Apuntes 4 Clase 11 de Marzo

El ADN es una hebra plectonemica, enrollada una hebra sobre la otra

El experimento de Meselson y Stahl permiti demostrar la teora
semiconservativa de la replicacin del DNA.
Este experimento consiste en que se
centrifuga DNA en el que el nitrgeno es un
isotopo pesado (15N), quedando una banda
en la regin inferior del tubo de ensayo, luego
se colocan los DNA pesados en un medio que
contiene el complejo replicante (enzimas de la
replicacin) y los sustratos necesario para los
nucletidos, pero stos son de istopos
livianos (14N), entonces se replica el DNA y la
muestra se centrifuga nuevamente, si la
replicacin fuera conservativa, habra una
banda a la misma altura de la primera y una
ms arriba correspondiente al DNA liviano, si
fuera dispersativa habran bandas distribuidas
en todo el rango entre el DNA liviano y el
pesado, mientras que si es semiconservativa
habra una banda al medio entre el DNA
liviano y el pesado. Luego de la centrifugacin se aprecia una banda en la
mitad, lo que comprobara la teora semiconservativa, se replica nuevamente la
muestra bajo las mismas condiciones de la primera, las hebras de la primera
generacin replicadas se encontraban formadas por una hebra de 15N y otra
de 14N, ahora al replicarlas de acuerdo a la teora semiconservativa la hebra
que se separa proveniente del 15N formara un DNA con una hebra de 14N
sintetizada con el 14N del medio, y la hebra de 14N del DNA de la primera
generacin se relacionara con otra hebra sintetizada con el nitrgeno liviano,
por lo tanto en la centrifugacin se obtienen bandas en el mismo nivel que
antes, nivel denominado de DNA hbrido (14N/15N) y bandas al nivel del DNA
liviano.
Un opern es un conjunto de genes capaces de ejercer una regulacin de su
propia expresin por medio de los sustratos con los que interaccionan las
protenas codificadas por sus genes.
El problema de la iniciacin de las cadenas de ADN
A) Con RNA Quin frabrica el partidor? Experimento de la transferencia de
marca (label transfer) El RNA es hidrolizado en un medio alcalino,
mientras que el ADN no. Se coloca RNA en una mezcla alcalina, lo que da
como resultado nucleosidos monofosfatos, con el fosfato en 2o 3. En

cada transicin de ribo a desoxirribonucleico hay una marca, una

interaccin. Donde se transfiere la marca de RNA como primer del DNA

Sintesis de los partidores

Como las DNA polimerasas no inician cadenas, requieren de un partidor, que es
casi siempre RNA. En bacterias estos son sintetizados por la primase, enzima
codificada por el gen dnaG. Por ello, la protena se denomina DnaG.
LA primase en eucariontes es la Pol alfa
B) Con DNA. En un circulo rotario en replicacin de virus, se puede utilizar
el DNA como partidor
C) Algunos virus utilizan protenas para comenzar la replicacin, como el
adenovirus. La protena sirve como molde para la replicacin, y despus
la hebra resultante se cicla.
Elongacin
Las DNA polimerasas solo alargan cadenas. En el sitio activo existen 2 iones
metlicos de Mg2+, que atacan nucleofilicamente el 3OH sobre el fosfato alfa.
Uno de ellos interactua con el 3OH y ambos con el trifosfato. Tienen actividad
exonuclasa 53y 35.
Las DNA polimerasas se pueden clasificar en familias.
A)
B)
C)
D)

Pol
Pol
Pol
Pol

I
alfa y Pol II
III
D

X) Pol beta
Y)

Pol V y Pol IV

El DNA recin replicado se asocia al sitio activo en la palma de la polimerasa.

La brusca torcion del templado en 90 impide que el dNTP entrante se hibride a
una base que no corresponda. Durante la actividad editora, cuando la DNA pol
agrega un nucleotico que no se aparea con el templado, se produce una torcion
del ADN de modo que el extremo 3OH se acerca al sitio activo de la actividad
exonucleasa, para editar en sentido 35. En este sentido, la geometra de los
apareamientos cannicos contribuyen a la fidelidad, ya que apareamientos
incorrectos no calzan bien en el sitio activo. El nucletido entrante llega al sitio
denominado de insercin. Luego de establecido el enlace fosfodiester, la DNA
pol transloca y el nuevo par de bases queda en el sitio de postinsercion.

