como estndar. Las unidades de los indicadores de estrs oxidativo se
entregan por gramos de protena. De esta forma se corrige la variacin de la composicin
proximal de los tejidos analizados, la cual puede variar con el tratamiento dietario al que
los peces fueron sometidos.
Los anlisis de cintica enzimtica fueron realizados mediante un anlisis de absorbancia
(Abs) en UV visible en el tiempo (t), en un lector de microplacas BioTek, modelo
PowerWave HT, utilizando el software Gen5 v1.10. Las lecturas se realizaron en
microplacas de 96 pocillos (Coastar). La variacin de Abs por unidad de tiempo (Abs/t)
obtenida fue comparada con la concentracin de protena presente en la muestra para as
determinar tanto la actividad enzimtica como para cuantificar los indicadores de dao
tisular.
Anlisis histolgico
Cortes histolgicos de hgados e intestinos de 2 peces por tratamiento fueron preparados
en dependencias del Instituto de Ciencias Marinas y Limnolgicas de la Universidad
Austral de Chile, Valdivia, Chile. Se conservaron en formalina al 6% y fueron
deshidratados de acuerdo a tcnicas histolgicas estndar, siguiendo el procedimiento
descrito en el Cuadro 1. Se prepararon cortes histolgicos con un espesor de 7 micras y
la tincin utilizada fue hematoxilina-eosina. Las muestras se analizaron mediante
microscopa ptica (x10) y las imgenes presentadas corresponden a magnificaciones de
x4 y x20, para intestino e hgado respectivamente. Se realiz un anlisis observacional,
evalundose en hepatocitos la conformacin y disposicin nuclear y en el intestino medio
se observ el largo de las vellosidades intestinales y el nmero de clulas caliciformes.

12

Cuadro 1. Descripcin del proceso de preparacin de las muestras para anlisis histolgico.
Etapa
Fijacin
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Lavado
Inclusin
Inclusin

Producto
Formalina al 6%
Alcohol al 50%
Alcohol al 70%
Alcohol al 80%
Alcohol al 90%
Alcohol al 96%
Alcohol al 100%
Alcohol al 100% + Butanol
Alcohol de Butanol
Butanol + Paraplast
Paraplast
Paraplast

Tiempo
4 semanas
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
30 min
10 min
15 min
20 min
30 min

N veces
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Anlisis estadstico
Se evalu un diseo completamente al azar con descomposicin polinmica del efecto de
los niveles crecientes de protena (9, 14, 21, 28, 35 y 42) en cada indicador de estrs
oxidativo estudiado. El coeficiente de determinacin R2 fue utilizado para determinar el
porcentaje de varianza que es explicado por el modelo. El modelo utilizado corresponde a:

Yij i ij
i 1, 2 , 3

j9, 14, 21, 28, 35, 42

Yij= Corresponde a la actividad enzimtica promedio del estanque i, alimentados con el nivel de
protena j.
= respuesta promedio a un aumento del porcentaje de inclusin de protena en la dieta.
i= Efecto del tratamiento j.
ij= Error residual

Para describir el efecto del origen de la protena, nivel de inclusin e interaccin entre
ambos se evalu una estructura factorial 2x2 en las dietas 28P - 28PLU y 35P - 35PLU.
Finalmente, para evaluar una posible accin conjunta entre los indicadores de estrs
oxidativo, se realiz un anlisis de correlaciones simples entre todos los indicadores
analizados. El nivel de significancia se determin con p< 0.05 y se utiliz el software SAS
enterprise guide v9.2 para Windows.

Resultados

Las actividades enzimticas y niveles determinados para cada indicador de estrs


oxidativo se presentan a continuacin. Se representa para cada indicador analizado el
efecto del aumento del nivel proteico de harina de pescado (HP) en la dieta y el efecto de
13

la incorporacin dietaria de 20% de harina de lupino (HL) en dos dietas con niveles de
protena diferentes.
Los resultados obtenidos para la enzima CAT mostraron diferencias significativas al
evaluar el efecto del nivel de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo cuadrtico. Los valores ms altos de la actividad de la enzima fueron
observados en los tratamientos con los niveles ms altos y ms bajos probados de
inclusin proteica (Figura 4). Al analizar el efecto factorial de la inclusin de lupino al 20%
de la dieta, se observa un aumento significativo de la actividad de esta enzima con el
aumento de la protena de la dieta y no se observ un efecto significativo de la utilizacin
de lupino.

nm/min/mg prot

A. Anlisis regresin CAT

Anlisis de regresin

210
180
150
120
90
60
30
0

R2
p
0,69 0,04

9P

14P

21P

28P

35P

Coef. Var.
7,6%

42P

Nivel de protena en la dieta

nm/min/mg prot

B. Anlisis factorial CAT


210
180
150
120
90
60
30
0

Anlisis Factorial

HP

Nivel
de prot.
s

Origen
de prot.
ns

Int
ns

HL

28

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 4. Actividad enzimtica de CAT en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del
nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin 9, 14, 21, 28, 35 y 42. B: Anlisis factorial: Efecto de la
inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores
son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

14

Para la enzima SOD se observaron diferencias significativas al evaluar el efecto del nivel
creciente de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la
representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena fue de tipo
cbico. La mayor actividad de la enzima SOD se encuentra en los peces alimentados con
las dietas 9P, 14P y 21P, con un valor mximo en el tratamiento 21P. Se observa una
disminucin de la actividad de esta enzima para niveles ms altos de protena (Figura 5),
comportamiento totalmente diferente a lo visto en la CAT, donde peces alimentados con
dietas altas en protena presentan alta actividad. En los grupos que recibieron dietas con
contenido vegetal (lupino a 20% de inclusin Dietas 28PLU y 35PLU), se observ que la
actividad de la SOD igualmente disminuye al aumentar la protena en la dieta. Tal como
en la CAT, a los niveles de protena probados, no se observ un efecto significativo del
reemplazo de protena de pez por protena de lupino en la actividad enzimtica de la
SOD.

U SOD/mg prot

A. Anlisis regresin SOD


Anlisis de regresin

35
30
25
20
15
10
5
0

R2
p
0,97 0,03

9P

14P

21P

28P

35P

Coef. Var.
4,3%

42P

Nivel de protena en la dieta

U SOD/mg prot

B. Anlisis factorial SOD


Anlisis factorial

35
30
25
20
15
10
5
0

HP

Nivel
de prot.
s

Origen
de prot.
ns

Int
ns

HL

28

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 5. Actividad enzimtica de SOD en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis regresin: Efecto del nivel
creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la
inclusin de harina de lupino a 2 niveles, 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son
presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

15

Los resultados obtenidos para la enzima GPX mostraron un efecto significativo al evaluar
el efecto del nivel creciente de protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo cuartico. Se observa para GPx altos valores de actividad en los grupos
experimentales alimentados con dietas con bajo nivel de protena, siendo el valor ms alto
de esta enzima observado en el grupo alimentado con la dieta 14P. Luego, la actividad de
la enzima disminuye y presenta un leve incremento en las dietas con mayor contenido
proteico (Figura 6). Contrariamente a lo observado en CAT y SOD, en los grupos de
peces que fueron alimentados con lupino se observ un efecto significativo de la inclusin
proteica de lupino, incrementando la actividad enzimtica, no siendo evidente un efecto de
la protena a los 2 niveles probados.

