Prctica 3.

Identificacin de presencia de ToLCNDV mediante

marcadores PCR (2 horas)
Objetivo de la prctica:
Aprender el fundamento de la tcnica de PCR, su realizacin y aplicaciones.
Aprender datos algunos datos de inters sobre el Tomato Leaf Curl New Delhi Virus de
aplicacin para su deteccin por medio de biologa molecular
Usar un marcador molecular para el diagnostico +/- del virus en plantas

Necesario uso de bata y guantes

Contenidos:
Principio de la PCR
Tipos de PCR
Aplicaciones de la PCR
Virus: organismos sencillos
Tomato Leaf Curl New Delhi Virus
Geminiviridae y begomovirus
Importancia sanitaria en Almera
Estructura molecular
Diseo de primers
Deteccin de ToLCNDV por PCR en calabacn
Componentes, concentraciones
Condiciones de amplificacin: Programa de PCR
Resultados
Tarea a realizar por el alumno

Gentica y
Mejora Vegetal
Prcticas
Curso: 2014/2015

Empezamos por el ltimo paso!

Anlisis de resultados en una electroforesis en gel de
agarosa al 1%
Con el fin de tener tiempo para todo: empezamos corriendo una electroforesis
con una PCR del gen de inters previamente hecha
Necesitamos un gel de agarosa al 1% (ya slido y listo para usar)
Cargamos la PCR. En un papel de paramfilm ponemos:
ponemos
9 gotas de 4 L de buffer de carga (LB)
En la primera gota de LB (o cerca), ponemos 7 L de 2 log (ladder)
En las 8 gotas restantes (o cerca), ponemos cada reaccin de PCR (+,-, muestras
desconocidas y NTC)

Corremos la electroforesis:
Pon el gel de agarosa dentro del TBE1x que hay en la cubeta de electroforesis
Con una pipeta y las puntas carga cada pocillo con las 9 gotas (LB y PCRs/marcador
molecular). Recuerda cambiar de punta en cada ocasin y ayudate con tu dedo para
cargar ms cmodamente
Cierra la cmara y pon la fuente de alimentacin a 111 mV. Comprueba que est
funcionando
Espera 1-1,5h y observa
Recuerda: el LB da densidad a la muestra y color (azul de bromofenol y xilene cianol), en este
caso tambin lleva Red dye (compuesto que permitir ver el AND al someter el gel a una
fuente de luz UV)

Gentica y
Mejora Vegetal
Practical sessions
Curso: 2014/2015

Principio de la PCR (Polymerase Chain Reaction)

Prctica 3

PCR 2 video

Tipos dePCR
La PCR es una de las tcnicas ms empleadas en biologa
molecular.
Algunos tipos:
PCR: obtenemos un resultados de presencia/ausencia
presencia
de un fragmento o
fragmentos de distinto tamao.
Marcador molecular: permite diferenciar materiales que portan alelos
diferentes.
Amplifica distinto tamao en distintos materiales,
materiales amplifica en un material y en
otro no
Diferencia de tamaos

Genotipado de una F2
P1 P2 F1

F2

Prctica 3

Tipos dePCR

Algunos tipos:

Prctica 3

PCR cuantitiativa, o RT-PCR a Tiempo Real (Trancriptoma).

(Trancriptoma) Usa ARN (cDNA)
se
observa la expresin de un gen en un tejido. Se determina donde y cuando se
expresa un gen
In situ (Trancriptoma). Usa ARN (cDNA)
expresin de un gen en un tejido (la
PCR se hace en el tejido). Se ve cuando y donde se expresa un gen

Boualem et al, 2008

Aplicaciones de la PCR
Se emplea en ganadera y agricultura.
Para la Mejora gentica Vegetal:
Estudio de caracteres de inters. Ej.- Expresin sexual
TILLING. Deteccin de mutaciones
Genotipado.
Genotipado. Estudio de segregacin de un gen en la F2
Evaluacin de la variabilidad gentica. Ej.- en bancos de
germoplasma
Estudio
Estudio de la expresin de genes a travs de RT-PCR
RT
a tiempo real
Seleccin
Seleccin temprana de individuos portadores de un gen de inters.
Ej.- Resistencia a TMV
Deteccin
Deteccin temprana de enfermedades. Antes de su aparicin

Prctica 4

Virus: organismos sencillos

Estructura
Agentes infecciosos de pequeo tamao.
Propiedad
Propiedad distintiva: organizacin estructural y composicin genmica simple.
Mutan con facilidad
Replicacin: usan la maquinaria celular del huesped
Partes:
Material gentico: ADN o ARN (ds o ss)
Cubierta proteica (cpside)
bicapa lpidica (en algunos virus)
Tamao: 10-300nm
Clasificacin
Orden (-virales)
Familia (-viridae)
Subfamilia (-virinae)
Gnero (-virus)
Especie ( )

Prctica 3

Tomato Leaf Curl New Delhi Virus:

Familia (-viridae): Geminiviridae Gnero (-virus):
(
begomovirus
Caractersticas de la familia Geminiviridae (Monci, 2004)
2004
Partculas de 18 x 30 nanometros.
22 capsmeros pentamricos que se organizan constituyendo 2
icosaedros incompletos unidos por una de sus caras.
Genoma constituido por una o dos molculas de DNA
monocatenario y circular, de un tamao entre 2,5 y 3 kb.
informacin
informacin:
Ms
http://www.danforthcenter.org/iltab/geminiviridae)

Caractersticas del gnero Begomovirus (Monci, 2004)

Gnero ms numeroso de la familia Geminiviridae (ms de 80
especies reconocidas).
Infectan dicotiledneas (solanceas)
Se transmiten por la mosca blanca (B. tabacci), (se ha citado otra
mosca blanca, Trialeurodes ricini) (Idriss et al, 1997).
Genoma normalmente bipartito.
Otros datos: Los begomovirus se clasifican en dos grupos en base al
estudio filognetico de la secuencia nucleotdica de la protena de la
cpsida (Padidam et al., 1995) begomovirus del "Viejo Mundo" que
incluye especies procedentes de la Cuenca Mediterrnea, frica,
Oriente medio, Asia y Australia, y los del "Nuevo Mundo" procedentes
del continente americano.