La tautamerizacin de las bases ocurre cuando un protn cambia su posicin,

resultando una forma tautomerica. Cuando las bases adoptan esta
conformacin, pueden ser apareadas errneamente, una guanina se
comportar como timina y de aparear con una adenina. Mientras que una
guanina se aparear con una timina. Estas transiciones pueden ser
responsables de mutaciones
Las cadenas de DNA crecen en sentido 53.
Un experimento para comprobar la direccionalidad de la elongacin consisti
en que mientras se estaba copiando el DNA. Se le da un pulso de tritio y se
congela inmediatamente, ya que lo que incorpor quedara al final de la
cadena. Luego aislo los fragmentos de replicacin y los marco con una
polinucleotido quinasa y fosforo 32. Finalmente, todos los carbonos quedan
marcados con fosforo 32 en el 5. Conclusion, el DNA crece en sentido 53.
El problema de la replicacin en los trminos del ADN plantea que, como la
hebra discontinua termina en ARN, este luego es removido y la hebra se
acorta, esto es debido a que la DNA pol I no puede replicar el segmento de RNA
hidrolizado en los extremos. La solucin en eucariontes, se debe a la actividad
transcriptasa reversa de la telomerasa que permite extender los trminos del
DNA. Para ello la telomerasa extiende el extremo 3del ADN utilizando como
templado su propio RNA, luego una primasa sintetiza en sentido 53, desde el
extremo 3del DNA elongado por la telomerasa, el extremo 3del primer sirve
para la replicacin por una DNA polimerasa y finalmente la ligasa sella el
espacio y la polimerasa elimina el primer.
Problemas topolgicos
I) El alivio al sobreenrrollamiento al frente del avance de la replicacin.
Esta dado por la topoisomerasa tipo II, que se encarga de cortar la doble
hebra y hasta puede girarla.
II) Es el nudo que se crea en el termino de la replicacin de un DNA
circular de doble hebra. Lo que se crea son dos argollas, denominadas
catenarios, unidas entre si. Lo que se necesita en cortar y luego volver a
sellar, realizado por la DNA topoisomerasa IV.
La Topoisomerasa tipo I corta una hebra de ADN, permitiendo de esta forma
liberar las tensiones internas debidas a un excesivo enrollamiento o a un
enrollamiento deficiente. Una vez que la tensin se ha relajado, pega los
extremos de la hebra cortada. Al cortar una de las hebras se permite que la
molcula rote alrededor del enlace que permanece ntegro reduciendo el estrs
debido al enrollamiento. Las topoiosmerasas de tipo I no requieren de ATP para
su funcionamiento. La Topoisomerasa tipo II corta ambas hebras de la cadena

de ADN, y pasa otra doble cadena intacta por el hueco formado en la ruptura.
Requiere de ATP para su funcionamiento
Al termino de la replicacin existen genes de temino, como el gen tus, que
sintetiza protenas que se unen al sitio de termino, frenando la replicacin, pero
no completamente. Por ello, existen numerosos genes de termino de
replicacin
Iniciacin
En E. coli hay cuatro sistemas de iniciacin de cadenas de DNA (priming)
1) Virus M13, con protenas SSB mediante una RNA polimerasa crea el
primer
2) Virus G4, con protenas SSB, mediante una primasa crea el primer
3) Virus x174 con protenas SSB. Ninguna de las anteriores tiene espacio,
por lo que necesitan usar las protenas del husped
Cuando el ADN no esta cubierto por protenas SSB y yo necesito DnaG y otras
protenas como la DnaB. Estas interaccionan y se unen, entonces la helicasa
empieza a avanzar separando las bases y a la vez se va haciendo los
partidores por las protenas DnaG, lo que se denomina prisosome. Surgen dos
conclusiones, DnaG es la protena que sintetiza los partidores cuando existen
SSB. Cuando no existen SSB, el DnaG solo puede sintetizar los partidores si
esta unido a DnaB.
Construccin de un plasmidio OriC
Ya se conoca cual era el origen de replicacin en E.Coli, por lo que los
cientficos decidieron apartar el origen y unirlo con un gen de resistencia a
antibiticos, creando un plasmidio artificial. Solo sobrevivir el gen que
incorpore el origen de replicacion
El origen contiene 4
cajas R, la caja R3 fue
reemplazada por C2 y
C3.Las cajas R1 y R4
son las que tienen
mayor afinidad por Dna
A-Atp, mientras que las
R2, R5, I, C y tau son las
de menor.
R5 tiene una diferencia con las dems cajas R
Entonces, lo necesario para replicar un plasmidio OriC:

Protena DnaA, que se une a la caja de reconocimiento de la secuencia

ori
Protena DnaB (helicasa), que desenrrolla el ADN
Protena DnaC, que se requiere para unir la DnaB al origen
HU, protenas similares a histonas, que estimulan la iniciacion
FIS, protena binding del ADN, estimula la iniciacin
IHF, protena binding del ADN, estimula la iniciacin
DnaG (primasa), sintetiza el partidor de RNA
SSB, se unen al ADN monohebra
Dam metilasa, metila la guanina de la secuancia GATC
DNA Girasa (toposisomerasa II), alivia la tensin.

Los distintos dominios de la protena Dna A incluyen 4 dominios, el primero

donde se une con la Dna B, en el tercero une ATP y en el cuarto se una al DNA.

La protena SeqA tiene como funcin impedir iniciaciones muy seguidas. Se une
a los sitios hemimetilados e impide la rpida metilacin y la unin del DnaA al
ori, su posterior liberacin del DNA permite la metilacin y el reinicio de la
replicacin por unin del Dna A.
La replicacin tiene una direccin bidereccional a partir del oriC, destacando la
continuidad o discontinuidad de las hebras y demostrando que la helicasa
DnaB se mueve en las dos direcciones

La actividad exonucleasa de la polimerasa III esta dada por el core

polimerasa, un complejo de subunidades alfa, psilon, o. Adems, la
polimerasa tiene el complejo de
protenas gama , o complejo

DnaX

Si es que existe un dao en la hebra retardada, la DNA pol simplemete se lo

salta y reinicia ms tarde.

En los cromosomas eucariontes hay mltiples oris, mientras que en

procariontes solo uno. Adems, la secuencia de iniciacin no es tan especifica,
algunas regiones actuarn como orgenes y otras no.
Iniciacin en eucariontes.

En eucariontes la pol alfa sintetiza los

partidores de RNA.
La eliminacin de los partidores en
eucariontes es debido a la exonucleasa
Fen1