nm NADPH ox/mg de prot

A. Anlisis regresin GPX

Anlisis de regresin

14
12
10
8
6
4
2
0

R2
p
0,97 0,04

9P

14P

21P

28P

35P

Coef. Var.
16,1%

42P

Nivel de protena en la dieta

nm NADPH ox/mg prot

B. Anlisis factorial GPX


Anlisis factorial

14
12
10
8
6
4
2
0

HP
HL

28

Nivel
de prot.
ns

Origen
de prot.
s

Int
ns

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 6. Actividad enzimtica de GPX en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis regresin: Efecto del nivel
creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la
inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son
presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

16

Al evaluar la enzima GST se observ un efecto significativo del nivel creciente de protena
en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin de la
actividad enzimtica en funcin del nivel de protena fue de tipo lineal, es decir hay una
relacin inversa de la actividad enzimtica con el aumento de protena de la dieta. Al
evaluar el efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la
utilizacin proteica de lupino en la actividad enzimtica, ni tampoco del nivel de protena
en la dieta a los 2 niveles proteicos probados.

A. Anlisis regresin GST


nm/min/mg prot

100

Anlisis de regresin

80

R2
p
0,65 0,004

60
40

Coef. Var.
11%

20
0
9P

14P

21P

28P

35P

42P

Nivel de protena en la dieta

nm/min/mg prot

B. Anlisis factorial GST


100
80

Anlisis factorial

60

HP

40

HL

20

Nivel
de prot.
ns

Origen
de prot.
ns

Int
ns

0
28

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 7. Actividad enzimtica de GST en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del
nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la
inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores
son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

Para la enzima GR, se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos de
peces al evaluar el efecto de la protena de la dieta. El modelo de regresin que mejor se
aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena
fue de tipo lineal y directa, es decir con el aumento de protena de la dieta hubo un
17

aumento en la actividad de esta enzima (Figura 8), situacin contraria a lo observado en


la enzima GST. El aumento de la actividad de la GR fue observado tambin en los grupos
de peces que se alimentaron con dietas con lupino, relativamente a las dietas con harina
de pescado como fuente proteica- aunque se haya observado un efecto significativo de la
inclusin proteica de lupino, no se observ un efecto significativo del nivel de protena de
la dieta en los niveles de protena probados y tampoco se observ una interaccin del tipo
de protena y del nivel de protena en la dieta.

nm NADPH ox/mg prot

A. Anlisis de regresin GR

Anlisis de regresin

2,0

R2
p
0,85 0,0002

1,6
1,2

Coef. Var.
21,6%

0,8
0,4
0,0
9P

14P

21P

28P

35P

42P

Nivel de protena en la dieta

nm NADPH ox/mg prot

B. Anlisis factorial GR

Anlisis factorial

2,0
1,6
1,2

HP

0,8

HL

Nivel
de prot.
ns

Origen
de prot.
s

Int
ns

0,4
0,0
28

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 8. Actividad enzimtica de GR en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del
nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la
inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores
son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

De acuerdo al anlisis realizado para la enzima G6PDH, se observaron diferencias


significativas entre los grupos de peces al evaluar el efecto del nivel proteico creciente de
la dieta. El modelo de regresin que mejor se ajusta a la representacin de la actividad

18

enzimtica en funcin del nivel de protena es de tipo cbico y se observ un aumento de


actividad de la enzima con el aumento de la protena (Figura 9). Para esta enzima no se
determin el efecto de la inclusin de lupino.

nm/min/mg prot

G6PDH
200

R2: 0,99
p: 0,01
CV: 10,7%

160
120
80
40
0
9P

14P

21P

28P

35P

42P

Nivel de protena en la dieta


Figura 9. Actividad enzimtica de G6PDH en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). Efecto del nivel creciente de
protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). Valores son presentados como promedios (n=3)
desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

Segn el anlisis de los valores observados de la lipoperoxidacin en hgado, se


demostr un efecto significativo al evaluar el efecto del nivel de protena en la dieta. El
modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin de los valores de este
indicador en funcin del nivel de protena fue de tipo cuadrtico, siendo significativamente
mayor en los peces alimentados con dietas de bajo contenido en protena y disminuyendo
a medida que aumenta el contenido proteico de la dieta (Figura 10a, LPO-H). Al evaluar el
efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la inclusin
proteica de lupino, pero si se observ un efecto significativo del nivel de protena en la
dieta. Contrariamente a lo observado en tejido heptico, para la lipoperoxidacin en tejido
muscular no se observ una tendencia en funcin del nivel de protena incorporado en la
dieta (Figura 10b, LPO-M). En relacin al anlisis observado en las dietas que contenan
protena vegetal, tampoco se observ un efecto significativo de la inclusin proteica de
lupino, ni un efecto significativo del nivel de esta protena en la dieta.

19

Eq MDA/mg prot

A. Anlisis de regresion LPO-H

Anlisis de regresin

0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00

R2
p
0,93 0,004

9P

14P 21P

28P 35P

Coef. Var.
22,3%

42P

Nivel de protena en la dieta

Eq MDA/mg prot

B. Anlisis factorial LPO-H


Anlisis factorial

0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00

HP
HL

Nivel
de prot.
s

Origen
de prot.
ns

Int
ns

28
35
Nivel de protena en la dieta
Figura 10a. Niveles hepticos (H) de LPO en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto
del nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de
la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores
son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

A. Anlisis de regresin LPO-M


Anlisis de regresin

Eq MDA/mg prot

0,05
0,04

R2
-

0,03

p
ns

Coef. Var.
89,6%

0,02
0,01
0,00
-0,01

9P

14P

21P

28P

35P

42P

Nivel de protena en la dieta

20

B. Anlisis factorial LPO-M


Anlisis factorial

Eq MDA/mg prot

0,05
0,04
0,03

HP

0,02

Nivel
de prot.
s

Origen
de prot.
ns

Int
ns

HL

0,01
0,00
28

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 10b. Niveles musculares (M) de LPO en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis regresin: Efecto del
2
nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42, (-): R muy bajo. B: Anlisis
factorial: Efecto de la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int:
interaccin. Valores son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

La determinacin y cuantificacin de protenas oxidadas hepticas, permiti observar


diferencias significativas entre los tratamientos al evaluar el efecto del nivel creciente de
protena en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin
los valores de este indicador en funcin del nivel de protena fue de tipo cbico. Los
valores de PROTOX fueron mayores en dietas con bajo contenido en protena y
disminuyeron cuando el contenido de proteica dietaria aument (Figura 11a, PROTOX-H).
Al evaluar el efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la
inclusin proteica de lupino, ni un efecto significativo del nivel de protena en la dieta. Sin
embargo, se observ un efecto significativo en la interaccin de ambos factores (origen de
la protena y el nivel de inclusin, p=0.0003), representado por un aumento de este
indicador con el aumento de la protena en dietas con harina de pescado y una
disminucin de este indicador con el aumento de protena en dietas con lupino. El anlisis
de este parmetro en tejido muscular (Figura 11b), no result en diferencias significativas
al evaluar el efecto del nivel creciente de protena en la dieta. As mismo, al evaluar el
efecto de la inclusin de lupino entre los peces alimentados con dietas con distinto
contenido proteico, no se observ un efecto significativo de la inclusin proteica de lupino,
ni un efecto significativo del nivel de protena en la dieta y tampoco la interaccin de
ambos factores observada en el tejido analizado.

