Inmovilizacion de P. Stipitis para Produccion de Etanol

INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE TIERRA BLANCA
INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
Establecimiento
de
las
condiciones
de
inmovilizacin de Pichia stipitis ACL2-1 utilizando
bagazo de caa de azcar fresco para la
produccin de etanol
PRESENTA:
Sonia Rodela Herrera
ASESORES:
Dr. Benigno Ortiz Muiz
Dra. Mara Guadalupe Aguilar Uscanga
Dr. Jos Armando Vargas Garca
Tierra Blanca, Ver., Mex.
Mayo, 2012.
i
ii
Establecimiento de las condiciones de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1

utilizando bagazo de caa de azcar fresco para la produccin de etanol
Por
SONIA RODELA HERRERA
Tesis propuesta a la
Divisin de Ingeniera de Industrias Alimentarias
del
Instituto Tecnolgico Superior de Tierra Blanca
Como requerimiento parcial para

obtener el ttulo de
Ingeniero en Industrias Alimentarias
Mayo, 2012
iii
DEDICATORIA
Mi tesis la dedico con todo mi amor y cario.

A ti Dios, por darme la oportunidad de vivir, y no abandonarme, gracias por
ayudarme a levantarme en mis fracasos, por aprender de ellos, por guiarme en mi
camino y principalmente por permitirme realizar la meta ms importante de mi
vida.
A mis padres quienes con su confianza, cario y apoyo me han convertido en una
persona de provecho, ayudndome al logro de una meta ms: mi carrera
profesional. Por compartir tristezas y alegras, regaos y consejos, xitos y
fracasos y por hacer de m lo que soy., por pasar noches en vela a mi lado, por
inculcarme valores y luchar por lo que quiero, y sobre todo por brindarme su amor
incondicional.
A mi hermana, gracias por estar conmigo siempre y apoyarme en todo momento,
por sus consejos y regaos.
A mi novio, quien me ha brindo su apoyo incondicional en los momentos ms
difciles que se me han presentado, por compartir conmigo momentos inolvidables
llenos de alegra, tristeza y enojo, por brindarme tu confianza, gracias por estar
conmigo y recuerda que siempre sers muy importante en mi vida.
A mis amigos, gracias por ser las personas ms lindas que dios me ha puesto en
mi camino, por brindarme su amistad verdadera y desinteresada, y por su
confianza brindada.
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Dr. Benigno y a la Dra. Guadalupe por darme la oportunidad de

trabajar en el laboratorio de Bioingeniera, por su paciencia brindada y gua en el
desarrollo de este trabajo.
A mis compaeros en especial a todos aquellos que compartieron conmigo
conocimientos en el laboratorio de Bioingeniera, momentos de alegra, y algunas
ocasiones de tristeza. (Betsy, Alba, Ana, Catalina, Claudia, Lorena, Alejandra,
Mara Jos, Beatriz, Francisco, Luis Enrique, Jess, Martn, Levi, Daniel, y Omar).
Tambin agradezco a mis compaeros de la carrera, por compartir momentos
maravillosos en nuestra vida como estudiantes (Emmanuel, Hugo, Madiam, Betsy,
Gabriela, Karen, Laura, Magbis, Yadira, Carmen, Irleg, Cesar, Eduardo, Jorge).
Al Dr. Jos Armando y al IBQ. Gerardo por dedicar su valioso tiempo en revisar
este trabajo y por sus aportaciones realizadas. Al MC. Ibis, Dra. Vernica y al Dr.
Adolfo, por ser muy buenos maestros y brindarme su apoyo en todo momento.
A CONACYT por el apoyo financiero para el desarrollo de este trabajo a travs del
proyecto nmero 150625 (CONACYT SENER).
RESUMEN
RODELA HERRERA, SONIA; Divisin de Ingeniera en Industrias Alimentarias,

Instituto Tecnolgico Superior de Tierra Blanca. Abril de 2012. Establecimiento de
las condiciones de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 utilizando bagazo de caa
de azcar fresco para la produccin de etanol. Asesores: Dr. Benigno Ortiz Muiz,
Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga y Dr. Jos Armando Vargas Garca.
El etanol es una opcin de biocombustible que presenta ventajas ante otros

derivados del petrleo, y que puede solucionar el gran problema que habr con el
agotamiento de los residuos fsiles. En su produccin biotecnolgica, por medio
de la fermentacin, an se sigue en la bsqueda de condiciones y cepas que
mejoren la productividad y rendimiento de etanol. Tambin se busca mejorar
caractersticas de inters industrial como utilizar diferentes sustratos y que sean
resistentes a etanol. Por otra parte, la investigacin sobre inmovilizacin de
organismos unicelulares ha generado gran inters en la comunidad cientfica,
debido a sus grandes ventajas tcnicas y econmicas respecto a la fermentacin
tradicional.
Entre
las
principales
ventajas
que
presentan
los
sistemas
biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se encuentra su facilidad para el

manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales,
un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperacin de la biomasa
para su posterior reutilizacin. El objetivo de este trabajo fue establecer las
condiciones de inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 utilizando bagazo de caa de
azcar fresco para la produccin de etanol.
Se realizaron las cinticas de crecimiento celular evaluando diferentes tamaos de

inculos: 3x106, 3x107, 3x108 cel mL-1. El incremento en el tamao de inculo de
3x106 a 3x108 cel mL-1 promovi la reduccin en el tiempo de fermentacin de 60 a
42 h. nicamente, empleando el tamao de inculo mayor se obtuvo un consumo
total de sustrato. Los parmetros obtenidos fueron; Yx/s= 0.055 gg-1, Ye/s= 0.452
gg-1, Ye/x= 8.271 gg-1, Qx= 0.08 gL-1h-1, Qp= 0.65 gL-1h-1; max= 0.127 h-1; Vs=
vi
0.971 gg-1h-1; Vp= 0.367 gg-1h-1. Para llevar a cabo la optimizacin de las
condiciones de inmovilizacin en medio con glucosa se emple el diseo de
superficie de respuesta Box-Behnken, en el cual se emplearon 3 variables: tamao
de inculo, relacin liquido-soporte y tiempo. Las condiciones de inmovilizacin
optimizadas fueron: inculo (12.2x106 cel mL-1), relacin lquidosoporte (1:23.3) y
tiempo (16 h). Adicionalmente, se evaluaron las condiciones de inmovilizacin en
bagazo de caa utilizando una relacin soporte-solucin isotnica de 1:20,
empleando tres tamaos de inoculo (3x106, 3x107 y 3x108 cel mL-1). Al inmovilizar
P. stipitis ACL2-1 slo se present adsorcin celular empleando el inculo mayor
(3x108 cel mL-1). Posteriormente, se realiz la cintica de inmovilizacin
obteniendo las mejores condiciones que fueron una viabilidad celular del 76 %,
una retencin de 19.3 mgg-1 y una eficiencia de 57 % a las 42 h. El tiempo que
dura este proceso puede ser debido a que el bagazo, al no ser pretratado,
presenta una estructura integra de la hemicelulosa cristalina, por lo que
el
proceso de adsorcin de clulas en el soporte utilizado es lento.

Los resultados obtenidos permiten sugerir que es ms recomendable inmovilizar
empleando medio de cultivo y no una solucin isotnica debido a que se obtienen
mejores parmetros de inmovilizacin.
vii
CONTENIDO
RESUMEN
CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS
V
Vii
X
LISTA DE TABLAS
Xii
1.
INTRODUCCIN.
2.
REVISIN BIBLIOGRFICA.
2.1.
Material lignocelulsico.
2.2.
Caa de azcar.
2.2.1.
Usos de la caa de azcar.
2.2.2.
Constituyentes de la caa de azcar.
2.2.3.
Variedades de la caa de azcar
2.2.4.
Principales productores de caa de azcar.
2.3.
Bagazo de caa de azcar.
2.3.1.
Composicin del bagazo de caa de azcar.
10
2.3.2.
Principal uso del bagazo de caa de azcar en Mxico.
12
2.3.2.1 Alimentacin a las Calderas.
12
2.4.
Etanol.
12
2.4.1.
Procesos productivos para la obtencin de etanol.
13
2.4.2.
Produccin de etanol a nivel mundial.
14
2.4.3.
Vas de produccin de etanol.
16
2.4.3.1 Va sinttica, reaccin de etileno con vapor.
16
2.4.3.2 Va sinttica fermentativa
16
viii
2.5.
Levaduras.
17
2.5.1.
Caractersticas morfolgicas generales.
17
2.5.2.
Reproduccin de las levaduras.
18
2.5.3.
Requerimientos nutricionales.
19
2.5.4.
Fuentes de carbono.
19
2.5.5.
Fuente de nitrgeno.
20
2.5.6.
Oligoelementos.
21
2.5.7.
El oxgeno.
22
2.6.
Metabolismo de levaduras.
22
2.6.1.
Asimilacin y fermentacin de la fuente de carbono.
22
2.6.2.
Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.
23
2.7.
Inmovilizacin de clulas.
26
2.7.1.
Problemas con la inmovilizacin de clulas.
29
2.7.2.
Mtodos
de
inmovilizacin
de
clulas
para
procesos
de
30
fermentacin.
2.7.3.
Inmovilizacin de levaduras para la produccin de etanol.
32
3.
JUSTIFICACIN.
34
4.
OBJETIVOS.
35
4.1.
OBJETIVO GENERAL.
35
4.2.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
35
5.
MATERIALES Y MTODOS
36
5.1.
Materia prima.
36
5.2.
Material Biolgico.
36
5.3.
Medios de cultivo.
36
5.3.1.
Medio de conservacin.
36
5.3.2.
Medio de fermentacin.
36
5.4.
Condiciones de cultivo.
37
5.5.
Inmovilizacin de clulas.
38
ix
5.6.
Mtodos Analticos.
38
5.6.1.
Cuenta celular.
38
5.6.2.
Determinacin de peso seco.
40
5.6.3.
Sustratos y productos.
41
5.6.3.1 Preparacin de muestras.
41
5.7.
Anlisis de datos experimentales.
42
5.7.1.
Clculo de rendimientos y productividad.
42
5.7.2.
Anlisis estadsticos.
44
5.7.2.1 Mtodo de Box Behnken.
44
6.
RESULTADOS Y DISCUSIN.
46
6.1.
Efecto del tamao de inculo.
46
6.2.
Optimizacin de las condiciones de inmovilizacin en medio con
53
glucosa
6.3.
Inmovilizacin de clulas con solucin isotnica.
62
7.
CONCLUSIONES.
64
8.
RECOMENDACIONES.
65
9.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
66
10.
ANEXOS.
73
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Estructura de la lignocelulosa.
Figura 2.
Caa de azcar.
Figura 3.
Bagazo de caa de azcar.
10
Figura 4.
Composicin del bagazo de caa de azcar.
10
Figura 5.
Estructura de a) celulosa y b) hemicelulosa (xilana y
11
arabinoxilano).
Figura 6.
Produccin mundial de Bioetanol.
14
Figura 7.
Gemacin de la levadura.
18
Figura 8.
Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.
24
Figura 9.
Cuenta celular en cmara de Thoma.
39
Figura 10.
Correlacin de peso seco y densidad ptica de P. stipitis
40
ACL2-1.
Figura 11.
Correlacin de densidad ptica y nmero de clulas con P.
41
stipitis ACL2-1.
Figura 12.
Diseo Box Behnken de tres factores.
45
Figura 13.
Crecimiento de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaos de
47
inculos.
Figura 14.
Consumo de glucosa.de P. stipitis ACL2-1 en diferentes
47
tamaos de inculos.
Figura 15.
Rendimientos de biomasa por P. stipitis ACL2-1 a diferentes
48
tamaos de inculo.
Figura 16.
Efecto del tamao de inculo sobre la produccin de etanol en
51
P. stipitis ACL2-1.
Figura 17.
Velocidades especficas de produccin de etanol por P. stipitis

ACL2-1 a diferentes tamaos de inculo.
51
xi
Figura 18.
Rendimientos de etanol por P. stipitis ACL2-1 a diferentes
53
tamaos de inculo.
Figura 19.
Graficas de contorno de retencin durante la inmovilizacin de
56
P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa empleando medio de

cultivo (glucosa).
Figura 20
Graficas de contorno de eficiencia durante la inmovilizacin de
57

cultivo (glucosa).
Figura 21
Graficas de contorno de viabilidad durante la inmovilizacin de
58

cultivo (glucosa).
Figura 22
Resultados de optimizacin de Minitab.
59
Figura 23.
Cintica de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de
60
caa fresco en las condiciones ptimas.

