Definicin

- Los marcadores genticos son polimorfismos en

genes o en general en secuencias de ADN que
permiten diferenciar individuos, poblaciones o
especies.
- Deben ser variables

Usos
- Gentica de poblaciones
- Programas de mejora
- Mapas genticos
- Filogenias
- Estudios evolutivos
- Medicina forense
- Trazabilidad
...

Materiales y Mtodos usados en el

estudio de los marcadores genticos
1.- Electroforesis

Materiales y Mtodos usados en el

estudio de los marcadores genticos
1.- Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tipos de marcadores genticos

- Alozimas
- RFLP
- AFLP
- VNTR
-RAPD
-.......

ALOZIMAS
Definicin: diferentes formas de una enzima
codificada por alelos de un mismo locus.
De manera resumida, los pasos consisten en
hacer una extraccin de protenas de las plantas
a analizar y posteriormente llevar a cabo una
una electroforesis en gel de almidn.
El polimorfismo se detecta aadiendo el sustrato
de la enzima al gel y mediante reacciones
qumicas colorear, detectar y localizar las
enzimas especficas, que aparecern en el gel
como bandas.
Las diferencias en la movilidad electrofortica
de las bandas, pondrn de manifiesto la
variabilidad gentica en los genes (sus alelos)
estudiados.

ALOZIMAS

Esquema general del proceso

ALOZIMAS
Aplicaciones :
9 Gentica de poblaciones
9 Marcador de lneas y stocks comerciales
9 Controversias filogenticas
9 Uso en Sistemtica
9 Relacin alozimas con caracteres cuantitativos

- Ventajas :
9 Rapidez y bajo coste
9 Importante base de datos

- Inconvenientes
No toda la variabilidad gentica se ve reflejada en
variabilidad proteica a nivel de bandas alozmicas. Entre las
razones para esta subestima de la variabilidad gentica,
estn que los cambios en la composicin aminoacdica de las
protenas no implican cambios en la movilidad
electrofortica en los geles y, por otra parte, la degeneracin
del cdigo gentico implica que cambios en la tercera base
de los codones no implican variaciones en la secuencia de
aminocidos una vez traducido el ARN mensajero.

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

1.- Digestin del ADN

- Enzimas de restriccin: Arber, Smith y Nathans: Nobel en 1978
- Utilizan las bacterias para cortar ADN forneo
- Cortan en unas secuencias del ADN: dianas de restriccin
- Tipo II: reconocen la diana y cortan en ese punto

G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
G
C-T-T-A-A

A-A-T-T-C
G

Eco RI

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)
Los RFLPs expresan las diferencias entre individuos en sitios
concretos del ADN que reconocen diferentes enzimas de
restriccin. Estas enzimas cortan en secuencias especficas del
DNA (denominadas dianas de restriccin), dando lugar a
fragmentos de tamaos diferentes que pueden ser analizados
mediante electroforesis en geles de agarosa.
Los pasos necesarios para su anlisis son:
1.- Extraccin de DNA.
2.- Fragmetacin del DNA mediante la digestin con enzimas
de restriccin
3.- Separacin de los fragmentos generados mediante
electroforesis en geles de agarosa.
4.- En algunos casos, se puede transferir e inmovilizar las
bandas del gel en membranas y detectar el polimorfimos
mediante hibridacin del ADN en la membrana con sondas
marcadas.
El uso de la PCR ha posibilitado la generacin de nuevos
marcadores de elaboracin sencilla. Por ejemplo, se puede
amplificar por PCR un gen de inters o un fragmento
determinado del genoma y hacer una digestin con enzimas de
restriccin para evaluar la aparicin de RFLPs (PCR-RFLP).

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

Tipos de polimorfismo (I)

Polimorfismo en la secuencia

1
2
Electroforesis

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

Tipos de polimorfismo (II)

Polimorfismo en el tamao de los fragmentos
(inserciones, deleciones, duplicaciones...)

1
1
Electroforesis

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)
Uso de sondas para deteccin de polimorfismos en secuencias
determindas

1
Sonda

2
Sonda
Electroforesis

Southern

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

Enfermedad fngica en V. vinifera:

(Oidio: Powdery mildew)

Uncinula necator

- Prdidas en la produccin
- No existen comercialmente cultivares resistentes a U. necator
- Tratamientos fungicidas: elevado coste e impacto ambiental
- Gen de resistencia a U. necator: Run1
- Es un gen dominante: los homocigotos y heterocigotos para
este gen presentan resistencia a este hongo. Los que no lo
lleven son susceptibles.
- Cruzamientos entre la especie salvaje de uva Muscadinia
rotundifolia (resistente a U. necator) y V. vinifera
-Estrategia para localizar genes similares a Run1: generar
sondas por PCR de genes (o partes de ellos) de resistencia y
usarlas en Southern-RFLP.
- Resultados:

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

continuacin

Marcadores: GLP1-12
MHD145
MHD98
Estos marcadores se pueden generar por PCR fcilmente,
marcarlos y usarlos como sondas sobre ADN genmico
digerido, la presencia de banda indica resistencia al hongo.

Elevado inters
comercial

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

A partir de ah otras estrategias:

Directamente mediante el anlisis del producto
de PCR de una planta que se desea conocer su
resistencia o mediante PCR-RFLP.

Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restriccin
(RFLP)

MAPA DE LIGAMIENTO

Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)
El polimorfismo de fragmentos amplificados aleatoriamente
(AFLP) se fundamenta en la amplificacin selectiva de los
fragmentos obtenidos en la digestion del ADN genmico con
enzimas de restriccion. El proceso consta de los siguientes pasos:
- Digestin del ADN con dos enzimas de restriccin que generan
dos extremos cohesivos con diferentes secuencias.
- Ligamiento a estos extremos de unos adaptadores (25-30 pb) que
encajan en los extremos cohesivos.
- Amplificacin selectiva con dos cebadores de secuencias
idnticas a cada uno de los adaptadores ms tres nucletidos
adicionales en el extremo 3, con lo que se obtiene una reduccin
drstica del nmero de fragmentos amplificados.
De esta forma se generan mltiples bandas que responden a
fragmentos de origen aleatorio en el genoma y que se resuelven en
geles desnaturalizantes de acrilamida o en analizadores de
fragmentos. Al igual que en los RAPD, para la generacin de
estos marcadores no es necesaria informacin previa, son
generalmente dominantes y no son transferibles, pero permite la
generacin de gran nmero de marcadores con pocas reacciones.
Requiere extracciones de DNA de gran calidad e infraestructura
especializada.

Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)

Esquema general del proceso

ADN genmico

Digestin con enzimas

de restriccin

Unin a adaptadores

Amplificacin selectiva

Geles de poliacrilamida o
analizadores de fragmentos

Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)

Ejemplo

Gen Run1

Repeticiones en Tndem de
Nmero Variable
(VNTR)

DNA eucaritico

Genes funcionales

DNA repetido

DNA espaciador

Secuencias sin funcin

conocida

Secuencias funcionales

Repeticiones de la
heterocromatina
centromrica

Repeticiones en Tndem
de Nmero Variable

Minisatlite

Secuencias
transponibles

Microsatlite

Repeticiones en Tndem de
Nmero Variable
(VNTR)

- Los microsatlites o SSR (Simple Sequence Repeats) se

basan en la amplificacin por PCR usando cebadores de una
regin microsatlite. El microsatlite consiste en repeticiones
de di- tri- o tetranucletidos (aunque puede ser ms
complejo) en tndem, por ejemplo, (CG)n.
- El polimorfismo en el nmero de repeticiones (n) da lugar a
fragmentos amplificados de diferente longitud. Estas
diferencias en longitud pueden ser analizadas en geles de
poliacrilamida o analizadores de fragmentos. Los primers o
cebadores estn muy conservados dentro de la especie e
incluso parcialmente entre especies afines. Se analizan por
PCR y posterior electroforesis. Muy usados en identificacin
de individuos y gentica de poblaciones.

Repeticiones en Tndem
de Nmero Variable
(VNTR)
Esquema general del proceso
MICROSATLITES

Amplificacin
por PCR

1
2
1

Electroforesis de
los productos
amplificados

Repeticiones en Tndem
de Nmero Variable
(VNTR)
MICROSATLITES

Electroforesis mostrando polimorfismo

para 3 microsatlites cuyos alelos migran
a diferentes distancias en el gel.

ADN polimrficos amplificados al azar

(RAPD)

EL polimorfismo de productos amplificados al azar

(RAPDs) es el ms sencillo de analizar. Se generan por la
amplificacin del DNA con un cebador de secuencia corta
(10-12 bases) y aleatoria, no es necesario conocimiento
previo de secuenciacion y utiliza como sustrato poco DNA.
Su sencillez y bajo coste est contrapesada por sus
limitaciones; herencia dominante, baja reproducibilidad
entre laboratorios Adems, la deteccin en geles de
agarosa puede producir resultados errneos, ya que
bandas que procedan de diferentes puntos de
amplificacin de parecida longitud sean indistinguibles y
den una sola banda en el gel. Sin embargo, la ventaja de
usar estos geles, es la sencillez con la que las bandas
pueden ser extraidas, clonadas y secuenciadas, por lo que
se obtiene la secuencia del fragmento amplificado. A partir
de sta, se puede redisear los primers para la
reproduccin de este marcador.

ADN polimrficos amplificados al azar

(RAPD)
Esquema general del proceso

ADN polimrficos amplificados al azar

(RAPD)

Electroforesis mostrando RAPD.

ANEXOS

Mapa gentico V. rupestris y V. arizonica

Doucleff et al., 2004

475 marcadores:
410 AFLP
32 RAPD
9 microsatelites (SSR)
...otros

Determinacin Sexual in Vitis spp.

Localizado en grupo de ligamiento 14 (junto a otros marcadores)

Dalb et al., 2000

277 RAPDs
25 microsatelites
12 AFLPs
...otros

PROYECTO GENOMA
Etapas

1 ) Mapas de ligamiento usando marcadores

2) Mapeo de genes relacionados
con caracteres cuantitativos
3) Desarrollo de mapas fsicos

MAPAS FSICOS
FISH: Hibridacin In Situ de Fluorescencia

MAPAS FSICOS
FISH: Hibridacin In Situ de Fluorescencia

Retrotransposn
Gret1 en V. vinifera
(Sofia Pereira et al., 2005)