21

A. Anlisis de regresion
PROTOX-H

nm DNPH/mg prot

7
6
5
4
3
2
1
0

Anlisis de regresin

R2
0,5
9P

14P

21P

28P

35P

p
0,01

Coef. Var.
6,1%

42P

Nivel de protena en la dieta

B. Anlisis factorial PROTOX-H


nm DNPH/mg prot

7
6
5
4
3
2
1
0

Anlisis factorial

Nivel
de prot.
ns

HP
HL

Origen
de prot.
ns

Int
s

28
35
Nivel de protena en la dieta

nm DNPH/mg prot

nm DNPH/mg prot

Figura 11a. Niveles hepticos (H) PROTOX en rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del nivel
creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Efecto de la inclusin de harina de
lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son presentados como
promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

Anlisis de regresin PROTOX-M


Anlisis de regresin

5
4
3
2
1
0

R2
9P

p
ns

Coef. Var.
14,8%

14P 21P 28P 35P 42P


Nivel de protena en la dieta

Anlisis factorial PROTOX-M


5
4
3
2
1
0

Anlisis factorial
HP
HL

28

Nivel
de prot.
ns

Origen
de prot.
ns

Int
s

35

Nivel de protena en la dieta


Figura 11b. Niveles musculares (M) de PROTOX en rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del
2
nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42), (-) R muy bajo. B: Anlisis
factorial: Efecto de la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int:
interaccin. Valores son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

22

Para determinar si debido a los tratamientos aplicados hubo una variacin similar entre los
indicadores de estrs oxidativo estudiados, se realiz un anlisis de correlaciones simples
de Pearson entre ellos. Entre las correlaciones significativas observadas, caben destacar:
la correlacin negativa entre SOD y CAT (p=0.001, R2=0.077), la correlacin positiva de
CAT con GPX (p=0.02, R2=0.63), la correlacin positiva entre GR y G6PDH (p=<0.0001,
R2=0.91), la correlacin negativa entre GR y LPO-h (p=0.008, R2=0.72), la correlacin
positiva de LPO-h con PROTOX-h (p=0.001, R2=0.76) y la correlacin significativa positiva
observada de GPX y GST con LPO-h y PROTOX-h. En el cuadro 4 se agrupan todas las
correlaciones significativas observadas.

Cuadro 4. Correlaciones simples observadas entre los indicadores de estrs oxidativo.


SOD

CAT

GPX

GR

GST

LPO-H

PROTOX-H

G6PDH

CAT (-)

SOD (-)

CAT (+)

SOD (-)

GPX (+)

GPX (+)

GPX (+)

SOD (-)

GR (-)

GPX (+)

GST (+)

GST (-)

GR (-)

GST (+)

GST (+)

GR (+)

G6PDH (-)

LPO-h (+)

LPO-h (-)

PROTOX-h (+) G6PDH (+)


-

LPO-h (+)

PROTOX-h (+)

LPO-h (+)

GST (-)

G6PDH (-)

G6PDH (-)

G6PDH (-)

LPO-h (-)

PROTOX-h (+)

GR (-)

PROTOX-H (-)

Signo entre parntesis indica grado de relacin de la correlacin. (+): Correlacin positiva, (-): correlacin negativa

Complementariamente a los anlisis bioqumicos, se realiz un estudio de histologa en


tejido heptico e intestinal. A continuacin se comparan imgenes de cortes histolgicos
de microscopa ptica obtenidas de grupos experimentales alimentados con dietas con
niveles de protena baja (9P) y niveles que bordean el contenido en protena ideal para
juveniles de esta especie, determinado por Llancabure 2011, (35P), permitiendo as
observar de mejor forma diferencias y dao a nivel tisular originados por el nivel de
protena de la dieta. Luego se presentan comparaciones entre los cortes de hgado e
intestino de peces alimentados con las dietas con y sin inclusin de lupino en ambos
niveles de protena dietaria probada, 28P y 28PLU y entre 35P y 35PLU.
En tejido heptico, peces alimentados con la dieta 9P presentan alta frecuencia de
hepatocitos anormales, con desplazamiento del ncleo y agrupados en forma de rosetas
(N.R.), clulas con picnosis nuclear (P.N.) y ncleos irregulares (N.I.), traducido como un
tejido con evidencia de dao heptico. Contrariamente, peces que recibieron la dieta 35P

23

presentaron hepatocitos con forma y tamao que se considera normal, sumado a algunos
adipositos (AD) dispersos (Figura 12).

P.N.

AD

N.R.
N.I.

Dieta 35P

Dieta 9P

Figura 12. Comparacin de cortes histolgicos de hgado de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x20).

En tejido intestinal, aunque no se haya encontrado una relacin entre el nmero de


Clulas Caliciformes (c.c.) y el contenido en protena en la dieta, cuando comparamos los
tratamientos con niveles extremos de protena (9P y 35P) se observ una disminucin del
nmero de estas clulas en la mucosa de los peces alimentados con dietas de menor
contenido en protena (9P), comparativamente a los grupos de peces alimentados con la
dieta 35P (Figura 13). Tambin se ha podido observar que las micro-vellosidades
intestinales de los grupos que recibieron la dieta 9P son ms cortas que las de la 35P y
presentan

invaginaciones (i.v.) consideradas anormales,

sugiriendo un

proceso

inflamatorio (Urn, 2008).

c.c.

c.c.
i.v.

Dieta 9P

Dieta 35P

Figura 13.Comparacin de cortes histolgicos de intestino de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x4).

24

Cuando se analizan comparativamente hgados obtenidos desde peces que recibieron


dietas que contenan 28% de inclusin de protena con y sin lupino, y dietas al 35% de
protena dietaria con y sin lupino, se observa en ambos grupos hepatocitos de buena
conformacin, bien distribuidos y considerados normales, sin apreciarse dao tisular por
efecto del origen de la protena (Figuras 14 y 15 respectivamente).

Dieta 28P15L

Dieta
Dieta28PLU
28PLU

Figura 14. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU. (H&E x20).

Dieta 35P 15L

Dieta 35PPLU
Dieta 35PLU

Figura 15. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU. (H&E x20).

Al analizar comparativamente cortes histolgicos de intestinos de peces que se


alimentaron con dietas que contenan 28% de inclusin de protena, con y sin lupino, y
dietas al 35% de protena dietaria, con y sin lupino, se observa un igual nmero de
Clulas Caliciformes (c.c) en ambas mucosas, micro-vellosidades largas y bien
conformadas y ausencia de dao tisular (Figuras 16 y 17 respectivamente).