Figura 24
Retencin, eficiencia, viabilidad y pH de P. stipitis ACL2-1,
61
durante la inmovilizacin, utilizando como fuente de carbono

glucosa.
Figura 25
Cintica de inmovilizacin de P.stipitis ACL2-1 en bagazo de

caa de azcar sin tratamiento, utilizando solucin isotnica.
63
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.
Composicin general de la caa de azcar.
Tabla 2.
Principales estados productores de caa de azcar 2011.
Tabla 3.
Composicin del medio de conservacin.
37
Tabla 4.
Medio lquido sinttico
37
Tabla 5.
47
Velocidades globales de formacin y productividades de etanol
51
Velocidades
globales
de
formacin,
productividades
produccin de biomasa en diferentes tamaos de inculos.

Tabla 6.
en diferentes tamaos de inculos.

Tabla 7.
Variables utilizadas en la cintica de inmovilizacin de clulas
52
utilizando medio con glucosa.

Tabla 8.
Coeficientes de regresin estimados para retencin.
52
Tabla 9.
Coeficientes de regresin estimados para la eficiencia
53
Tabla 10.
Coeficientes de regresin estimados para la viabilidad.
53
Tabla 11.
Tamao de inculo para la inmovilizacin de clulas de P. stipitis
58
ACL2-1 con solucin isotnica, empleando un tiempo de 16 h.
1. INTRODUCCIN.
El etanol es un biocombustible renovable producido por la fermentacin de

azcares. Sin embargo, el costo del etanol como fuente de energa es
relativamente alto comparado con los combustibles fsiles. Una fuente potencial
para la produccin de etanol a bajo costo son los materiales lignocelulsicos como
pastos, aserrn, astillas de madera y residuos slidos de la Industria Alimentaria
(Sun et al, 2002); entre ellos, el bagazo de caa de azcar es un producto de
desecho de los ingenios azucareros. Dentro de la industria alimentaria, la
inmovilizacin de microorganismos en soportes naturales o sintticos proporciona
estabilidad a las funciones celulares. Esta tcnica permite alcanzar una mayor
densidad celular, as como la reutilizacin como biocatalizador y la implantacin de
sistemas continuos de produccin.
En el presente documento, el objetivo principal fue evaluar los diferentes tamaos
de inculos para la produccin de etanol, establecer las condiciones de
inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 en el bagazo de caa de azcar y emplear un
diseo de superficie de respuesta (Box Behnken).
Posteriormente se presenta detalladamente una revisin bibliogrfica, los
materiales y mtodos empleados y los resultados obtenidos de evaluar el tamao
de inculo, las condiciones de inmovilizacin empleando un diseo de superficie
de respuesta (Box Behnken) y las condiciones de inmovilizacin empleando una
solucin isotnica.
Finalmente, se presentan las conclusiones y recomendaciones del presente
proyecto.
2. REVISIN BIBLIOGRFICA.
2.1 Material lignocelulsico.
La biomasa lignocelulsica (material vegetal) ha sido reconocida como una fuente
potencial de azcares a bajo costo para la produccin de etanol, debido a que, por
su origen, est disponible en grandes cantidades y es ms barata que el maz.
Estos suministros celulsicos incluyen rastrojos de maz, trigo, arroz, bagazo de
caa de azcar, pastos, etc. Los materiales lignocelulsicos estn formados de
tres polmeros principales: celulosa, hemicelulosa y lignina, ver Figura 1. La
organizacin estructural exacta de esos polmeros depende de la variedad y el tipo
de planta (Pandey et al., 2000).
Figura 1. Estructura de la lignocelulosa.
La celulosa est constituida por molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos. Estas cadenas estn enlazadas dentro de las microfibrillas por
puentes de hidrgeno y constituyen la estructura de soporte principal de la pared
celular de las plantas. Por su constitucin rgida, se requiere de un tratamiento
2
severo para romperla. Los otros polmeros forman una matriz entre las uniones de
celulosa proporcionando la fuerza y rigidez del complejo. La lignina es el nombre
general para un grupo de polmeros constituidos por alcoholes aromticos que
imparten fuerza considerable a la estructura de la pared celular. Es
extremadamente difcil de degradar y con la tecnologa disponible hasta ahora es
prcticamente imposible fermentar a etanol (Kuijper, 2006). La hemicelulosa es
ms diversa que la celulosa, es un polisacrido que consta de cadenas de
azcares cortas, lineales y altamente ramificadas. En contraste con la celulosa, la
cual es un polmero de D-xilosa, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa y L-arabinosa
(Chandel et al., 2007).
2.2 Caa de azcar.

La caa de azcar (Saccharum officinarum) es una gramnea tropical, un pasto
gigante emparentado con el sorgo y el maz, tiene un tallo macizo de 2 a 5 metros
de altura con 5 6 cm de dimetro. El sistema radicular lo compone un robusto
rizoma subterrneo; El tallo acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al
ser extrado y cristalizado en el ingenio forma el azcar. La sacarosa es
sintetizada por la caa gracias a la energa tomada del sol durante la fotosntesis
con hojas que llegan a alcanzar de dos a cuatro metros de longitud. En su parte
superior encontramos la panocha, que mide unos 30 cm de largo.
La caa de azcar se cultiva actualmente en prcticamente todas las regiones
tropicales y subtropicales del mundo. La parte ms importante es su tallo, del cual
se extrae jugo dulce que se utiliza para la elaboracin de sacarosa. La produccin
de caa de azcar en Mxico se desarrolla bajo diversas condiciones, todo esto
se debe a la amplia distribucin geogrfica que tiene el pas y de otros factores
que inciden. Las caractersticas del clima, los elementos socioeconmicos y la
competencia de otros cultivos son aspectos que en cada regin caera toman
particular importancia. La calidad de la materia prima que se recibe en el ingenio
depende de diferentes factores agrcolas relacionados, tanto en el cultivo como
3
en la cosecha de caa. En cuanto al cultivo se puede comentar que van desde la

variedad hasta el tipo de suelo en el que la siembra, los niveles de fertilizacin, el
rgimen de lluvias, el riego, el clima, etc., y en la cosecha los factores son
esencialmente las materias extraas que aparecen, desde el alza hasta la
introduccin de las mquinas cortadoras.
Los principales factores que caracterizan el campo caero mexicano y que
condicionan su comportamiento son los siguientes:
La superficie cultivada por productor.
La clase de tierra y el tipo de cultivo.
Los rendimientos por unidad de superficie.
La organizacin de la produccin.
La aplicacin de fertilizantes en los campos caeros.
Los costos de produccin de la caa de azcar.
La competencia con otros cultivos.
El sistema de pago de la caa de azcar.
Las
superficies
cultivadas
con
caa
de
azcar
se
han
establecido
predominantemente en reas de temporal, aprovechando el amplio espectro de

condiciones de humedad en el suelo, bajo las cuales este cultivo se desarroll,
desde que se planta el esqueje hasta que se llega el ptimo de madurez (el cual
coincide con la mxima acumulacin de sacarosa en la caa), a los cultivos que
complementan este ciclo se les llama plantilla y despus del primer corte al
segundo se le denomina soca. Ya en el tercer corte al ao siguiente y los cortes
al segundo se les llama resoca dos, para Mxico se recomienda que se realicen
como mximo cinco cortes ya que el rendimiento de jugo de caa va
disminuyendo. La produccin del cultivo por unidad de superficie se le conoce
como rendimiento en campo, y un indicador que mide la cantidad de caa que se
obtiene por hectrea, vara segn las zonas del pas (Valdez Barrn et al., 1998).
En la Figura 2 se muestra la caa de azcar.
Figura 2. Caa de azcar.
2.2.1 Usos de la caa de azcar.

Se utiliza preferentemente para la produccin de azcar, adicionalmente se puede
utilizar como fuente de materias primas para una amplia gama de derivados,
algunos de los cuales constituyen alternativas de sustitucin de otros productos
con impacto ecolgico adverso (cemento, papel obtenido a partir de pulpa de
madera, etc). Los residuales y subproductos de esta industria, especialmente los
mostos de las destileras contienen una gran cantidad de nutrientes orgnicos e
inorgnicos que permiten su reciclaje en forma de abono, alimento animal, etc. En
este sentido es importante sealar el empleo de la cachaza como fertilizante, las
mieles finales y los jugos del proceso de produccin de azcar pueden emplearse
para la produccin de alcohol, lo que permite disponer de un combustible lquido
de forma renovable y la incorporacin de los derivados tradicionales (tableros
aglomerados, papel y cartn, cultivos alternativos para alimento animal y mieles
finales). Una pequea parte la produccin de caa de azcar tiene fines de
produccin de piloncillo, el cual se obtiene de la concentracin y evaporacin libre
del jugo de la caa, tambin es conocido como panela. El piloncillo tiene varios
usos, como materia prima en la industria de la repostera, pastelera, y como
endulzante en diversos alimentos y tambin se usa para la elaboracin de alcohol
y otros licores. Otra cantidad de caa an ms pequea se utiliza como fruta de

estacin (http://w4.siap.gob.mx/sispro/Integra/Caracteristicas/CanaAzu.html)
2.2.2 Constituyentes de la caa de azcar.
El tronco de la caa de azcar est compuesto por una parte slida llamada fibra
y una parte lquida, el jugo, que contiene agua y sacarosa. En ambas partes
tambin se encuentran otras sustancias en cantidades muy pequeas como se
pueden observar las proporciones varan de acuerdo con la variedad (familia) de
la caa, edad, madurez, clima, suelo, mtodo de cultivo, abonos, lluvias, riegos,
etc. Sin embargo, unos valores de referencia general se muestran en la Tabla 2.1.
La sacarosa del jugo es cristalizada en el proceso como azcar y la fibra
constituye el bagazo una vez molida la caa.
Tabla 1. Composicin general de la caa de azcar (Chen, 1998).
Componente
% (w/w)
Agua
73-76
Sacarosa
8-15
Fibra
11-16
Glucosa
0.2-0.6
Fructosa
0.2-0.6
Sales
0.3-0.8
cidos Orgnicos
0.1-0.8
Otros
0.3-0.8
2.2.3 Variedades de la caa de azcar.

Las variedades se distinguen por tipos de colores:
El de las caas verdes y amarillas, como la criolla y la cristalina
El relativo a las moradas y las coloradas, como la violeta.
La veteada o rayada como la listada.

6
La caa criolla cuya clasificacin botnica es Saccharum offinarum, es la variedad

que trajo Hernn Corts. Es la ms antigua y la ms repartida en la Repblica
Mexicana; posee un jugo abundante y de la mayor riqueza en sacarosa, estando
dotada de gran vitalidad, pues a pesar de su larga estancia en nuestros campos,
no ha degenerado en lo ms mnimo. No obstante, tiene el inconveniente de que
es muy sensible a los extremos de calor y fro. Llega a alcanzar 3.5 m de altura.
La Caa Cristalina que es la Saccharum lubridatium suelen adquirir sus tallos

hasta 6.5 metros. El nombre de Cristalina procede del aspecto de su tallo, cuyos
cautos estn cubiertos de una capa de vello blanquecino que le comunican
brillantes reflejos; el color de sus hojas, es de un verde ms oscuro que el de las
otras variedades. Este tipo de caa es robusto y tiene mayor resistencia a las
adversas condiciones meteorolgicas; pero tiene el defecto de ser muy dura,
exigiendo con este motivo mayor gasto de energa en los trapiches. Se cultiva esta
variedad en los estados de Morelos, Puebla y en algunas zonas de Campeche.
La Caa Violeta o Saccharum violaceum tiene los tallos con una coloracin violeta
y las hojas ofrecen un color verde intenso. Tiene la ventaja de resistir mejor que
las otras a las bajas de temperatura. Una de sus desventajas es su tendencia a
secarse rpidamente y ser menos jugosa que sus congneres.
La Caa Veteada pertenece al grupo Saccharum versicola y alcanza una altura de

unos 3.5 metros; resiste muy bien a los efectos del fro, y se distingue de las otras
por su agradable aspecto rayado de amarillo y rojo violeta. Las variedades se
agrupan en claves y estn compuestas por letras y nmeros. Las letras sealan el
lugar de origen de la variedad y el nmero al ao cuando fue producida y a la serie
que corresponde. (w4.siap.gob.mx/sispro/portales/agricolas/cania/Descripcion2008.pdf)
2.2.4 Principales productores de caa de azcar.

