UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Tema: Aislamiento, selección y preservación de cepas Azotobacter spp.

obtenidas de plantaciones de Stevia Rebaudiana usando melaza como
sustrato para la producción de un biofertilizante.

Autores:

• Andrade María José

• Correa Carina
• Cueva Patricia
• Jácome Rafael
• Simba Saskia
• Tufiño Carolina

2009
1. INTRODUCCIÓN

En la Universidad Javeriana se realizó una investigación sobre el aislamiento

de bacterias fijadoras de nitrógeno para emplearlas en un programa de
fertilización bajo un esquema de agricultura orgánica. El aislamiento se
realizó a partir del suelo de un cultivo de Stevia Reubaudiana. La bacteria
encontrada fue Azotobacter y su rendimiento se determinó con base en la
producción de biomasa y concentración de glucósidos en la planta
presentando mejor estabilidad, pigmentación, mayor velocidad de
crecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas y una producción de
A/A promedio de 38,4 mg/ml a las 150 horas. [1]

En la India se realizaron estudios para comparar un fertilizante químico y un

biofertilizante en una plantación de Stevia, mediante mediciones de fósforo
soluble con bacterias de Azospirillum, y los resultados demuestran una
eficiencia incrementando la producción de biomasa en un 53,20%. La química
inorgánica del biofertilizante cambio favoreciendo el crecimiento mas no se
demostró el aumento de glucósidos en la planta. [2]

El Azotobacter es el género que ha demostrado tener el rendimiento de

absorción más alto (72.64%) a nivel de la rizosfera comparado con
microorganismos como Azospirillum brasilense y Rhizobium analizados
también para la elaboración de biofertilizantes, fijan aproximadamente 20
mg N/g de azúcar en un cultivo de Stevia en medio libre de nitrógeno, A
maximum of 30 mg.However, Azotobacter is a poor competitor for nutrients
in soil.siendo una gran fuente para obtener un biofertilizante natural
reduciendo el uso de los fertilizantes químicos nitrogenados, tienen mayor
velocidad de crecimiento que otras cepas aisladas de cultivos diferentes
ofreciendo una mayor productividad.

El azotobacter produce fitohormonas (ácido indolacético y citoquininas)

capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas; promueve la
formación de sideróforos, sustancias antifúngicas y genera enzimas que
favorecen a la solubilización de fosfatos y oligoelementos facilitando la
asimilación de estos compuestos.
 El uso de fertilizantes químicos constituye un daño biológico a los suelos
deteriorando la calidad de los mismos: inducen el aumento de acidez y
salinidad eliminando el humus y suavizando los tejidos de la planta
provocando que ésta sea menos resistente y saludable, eliminan el
ecosistema natural de suelo desarrollando plantas más vulnerables.

La tierra se hace dependiente a los químicos incrementando los daños al

suelo y los costos de fertilización. Actualmente un fertilizante químico
nitrogenado se comercializa en $380 por sacos de 19Kg, este costo es alto
por la energía que se utiliza para su elaboración. a

El objetivo de la presente investigación es realizar el aislamiento de una cepa

fijadora de nitrógeno, Azotobacter, que pueda ser empleada para la
producción de un biofertilizante en el cultivo de Stevia rebaudiana, mediante
fermentación discontinua.

a) 1.33.5 MBtu à 1 T amoniaco anhidro.

Costo de 1MBtu = 2.20 a 5.00 USD

Costo de 1 T amoniaco anhidro = 200 USD

2. OBJETIVOS

2.1. General

Aislar, seleccionar y preservar cepas Azotobacter spp. obtenidas de plantaciones de

Stevia Rebaudiana usando melaza como sustrato para la producción de un
biofertilizante.

2.2. Específico

• Aislar cepas de Azotobacter spp de muestras de cultivos de Stevia

Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agar ashby.

• Seleccionar las mejores cepas de Azotobacter spp degradadoras de melaza

utilizando como parámetro de medición el peso seco.

• Preservar cepas de Azotobacter spp en caldo BHI por la técnica del criovial.

• Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya modificado y

caldo alternativo con melaza y establecer el más adecuado para una
producción a nivel industrial.
 • Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles las
condiciones óptimas para su crecimiento.

• Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH,

temperatura y concentración de oxígeno.

3. MARCO TEÓRICO

3.1. Stevia Rebaudiana

Es un género de plantas fanerógamas perteneciente a la familia de las asteráceas.]

Son hierbas y arbustos de la familia del girasol (Asteraceae), nativa de regiones

subtropicales y tropicales de América del Sur y América Central.

La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocida comúnmente como dulce hoja, o,

simplemente, stevia, es ampliamente cultivada por sus hojas dulces. Como un
sustituto del azúcar.

3.2. Biofertilizante

Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que

no causan daño o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden
emplearse bacterias u hongos microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian
en forma natural con las raíces de las plantas, beneficiando su crecimiento y el
rendimiento de los cultivos.

Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas y el rendimiento

de los cultivos, pero para que éstos sean beneficiados es indispensable que las
bacterias u hongos se encuentren vivos. El biofertilizante debe contener varios
millones de bacterias por gramo de soporte sólido o por mililitro, en caso de ser
acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a desarrollarse, las
bacterias se multiplicarán y colonizarán la superficie de las raíces y promoverán el
crecimiento de las plantas.

3.3. Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y
se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en
condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se
añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos
o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración
de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como
resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de
crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.

En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final

de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de
muerte (metabolitos secundarios).

3.4. Factores de crecimiento

3.4.1.Oxígeno

El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y

el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es
un gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene
aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. Debido a la influencia de los
ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de
lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el
fermentador durante el proceso.

Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada
célula individual.

3.4.2. Temperatura

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen

retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su
productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se
puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente
producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento
de los productos proteicos.

3.4.3. pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5.

Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son
liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por
lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base
cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición
del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio
de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno

Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo.
Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En
las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno
producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y,
con los azúcares que obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa
bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, el
nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de proteína en la
planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la
planta, o se exuda al suelo en la rizosfera.

Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de las leguminosas

como el Rhizobium y las libres que viven en el suelo y no necesitan la planta para
su reproducción como el Azotobacter y el Azospirillum, entre los más importantes
en agricultura.

El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, pueden sustituir

al nitrógeno químico (urea, amoníaco) sin disminuir la producción y a menor coste.

Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como biofertilizante son:

a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas, capaces de

acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas.

b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólo no lo

degradan sino que contribuyen a su enriquecimiento en nitrógeno y a su
regeneración de forma ecológica y gradual, incluso en terrenos de alta
concentración salina.

c) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y con

nitrógeno químico en un porcentaje entre el 20 y 50% del utilizado normalmente, se
consigue un aumento de producción sobre las cosechas obtenidas únicamente con
fertilizante químico al 100%. Esto es debido a que, al liberarse la bacteria de su
función fijadora de nitrógeno, produce más factores de crecimiento vegetal, En
cereales de secano, esto puede suponer el ahorro del abonado de cobertera.

d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en la raíz de la

planta, por lo que ésta crece más sana y fortalecida.

e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más accesibles a la
planta, así como factores que facilitan la absorción de oligoelementos.

f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y los climas

áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas.

g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de las raíces de

las plantas, con el consiguiente beneficio general para ésta, así como el peso de los
frutos.

h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de semillas

comparada con otros sistemas de abonado.
i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijar un 72,64%
más de nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales.

Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A corto,

medio y largo plazo en la progresiva sustitución de la fertilización química por las
bacterias naturales, totalmente inofensivas para el medio y el ser humano.

La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P

4. MARCO METODOLÓGICO

4.1 MUESTREO DEL SUELO

De la plantación de la agrícola El Edén se toman muestras de 4 hectáreas, de cada

una se toman 10 puntos al azar de dos zonas de la planta: rizosfera y la anterior a
esta, el muestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo del cultivo.

Las muestras se empacan en bolsas de papel que se colocan dentro de bolsas de

plásticos herméticas y posteriormente se transportan en coolers.