25

c.c.
c.c.

Dieta 28PLU

Dieta 28P

Figura 16.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU.
(H&E x4).

c.c.

Dieta 35P

c.c.

Dieta 35PLU

Figura 17.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU,
(H&E x4).

26

Discusin

Los juveniles de rbalo, al igual que todos los organismos que utilizan oxgeno en
situaciones normales, producen ERO durante su metabolismo. Estos radicales se
consideran molculas mensajero y controlan procesos de ventilacin, relajacin muscular
y funciones inmunolgicas en los peces (Drge 2002). A su vez, las defensas
antioxidantes del organismo aseguran que las EROS no extiendan una accin catablica
toxica sobre el propio organismo, dependiendo as la homeostasis del equilibrio entre
factores oxidantes y antioxidantes del organismo. Este equilibrio es frecuentemente
perturbado por diversas situaciones, tales como la presencia de xenobiticos (Ferreira et
al., 2006); la contaminacin con metales pesados (Pandey et al., 2001; Ferreira et al.,
2008); la presencia de un estrs nutricional (Pascual et al., 2003; Welker et al., 2003;
Sitj-Bobadilla et al., 2005), entre otros. Estas situaciones resultan en una sobreestimulacin y generacin de ERO, la cual, al provocar una situacin de estrs oxidativo
en el organismo, gatilla una respuesta de defensa que es evidenciada por un aumento de
la actividad de algunas enzimas y la cantidad de algunos indicadores celulares, tales
como la oxidacin lipdica o proteica.
El presente experimento prob el efecto de la utilizacin de dietas con diferente contenido
de protena (concentracin y tipo de protena) en el equilibrio redox de juveniles de rbalo
mantenidos en cautiverio, en idnticas condiciones de densidad y de variables
ambientales. De todos los indicadores de respuesta a una situacin de estrs oxidativo
probados, algunos evidenciaron una estrecha relacin con el nivel proteico entregado en
la dieta, mientras que otros indicadores no mostraron tal relacin.
Este estudio comenz del principio de que la utilizacin de un nivel de protena en la dieta
que no sea el ideal para la especie, representa un desbalance nutricional y resultar en
una consecuente variacin del equilibrio entre los EROS formados y la respuesta de
defensa del organismo. La validacin de una relacin entre la actividad de algunos
indicadores de estrs oxidativo y el nivel proteico de la dieta representa un enorme
potencial, pues permitir identificar de forma inmediata una posible situacin de carencia
o exceso de protena al comparar grupos de peces de esta especie mantenidos en
cautiverio y alimentados con diferentes niveles de protena en la dieta.

27

Del experimento de crecimiento ejecutado con juveniles de rbalo alimentados durante 14


semanas a saciedad visual aparente con dietas isoenergticas e isolipdicas y con
variable contenido en protena, se estim que 35.5% de protena en la dieta
correspondera al ptimo de protena dietaria necesaria para un mximo crecimiento. A
partir de este nivel de incorporacin de protena, aunque la proporcin en la dieta del
contenido en hidratos de carbono y protena variara, no se observaron diferencias
significativas de crecimiento o composicin proximal en los peces. En los peces
alimentados con niveles de incorporacin proteica ms altos no se observaron diferencias
significativas de crecimiento ni composicin proximal, pese a que la proporcin en la dieta
de hidratos de carbono y protena variara. Por otro lado, se observ una disminucin del
crecimiento en los grupos alimentados con niveles de protena inferiores a 35,5%. Para la
composicin proximal, solamente se observ una variacin significativa cuando el nivel de
protena en la dieta era inferior a 14%, aunque la razn protena/energa variara en todos
los grupos experimentales. Adicionalmente, los indicadores de crecimiento o composicin
proximal no han podido evidenciar un efecto significativo de la utilizacin de protena de
origen vegetal (harina de lupino a 20% de la composicin de la dieta), como reemplazante
proteico de la harina de pescado.
Los anlisis bioqumicos realizados en tejido heptico y muscular de peces de los
diferentes grupos experimentales han permitido identificar variaciones fisiolgicas donde
los resultados zootcnicos mencionados antes no las han permitido distinguir.
Concretamente, se pudo distinguir diferentes respuestas metablicas a un aumento de
produccin de EROS en dos situaciones nutricionales distintas (carencia de protena y
exceso de protena en la dieta) y se pudo adems estimar un posible efecto benfico de la
utilizacin de la harina de lupino al nivel de la respuesta antioxidante, cuando es
incorporado a 20% en la dieta.
A continuacin se plantear la interpretacin de los resultados obtenidos en funcin de los
cambios fisiolgicos anteriormente descritos:

28

1.

Efecto del nivel de protena dietaria en los indicadores de estrs oxidativo

Deficiencia de protena en la dieta:


De las dietas experimentales probadas, las que contenan bajos niveles de protena
tenan simultneamente un alto contenido en carbohidratos (CHOs) (Anexo 1 Cuadro
1), el cual podra representar un agente estresor (Morel y Barouki, 1999). La falta de
protena afectara tanto la sntesis proteica como la estructura celular, y el exceso de
CHOs podra generar inflamaciones a nivel intestinal y disminucin del crecimiento,
siendo esta situacin anteriormente reportada en salmn del atlntico (Hemre et al.,
1995). Esto desencadenara un desequilibrio a nivel de la cadena transportadora de
electrones y aumentara la produccin de ERO. En el presente trabajo se cree que ocurri
tal situacin, al observar el aumento de los indicadores de respuesta antioxidante y los
indicadores de dao tisular estudiados. Por otro lado, relativo a la respuesta antioxidante,
Hilton y Atkinson (1982) al determinar el efecto nutricional en la regulacin enzimtica en
truchas arcoris, observaron una alta actividad de la G6PDH cuando fueron alimentadas
con dietas altas en CHOs. La G6PDH, siendo una enzima indicadora de lipognesis, es
simultneamente una enzima indicadora de la ocurrencia de estrs oxidativo y en el
presente experimento, los tratamientos que presentaron la mayor relacin entre CHO y
protenas en la dieta fueron los grupos 9P y 14P, no siendo visible en estos grupos un
aumento de la actividad de la enzima G6PDH. Aunque esto pudiera indicar una ausencia
de estrs oxidativo en estos grupos, su presencia no puede ser descartada.
Concretamente, se observ en estos tratamientos una disminucin del crecimiento
(Llancabure 2011) y un dao tisular a nivel intestinal, tal como haba sido observado por
Hemre et al. (1995). Adems, otros indicadores enzimticos y de dao tisular han
mostrado alta actividad en estos grupos experimentales, indicando que la presencia de
estrs oxidativo debe ser sealada mediante una anlisis multiparamtrico de indicadores.
Efectivamente, adems del aumento de los indicadores de oxidacin tisular (TBARS y
PROTOX), fue posible tambin observar alta actividad en las enzimas SOD, CAT, GPx y
GST en los peces alimentados con las dietas de menor inclusin proteica (9P y 14P),
indicando una respuesta del organismo a un aumento de la produccin de EROS.
En relacin a la utilizacin de dietas con bajos niveles de protena, el estrs resultante de
deficiencias en nitrgeno puede ser justificado por una posible limitacin de la sntesis
29

proteica y un consecuente dao a la estructura celular. Boer et al., 2010 explica esta
situacin por la ocurrencia de una sntesis de protenas deteriorada, la cual, entre otros
factores, desencadenar un desequilibrio a nivel de la cadena transportadora de
electrones produciendo un incremento de ERO a nivel celular y elevando tambin los
valores de las enzimas antioxidantes.