Los principales productores de caa de azcar son: Veracruz, Jalisco, Oaxaca,
San Luis Potos, Tamaulipas, Chiapas, Morelos, Puebla, Quintana Roo y Nayarit.
El estado de Veracruz sobre sale en comparacin con los estados mencionados,
al obtener 4, 765, 133 toneladas; sin embargo, el rendimiento que se obtiene es
inferior al registrado en Morelos: 115.383 toneladas por hectrea Sinaloa donde
se tienen rendimientos de 113.024 toneladas por hectrea, como se muestra en la
Tabla 2.
2.3 Bagazo de caa de azcar.

El bagazo de caa es un desecho fibroso, residuo del tallo o cuerpo de la caa de
azcar (Saccharum officinarum) que se genera despus de haberle exprimido el
jugo durante la produccin de azcar (Figura 3). Por cada tonelada de caa de
azcar que se muele se producen aproximadamente 259 kg de bagazo de caa.
La agroindustria azucarera es de gran relevancia en la mayora de las reas
tropicales y subtropicales. En Mxico existen 56 ingenios azucareros, de los
cuales 21 se encuentran en el Estado de Veracruz. Anualmente se producen
alrededor de 50 millones de toneladas de caa de azcar que se destinan a la
produccin
de
azcar.
De
la
produccin
nacional,
Veracruz
aporta
aproximadamente el 40%, de los cuales genera 4.9 millones de toneladas de

bagazo de acuerdo a los datos proporcionados por la Unin Nacional de caeros,
A.C.-CNPR (www.caneros.org.mx). El bagazo, generalmente se apila en el
exterior el ingenio para posteriormente ser utilizado en la produccin de energa
para autoconsumo. No obstante, se tiene la posibilidad de obtener diversos
metabolitos de inters como el etanol, xilitol, furfural, papel, alimento animal, entre
otros, a partir de este residuo (Noa, 1986).
Tabla 2. Principales estados productores de caa de azcar 2011. (Fuente:

Servicio de Informacin Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) con datos del Sistema
de Informacin Agroalimentaria de Consulta (SIACON).
Estado
Superficie (ha)
Siniestrada
Produccin
Rendimiento
(ton)
(ton/ha)
Obtenida
Obtenido
Sembrada
Cosechada
CAMPECHE
10,415
615
34,141
55.500
COLIMA
13,619
5,427
451,679
83.234
CHIAPAS
29,835
10,889
934,297
85.802
JALISCO
71,703
27,854
2,449,160
87.930
MICHOACAN
14,985
4,494
317,258
70.604
MORELOS
17,818
6,214
716,954
115.383
NAYARIT
33,546
6,938
550,074
79.284
OAXACA
61,206
24,657
1,605,374
65.109
PUEBLA
16,174
6,221
676,903
108.809
QUINTANA ROO
27,384
9,641
588,548
61.046
SAN LUIS POTOSI
68,787
23,646
1,553,533
65.700
SINALOA
21,748
2,210
249,784
113.024
TABASCO
31,817
1,138
72,329
63.558
TAMAULIPAS
58,238
12,781
1,016,866
79.561
VERACRUZ
264,831
69,696
756
4,765,133
68.370
TOTAL
742,106
212,419
764
15,982,033
75.238
Figura 3. Bagazo de caa de azcar.
2.3.1 Composicin del bagazo de caa de azcar.

El tallo de la caa de azcar est constituida por dos partes: una esponja central
llamada mdula, que es la que realmente se exprime, y una fibrosa, perifrica
denominada corteza. El bagazo es un material fibroso, heterogneo en cuanto a
su composicin granulomtrica y estructural, que presenta
relativamente baja
densidad y un alto contenido de humedades. En la Figura 4 se muestra la

composicin de materiales aprovechables del bagazo (Aguilar-Uscanga et al.,
2005).
Celulosa
10%
30%
40%
Lignina
Hemicelulosa
Otros
20%
Figura 4. Composicin del bagazo de caa de azcar

10
La mayor fraccin de estos residuos est compuesta por celulosa, la cual puede
ser convertida en glucosa, (ver Figura 5), que es la fuente de carbono ms comn
en las fermentaciones (Neureiter et al., 2002).
a)
b)
Figura 5. Estructura de: a) celulosa y b) hemicelulosa (xilana y arabinoxilano)

(Roubroeks et al., 2001).
11
2.3.2 Principal uso del bagazo de caa de azcar en Mxico.

2.3.2.1 Alimentacin a las Calderas.
Uno de los principales usos que se le da al bagazo de caa de azcar es para la
alimentacin de calderas. El bagazo es llevado directamente de los molinos a las
calderas por transportadores de arrastre y se alimenta mecnicamente a las
calderas. El dispositivo mecnico ms simple consiste en una tolva dotada de
una compuerta contrabalanceada. Los alimentadores rotativos estn constituidos
por tambores movidos mecnicamente que sella la apertura todo el tiempo
mientras gira y entrega el bagazo a los hornos.
Los dispositivos automticos que regulan la cantidad de bagazo alimentado a las
calderas se han vuelto muy comunes. Los transportadores de velocidad variable
operando en forma conjunta con un equipo automtico de control de la
combustin mantienen una alimentacin uniforme, una adecuada relacin
aire/combustin y una buena eficiencia de la caldera.
2.4 Etanol.
El etanol es el biocombustible ms ampliamente utilizado hoy en da los Estados
Unidos, Brasil, Japn, Colombia, India y la Unin Europea; millones de litros se
agregan al ao a la gasolina para mejorar el rendimiento de los vehculos y
reducir la contaminacin atmosfrica. El etanol es un alcohol y su mayor parte se
produce
convirtiendo
los
azcares
en
etanol
por
fermentacin,
que
posteriormente es destilado en su forma final. El etanol se utiliza para aumentar el

octanaje de la gasolina y mejorar la calidad de sus emisiones, como la mezcla
E10 (10% de etanol y 90% de gasolina) pero puede ser usado en
concentraciones mayores, tal como la mezcla E85 o en su forma pura (Cabrera et
al., 2000).
12
2.4.1 Procesos productivos para la obtencin de etanol.

La produccin de etanol a partir de la agroindustria azucarera obliga a la
integracin de la destilera con la produccin de azcar. Esto aumenta el potencial
de aplicacin no slo de las mieles finales, sino tambin de los jugos, mieles y el
bagazo en la produccin biotecnolgica de energticos.
Se pueden emplear otras alternativas de materias primas del proceso azucarero
como stas: que representan ventajas en el ahorro de mieles, disminucin en el
consumo de combustible, incremento en la calidad del azcar y una mayor
integracin tecnolgica azcar-derivados dentro del complejo agroindustrial. En un
sentido general, las opciones de produccin de etanol, a partir de la caa de
azcar, son las siguientes (Murtagh, 2003):
A travs el uso de las melazas, tal como se estila en Mxico y en la mayora

de los pases azucareros.
Utilizar mieles intermedias A y B, con importantes aumentos del

rendimiento y para bebidas de calidad.
Emplendose para este fin directamente el jugo o guarapo. Esto se realiza

en destileras autnomas; prescindindose, entonces, del rea de
produccin de azcar.
Aprovechamiento de jugos pobres (maceracin y filtrados).
Fermentacin de azcares de la biomasa caera (bagazo o residuos de

cosecha).
La obtencin de alcohol de melazas (A, B, o C) se diferencia de otras materias

primas, como maz, papa, milo y otros, en que stos son productos de plantas con
alto contenido de carbohidratos almacenados en la forma de almidn. Por lo tanto,
estos materiales deben pasar por un proceso de pretratamiento de coccin o
tratamiento enzimtico para hidrolizar stos hacia azcares fermentables. En
contraste, los carbohidratos presentes en las melazas ya se encuentran
disponibles y no requieren tratamiento, con un fundamento en las propiedades que
13
tienen algunos microorganismos de metabolizar azcares y producir como residuo,

alcohol etlico.
Para el caso particular de hidrlisis de materiales lignocelulsicos de la caa de
azcar o ruptura de molculas en medio acuoso, tiene como finalidad la
transformacin de azcares complejos (polisacridos) en carbohidratos sencillos.
Esto se logra con cido sulfrico o clorhdrico a altas temperaturas y tiempos de
operacin cortos o largos; el cido acta como catalizador y se obtiene una
mezcla de glucosa y xilosa con algunos productos de degradacin como cido
actico, furfural y derivados de la ruptura de la lignina (Canizalez, 2001; Krishna,
2000).
2.4.2 Produccin de etanol a nivel mundial.

La produccin de etanol est encabezada a nivel mundial por los Estados Unidos
(48%), Brasil es el segundo productor con 42% de produccin, en tercer lugar est
China y le siguen pases como Canad y Francia (ver Figura 6).
Francia, 1%
Canad, 2%
Alemania, 1%
Tailandia, 1%
Colombia
, 1%
China, 4%
Estados Unidos,
48%
Brasil, 42%
Figura 6. Produccin mundial de Bioetanol, Biofuels Platform (2007).

14
Los procesos biolgicos para la obtencin de etanol, pueden realizarse con la

ayuda de enzimas, bacterias o levaduras, dependiendo del tipo de materia prima
que se utilice, por ejemplo en el caso de Estados Unidos, la produccin de etanol,
se lleva a cabo a partir de almidn, usando maz como fuente de carbono, donde
se utilizan enzimas para degradar los almidones y tener acceso a los azcares
simples para el proceso fermentativo. Posterior a esta etapa se lleva a cabo la
fermentacin. En el caso de Brasil, se utiliza el jugo de caa, en Francia y otros
pases se usan la remolacha, el trigo, las melazas de soya y la yuca entre otros.
(Snchez y Cardona, 2008).
En Mxico la produccin de etanol, se lleva a cabo principalmente en 12
destileras a partir de las melazas, residuales del proceso de obtencin de azcar
de caa. La produccin de etanol es de 6x107 L, con un rendimiento de 230-250
L/TM (Litros/Toneladas Mtricas) de Melaza procesada. Con grandes cantidades
de mieles intermedias como efluentes adems de vinazas, las cuales representan
una oportunidad para la produccin de etanol. Dos de los ingenios productores de
etanol ms importantes estn en Veracruz, la Gloria y San Nicols y producen
115,000 L da-1 de etanol, 1 Ton de caa genera 55 kg de miel intermedia B, que
a su vez puede producir 8.25 kg de azcar y el resto de miel final (melaza): los
efluentes de vinazas son mayores a 750 millones de litros con restos de azcares
y levaduras (11Bx) los cuales son desechados presentando un problema de
contaminacin ambiental. La produccin de caa de azcar a nivel nacional
represent 13,000 millones de pesos en 2010, miles de familias viven del cultivo
de la caa de azcar y existen asociaciones y sindicatos que hacen ms costosos
los procesos de produccin. (Unin de caeros AC, CNPR, 2007).
15
2.4.3. Vas de produccin de etanol.

2.4.3.1 Va sinttica, reaccin de etileno con vapor.
En la siguiente ecuacin muestra el proceso de produccin de etanol por va
sinttica, que es utilizada para producir etanol. El cual posteriormente es utilizado
en diferentes procesos industriales.
C2H4
H2O
C5H5OH
2.4.3.2. Va fermentativa.
El proceso para la produccin de etanol por va fermentativa tiene dos etapas
fundamentales: la fermentacin y la destilacin.
La fermentacin es la etapa principal del proceso, no solo porque en ella se
produce el etanol, sino porque se reproduce la masa fundamental de levadura y
adems por formarse aqu los productos secundarios. En la etapa fermentativa se
emplean diferentes tipos de nutrientes, los ms utilizados en Cuba son urea y
sulfato de amonio como suministradores de nitrgeno; como aportador de fsforo
se emplea el fosfato dibsico o simplemente fosfato de amonio. En la siguiente
ecuacin, se muestra el proceso de transformacin cuantitativa de la glucosa en
etanol y bixido de carbono.
C6H12O6
2CH3CH2OH
2CO2
2H2O
2.5. Levaduras.
Las levaduras son hongos unicelulares que producen colonias opacas, cremosas
o pastosas. La reproduccin vegetal tiene lugar habitualmente por gemacin. En
comparacin con otros grandes grupos de microorganismos, las levaduras
presentan escasa diversidad (39 gneros, 350 especies). No constituyen una
16
cantidad taxonmica propiamente dicha. Este grupo est formado por especies
relacionadas con distintos grupos de hongos filamentosos. Muchos hongos
pueden presentar dos fases: miceliar y unicelular. Las levaduras slo se presentan
en forma de clulas aisladas o, con mucho, pseudomicelios.
2.5.1. Caractersticas morfolgicas generales.