4.1.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Una vez en el laboratorio, las muestras procedentes de la rizosfera de cada

hectárea se homogenizan, lo mismo se realiza con la zona anterior a la rizosfera.

Se extrae de cada hectárea cuatro muestras para sembrar en cajas petri luego se
tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con el fin de obtener gránulos
uniformes, para realizar el aislamiento primario.

4.2. AISLAMIENTO

4.2.1. AISLAMIENTO PRIMARIA

A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realiza el

aislamiento primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; Se
colocan 20 gránulos en cajas de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para
Azotobacter spp) a una distancia aproximada de 1 cm. Las cajas se incuban a 28°C
por 7 días hasta observar alrededor de los gránulos colonias translucidas y
mucilaginosas.
4.2.2. AISLAMIENTO SECUNDARIO

El aislamiento secundario se realiza mediante siembra por agotamiento en cajas

con Agar Ashby – Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento
primario. Las cajas son incubadas por 7 días a 28°C, posteriormente se observa el
crecimiento en el medio selectivo Ashby – Sacarosa, la morfología de la colonia y de
las células por medio de la coloración de Gram.

4.2.3. PIGMENTACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada

aislamiento se realiza una siembra en agar diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato,
remplazando la fuente de carbono (sacarosa) en cajas petri para observar la
pigmentación en las colonias. La siembra se realiza tomando una colonia de cada
aislamiento y realizando un estria en toda la caja, se incuba a 28°C por 7 días y se
observa pigmentación
 4.3. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

A cada aislamiento se le realiza una caracterización con base en el comportamiento

bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol y ramnosa
también se realiza una prueba de asimilación y crecimiento en benzoato como
fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación en caldo nitrato.
 4.4. CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA TÉCNICA
DE CRIO PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V)

A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizan cultivos en erlenmeyer de 100

ml con 50 ml de caldo nutritivo, el cual se incuba a 28°C por 24 Horas con agitación
de 150 rpm. El cultivo se deposita en 10 viales de 1.5 ml de 50 % V/V de glicerol
puro estéril. Luego se mantiene en congelación a -80°C.

4.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo para Azotobacter debido a que no

contiene nitrógeno. Su ventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento es
lento, es observable a partir de los 3 – 5 días de realizada la siembra lo que implica
un mayor gasto de energía para la producción.

El caldo Pikovskaya modificado es un medio no selectivo pero permite el

crecimiento rápido de las bacterias y requiere un gasto de energía menor

En ambos casos se necesitan reactivos químicos que implican un costo alto

adecuado solo para producciones pequeñas a escala de laboratorio, por este motivo
se formula un medio de cultivo alternativo a base de melaza tomando al caldo
Pikovskaya modificado como patrón.

4.5.1. FORMULACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ALTERNATIVO (CA)

Se partió de un estudio químico de la composición de la melaza y se procedió a

sustituir los componentes del medio químicamente definido (CPM), por el medio
natural, que constituye un medio adecuado para el crecimiento de
microorganismos.

Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas (carbono y nitrógeno),

garantizando el contenido requerido por la bacteria, según el caldo Pikovskaya
modificado.

Una vez obtenida la concentración teórica de melaza necesaria para sustituir los
componentes del medio químico se realizan pruebas de crecimiento a nivel
laboratorio, para ello se siembran cepas de Azotobacter spp en CA sólido utilizando
concentraciones menores y mayores a la obtenida teóricamente. Las siembras se
realizan por triplicado.

4.5. PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO

4.6.1. REACTIVACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS

Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldo Pikovskaya modificado liquido, ideal
para el crecimiento de Azotobacter spp. La cepa madre se inocula en los tubos con
el medio, bajo condiciones de esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas.
4.6.2. OBTENCIÓN DEL PRE INOCULÓ

Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos:

1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes.

2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para
ello se evalúa el crecimiento bacteriano durante 30 horas que es el tiempo
estimado que tarda en alcanzar la fase exponencial. Se procura obtener pre
inóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-109 células/ml.