Relativamente a los grupos alimentados con bajos niveles de protena, se registr una
ingestin de alimento muy baja, observndose el rechazo del alimento e inclusivamente
una prdida de peso en el grupo 9P. En este tratamiento se asume que los peces
metabolizaron parte de los lpidos y protenas estructurales para la obtencin de energa,
situacin que no ocurri en los tratamientos con niveles de protena superiores. En el
grupo alimentado con la dieta con 9% de protena (9P), se observ adems una variacin
en la composicin proximal, con una disminucin significativa del contenido en grasa
relativo a los dems grupos experimentales (Llancabure, 2011). Esta situacin, adems
de explicar los bajos niveles de actividad de la enzima G6PDH, indicadora de sntesis
lipdica, fue acompaada de un incremento en la mayora de los indicadores de estrs
oxidativo y de dao tisular, apuntando este conjunto de resultados a un estado de gran
estrs oxidativo en los grupos 9P y 14P. Cabe mencionar que aunque no se haya
observado en el grupo 14P diferencias en la composicin proximal de los peces
comparativamente a grupos alimentados con mayor nivel de protenas, las diferencias en
el crecimiento son corroboradas por la alta actividad de las enzimas indicadores de estrs
oxidativo, confirmando un estrs nutricional que haba sido apenas sugerido por el menor
crecimiento observado. Para los tratamientos de bajo contenido proteico en la dieta, el
anlisis complementario de otros parmetros sanguneos (lactato, glucosa, cortisol)
ayudarn a confirmar un estado de estrs fisiolgico asociado al estrs celular
encontrado.
Otros trabajos han igualmente asociado la disminucin del crecimiento a una situacin de
estrs oxidativo. Braun et al., 2006; 2008, observaron menor crecimiento en Rhamdia
quelen y Leporinus elongatus, cuando fueron sometidos a hipoxia severa, la cual resulta
en un aumento significativo de radicales libres. Tal como ocurri en el presente trabajo,
estos autores explicaron el menor crecimiento observado por un desvo de la energa
disponible hacia la sntesis de defensas antioxidantes. En estos trabajos, se observ
igualmente una alta actividad de las enzimas SOD y CAT asociada a altos valores de
30

TBARS en los peces sometidos a la hipoxia severa como factor de estrs. La presencia
de una baja tasa de ingestin, baja tasa de crecimiento y una alta respuesta enzimtica
de la CAT, SOD, GPX y GST, adems del aumento de los indicadores de oxidacin tisular
LPO-H y PROTOX-H fueron tambin observadas en dentn (Dentex dentex) cuando fue
sometido a tratamientos de ayuno (Morales et al., 2004), indicando una respuesta
metablica similar al rbalo cultivado en una situacin de carencia nutritiva.

Correlacin entre los diferentes parmetros bioqumicos determinados:


De los indicadores de estrs oxidativo determinados, la SOD es la primera enzima en
generar una respuesta contra un aumento de las ERO (McCord y Fridovich, 1969).
Adems, Winston y Di Giulio, 1991, afirmaron que en organismos acuticos, la SOD es la
enzima que ofrece la mayor respuesta contra un EO. Sin embargo, otros autores han
definido una accin sinrgica entre las enzimas SOD y CAT (Belge et al., 2008), siendo
ambas descritas como un set de proteccin antioxidante (Kono y Fridovic, 1982). Estas
enzimas antioxidantes son las primeras en generar una respuesta de defensa. Es
importante destacar el comportamiento inverso evidenciado entre ellas en el presente
trabajo, mostrado por una correlacin negativa significativa entre ellas, la cual fue notoria
cuando el nivel de protena en la dieta era alto. Esta misma relacin inversa fue tambin
observada en hgados de trucha arcoris y esturin en el estudio realizado por Trenzado et
al., 2006.

Para otros indicadores estudiados, las enzimas dependientes del glutatin (enzimas GPX,
GR, GST), la enzima GPX present una correlacin positiva con las enzimas CAT, GST, y
con los indicadores LPO-h y PROTOX-h, observndose los mayores valores en los
tratamientos con menor contenido en protena de la dieta. Esta correlacin seala que en
esta especie este grupo de enzimas vara significativamente con el contenido proteico en
la dieta, aumentando su actividad simultneamente a la ocurrencia de dao oxidativo en
las dietas con menor contenido en protena.
Exceso de protena en la dieta:
Los parmetros de crecimiento y composicin corporal obtenidos para este mismo
experimento determinaron que aunque el nivel de protena de 35% haya sido el nivel
31

indicado para alcanzar un crecimiento mximo, 30% de protena en la dieta corresponde


al menor nivel de protena de la dieta necesario para obtener un nivel mximo de
retencin de nitrgeno (gN kg peso promedio-1 dia-1). Estos parmetros plantean que en
los grupos alimentados con las dietas 35 y 42% de protena posiblemente ocurrir un
aumento de la tasa metablica de degradacin proteica y un consecuente aumento de la
produccin de ERO a nivel mitocondrial y una alta respuesta de los mecanismos
antioxidantes. De acuerdo con Walzem et al., 1991, la actividad heptica de algunas
enzimas est ntimamente relacionada con el crecimiento del pez, sin embargo en el
presente estudio se observaron las ms altas actividades en los peces de menor tamao.
Walton et al., 1986 observaron un aumento en la actividad de las enzimas
gluconeognicas y en Treonina deshidrogenasa, Alanina aminotransferasa y Glutamato
deshidrogenasa en trucha arcoris alimentadas con dietas altas en protena, evidenciando
una mayor actividad metablica heptica. Esta mayor actividad metablica fue tambin
observada por otros autores en diferentes especies (Petzke et al., 2000) no siendo
asociada a una situacin de estrs oxidativo. En el presente estudio, los resultados
obtenidos igualmente sugieren un aumento de la formacin de EROs y una eficiente
respuesta del organismo de proteccin antioxidante.
Concretamente, la determinacin de la actividad de algunos indicadores del metabolismo
intermediario (enzimas Alanina Amino-Transferasa ALT, Glutamato deshidrogenasa
GDH, Sintetasa de cidos grasos FAS, Glucosa-6-Fostato deshidrogenasa G6PDH,
Fructosa 2,6 bifosfatasa) apuntaron a un aumento del metabolismo en los grupos
alimentados con altos niveles de protena (Rioseco, 2011). En cuanto a la respuesta
antioxidante, la relacin entre la actividad de la enzima CAT y el nivel de incorporacin
proteico probado en la dieta fue de tipo cuadrtica, siendo alta la actividad en los grupos
con menor y mayor nivel de protena. Por otro lado, en los grupos que recibieron altos
niveles de protena (35P y 42P) bajos niveles de TBARS y PROTOX fueron observados,
indicando una eficiencia de la enzima CAT como un mecanismo de proteccin
antioxidante en estos tratamientos. As, la mayor actividad metablica en los peces que
fueron alimentados con las dietas con mayor contenido en protena result en un aumento
de la formacin de EROS, los cuales fueron balanceados por el aumento de la actividad
de la enzima CAT y de otras defensas antioxidantes. De este modo, se puede distinguir el
estado fisiolgico indicado por una alta actividad de la CAT en los peces alimentados con
dietas de bajo nivel de inclusin proteica estado de estrs oxidativo del estado de alta
32