Las caractersticas generales de las levaduras por las que se las diferencian entre
s son ms bien morfolgicas. La reproduccin vegetal tiene lugar habitualmente
por gemacin como se observa en la Figura 7, tambin se reproducen de manera
sexuada formando ascosporas o slo asexualmente por gemacin o divisin
binaria. El punto de sexualidad puede ser homolactica o heterocclica y da por
resultado la formacin ya sea de cuatro o de ocho esporas en saco que recibe el
nombre de asco, de ah el nombre de ascosporas (Julian, 2001). Las levaduras
tienen forma elptica, aunque algunas veces son alargadas o esfricas. Cada una
de las especies tiene forma caracterstica, pero an en los cultivos puros, las
clulas ofrecen notable variedad en el tamao y la forma, segn la edad del cultivo
y el medio en que se desarrolla su tamao es mayor que el de las bacterias,
pueden medir entre 1 y 5 micras de ancho por 5 a 30 micras de longitud.
17
Figura 7. Gemacin de la levadura.
2.5.2. Reproduccin de las levaduras.

Se reproducen por ascosporas o slo asexualmente por gemacin o divisin
binaria. En observacin microscpica se les distinguen a primera vista por no
poseer pigmentacin verde, de los protozoos por presentar pared rgida y ser
inmviles, y de las bacterias por presentar un tamao mucho mayor, ya que las
levaduras son organismos eucariotas. La mayora de las levaduras se reproducen
principalmente mediante gemacin, la clula madre forma una zona de
crecimiento hacia el exterior, la que finalmente se separa como clula hija.
(Julian, 2001).
18
2.5.3. Requerimientos nutricionales.

Los requerimientos nutricionales de las levaduras, son un factor importante a
cubrir ya que de ello depende una propagacin adecuada y al mismo tiempo una
fermentacin o produccin de etanol eficiente. Las levaduras requieren sustancias
bsicas para realizar los procesos bioqumicos, en proporciones y relaciones
ptimas. Estos comprenden los elementos bsicos al igual que todos los
microorganismos (Carbono, Hidrgeno, Oxgeno, Nitrgeno, Fsforo y Azfre) y
algunas sales (K, Na, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cu, Co) y vitaminas (B1, B5, B6,
Biotina, etc.) (Walker, 1998). De estos elementos los que se consumen en mayor
proporcin durante la fase de crecimiento, son la fuente de carbono, la cual, la
clula deber tomar de su ambiente cercano.
2.5.4. Fuentes de carbono.

Las levaduras son microorganismos anaerobios facultativos, capaces de
metabolizar diferentes fuentes de carbono, como azcares simples, polioles,
cidos orgnicos y cidos grasos, alcoholes alifticos y varios compuestos
heterocclicos y polimricos. La capacidad de metabolizar diferentes fuentes de
carbono, para la obtencin de ATP, su selectividad por los diferentes nutrientes,
vara de especie a especie y se relaciona con los diferentes nichos en los que
habitan. Es esta capacidad de metabolizar diferentes sustratos lo que las hace
tan interesantes para diversos procesos industriales (Walker, 1998).
El azcar ms comn es la glucosa sin embargo, esta no se encuentra sola en la
naturaleza, generalmente se encuentra en la sacarosa. Existen materias primas
complejas que contienen diversos azcares como fuentes de carbono. El azcar
es principalmente producido a partir de la caa de azcar, la cual se cultiva en la
mayora de las regiones tropicales del mundo. Los azcares son la principal forma
de carbohidratos y probablemente son encontrados en casi todas las plantas
verdes, tambin se encuentran en cantidades significativas en la mayora de las
19
frutas y vegetales. Hay tres azcares simples principales, la sacarosa, la glucosa

y la fructosa. La sacarosa es de hecho la combinacin de una molcula de
glucosa y una de fructosa, y una vez dentro del organismo esta se degrada a los
azcares simples. El azcar se produce generalmente de caa de azcar, maz,
remolacha y yuca, entre otros, pero en la mayora de los pases, la caa es usada
para la produccin de azcar, ya que son considerados varios aspectos como: el
costo total, los efectos ambientales, la velocidad de produccin de azcar y el
porcentaje de sacarosa presente en las diferentes materias primas (Chauhan et
al, 2011). El azcar producido se obtiene principalmente de tres tipos de jugos:
Jugo de caa producido por molienda y clarificacin (93% pureza).
Jugo de la remolacha producido de la difusin de azcar de remolacha y

purificacin (92% pureza).
Solucin de hidrolizado de maz producido despus de la sacarificacin

(hidrlisis) y filtracin (95%pureza) (Chauhan et al, 2011).
Del proceso de produccin de azcar, adems hay varios subproductos como la

cachaza, la miel intermedia A y B, resultante de los primeros pasos de
cristalizacin, y la melaza final que es la miel final despus de la tercera
cristalizacin, la cual ha sido utilizada por muchos aos. Se han empezado a
utilizar directamente los jugos de caa (Garca et al, 2011).
2.5.5 Fuente de nitrgeno.

La fuente de nitrgeno pueden ser compuestos como cido glutmico, sales de
amonio, o bien directamente de una mezcla de aminocidos, estas opciones han
sido probadas por Albers et al. (1996), quien report que la mejor opcin es usar
una
mezcla
de
aminocidos,
sin
embargo,
esta
no
es
una
opcin
econmicamente viable para cantidades industriales, por lo cual, frecuentemente

se recurre a opciones como el sulfato de amonio y sulfato diamnico. En el caso
de las levaduras, puede formarse el cido glutmico a partir del in amonio, el
20
cual es importante en la sntesis de aminocidos en la clula, adems de

proporcionar al mismo tiempo azufre y fsforo; aunque la asimilacin de la fuente
de nitrgeno puede variar dependiendo de la cepa en cuestin y de algunas otras
condiciones de cultivo (Aguilar, 1998).
2.5.6. Oligoelementos.
Existen algunos minerales que son esenciales para el crecimiento de clulas, en
cantidades de trazas menores a 0.1%, y que en exceso son txicos para la clula.
En el caso del magnesio por ejemplo, existen reportes de que participan en
funciones fisiolgicas, ya que participan como co-factor de al menos 300 enzimas,
en funciones como la divisin celular, y de la ruta glicoltica, ayuda a incrementar
o disminuir del intercambio de iones y por ende la permeabilidad de la membrana
plasmtica interactuando con los fosfolpidos de la membrana y dando como
resultado la estabilizacin de la bicapa lipdica de la misma, adems participa en
los sistemas de sealizacin de la membrana. Se cree que el magnesio, est
implicado de los efectos de liberacin o deteriorativos del estrs por etanol en las
levaduras (Walker, 1998). Un caso similar tiene la presencia de sales de potasio,
participando como reguladores de la concentracin osmtica de las clulas, por lo
que se cree que es el mineral cuantitativamente ms importante en las levaduras.
Otros elementos indispensables para el crecimiento son el manganeso y el zinc.
En el caso del zinc en conjunto con el magnesio, participan como co- factores del
crecimiento y en la funcionalidad de enzimas de la ruta glicoltica, as como
moduladores del estrs (Walker et al., 2006).
El fosforo es otro elemento necesario para el crecimiento y el proceso de
fermentacin en las levaduras, adems mantiene la integridad de la pared celular
y participa generalmente en el metabolismo energtico de los microorganismos,
adems participa en la sntesis de lpidos y carbohidratos. Este elemento
generalmente se agrega en la forma de sales como el fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) o hidrgeno de fosfato di-sdico (Na2HPO4) (Walker et al.,
21
2006). Sin embargo cuando hay exceso de algunas sales, se presenta estrs por
aumento en la presin osmtica, lo que ocasiona la produccin de metabolitos no
deseados en el caso de la fermentacin alcohlica.
2.5.7. El oxgeno.
El oxgeno es un factor de crecimiento importante para las levaduras, este es
necesario para las reacciones de oxidacin de la biosntesis de esteroles y cidos
grasos insaturados, mismos que forman parte de las membranas. O bien son
necesarios, para la respuesta al estrs. Las levaduras se pueden clasificar en
base a su capacidad para desarrollarse en presencia de oxgeno como:
Aerobias estrictas.
Aerobias facultativas.
En este tipo de microorganismos no existen levaduras anaerobias estrictas.

Adems participan en combinacin con la concentracin de sustrato presente en
el medio como represor o activador del metabolismo respiratorio y fermentativo de
las levaduras, mismos que son de suma importancia para obtener los
rendimientos adecuados ya sea de clulas o bien de productos de fermentacin
en los procesos industriales (Walker, 1998).
2.6. Metabolismo de levaduras.

2.6.1. Asimilacin y fermentacin de la fuente de carbono.
Existen diferentes rutas metablicas involucradas en el metabolismo del carbono
y la generacin de energa. El fundamento de cmo son reguladas estas rutas se
conoce como metabolismo de azucares y permite optimizar rendimientos de
biomasa y fermentacin as como la produccin de metabolitos de inters y con
ello el mejor aprovechamiento biotecnolgico (Walker, 1998).
22
El catabolismo de los azucares se lleva a cabo por la ruta de glucolisis, en el

citoplasma, para generar energa para la clula y poder reductor (NAD+),
partiendo de la glucosa (hexosa), por reacciones oxidativas realizadas por varias
enzimas; mismas que sirven como reguladoras de estas reacciones, en respuesta
a varios factores activadores o inhibidores de las reacciones (Dawes, 1986).
Durante la primera parte de esta catlisis, se consume energa en la forma de
ATP, generando azcares intermediarios ms pequeos. Estos intermediarios
podrn desviarse a la ruta metablica de la gluconegnesis, adems en las
ltimas etapas se produce ATP y treosas, hasta llegar al piruvato. El piruvato a su
vez podr convertirse en acetaldehdo y posteriormente a etanol o bien en Acetil
Co-A y entrar al ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA) donde finalmente se
oxidar a CO2 y agua (Figura 8).
2.6.2. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.

El organismo es el principal activador o represor del metabolismo respiratorio o
fermentativo de las levaduras, es el responsable de la presencia o ausencia de
efectos como el Pasteur, Crabtree, y Custer. El metabolismo de tipo respiratorio,
de las levaduras es un proceso catablico en el cual el aceptor final de electrones
es el oxgeno, y el metabolismo de tipo fermentativo, en el cual el aceptor final de
electrones es un compuesto orgnico. El metabolismo respiratorio, genera
produccin de biomasa, al utilizar el ATP, para la sntesis de componentes de la
clula (Figura 8). Mientras que el metabolismo fermentativo, degradar el piruvato
a compuestos orgnicos como el etanol, CO2, reoxidando el NADH a NAD+,
(regeneracin que resulta primordial para mantener el balance redox y controlar la
glucolisis) y con la participacin de la piruvato descarboxilasa, enzima reguladora
de esta reaccin. Las levaduras son capaces de asimilar directamente los
azcares simples como glucosa y fructosa, seguido de su paso a travs de la
membrana plasmtica. Los azcares simples son transformados en alcohol y
CO2. (Figura 8) en el metabolismo fermentativo, el cual se resume en la siguiente
ecuacin (Dawes, 1986; Walker, 1998):
23
Figura 8. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.