3.- Se debe dispones de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen
de medio liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 %
del volumen total a fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente
al 10% del volumen total a fermentar.

PROCEDIMIENTO

Con las cepas reactivadas anteriormente se realiza un pool bacteriano, 10 ml de

pool se inoculan en 90 ml de caldo Pikovskaya modificado (10% de volumen total a
fermentar) y otros 10 ml en 90 ml de caldo alternativo, obteniéndose un volumen
final de 100 ml de cultivo por cada caldo de fermentación. Posteriormente se
incuban a 30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces de 250 ml.

4.6.3. FERMENTACIÓN DISCONTINUA

Una vez obtenidos los preinoculos, estos se inoculan en 900 ml de CPM y 900 de
CA. Luego, son incubados a una temperatura promedio de 28°C por 72 horas. El
oxigeno se suministra utilizando un aireador para pecera con un flujo de aire
aproximado de 1 m3 /h en matraces de 2000 ml.

El esquema del proceso global de producción de Azotobacter spp a nivel de

laboratorio
4.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Se realizan una serie de corridas cinéticas en las que se evalúa la variación de pH,
la temperatura del caldo de cultivo y la concentración de biomasa. Además se
evalúa el consumo de sustrato en CPM con lo que se puede obtener las variaciones
cinéticas de crecimiento. Las muestras se toman cada tres horas durante las 72
horas que dura la fermentación. Este procedimiento se realiza tres veces

4.7.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA

Se utiliza la técnica de la determinación de biomasa por Peso seco para el CA y

CPM.

Se puede realizar la determinación por espectrofotometría del CPM ya que por el

color de la melaza es imposible de medir la absorbancia en el CA , pero para
obtener las mismas unidades de biomasa se va a realizar la determinación por peso
seco en los dos casos.

4.8. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

4.8.1. TINCIÓN GRAM

- Se preparan frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al calor.

- Se cubre el frotis con el reactivo cristal violeta durante un minuto.

- Se lava el frotis con agua durante 5 segundos, y luego se aplica el reactivo yodo
de Lugol durante un minuto.

- Se lava y se aplica el decolorante.

- Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30 segundos.

- Se lava, se seca y se coloca en el microscopio.

4.8.2. PRUEBA DE QUISTE

- Se coloca un asas del cultivo en un portaobjetos, emulsionado con agua

estéril

- Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire.

- Se coloca al microscopio con aceite de inmersión.

4.8.3. PESO SECO CELULAR (PCS g/ml)

- Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno el sobrenadante.

- Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/ml.

4.8.4. Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El peróxido de hidrógeno se

produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto
muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima
catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

En un portaobjetos se toma una muestra de la bacteria, seagrega unas gotas de

peróxido de hidrógeno al 3% y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

4.8.5. Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de

producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único
medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2.

Inocular los tubos de TSI con punta, estriar el pico con un movimiento hacia uno y
otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de
los cultivos. Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada, lactosa ni sacarosa
fermentadas. A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

4.8.6. Indol
 El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido
triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco.

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol

reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el
principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich.

4.8.7. O/F:

En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El
oxígeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones
anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo
pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad
de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido que se detecta gracias
al azul de bromotinol (indicador de pH)

4.8.8. Nitratos

Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. El

nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno).

Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito

procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y
ácido sulfanílico produciendose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede
haberse reducido a más que a nitritos produciendose gas. Si al añadir zinc en polvo
no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas
(desnitrificación).