actividad metablica indicado por la actividad de esta misma enzima en los tratamientos
de alta inclusin proteica. Tal como fue mencionado, la definicin de ambos estados
depender no solamente de la actividad de la enzima CAT, sino que tambin de los
indicadores de LPO y PROTOX que definirn la presencia o no de un estado de EO.
Finalmente se destaca una alta correlacin observada entre las enzimas CAT y GPX
(p=0.02, R2=0.63), la cual sugiere una respuesta a situaciones de estrs oxidativo o
aumento metablico (bajos o altos niveles de protena, respectivamente) similar para las
dos enzimas con accin de proteccin antioxidante. A su vez, la enzima GST, aunque
tambin presente una correlacin positiva con las enzimas CAT y GPX, su alta actividad
solamente fue demostrada en los grupos alimentados con bajos niveles de protena, no
registrando un aumento de su actividad con el aumento de la actividad metablica
sugerida para los grupos alimentados con dietas de alto contenido proteico. La importante
accin de la enzima GST frente a una situacin de estrs oxidativo fue tambin detectada
en turbot (Scophthalmus maximus) frente a la presencia dietaria de ingredientes
precursores de radicales libres (Tocher et al., 2003). La actividad de las enzimas GST,
GPX y GR est ntimamente relacionada con la presencia de Glutatin en su forma
reducida u oxidada (GSH o GSSG) y en el presente experimento las enzimas GPX y GST,
aunque hayan presentado una alta actividad en los tratamientos de menor contenido en
protena, podran haber presentado una actividad ms alta si la actividad de la enzima GR
hubiese sido igualmente alta. La forma reducida del Glutatin (GSH), convertida por la
enzima GR, representa el sustrato de las enzimas GPX y GST, que convertiran el
glutatin a su forma oxidada (GSSG) (Leopold y Loscalzo, 2000), estimulando a su vez el
aumento de la actividad de la enzima GR. Diferentes situaciones podran explicar la baja
actividad de la enzima GR y alta actividad de las enzimas GPX y GST: por un lado podra
estar presente un insuficiente aporte nutricional de la forma reducida del glutatin (GSH),
acompaado de una baja disponibilidad de NADPH (sugerido por la baja actividad de la
enzima G6PDH, en estos tratamientos). De este modo estara presente el sustrato de las
enzimas GPX y GST sin intervencin significativa de la enzima GR. Por otro lado, en los
grupos alimentados con bajos niveles de protena en la dieta puede haber ocurrido un
bombeo de la forma oxidada del glutatin (GSSG) hacia el exterior de la clula. Esta
situacin fue observada por Keppler (1999) en situaciones en que la actividad de la GR es
insuficiente para la conversin del GSSG en GSH. Considerando esta posibilidad, esto
explicara una alta actividad de las enzimas GPX y GST y una simultnea baja actividad
33

de la enzima GR. Por el momento no hay informacin que permita confirmar el posible
bombeo de GSSG hacia el exterior de la clula. Por otro lado, los resultados disponibles
hasta el momento siguieren que efectivamente la disponibilidad de NADPH que permita la
accin de algunas enzimas antioxidantes fue significativamente ms alta en los
tratamientos con dietas de alta concentracin proteica en relacin a los tratamientos de
baja concentracin proteica. En este sentido, la actividad de la enzima G6PDH,
productora de NADPH, fue significativamente ms alta en las dietas de mayor inclusin
proteica y, no se observ una variacin significativa de la concentracin lipdica en los
peces de estos grupos experimentales (Llancabure, 2011 y Rioseco, 2011). Esta situacin
sugiere que el poder reductor del NADPH no fue destinado a la sntesis lipdica, siendo
utilizado por las enzimas antioxidantes, tales como la GR. Para corroborar esta hiptesis
se tiene la alta correlacin observada entre las enzimas GR y G6PDH para los altos
niveles de protena probados.
Indicadores de estrs oxidativo en diferentes tejidos:
Los presentes resultados corroboran la necesidad inherente a este tipo de estudios en
determinar la actividad de una amplia gama de indicadores de respuesta a una situacin
de estrs oxidativo. Esto se debe a que las diferentes especies de peces cuentan con
diferentes mecanismos de proteccin antioxidante que responden de forma particular, en
diferentes tejidos y en diferentes situaciones fisiolgicas, que inducen la formacin de
EROS. Concretamente y con respecto a la actividad enzimtica medida, la GPx mostr
ser una efectiva defensa heptica al estrs oxidativo en rbalo, al contrario de lo
observado por Trenzado et al., 2006, que mostr en hgado su menor actividad cuando
fue comparada con otros tejidos. Por otro lado, en este mismo estudio de Trenzado et al.
2006, se observ una mayor actividad de la enzima CAT en hgado que en msculo,
justificando estos autores las diferencias por el mayor consumo de oxgeno y actividad
metablica ms alta observada en hgado.
Con respecto al grado de peroxidacin lipdica (LPO), se observ una alta actividad de
este parmetro en hgado (LPO-H) en los tratamientos de menor nivel de incorporacin
proteica, indicando la presencia de estrs oxidativo y tambin una posible movilizacin de
lpidos (Ferreira et al., 2005; 2007). La correlacin positiva observada entre la LPO y
algunas enzimas de proteccin antioxidante corrobora la presencia de una actividad
34

enzimtica combinada para poder disminuir y/o detener la accin promotora de


lipoperoxidacin. Sin embargo, la actividad de lipoperoxidacin medida en tejido muscular
(LPO-M) mostr un patrn de variacin distinto al observado en hgado, con altas
variaciones estndar, lo que no fue esperado y no permite encontrar una explicacin para
lo ocurrido. Los resultados obtenidos son contrarios a los de otros trabajos, en los cuales
se observa una variacin similar de respuesta a tratamientos experimentales en msculo
e hgado (Braun et al., 2008).