Las flechas gruesas indican flujo preferencial y las flechas delgadas flujo limitado.
1: Transporte de piruvato a la mitocondria, 2: complejo piruvato deshidrogenasa,
3: Piruvato descarboxilasa, 4: Alcohol deshidrogenasa, 5: Acetaldehdo
deshidrogenasa, 6: Acetil CoA sintetasa (citoplasmtico), 7: Acetil CoA sintetasa
(mitocondrial), 8: Transporte de acetil CoA mediado por la va carnitina.
Formacin de steres, 9: Acetiltransferasa, 10: ster sintasa. (Adaptado de Bai et
al., 2008).
24
Glc + 2ADP + 2Pi + 2 Etanol + 2CO2 + 2ATP + 56 Kcal.
Entre los productos del metabolismo fermentativo se encuentran en orden de

importancia el glicerol, que ayuda a mantener el balance redox en la clula.
Adems de la formacin de otros cidos orgnicos, estos metabolitos pueden
variar dependiendo de las condiciones de cultivo y de las cepas, y resultan muy
importantes en el desarrollo de sabor y aroma en las bebidas alcohlicas; sin
embargo, cuando el objetivo es etanol para diversos usos, el glicerol es un
metabolito no deseado, ya que infiere en el proceso de destilacin (Walker, 1998).
Las levaduras tambin tienen un metabolismo respiratorio, este se lleva a cabo en
presencia de oxgeno, y es en este tipo de metabolismo donde se produce la
mayor cantidad de clulas. El metabolismo tipo respiratorio, se puede resumir en
la siguiente ecuacin:
Glc + 6CO2 + 38ADP + 38Pi
6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 kcal.
Entender el proceso por el cual las levaduras adquieren el azcar y otros

nutrientes slidos es de suma importancia en biotecnologa, ya que el transporte
eficiente conlleva un crecimiento y metabolismo adecuado de las clulas. Y por
ende, se puede dirigir de manera ptima la produccin del metabolito de inters, o
bien de la biomasa de acuerdo a lo que se busque (Walker, 1998).
25
Otro metabolito importante es el cido succnico, el cual puede sintetizarse por

algunas enzimas del ciclo del cido ctrico. Adems del ciclo de las hexosas
monofosfato, donde se incorporan compuestos importantes como la xilosa, est el
ciclo de degradacin de las pentosas fosfato, el cual en un solo ciclo puede
convertir azucares de 6C a ribulosa 5-Fosfato y CO2. Esta ruta del xilitol es
importante en algunas levaduras que usan pentosas como Candida shehatae y
Pichia stipitis, que generan azucares de 2 carbonos por respiracin y
fermentacin. Adems recientemente se ha promovido el uso de este edulcorante
en la industria alimentaria y farmacutica, por lo que su produccin aprovecha el
conocimiento de estas rutas (Evans y Ratledge, 1984).
De manera simultnea a la ruta de la glucolisis, se lleva a cabo el catabolismo de
azcares por la ruta de las hexosas monofosfatos, en la cual, se genera el
NADPH citoslico, para reacciones de biosntesis como produccin de cidos
grasos, aminocidos y azcares alcoholes, el poder reductor generado por esta
ruta, no est relacionado con la respiracin, sino que tambin participa en la
formacin de azcares de ribosa, para sntesis de cidos nuclecos y coenzimas
de nucletidos (Walker, 1998).
La produccin de etanol por clulas de levadura inmovilizadas ha sido
ampliamente investigada en las ltimas dcadas. Los mtodos de inmovilizacin
ms ampliamente utilizados se basan en el atrapamiento en geles de clulas,
tales como alginato de carragenina. A continuacin se describen los mtodos de
inmovilizacin de clulas para procesos de fermentacin, los problemas que en
dicho mtodo se presentan, etc.
2.7. Inmovilizacin de clulas.

La investigacin sobre inmovilizacin de organismos unicelulares ha generado
gran inters en la comunidad cientfica, debido a sus grandes ventajas tcnicas y
econmicas respecto a la fermentacin tradicional. Entre las principales ventajas
26
que presentan los sistemas biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se

encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado
con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible
recuperacin de la biomasa para su posterior reutilizacin. En general, los
materiales para inmovilizar clulas deben cumplir importantes requisitos como: ser
grado alimenticio (segn sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y
aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996;
Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los
mtodos de inmovilizacin de clulas ms usados son la autofloculacin
(Verstrepen y Klis, 2003; Stewart y Russel, 1986), la adsorcin sobre soportes
(Bardi et al., 1996) y la incorporacin de levaduras en matrices solidas. La
floculacin es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y
Russel, 1986). La adsorcin consiste en la adhesin de las levaduras a la
superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel,
1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporacin de
clulas a matrices solidas se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno
de un material polimrico. Las matrices ms adecuadas son polmeros naturales
como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy
suaves aunque tambin se pueden usar matrices sintticas como poliacrilamida y
poliuretano (Groboillot et al., 1994).
El atrapamiento de levaduras en matrices solidas puede realizarse por difusin
de las clulas en matrices solidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert,
2004) o por formacin de las matrices alrededor de las clulas Este mtodo de
inmovilizacin permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y
Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados. Adems se pueden inmovilizar
en matrices independientes clulas que no podran coexistir en contacto directo
debido al efecto killer (Prez et al., 2001). No obstante, al igual que los otros
mtodos de inmovilizacin presenta desventajas. Las ms importantes son los
posibles problemas de difusin de nutrientes y productos a travs de la matriz
porosa y la pobre resistencia mecnica de los soportes slidos (Verbelen et al.,
2006). La inmovilizacin de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha
27
utilizado con xito en la fermentacin de vino blanco y en la produccin de etanol

(Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la composicin de las clulas por
interaccin con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven ms activos
y se observa que la fermentacin ocurre a mayor velocidad respecto a los casos
en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja
importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura
de la accin de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas.
Adems, a diferencia de los floculos de biomasa, estos slidos al ser ms sencillos
de manejar, permiten un mejor control de la actividad cataltica en reactores de
tipo lote y continuos.
La implementacin de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial
inters para el rea de los vinos espumosos. La forma tradicional de preparacin
de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior eliminacin de estas
por medio del degorgement (degelle), esto es mediante congelacin (-25C) del
cuello de la botella donde las levaduras se acumulan por sedimentacion durante el
remuage (cribado). Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante
el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cintica del
proceso se vea afectada consiguindose las mismas propiedades organolpticas
que los vinos producidos de manera tradicional (Yokotsuka et al., 1997). En el ao
2001 el Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC) report la
fabricacin de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnologia
(Divies y Chacon, 2005). Tambin se han reportado estudios en los que se usan
estos dispositivos para la produccin de sidra espumosa y vinos de pina (Divies y
Deschamps, 1986). Cabe destacar que combinando esta tecnologa con el uso de
reactores de alta presin y reactores de flujo continuo ha sido posible la
produccin a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades
sensoriales similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras
libres (Iconomopoulou et al., 2002) En el campo de los vinos espumosos tambin
se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapn de la botella que
permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentacin final
(Lemonnier, 1992). Esta tcnica alarga los tiempos de fermentacin, pero ofrece la
28
posibilidad de realizar el degorgement de manera ms sencilla sin necesidad de

enfriar la botella. Otro proceso de inters en el que la inmovilizacin de clulas
exhibe gran potencial es en la fermentacin malolctica. Este proceso es esencial
en la preparacin de muchos vinos, ya que la transformacin de acido malolctico
en acido lctico y anhdrido carbnico reduce la acidez y mejora la calidad de los
mostos. Esta fermentacin es difcil de controlar mediante las tcnicas de
fabricacin tradicionales, ya que las bacterias que catalizan dicha fermentacin,
principalmente Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura,
pH y concentracin de SO2. En 1991, se reporto que el O. oeni inmovilizado en
perlas de alginato se puede adaptar fcilmente a procesos en continuo sin que se
observe prdida de actividad en procesos de fermentacin malolctica (Fleet et al.,
1991). Sin embargo, tambin se han reportado resultados en los que si se observa
una prdida importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991).
Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la produccin de
vinos espumosos se ha beneficiado con el uso de tecnologas que involucran la
inmovilizacin de clulas. No obstante, es de esperar que con un mejor
entendimiento de los procesos de fermentacin y la fisiologa de los
microorganismos inmovilizados, sea posible implementar esta tecnologa a otros
procesos de produccin.
2.7.1. Problemas con la inmovilizacin de clulas.

Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la
implementacin de procesos de fermentacin en sistemas de flujo continuo,
existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales se
describen a continuacin.
Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacin
depende de factores como el pH, la concentracin de Ca2+, temperatura y la
agitacin (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Adems, cada cepa
de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999). Otro caso,
29
es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en

el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos.
El mayor problema que presenta esta tcnica es el bloqueo que eventualmente
sufren los poros de la membrana debido a partculas o a las mismas levaduras
(Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilizacin de clulas por adsorcin
sobre la superficie de materiales es fcil de conseguir, pero al ser la adsorcin un
fenmeno fundamentalmente electrosttico, durante los procesos en continuo,
especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del soporte.
Adems, por este mtodo es difcil inmovilizar grandes cantidades de biomasa
(Verbelen et al., 2006).
2.7.2. Mtodos de inmovilizacin de clulas para procesos de fermentacin.

Si bien, existe una problemtica alrededor del uso de clulas inmovilizadas, hoy en
da se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan
el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos
diferentes a los polmeros de origen natural que se han usado hasta ahora muchos
de estos slidos porosos podran encontrar un lugar importante en los procesos de
produccin de vinos y fermentaciones alcohlicas en general. Las zeolitas y los
diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos
procesos catalticos, prueba de ello es su extensa aplicacin (Corma, 1995).
Debido a su tamao de poro pequeo, no sera posible inmovilizar levaduras
dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeoliticas si podra
ser de gran utilidad en procesos de fermentacin en los que se requiere eliminar el
etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicacin se
podran emplear materiales zeoliticos hidrofbicos convencionales como la zeolita
beta (Camblor et al., 1996) o materiales hbridos orgnicos-inorgnicos como los
metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatosbeta (Maeda et al., 1997). Cabe
mencionar que la produccin de membranas zeoliticas compactas y con
propiedades mecnicas adecuadas no es sencilla y hoy en da sigue siendo un
reto para muchos grupos de investigacin.
30
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares

(Taguchi y Schuth, 2005), aunque siguen sin presentar el tamao de poro
adecuado para la inmovilizacin de levaduras, si permiten la inmovilizacin de
enzimas (Yiu y Wright, 2005). Esto hace que estos slidos tengan un inters
especial en la industria vincola ya que mediante el uso de enzimas podran
modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y
sabores caractersticos del vino consiguindose productos con propiedades
organolpticas diferentes. Los materiales mesoporosos ms adecuados para la
inmovilizacin de enzimas serian los slidos del tipo SBA-15 debido a su gran
tamao de poro (Zhao et al., 1998). La inmovilizacin de las enzimas se
conseguira por difusin de las mismas en los poros del solido previamente
funcionalizado con molculas que anclaran la enzima a la pared del material
(Hartmann, 2005). Slidos como los que se proponen aqu podran usarse en
procesos en continuo o en sistemas fluidizados. La inmovilizacin de levaduras
requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras,
estos materiales pueden sintetizarse mediante dos tcnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacin en microemulsin,
que posteriormente son usadas como moldes que se recubren con precursores de
xidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008; Marrero-Lpez et al.,
2008). Por medio del proceso de calcinacin de las esferas es posible sintetizar
materiales macroporosos de cavidades esfricas regulares conectados por
ventanas de menor tamao. Mediante esta tcnica sera posible sintetizar
bioslidos de gran resistencia mecnica en los que no habra grandes problemas
de difusin de reactivos o productos. El paso ms complejo de sntesis sera la
inoculacin de las clulas en el interior del slido, ya que aunque los poros pueden
ser muy grandes, las levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los
poros. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podra resultar
de inters para la fabricacin de membranas para la retencin de levaduras en
reactores en continuo.
El segundo mtodo que posee gran potencial es el uso de materiales porosos
sintetizados por congelacin unidireccional y posterior liofilizacin (Choi et al.,
31
2009). Esta tcnica de preparacin de slidos macroporosos, al ser reciente, es la

menos explorada en el campo de la catlisis. Este mtodo implica la congelacin
de una solucin de partculas que pueden ser polimricas, silceas, metlicas etc.
a temperatura de nitrgeno lquido de manera unidireccional y a velocidad
controlada.
El proceso que parece complejo, es en realidad un mtodo sencillo de fabricacin
de materiales macroporosos que, adems, permite la incorporacin de especies
biolgicas in-situ en la matriz durante la sntesis del material debido a que no se
requiere calcinacin de ningn molde orgnico. Para inmovilizar bacterias dentro
de una matriz polimrica (Gutirrez et al. 2007).
2.7.3 Inmovilizacin de levaduras para la produccin de etanol.