RESULTADOS

ZONA DE CAJAS
HECTAR CRECIMIENT CEPAS
MUESTREO DEL SEMBRAD
EA O ENCONTRADAS
SUELO AS
C1 + S1 S2
R
C2 + S1 S2
1H
C3 -
ZA
C4 + S1
C5 + S2
R
C6 ± S2
2H
C7 -
ZA
C8 -
C9 + S2
R
C10 -
3H
C11 -
ZA
C12 -
 C13 + S1 S2
R
C14 + S1 S2
4H
C15 ± S2
ZA
C16 -

Simbología:

H: hectárea
R: rizósfera
Z:A: zona anterior a la rizosfera
C: caja petri
+: Buen crecimiento
±: mediano crecimiento
-: no crecimiento

CARACTERISTICAS FÍSICAS DE LAS DIFERENTES CEPAS

ENCONTRADAS
Cepa S1 Cepa S2
Color Incoloro transparente Incoloro transparente
Forma cocos Cocos
Tamaño de colonia 0.2 cm 0.4 cm
Apariencia Poco Musilaginosa Bastante Musilaginosa

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE LAS DIFERENTES CEPAS

ENCONTRADAS
Cepa S1 Cepa S2
Tinción Gram Negativas Negativas
Nitrato Positivo Positivo
TSI Positivo Positivo
O/F Aerobio Aerobio
Catalasa Positivo Positivo
Quiste Cocos - Amarillos Cocos – Amarillos

Medición del peso seco de la cepa en medio de melaza

Tiempo SI S2
18 horas 0.562 0.685

Medición del peso seco de la cepa en medio de PiKovskaya

Tiempo SI S2
18 horas 0.413 0.488

Discusiones:

• Es necesario realizar estudios sobre la capacidad fijadora de nitrógeno y la

capacidad productora de hormonas vegetales de las bacterias para poder
seleccionar las de mejor rendimiento.

• Se recomienda seguir aislando cepas en otros terrenos con el fin de obtener

un cultivo mixto apto para todo terreno.
 • Hay que considerar que la composición nutricional de la melaza va a variar
de acuerdo al origen o procedencia del mismo siendo recomendable contar
con un solo proveedor y seleccionar si es posible la melaza que posea las
mejores características nutricionales.

• La cepa S1 produjo mayor cantidad de biomasa en el medio con melaza

posiblemente por la presencia de un gen mutante, o que posee una enzima
con mayor capacidad degradadora del sustrato utilizado.

• Se recomienda hacer pruebas experimentales para ver la eficiencia de las

bacterias y la producción de la fitohormona estimulantes de crecimiento de
las plantas, puesto que por falta de tiempo no se pudo aplicar este
biofertilizante para comparar el crecimiento de una planta, con este
biofertilizante y un químico.

Conclusiones:

• Se observó que existe mayor crecimiento de bacterias azotobacter, cuando

se aísla de la zona rizosfera de la planta.

• De acuerdo a las pruebas bioquímicas realizadas se encontró que la bacteria

aislada correspondía al género azotobacter.

• Se comprueba que los microorganismos aislados del género azotobacter,

2 cepas, si degradan la melaza.

• Se verificó que existe un mayor crecimiento de biomasa en la medio

alternativo con melaza con respecto a medio picovscaya.

• Se observó que produce mayor biomasa en el medio de cultivo con melaza

la S2 que la S1, a pesar de estar sometidas a las mismas condiciones.

• La melaza por su gran riqueza nutritiva que posee resulto ser un buen medio
alternativo de cultivo para el crecimiento de azotobacter spp.

• Al utilizar en el medio de cultivo alternativo melaza como fuente de carbono

disminuye el costo, de producción de biofertilizante.

Bibliografía:

1. http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos/producción_bio
fertilizante.pdf.

2. http://www.nobelonline.net/UserFiles /File /7kdas.pdf

3. http://nostoc.usual.es/sefin/MIhttp:/tema12MI.html
4. ¨Interacción rhizobium/Azosoirllumrhizobium/azotobacter” en línea http
//www.edumicro.usual.es/sefin/rodelas.html

5. Espin,gbiología de azotobacter vinelandi Instituto de biotecnología UNAM en

línea http:
//www.microbiología.org.mx/microbiosenlínea/capitulo_09/capitulo09.pdf

6. Guiar2001”biofertilzantes” en línea:
http//coli.usual.es/web/educativo/biotec_microb/temas/29RubenIGlesiasGarci
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7. IAB Centro de investigaciones y aplicaciones

biotecnologías2001”biofertilizantes” Valencia España en línea:
http//www.iabiotec.com/respuestas.htm.