Las protenas oxidadas (PROTOX) y LPO a nivel heptico y muscular han sido utilizadas
en diferentes trabajos como indicadores de dao celular (Morales et al., 2004; Ferreira et
al., 2008; Ferreira et al., 2010). En el presente trabajo una correlacin positiva entre estos
indicadores de dao oxidativo fue observada en tejido heptico (p=0.001, R2=0.76). En
los trabajos de Ferreira et al. (2008; 2010), una similar correlacin positiva fue observada
para estos parmetros, observndose que el incremento de la LPO en hgado puede ser
responsable por un consecuente aumento del nivel de PROTOX. En el presente trabajo,
en los diferentes grupos experimentales no fueron observadas diferencias significativas
para estos indicadores de oxidacin tisular y tampoco una asociacin fue observada en
tejido muscular, imposibilitando determinar si en el musculo existi un real dao proteico o
lipdico.
A nivel muscular, los valores promedios observados en PROTOX evidencian un bajo nivel
de oxidacin proteica en las dietas de menor y mayor nivel de inclusin proteica. Estos
resultados sugieren que a nivel muscular no ocurri un dao proteico significativo,
presumiblemente debido al efecto protector de las enzimas antioxidantes presentes y que
evidenciaron un aumento significativo de su actividad.
Histologa digestiva:
El anlisis histolgico permiti observar en el grupo de peces alimentado con dietas con
bajo aporte proteico la presencia de hepatocitos anormales, con desplazamiento de los
ncleos hacia la periferia celular, agrupndose en forma de rosetas (N.R.) o presentando
ncleos con bordes irregulares (N.I.). En el tejido intestinal analizado, fue observado para
estas mismas dietas, que los peces presentaron bajo nmero de clulas caliciformes (c.c.)

35

y la presencia de vellosidades intestinales cortas, engrosadas y daadas. Por otro lado,


peces alimentados con las dietas con mayor concentracin en protena (> 21% de
inclusin) presentan hepatocitos y adipositos considerados normales, atendiendo a su
tamao y cantidad.
Estos resultados permitieron confirmar que los peces que fueron alimentados con bajos
niveles de protena presentaron un aumento de las respuestas antioxidantes a nivel
celular, evidenciando un estrs oxidativo, confirmado por la presencia de dao tisular,
demostrado por los ndices de TBARS, PROTOX y tambin corroborado por el anlisis
histolgico observacional.

2.

Efecto de la utilizacin de lupino en los indicadores de estrs oxidativo

Para el presente experimento se utiliz lupino blanco (L. albus) como reemplazante de la
harina de pescado, el que ha sido descrito por Sujack et al., 2006, como un cultivo con
uno de los mayores niveles de aminocidos, mejor perfil y ms altos niveles de
aminocidos esenciales, que otras especies por los estndares de nutricin para
humanos y animales. Segn Llancabure (2011), se observ que la inclusin dietaria de
lupino no afect significativamente el ndice Hepatosomtico (IHS) de los peces y
tampoco el crecimiento. Similarmente, en nuestros resultados, la mayora de los
indicadores de estrs oxidativo aqu cuantificados no present significancias frente a la
inclusin de lupino, por lo que se esperaba un comportamiento similar entre estos
indicadores. De las enzimas e indicadores estudiados, solamente la GR y GPX arrojaron
resultados significativos para el tipo de protena utilizado y se observ una interaccin
entre la cantidad de protena y el tipo de protena utilizado y las PROTOX-H en la
interaccin de ambos factores (nivel de protena dietario x tipo protena). Aunque no haya
mucha investigacin realizada en el Rbalo con respecto a estos parmetros, la utilizacin
de lupino dulce en otras especies gener una disminucin del IHS en los peces (Borquez
et al., 2011a), siendo en este trabajo juveniles de truchas arcoris alimentadas con dietas
con un porcentaje de inclusin significativamente ms alto que los que fueron probados
en el reemplazo parcial utilizado en esta investigacin.

36

Anlogamente a lo observado en los parmetros zootcnicos, en la mayora de los


indicadores medidos en el presente estudio, la inclusin de lupino al 20% no influy sobre
la actividad ni nivel de los indicadores de estrs oxidativo y dao tisular analizados. Por lo
tanto la presencia de ciertos alcaloides presentes en el lupino blanco (Erbas et al., 2006)
no afectaron la actividad heptica de los peces que recibieron las dietas con contenido
vegetal. En el estudio en salmones (Salmo salar L.) de Olsvik et al., 2011, se observ que
dietas con contenido vegetal presentaban mayor contenido de antioxidantes (GSH y tocoferol), lo que probablemente influenci una mejor respuesta antioxidante, situacin no
observada en nuestro estudio.
En el presente trabajo, la GPX (p=0.01), la GR (p=0.01) y los niveles de PROTOX
hepticos (p=0.0003) sugieren que habr un efecto positivo de la utilizacin de protena
de origen vegetal. Similarmente, en el estudio de Ashida et al., (2006) juveniles de
Paralichthys olivaceus, cuando fueron alimentados con un producto vegetal fermentado,
evidenciaron alta actividad de la GPX y menores niveles de LPO en hgado. Estos autores
sugirieron que habra ocurrido un efecto supresor de la LPO por el fermentado vegetal.
Para los dems parmetros estudiados, no se observaron diferencias significativas entre
la utilizacin de harina de lupino y harina de pescado. La mayor actividad de GPX y GR
observada en el presente trabajo se debi posiblemente a la mayor disponibilidad y aporte
de glutatin (GSH) presente en las dietas con contenido vegetal (Olsvik et al., 2011).
Sin embargo, Olsvik et al., 2011 tambin observaron que al cambiar desde una dieta de
origen marino a una dieta de origen vegetal afecta la expresin gnica y las defensas
antioxidantes del pez en el corto plazo. Ellos observaron bajos niveles transcripcionales
de la SOD-CuZn, SOD-Mn, bajos niveles hepticos de GSH y menor actividad de la SOD
y CAT, sugiriendo una menor defensa antioxidante. No obstante, en el largo plazo
(medicin al da 17), los niveles de TBARS no variaron, hubo menores niveles de cortisol
plasmtico y los niveles transcripcionales de la GPX aumentaron. Coincidentemente, en
nuestras mediciones se observ que la LPO en hgado no vari y la GPX y GR
aumentaron significativamente sus actividades en los peces que recibieron las dietas con
lupino, corroborando el resultado de que hubo un mayor aporte de GSH entregado por las
dietas vegetales.

37

A nivel histolgico, se observ que la utilizacin de 20% de lupino en dietas con 28% y
35% de protena dietaria no genera en juveniles de rbalo alteraciones a nivel de los
hepatocitos, de los enterocitos y ni de los adipocitos. En Borquez et al., 2011a al incluir
harina de lupino blanco entero en las dietas para trucha arcoris, se observ a nivel tisular
que la utilizacin de niveles muy altos de inclusin de lupino (40% de la dieta) puede
resultar en un excesivo aumento de clulas adiposas en hepatocitos. As, Vilhelmsson et
al., 2004 observaron en Oncorhynchus mykiss, que el remplazo dietario del 100% de la
harina de pescado por una mezcla de productos de origen vegetal gener un aumento en
la actividad de la G6PDH y enzima mlica (ME), enzimas indicadoras de la lipognesis.
Sin embargo, niveles menores de inclusin, similares a los utilizados en la presente
investigacin, tales efectos no fueron observados y no se observaron patologas
asociadas al contenido vegetal de la dieta, especficamente, la presencia y cantidad de
clulas adiposas en salmn fue considerada normal cuando se remplaza harina de
pescado por niveles de lupino hasta el 30% (Borquez et al., 2011a; 2011b).