Se ha empleado la tecnologa de utilizar clulas inmovilizadas como medio eficaz
para mejorar la fermentacin de etanol. La inmovilizacin de las clulas da lugar a
densidades celulares ms altas, con el consiguiente incremento en las
velocidades de reaccin y la productividad, dando como resultado, el tiempo de
residencia ms corto.
La produccin de etanol por clulas de levadura inmovilizadas ha sido
ampliamente investigada en las ltimas dcadas. Los mtodos de inmovilizacin
ms ampliamente utilizados se basan en el atrapamiento en geles de clulas,
tales como carragenina y alginato de Ca (Luong, 1985; Godia et al., 1987;
Hamamchi y Ryu, 1987). Otros mtodos se basan en la adherencia a las
superficies pasivas, tal como perlas de vidrio, esferas de alambre de acero
inoxidable (Van Haecht et al., 1985; Vega et al., 1987; Sho et al., 2001). En el
primer caso, el principal inconveniente de estos sistemas es la inestabilidad de los
Ca-alginato contra los fosfatos y la interrupcin de las partculas de gel, debido a
la evolucin de CO2 durante la fermentacin. Para la segunda, las clulas se unen
a la superficie de los transportistas, por interacciones electrostticas o unin
covalente de las clulas, los dos inconvenientes principales son la limitacin de la
32
carga de biomasa por la superficie portadores, y el efecto de diversos factores

que pueden causar a la clula desorcin limitando con ello la estabilidad.
Las clulas se han inmovilizado sobre una variedad de soportes naturales y
sintticos. Se han utilizado ampliamente materiales lignocelulsicos como son:
aserrn, astillas de madera o virutas, cascarilla de arroz y paja (Shukla et al.,
1988; Das et al, 1993; Maryse y Zdravko, 1996). Sin embargo, existen algunos
inconvenientes, por ejemplo, algunos de estos soportes tienen estructuras no
uniformes que a menudo estn presentes en forma de partculas y las cadas de
presin o de flotacin se observan a menudo especialmente cuando los sustratos
de densidad son altos.
33
3. JUSTIFICACIN.
En la actualidad, no se satisface la demanda de etanol a nvel nacional para su
uso en la indstria. Adems es necesario utilizar procesos para la obtencin de
fuentes de energas renovables (biocombustibles) que atiendan las demandas del
sector energtico.
Existen varias caractersticas y ventajas que ofrecen los
sistemas de
inmovilizacin para la explotacin de clulas inmovilizadas en lugar de la

utilizacin de clulas libremente suspendidas; proporcionan una larga estabilidad,
existe mayor rendimento de la fermentacin, alta actividad biocataltica, el agente
biologicamente activo se concentra en un volmen pequeo tanto como sea
posible, reutilizacin de las clulas inmovilizadas, durabilidad funcional del sistema
de inmovilizacin.
34
4. OBJETIVOS.
4.1. Objetivo General.
Establecer las condiciones de inmovilizacin de Pichia stipitis ACL2-1,

utilizando bagazo de caa de azcar fresco para la produccin de etanol.
4.2. Objetivos Especficos.
Evaluar el efecto del tamao de inculo sobre el crecimiento y produccin

de etanol en P. Stipitis ACL2-1.
Establecer las condiciones ptimas de inmovilizacin de Pichia stipitis

ACL2-1 para la produccin de etanol (tamao de inculo, relacin lquidosoporte y tiempo).
Evaluar la cintica de inmovilizacin bajo las condiciones ptimas

establecidas.
35
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Materia prima.
Se utiliz bagazo procedente del Ingenio Adolfo Lpez Mateos (zafra 2007-2008),
se procedi a ser tamizado, utilizando un de tamiz de 4.75 mm, posteriormente el
bagazo fue lavado con agua destilada, se puso a secar al sol y despus se sec
en estufa a 75 durante 72 horas.
5.2. Material Biolgico.

La cepa de levadura utilizada en el presente trabajo fue Pichia stipitis ACL2-1, la
cual fue mutada por Rasgado Mellado (2011). Y que presenta el fenotipo
deficiente respiratorio, es capaz de fermentar xilosa y glucosa a etanol, presenta
baja produccin de cido actico y glicerol.
5.3. Medios de cultivo.

5.3.1. Medio de conservacin.
La cepa fue conservada en refrigeracin a 4 y resembrada cada mes en el
medio de cultivo, cuya composicin se indica en la Tabla 3.
5.3.2. Medio de fermentacin.

El medio sinttico utilizando para activar la levadura fue preparado como se
muestra en la Tabla 4.
36
Tabla 3. Composicin del medio de conservacin.

Componente
gL-1
Agar agar
20
Glucosa
20
Extracto de levadura
10
pH
5.5
Tabla 4. Medio lquido sinttico

Componente
gL-1
Glucosa
70
Extracto de levadura
Fosfato de potasio
Sulfato de magnesio
0.4
Sulfato de amonio
5.4. Condiciones de cultivo.

Se tomaron tres asadas de las que contenan la levadura de conservacin y se
inocul en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo y se
incub a 150 rpm y 30 . Despus de transcurridas 12 h de incubacin para
Pichia stipitis ACL2-1
Se activ la cepa tomando tres asadas de las cajas de medio slido que contenan
la levadura y se pas al medio sinttico lquido en un matraz Erlenmeyer de 250
mL con 100 mL de medio, incubndolo durante 12 h a 250 rpm y 30 C, para ello
se utiliz una incubadora con agitacin/refrigeracin marca New Brunswick
Scientific, modelo C24KC. Despus de 12 h de activacin, se realiz un precultivo
preinculo con el mismo medio a utilizar.
37
5.5. Inmovilizacin de clulas.

Se inocularon y se incubaron matraces Erlenmeyer de 250 mL con 58 mL de
medio y 12.2x106 cel mL-1 durante 24 h, para posteriormente ser retirados de la
incubadora, realizando un lavado con agua estril destilada, siendo a la vez
decantado el matraz para extraer el agua presente en el. Del agua que fue
extrada se tom una alcuota para conocer la viabilidad y ser analizada en HPLC
(cromatografa lquida de alta resolucin), despus se colocaron los matraces en
la estufa de secado a 75 durante 72 horas. Una vez transcurrido el tiempo de
secado los matraces fueron pesados para conocer la eficiencia y retencin de
clulas presentes en el soporte.
5.6. Mtodos Analticos.

5.6.1. Cuenta celular.
La cuenta celular se determin por conteo al microscopio el nmero de
microorganismos contenidos en un volmen conocido, empleando una cmara de
Thoma en un microscopio MEIJ (objetivo 40X), usando una tincin con azul de
metileno (haciendo una relacin 1:1). Se dej reposar durante 5 min,
posteriormente se coloc una alcuota de la solucin celular teida en la cmara
de Thoma (celda hemacitomtrica). Esta cmara tiene un volmen conocido,
delimitado por lneas (Figura 9). El cual se llena con una suspensin de clulas, la
cual puede estar teida o no con algn colorante, esto permite contar las clulas,
en cada cuadrante y calcular el nmero total de clulas. Para diferenciar entre las
clulas vivas y las clulas muertas se hace una tincin con solucin de azul de
metileno, el cual penetra en la membrana de las clulas muertas teiendolas de
azul. La cual permite observar un rea de volmen conocido y contar las clulas
vivas, las cuales aparecen transparentes mientras que las muertas se observan de
color azul.
38
Figura 9. Cuenta celular en cmara de Thoma.
Existen dos teoras que explican por qu las clulas se tien con el azul de
metileno.
a) Al ser el azul de metileno un colorante de xido-reduccin, al cambiar a su
forma reducida, se vuelve incoloro; esta reaccin puede realizarse por una
hidrogenasa, si la clula est viva.
b) La segunda teora consiste en que cuando las levaduras mueren, su
membrana se debilita y permite el paso del azul de metileno a travs de la
membrana.
Las clulas contadas deben ser no ms de 500, para lo cual se hicieron las
diluciones pertinentes.
Para obtener el nmero de clulas totales por mililitro de medio, se uso la
siguiente frmula:
No. cel* 106 / mL=
De acuerdo a lo reportado por (Lange, 1993), se calcul la viabilidad celular:

Viabilidad =
39
5.6.2 Determinacin de peso seco.

Para la determinacin de peso seco a partir de las cinticas realizadas en medio
sinttico con glucosa como fuente de carbono a 70 gL-1, (por duplicado), se
filtraron 20 mL del medio de cultivo en crecimiento, para recuperar las clulas en
membranas Millipore de 0.45 m, previamente a peso constante. Enseguida estas
membranas fueron llevadas a estufa de secado ya con la muestra de clulas
filtradas, hasta su peso constante, al trmino de las cuales, se determin el peso
seco de las clulas contadas en cada muestra y se hizo una correlacin entre el
peso seco de las clulas y la D.O. (Densidad ptica). La ecuacin de correlacin
obtenida fue Y = 0.7558x - 0.0327, con una R2 = 0.998. Tambin se realiz otra
correlacin entre el peso seco de las clulas y el nmero de clulas por mililitro. La
ecuacin obtenida para este caso fue: Y = 5x109x + 0.0926, con una R2 = 0.9918.
Estas correlaciones se usaron para calcular el peso seco del bagazo de caa de
azcar, a partir de las clulas contadas (Figura 10 y 11).
4.0
Concentracin de clulas (gL-1)
3.5
y = 0.7558x - 0.0327
R = 0.998
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
Densidad ptica (620nm).
Figura. 10. Correlacin de peso seco y densidad ptica de P. stipitis ACL2-1.
40
4.000
3.500
Densidad ptica (620nm)
3.000
2.500
2.000
y = 5E-09x + 0.0926
R = 0.9918
1.500
1.000
0.500
0.000
0.00E+00
5.00E+08
1.00E+09
Concentracin de clulas (cel mL-1)
Figura. 11 Correlacin de Densidad ptica y nmero de clulas con P. stipitis

ACL2-1.
5.6.3. Sustratos y productos.

5.6.3.1. Preparacin de muestras.
Antes de inyectar las muestras en el cromatgrafo, se centrifugaron a 10,000 rpm,
por 10 minutos, se enfro por 5 minutos y a partir del sobrenadante se tom una
alcuota para realizar una dilucin de manera que se tuvieran menos de 70 gL -1de
azcares, esta dilucin se filtr con membranas Millipore de 0.22 m, para retirar
cualquier partcula que pueda bloquear la columna del cromatgrafo.
Se utiliz un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin (HPLC) Waters 600,
detector de ndice de refraccin, una columna Shodex SH-1011, con H2SO4 5 mM
como fase mvil, temperatura 50 , flujo 0.6 mL min-1, se determinaron las
concentraciones de azcares totales (glucosa), glicerol, cido actico y etanol.
41
5.7. Anlisis de datos experimentales.

5.7.1. Clculo de rendimientos y productividad.
La ecuacin de rendimiento Y x/s (g de biomasa/ g de sustrato) que expresa la
biomasa respecto al sustrato es definido como:
Y x/s =
Donde:
Y x/s = rendimiento de biomasa / sustrato.
xf = biomasa final.
x0 = biomasa inicial.
s0 = sustrato inicial.
sf = sustrato final.
La ecuacin de rendimiento Y p/s (g de producto /g de sustrato) que expresa el

producto respecto al sustrato es definido como:
Yp/s =
Donde:
Y p/s= Rendimiento de producto/sustrato.
Pf = Producto final.
P0 = Producto inicial.
s0 = Sustrato inicial.
sf = Sustrato final.
42
La ecuacin de productividad P (g de producto L-1 h-1) que expresa la velocidad de

formacin de producto es definido como:
P=
Donde:
P = Productividad.
tf = Tiempo final.
La ecuacin de eficiencia E (% del producto) es definida como:

E=
Donde:
E = Eficiencia.
xi = Clulas inmovilizadas.
xf = Clulas libres.
La ecuacin de retencin de clulas R (gg-1 de soporte) es definida como:

R=
Donde:
R = Retencin.
Pi = Producto inicial.
43
5.7.2. Anlisis estadsticos.

Se emple el software Minitab 15 (Minitab Inc.), para determinar mediante un
anlisis ANOVA la diferencia significativa entre los experimentos, as como para
realizar el anlisis del mtodo de optimizacin.
5.7.2.1. Mtodo de Box Behnken

Se emple el diseo de superficie de respuesta Box-Behnken (Box Behnken,
1960), el cual fue llevado a cabo con tres factores: Tamao de inculo, relacin
lquido-slido y tiempo. El ensayo const de 15 corridas base y se llev a cabo por
duplicado (30 en total). Para evaluar la variable de respuesta se emple un
anlisis de regresin con el fin de obtener un modelo emprico que relacionara la
respuesta medida para las variables independientes. La relacin entre estas y la
respuesta fue calculada mediante la ecuacin polinomial de segundo orden:
Donde Y es la respuesta predicha, 0 una constante, 1 el coeficiente lineal, ii el

coeficiente del producto cruzado, k es el nmero de factores (Jian-Zhong Yin et al.,
2003)
Los diseos de Box Behnken poseen combinaciones de tratamiento que se
encuentran en los puntos medios de los bordes del espacio experimental y
requieren un mnimo de tres factores. La siguiente Figura (Figura 12) muestra un
diseo Box Behnken de tres factores. Los puntos del diagrama representan las
corridas experimentales que se realizan:
44
Figura 12. Diseo Box Behnken de tres factores.

Estos diseos permiten una estimacin eficiente de los coeficientes de primer y
segundo orden. En virtud de que los diseos de Box Behnken con frecuencia
tienen menos puntos de diseo, la aplicacin de este tipo de diseos resulta
menos costosa que ejecutar diseos compuestos centrales con el mismo nmero
de factores.
45
6. RESULTADOS Y DISCUSIN.
El presente trabajo, consisti en evaluar el efecto del tamao de inculo. Es por
ello que se manejaron tres variables las cuales fueron: relacin lquidosoporte,
tamao de inculo y tiempo. Dichas variables se trabajaron a diferentes
concentraciones y tiempos, con la finalidad de observar el efecto de los diferentes
tamaos de inculos evaluados.
6.1. Efecto del tamao de inculo.

Fue necesario realizar cinticas del crecimiento celular de P. Stipitis ACL2-1
manejando tamaos de inculo de: 3x106, 3x107, 3x108 cel mL-1 en el medio de
cultivo con 70 gL-1 utilizando como medio de sustrato (glucosa). Las variables de
respuesta fueron la produccin de etanol y el consumo de sustrato.
Posteriormente se seleccion la condicin que present la mayor produccin de
etanol en menor tiempo.
En la Figura 13 se muestra la formacin de biomasa con respecto al tiempo.
Puede observarse que al incrementar el inculo de 3x106 a 3x107 cel mL-1 no
existi cambio en la cantidad de biomasa producida. Sin embargo, cuando se
emple 3x108 cel mL-1, mostr un incremento notable en la produccin de
biomasa. En la Figura 14 se puede observar notablemente que en el inculo
mayor (3x108 cel. mL-1) se present un consumo muy rpido de sustrato (glucosa).
La velocidad de consumo de sustrato fue mayor en el inculo mayor, comparado
con los otros dos tamaos de inculos. Puede observarse adems que el
consumo total de sustrato ocurri a las 42 horas para el inculo mayor, mientras
que esto no fue logrado con los otros inculos evaluados (3x106 y 3x107 cel mL-1).
46
8
7
Biomasa (gL)
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
tiempo (h)
Figura 13. Crecimiento de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaos de inculos.

Inculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108 ().
80
70
Glucosa (gL)
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
tiempo (h)
Figura.14. Consumo de glucosa.de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaos de

inculos. Inculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108().
47
En la siguiente Figura se muestran los rendimientos obtenidos de biomasa por P.

stipitis ACL2-1, evaluando diferentes tamaos de inculos. Se observa que los
rendimientos de biomasa disminuyeron conforme se incremento el tamao de
inculo. Lo anterior, es un factor de inters, puesto que la biomasa es un producto
secundario en la produccin de etanol y por lo tanto es deseable minimizar la
produccin de biomasa e incrementar la produccin de etanol. No obstante es
importante mencionar que es necesario preservar un equilibrio de modo que se
mantengan parmetros cinticos de la fermentacin adecuados.
Rendimientos de Biomasa (gg-1)
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
3x10 cel mL-1
3x10cel mL-1
3x10cel mL-1
Tamao de inculo.
Figura 15. Rendimientos de biomasa por P. stipitis ACL2-1 a diferentes tamaos

de inculo. Inculo (cel mL-1): 3x106 (), 3x107 (), 3x108, ().
Cuando el tamao de inculo es mayor, al haber ms clulas activas, el
crecimiento en s se detiene sin afectarse la viabilidad, esto puede ser observado
en el inculo mayor donde la produccin de biomasa lleg a 7.2 gL -1 a las 27 h,
mientras que para el inculo menor fue de 4.3 gL-1 a las 48 h, ver Tabla 5.
48
Tabla 5. Velocidades globales de formacin, productividades y produccin de

biomasa en diferentes tamaos de inculos.
Inculo (cel mL-1)
3x106
3x107
3x108
Biomasa producida (gL-1)
4.3
4.0
7.2
Productividad (gL-1h-1)
0.15
0.09
0.15
Velocidad global
de crecimiento (gg-1h-1)
0.03
0.05
0.11
A continuacin se comparan los resultados obtenidos del presente trabajo con los
resultados de diferentes autores y utilizando otros tamaos de inculos.
Campos (2008) evalu tres tamaos de inculos con S. cerevisiae ITV-01 medio
sinttico con sacarosa reportando que el inculo ms adecuado para la produccin
de etanol era el 6x106 cel mL-1. Jones et al., (1983), observaron que factores fsico
qumicos, y as como el oxgeno, el tamao de inculo, el tiempo del inculo y las
condiciones en las que se cultiv el preinculo pueden afectar el desempeo de la
cepa, ya que se desean mayor nmero de clulas metablicamente activas para
iniciar la fermentacin, propiamente dicha como produccin de etanol y as
disminuir los nutrientes, porque es en el crecimiento donde sucede dicha
disminucin, es decir que el consumo de sustrato se dirija todo a produccin de
etanol y no a biomasa. Campos (2008) report que es importante el estado
metablico en el que se encuentra la cepa cuando va a ser inoculada, y
recomend utilizar microorganismos en fase exponencial.
Fernndez (2011), increment el volumen del tamao de inculo a 1x107 cel mL-1,
observ la misma tendencia, con respecto a la biomasa, el rendimiento disminuy
con el aumento de la concentracin de azcares totales, de 0.13 a 0.004gg -1, el
cual coincide con lo reportado por Ergun y Moutlu (2000) reportaron que se afecta
el crecimiento a concentracin de sustrato de 250 gL-1 obteniendo una biomasa de
11 gL-1.
49
En este trabajo se utiliz la levadura P. stipitis ACL2-1, y se trabajaron con

diferentes tamaos de inculos (3x106, 3x107, 3x108), sin embargo con los
resultados obtenidos se puede establecer que a mayor tamao de inculo se
obtiene mayor produccin de biomasa, utilizando una concentracin de 70 gL -1,
obteniendo as una biomasa de 7.2 gL-1. Algunos autores han reportado que existe
una influencia del tamao de inculo sobre la prdida momentnea de la viabilidad
despus de adicionar el inculo, tambin se ha observado que se mejora la
velocidad de fermentacin con cantidades mayores de levadura, D Amore et al.,
(1990), pero no se afecta la produccin de etanol. Otros trabajos reportan que la
velocidad a la que se realiza el inculo tambin tiene efecto, ya que esto ayuda
con el control de la contaminacin por bacterias u otras levaduras, ayuda al
desarrollo de compuestos voltiles y al perfil de sabores, lo cual es de suma
importancia en la produccin de vinos (Erten et al., 2006).
En la Figura 16 se muestra el efecto del tamao de inculo sobre la produccin de
etanol. La produccin de etanol se vio favorecida con el tamao de inculo mayor,
la concentracin alcanzada fue 30 gL-1. Al utilizar tamaos de inculos mayores la
viabilidad se mantiene alcanzando as concentraciones mayores de etanol a
comparacin de los otros tamaos de inculos. De esta forma se puede establecer
una relacin que indica que mayor tamao de inculo, se obtiene una mayor
produccin de etanol en menor tiempo.
50
35
30
Etanol (gL)
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
tiempo (h)
Figura 16. Efecto del tamao de inculo sobre la produccin de etanol en P. stipitis
ACL2-1. Inculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108().
En la Figura 17 se muestran las velocidades especficas de produccin de etanol
obtenidas con P. stipitis ACL2-1 en los diferentes tamaos de inculo evaluados.
Velocidades especficas de
produccin de etanol (gg-1 h-1)
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
3x10 cel ml
3x10 cel ml
Tamao de inculo.
3x10 cel ml
Figura 17. Velocidades especficas de produccin de etanol por P. stipitis ACL2-1

a diferentes tamaos de inculo. Inculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(),
3x108().
51
Puede verse en la Figura que la velocidad especfica fue menor en el tamao de

inculo mayor (aproximadamente en un 15%) en comparacin con los otros dos
tamaos de inculos evaluados. Sin embargo la aplicacin del mayor tamao de
inculo (3x108 cel mL-1) permiti la mayor productividad de etanol, presentando as
mayores velocidades globales de formacin y la mayor produccin de etanol se
obtuvo en el inculo mayor en menor tiempo a diferencia de los otros tamaos de
inculos evaluados (ver Tabla 6). En la Figura 18 se muestra que el inculo que
present un mayor rendimiento de etanol fue el inculo mayor (3x108 cel mL-1) el
cual es de 0.452 gg-1. Por lo que, con respecto a los rendimientos obtenidos, es
recomendable que se utilicen grandes tamaos de inculos, para poder as
obtener un mayor rendimiento de etanol.
Tabla 6. Velocidades globales de formacin y productividades de etanol en

diferentes tamaos de inculos.
Inculo (cel mL-1)
3x106
3x107
3x108
Etanol producido (gL-1)
19.4
19.7
29.8
Productividad (gL-1h-1)
0.47
0.46
0.71
0.61
0.69
1.31
Velocidad global de
produccin de etanol
(gg-1h-1)
52
0.50
Rendimientos de etanol (gg-1)
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
3x10 cel ml
3x10 cel ml
Tamao de inculo.
3x10 cel ml
Figura 18. Rendimientos de etanol por P. stipitis ACL2-1 a diferentes tamaos de

inculo. Inculo (cel mL-1): 3x106 (), 3x107 (), 3x108, ().
En lo que respecta a la produccin de glicerol y cido actico en todos los
tratamientos la cantidad obtenida de stos metabolitos fue muy baja. Este
comportamiento caracterstico de dirigir el metabolismo mayoritariamente a la
produccin de etanol y no a la produccin de otro tipo de metabolitos es tpico de
la levadura P. stipitis ACL2-1 (Rasgado-Mellado, en proceso).
6.2.
Optimizacin de las condiciones de inmovilizacin en medio con

glucosa
Para la cintica de inmovilizacin se evaluaron tres tamaos de inculos

diferentes, as como tambin fueron evaluados el tiempo y la relacin L-S. En la
siguiente (Tabla 7) se muestran las variables utilizadas
53
Tabla 7. Variables utilizadas en la cintica de inmovilizacin de clulas utilizando

medio con glucosa.
Inculo (cel.mL-1)
Relacin L:S
Tiempo (h)
-1
3x106
-1
1:16
-1
16
3x107
1:20
20
3x108
1:24
24
Para el bagazo de caa de azcar se realiz un anlisis utilizando unidades

codificadas y se obtuvieron coeficientes de regresin lineal, grficos de contorno y
valores ptimos. En la Tabla 8 se presentan los coeficientes de regresin
estimados de retencin y se observa que existe efecto sobre las variables de L-S
(Lquido-Slido) y tiempo, ya que dichas variables son muy importantes en el
mtodo de inmovilizacin.
Tabla 8. Coeficientes de regresin estimados para retencin.
Trmino
Coeficiente
Probabilidad
Constante
0.317
0.000
Inculo
-0.002
0.617
Relacin LS
Tiempo
0.013
0.012
0.003
0.005
Inculo*Inculo
-0.010
0.095
-0.009
0.000
-9.94E-04
0.122
0.983
0.861
-0.008
0.006
0.131
0.236
Relacin LB*Relacin LS
Tiempo*Tiempo
Inculo*Relacin LS
Inculo*Tiempo
Relacin LS*Tiempo
En la Tabla 9 se muestran los coeficientes de de regresin lineal estimados para la

eficiencia, donde se observa que la variable que tiene efecto significativo es el
tamao de inculo
54
Tabla 9. Coeficientes de regresin estimados para la eficiencia

Trmino
Constante
Inculo
Relacin LS
Tiempo
Inculo*Inculo
Tiempo*Tiempo
Inculo*Relacin LS
Inculo*Tiempo
Relacin LS*Tiempo
Coeficiente
0.965
0.591
0.591
0.591
0.870
0.870
0.870
0.836
0.836
0.836
Probabilidad
0.000
0.000
0.679
0.706
0.001
0.269
0.973
0.126
0.541
0.761
En la Tabla 10 se representan los coeficientes de regresin lineal, estimados para

la viabilidad, es notable que solo exista efecto significativo sobre la variable del
tamao de inculo.
Tabla 10. Coeficientes de regresin estimados para la viabilidad.
Trmino
Constante
Inculo
Relacin LS
Tiempo
Inculo*Inculo
Tiempo*Tiempo
Inculo*Relacin LS
Inculo*Tiempo
Relacin LS*Tiempo
Coeficiente
0.965
0.591
0.591
0.591
0.870
0.870
0.870
0.836
0.836
0.836
Probabilidad
0.000
0.000
0.679
0.706
0.001
0.269
0.973
0.126
0.541
0.761
En las Tablas anteriores se muestran los coeficientes de regresin del bagazo de

caa de azcar estimados para: la eficiencia, viabilidad y retencin, en cada
trmino se puede observar que existen variables que afectan en mayor proporcin
ya que son las que tienen mayor relevancia en comparacin con las dems.
55
En las Figuras 19, 20 y 21 se muestran los grficos de contorno los cuales

presentan el comportamiento de cada una de las variables como son: relacin L-S
(Lquido-Slido), tamao de inculo y tiempo, con respecto a los coeficientes de
retencin, viabilidad y eficiencia para el bagazo de caa de azcar, utilizando
medio sinttico de glucosa.
Figura 19. Grfica de contorno de retencin durante la inmovilizacin de P. stipitis