Conclusin

Segn los indicadores hepticos y musculares analizados, la utilizacin de niveles de


protena dietaria de 9 y 14% repercuten en un significativo estrs oxidativo en juveniles de
rbalo, comprobado por los altos valores de las enzimas antioxidantes, los altos valores
en los indicadores de dao tisular y daos a nivel tisular observados en la histologa
heptica e intestinal. Estos resultados corroboran que los bajos ndices de crecimiento
observados en tratamientos con un nivel proteico deficitario para la especie son
acompaados por un aumento del estrs oxidativo al nivel metablico.
Se observ igualmente que cuando la protena excede al nivel proteico determinado para
un mximo crecimiento (35,5), aumenta la produccin de compuestos pro-oxidantes y
consecuentemente la actividad de las enzimas antioxidantes de primera accin SOD y
CAT. No obstante, no se produce EO en estos grupos comprobado por los niveles
reducidos de LPO y PROTOX observados a nivel heptico.

38

Para contrarrestar la mayor produccin de ERO, la actividad de las enzimas antioxidantes


hepticas de primera accin tambin aumenta, SOD y CAT, sin embargo no se produce
EO en estos grupos, corroborado por bajos niveles de LPO y PROTOX.
Finalmente, el reemplazo de la harina de pescado por lupino blanco al 20% en dietas que
contienen 28 y 35% de protena dietaria no genera una variacin en los indicadores de
estrs oxidativo, por lo que se considera que juveniles de rbalo aceptan la inclusin
vegetal de lupino al 20%.

39

Resumen
El objetivo de este trabajo fue evaluar en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus) el
efecto metablico de la utilizacin de dietas isoenergticas e isolipdicas con diferentes
niveles de protena de pescado y tambin el efecto de una sustitucin parcial de protena
de pescado por protena vegetal. Para ello, la actividad heptica de las enzimas
antioxidantes clave (CAT, SOD, GPx, GST, GR y G6PDH) y la presencia de algunos de
los indicadores de dao tisular (peroxidacin de lpidos, protenas oxidadas e histologa
heptica e intestinal) fueron determinadas. Los peces fueron distribuidos aleatoriamente
en 24 grupos de 40 peces cada uno. Ocho dietas experimentales fueron asignadas al azar
a los grupos en triplicado y se alimentaron durante 3 meses. Seis dietas presentaban un
aumento de los niveles de protena de pescado (9, 14, 21, 28, 35 y 42% de protena de la
dieta). Adems, dos dietas se formularon con 28 y 35% de protena y con una inclusin de
harina de lupino (Lupinus albus) al 20%. Al final del experimento, las enzimas CAT, SOD,
GPX y GST mostraron una mayor actividad en los grupos de peces alimentados con
menores niveles de protenas -Dietas 9P y 14P. De manera similar, los niveles de TBARS
y protenas oxidadas a nivel heptico mostraron un grado de oxidacin ms alto en los
peces alimentados con dietas con bajo contenido en protena, lo que indica un estrs
oxidativo en estos grupos. La actividad de GR y G6PDH aument con el contenido de
protena en la dieta. Tambin se observ una alta actividad de la enzima CAT en los
peces alimentados con un alto nivel de inclusin de protena, lo que sugiere un aumento
en la actividad metablica en los grupos alimentados con alto contenido de protena. El
anlisis histolgico de los peces alimentados con dietas bajas en protena mostr en
hgado la presencia de ncleos agrupados en rosetas y con forma irregular. En el intestino
se observ una menor presencia de clulas caliciformes y microvellosidades ms cortas y
engrosadas, indicando la ocurrencia de dao celular en ambos tejidos. En cuanto a la
utilizacin de protenas vegetales, los resultados no mostraron un aumento del estrs
oxidativo en los dos niveles de protenas ensayadas. Los parmetros estudiados en este
trabajo mostraron que los juveniles de rbalo presentan una alta tolerancia a las
diferentes dietas y evidencian un alto estrs oxidativo cuando la inclusin de protena
dietaria es muy baja.
Palabras clave: Eleginops maclovinus, Estrs oxidativo, Enzimas antioxidantes,
Lipoperoxidacin, Protenas oxidadas.

40

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48

Anexos
Cuadro 1. Formulacin y composicin de las dietas experimentales
Dietas
9P

14P

21P

28P

35P

42P

28PLU 35PLU

10,0

17,5

27,5

37,5

47,5

57,5

25,5

35,5

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

20,0

20,0

51,0

45,0

37,0

29,0

21,0

13,0

21,5

13,5

Grano de trigo

18,0

18,0

18,0

18,0

18,0

18,0

18,0

18,0

Aceite de pescado

14,3

13,5

12,5

11,5

10,5

9,5

11,0

10,0

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

NaH2PO4

4,7

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0

2,0

1,0

Oxido de cromo III

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Ingredientes (% materia seca)


Harina de pescado LT

(1)

Lupino (2)
Almidn

(3)

Vitaminas & Minerales Premix

(4)

Composicin proximal (%DW))


DW

91,37 91,34 91,36 91,38 91,40 91,42 90,40

90,42

Protena

8,94

14,19 21,19 28,19 35,19 42,19 28,19

35,19

Lpidos

15,46 15,42 15,43 15,44 15,45 15,46 15,55

15,56

Ceniza

1,81

5,77

Energa (kJ g-1)

19,49 19,66 19,92 20,18 20,43 20,69 19,95

20,21

P (Total)

1,36

1,39

1,40

1,42

1,44

1,46

1,41

1,43

Proporcin Protena/Lpidos

0,58

0,92

1,37

1,83

2,28

2,73

1,81

2,26

P/E (g / MJ)

7,22

10,80 14,95 18,52 21,63 24,37 16,25

(1)
(2)
(3)
(4)

2,71

3,91

5,11

6,31

7,51

4,57

20,26

Harina de pescado ALIMAR, secada con vapor a baja temperatura (LT), (Prot: 72.8% MS; Lip: 9.9% MS).
Lupino blanco AVELUP
Almidn de betarraga (crudo)
Premix vitamnico y mineral DSM, CLSF26A008

49

Y = (0,616134)*(1-euler^(-(0,113414)*(x-(8,90866))))

0,8
0,6
0,4
0,2

SGR

0,0
-0,2 0

8,910

20

35,5 40

50

60

TCE 95%

-0,4
-0,6

30

TCE MANT

-0,8
-1,0
-1,2

Nivel de protena en la dieta (%)

Figura 1. Modelo que relaciona la Tasa de Crecimiento Especifica (TCE, SGR en ingls) de juveniles de
Eleginops maclovinus con los diferentes niveles de protena dietaria presente en las dietas experimentales
(%). SGR mxima al 95% se obtiene con 35,5% de protena en la dieta y la TCE que cubre las necesidades
de mantencin (TCE MANT) de la especie se obtiene con 8,9% de protena en la dieta

50