ACL2-1 en bagazo de caa empleando medio de cultivo (glucosa).
56
En la Figura anterior se muestran las graficas de contorno para retencin. A travs

de estos grficos puede observarse que la variable que present efecto
significativo fue la relacin Lquido-Soporte y el tiempo de acuerdo al anlisis de
regresin lineal. Tambin se observa que el inculo no present cambio
significativo con respecto a la relacin Lquido-Soporte.
Figura 20. Grfica de contorno de eficiencia durante la inmovilizacin de P. stipitis

57
Por otra parte, en la Figura anterior, a travs de las grficas de contorno para
eficiencia puede observarse una gran superficie de respuesta para la relacin
Lquido-Soporte, lo cual sugiere que es posible la optimizacin en niveles mximos
o mnimos, por lo que no existe efecto de la relacin Lquido- Soporte; con
respecto al tiempo. Puede verse tambin en estas grficas de acuerdo a los
resultados obtenidos en la evaluacin por el anlisis de regresin lineal, que existe
mayor efecto sobre el inculo,
Figura 21. Grfica de contorno de viabilidad durante la inmovilizacin de P. stipitis

58
Las graficas de contorno para viabilidad presentados en la Figura anterior

muestran que el inculo tuvo efecto significativo, lo cual confirm lo obtenido en el
anlisis de regresin lineal. Tambin se observa que la relacin Lquido-Soporte
no tuvo efecto significativo sobre el tiempo y el inculo.
Los datos de optimizacin que se obtuvieron de la optimizacin, empleando el
programa de Minitab se muestran en la Figura 22. De los resultados ptimos que
se obtuvieron del programa, de acuerdo a ello se hicieron los clculos pertinentes
para saber el tamao de inculo, la relacin L-S, y el tiempo, los cuales se
muestran la continuacin.
Figura 22. Resultados de optimizacin de Minitab.
Por lo tanto de acuerdo a lo obtenido por el programa Minitab, se obtuvo un

tamao de inculo de 12.2x106 cel mL-1, utilizando as una relacin de lquidosoporte de de 1:23.3 (58 mL), con un tiempo de 24 h. Una vez que se obtuvieron
los datos, se realiz una cintica de inmovilizacin, utilizando como sustrato
glucosa, posteriormente las muestras fueron analizadas en el HPLC, para conocer
los resultados, ver Figura 23.
Con respecto a la cintica de inmovilizacin que se realiz se pudo establecer que
la mayor cantidad de etanol obtenida se dio a las 24 h, alcanzando una produccin
mxima de biomasa al mismo tiempo.
59
70
1.4
60
1.2
50
1.0
40
0.8
30
0.6
Glucosa (gL-1)
Etanol y Biomasa (gL-1)
1.6
20
0.4
10
0.2
0.0
0
0
10
15
20
25
30
tiempo (h)
Figura 23. Cintica de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa

fresco en las condiciones ptimas. Etanol () y biomasa (), con respecto al
tiempo y al consumo de glucosa ().
En Figura 24 se muestran la retencin, eficiencia, viabilidad y pH, donde se

observa que la retencin mayor (22.96 mgg-1) a las 16 h y el pH se mantiene
estable con respecto al tiempo, tambin se observa que se obtiene una viabilidad
de 95.7%, con una eficiencia de 90.1%.
60
100
70
60
80
50
70
60
40
50
30
40
30
20
pH y Retencin (mgg-1)
Eficiencia y Viabilidad (%)
90
20
10
10
0
0
0
10
15
20
25
30
tiempo (h)
Figura 24. Retencin, eficiencia, viabilidad y pH de P. stipitis ACL2-1, durante la

inmovilizacin, utilizando como fuente de carbono glucosa. Retencin (), pH ()
eficiencia (), y viabilidad ().
61
6.3 Inmovilizacin en solucin isotnica.

En la Tabla 11 se presentan los resultados de la inmovilizacin de P. stipitis ACL21 empleando una solucin isotnica a diferentes tamaos de inculo sobre la
viabilidad, la retencin y la eficiencia. Puede observarse de acuerdo a los
resultados mostrados en la tabla que slo se present inmovilizacin celular con el
tamao de inculo de 3x108 cel mL-1. Ya que para los otros dos tamaos de
inculos evaluados no se present retencin y por tanto la eficiencia fue nula.
Tabla 11. Tamao de inculo para la inmovilizacin de clulas de P. stipitis ACL21, con solucin isotnica, empleando un tiempo de 16 h.
Inculo
(cel mL-1)
3x106
Viabilidad
(%)
85.5
Retencin
(mgg-1)
0.00
Eficiencia
(%)
0.00
3x107
86.0
0.00
0.00
3x108
95.5
11.76
34.00
Por lo anterior, se realiz la cintica de inmovilizacin utilizando como medio una

solucin isotnica, empleando una relacin LS de (1:20), con el inculo de 3x108
cel mL-1 y trabajando con un tiempo 0-42 horas. De la cintica de inmovilizacin
se puede observar en la Figura 25 la retencin de clulas presentes en el soporte
utilizado, pH, eficiencia y viabilidad con respecto al tiempo, ya que el mejor tiempo
para la inmovilizacin fue a las 42 horas. Adems se pudo observar que el pH
permanece constante, se obtuvo una viabilidad del 76 % a las 42 h, una retencin
de 19.3 mgg-1 y una eficiencia de 57 %.
62
20
90
18
80
16
70
14
60
12
50
10
40
30
20
10
pH y Retencin (mgg-1)
Eficiencia y Viabilidad (%)
100
10
20
30
40
50
tiempo (h)
Figura 25. Cintica de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa de

azcar sin tratamiento, utilizando solucin isotnica. Retencin (), pH (),
eficiencia () y viabilidad ().
Los resultados obtenidos se compararon con los previamente reportados por Tan
(2007) quien utiliz como soporte bagazo de sorgo, utilizando la levadura
Saccharomyces cerevisiae para la produccin de etanol y que obtuvo una
eficiencia de 52.3 %. Considerando este dato los resultados permiten sugerir que
la inmovilizacin con el bagazo de caa de azcar fue mejor que con el bagazo de
sorgo. Por lo tanto la inmovilizacin de clulas de P. stipitis ACL2-1 en el bagazo
de caa de azcar es factible.
63
7. CONCLUSIONES.
Cuando se emple un tamao de inculo de 3x108 cel mL-1 se present la mayor
productividad de etanol (0.65 gL-1 h-1) y un menor tiempo de fermentacin (42 h)
debido al consumo total de sustrato; por lo que el incremento en el tamao de
inculo en P. stipitis ACL2-1 aument la eficiencia del proceso. P. stipitis ACL2-1
tolera concentraciones mayores de 50 gL-1 de glucosa, sin presentar inhibicin de
la produccin de etanol, presentando sus mejores rendimientos de etanol y
biomasa a concentraciones de sustrato de 70 gL-1.
Las condiciones ptimas para la inmovilizacin de Pichia stipitis ACL 2-1 en
bagazo de caa de azcar sin tratamiento para la produccin de etanol utilizando
medio con glucosa fueron: inculo: 12.2x106 cel mL-1, relacin lquido soporte de
1:23.3 y tiempo de 16 h. A estas condiciones se obtuvieron una retencin de 22.9
mgg-1, una eficiencia de 90.1% y una viabilidad del 95.7%.
Al ser inmovilizada P. stipitis ACL2-1 en el bagazo de caa de azcar nicamente
se present adsorcin celular con el mayor inculo evaluado (3x10 8 cel mL-1) con
16 horas de contacto.
Mediante la cintica de inmovilizacin empleando una solucin isotnica, el
bagazo de caa de azcar present una retencin, eficiencia y viabilidad celular
de 19.3 mgg, 57 % y 76 % respectivamente y se observ que el tiempo que se
requiere para la inmovilizacin de Pichia stipitis ACL 2-1 es lento (42 h). El tiempo
que dura este proceso de inmovilizacin se debi, a que el bagazo al no ser
pretratado, present una estructura cristalina de la hemicelulosa la cual no es
daada, es por este motivo que el tiempo de adsorcin de clulas en el soporte
utilizado es lento. Por lo anterior, las mejores condiciones fueron empleando
medio de cultivo como medio para la inmovilizacin celular y no el uso de una
solucin isotnica.
64
8. RECOMENDACIONES.
Realizar un tratamiento qumico o fsico al bagazo de caa de azcar, que

permita romper la estructura de la hemicelulosa formando una superficie
porosa, y reducir el tiempo de adsorcin de las clulas.
Realizar una cintica de inmovilizacin con hidrolizado lquido neutralizado

y enriquecido con nutrientes para estudiar la produccin de etanol.
65
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
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10. ANEXOS.
74
75
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Inmovilizacion de P. Stipitis para Produccion de Etanol

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INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE TIERRA BLANCA

INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Tierra Blanca, Ver., Mex.

Establecimiento de las condiciones de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1

Como requerimiento parcial para

Ingeniero en Industrias Alimentarias

Mi tesis la dedico con todo mi amor y cario.

Agradezco al Dr. Benigno y a la Dra. Guadalupe por darme la oportunidad de

RODELA HERRERA, SONIA; Divisin de Ingeniera en Industrias Alimentarias,

El etanol es una opcin de biocombustible que presenta ventajas ante otros

biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se encuentra su facilidad para el

Se realizaron las cinticas de crecimiento celular evaluando diferentes tamaos de

proceso de adsorcin de clulas en el soporte utilizado es lento.

Usos de la caa de azcar.

Constituyentes de la caa de azcar.

Variedades de la caa de azcar

Principales productores de caa de azcar.

Bagazo de caa de azcar.

Composicin del bagazo de caa de azcar.

Principal uso del bagazo de caa de azcar en Mxico.

2.3.2.1 Alimentacin a las Calderas.

Procesos productivos para la obtencin de etanol.

Produccin de etanol a nivel mundial.

Vas de produccin de etanol.

2.4.3.1 Va sinttica, reaccin de etileno con vapor.

2.4.3.2 Va sinttica fermentativa

Caractersticas morfolgicas generales.

Reproduccin de las levaduras.

Asimilacin y fermentacin de la fuente de carbono.

Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.

Problemas con la inmovilizacin de clulas.

Inmovilizacin de levaduras para la produccin de etanol.

Determinacin de peso seco.

5.6.3.1 Preparacin de muestras.

Anlisis de datos experimentales.

Clculo de rendimientos y productividad.

5.7.2.1 Mtodo de Box Behnken.

Efecto del tamao de inculo.

Optimizacin de las condiciones de inmovilizacin en medio con

Inmovilizacin de clulas con solucin isotnica.

Bagazo de caa de azcar.

Composicin del bagazo de caa de azcar.

Estructura de a) celulosa y b) hemicelulosa (xilana y

Produccin mundial de Bioetanol.

Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.

Cuenta celular en cmara de Thoma.

Correlacin de peso seco y densidad ptica de P. stipitis

Correlacin de densidad ptica y nmero de clulas con P.

Diseo Box Behnken de tres factores.

Crecimiento de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaos de

Consumo de glucosa.de P. stipitis ACL2-1 en diferentes

Rendimientos de biomasa por P. stipitis ACL2-1 a diferentes

Efecto del tamao de inculo sobre la produccin de etanol en

Velocidades especficas de produccin de etanol por P. stipitis

Rendimientos de etanol por P. stipitis ACL2-1 a diferentes

Graficas de contorno de retencin durante la inmovilizacin de

P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa empleando medio de

Graficas de contorno de eficiencia durante la inmovilizacin de

P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa empleando medio de

Graficas de contorno de viabilidad durante la inmovilizacin de

P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caa empleando medio de

Resultados de optimizacin de Minitab.

Cintica de inmovilizacin de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de