Prctica 3

Tomato Leaf Curl New Delhi Virus: Importancia sanitaria en Almera

Importancia fitosanitaria (Informe Consejera de Agricultura, Pesca y Desarrollo rural,
Delegacin de Almera, 2013)
Vector: mosca blanca (B. tabacci)
Huspedes: tomate, calabacn, sanda, meln, pepino
Sntomas: reduccin del crecimiento, amarilleo, rizado de las hojas, en frutos pitting
Control: se realiza a travs del vector, trampas amarillas, mallas y tratamientos
fitosanitarios
Incidencia
Prospeccin realizada en el campo almeriense por la delegacin de Agricultura, Pesca y
Desarrollo rural en 2013
34 CALABACIN TODOS POSITIVOS ToLCNDV
30 TOMATE TODOS NEGATIVOS ToLCNDV
9 PEPINO 4 POSITIVOS ToLCNDV
3 PIMIENTO 1 POSITIVOS ToLCNDV

Sntomas en calabacn: reduccin crecimiento, amarilleo, rizado, pitting en frutos

Prctica 3

Tomato Leaf Curl New Delhi Virus: estructura molecular

Caractersticas a nivel molecular
Begomovirus (Geminiviridae)
virus ADN monocatenario (o virus ssDNA)
2 ADNs (A y B)

Prctica 3

Estructura proteica

ADN A (2738 pb)

AV2

ADN B (2696 pb)

(componente que causa daos severos)
BV1

AC5

AV1 (protein coat)

BC1

nuclear shuttle protein movement protein

AC3 (replication enhancer protein)
AC2 (suppresor protein)
AC4

Tomato Leaf Curl New Delhi Virus: diseo de primers

Usamos el ADN A para disear primers o oligos (hay secuencias conservadas y con las
caractersticas adecuadas para el diseo de los mismos)
Para el diseo de los primers existen distinto softwares libres en internet, usamos la herramienta
de diseo de NCBI. YA EST HECHO

Factores en el diseo de los primers

1. Especificidad: tamao de los oligos (20-25
25 nucletidos)
2. Contenido en G/C: 45-55%.  G/C
 temperatura de anillamiento
 especificidad
3. Secuencia en 3: contenido en G/C en 3
Evitar formacin de horquillas y dimeros de primer

Prctica 3

Tomato Leaf Curl New Delhi Virus: diseo de primers

Secuencia ADN A: Obtenemos hasta 5 parejas a lo largo de la secuencia considerando los
factores de diseo

Prctica 3

Primers publicados

Sequence (5'->3')

Template
Length Start Stop
strand

Tm

GC%

Self
complementarity

Self 3'
complementarity

Forward primer AATGCCGACTACACCAAGCA Plus

20

1145 1164

59.96

50.00

3.00

0.00

Reverse primer GGATCGAGAAGAGAGTGGCG Minus

20

1418 1399

59.97

60.00

4.00

2.00

GC%

Self
complementarity

Self 3'
complementarity

Combinacin 1: entre AC3 (replication enhancer

protein) y AC2 (suppressor protein)

Product length 274

Template
strand

Length Start

Stop Tm

Forward primer GAGGCCGGCAAGTATGAGAA

Plus

20

921

940 59.82 55.00

6.00

0.00

Reverse primer ATGCTTGGTGTAGTCGGCAT

Minus

20

1165

1146 59.75

50.00

4.00

2.00

Template
strand

Length Start

Stop Tm

GC%

Self
complementarity

Self 3'
complementarity

26

476

501

62.70 58.00

4.00

1.00

32

953

985

60.50 41.00

4.00

1.00

Sequence (5'->3')

Combinacin 4: entre AV1 (coat protein) y AC3

(replication enhancer protein)

Product length 245

Sequence (5'->3')

GGGTTGTGAAGGCCCTTGTAAG
Plus
GTGC
GCATGAGTACAGGCCATATACA
Reverse primer
Minus
Forward primer

Primers publicados (Lpez et al, 2014): AV1 (coat

protein) PAREJA QUE VAMOS A USAR

Deteccin de ToLCNDV por PCR en calabacn:

Componentes de la reaccin
ADN MOLDE previamente extrado de plantas de calabacn con y sin sntomas de
ToLCNDV. Cada grupo har 4 reacciones de PCR:
3 ADN (positivo para el virus, negativo para el virus y desconocido)
Reaccin sin molde o templete (Non template control, NTC)
PRIMERS (concentracin de uso: 10 M): ToLCNDV F1 y ToLCNDV R1 (previamente
diseados, pareja de primers publicada por Lpez et al, 2014)
MEZCLA DE NUCLETIDOS TRIFOSFATO (dNTPs):
(dNTPs) dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
(10mM)
Buffer de la reaccin de la PCR (10X), cloruro de magnesio (cofactor de la enzima)
y Taq DNA polimerasa.
Guantes, bata, pipetas de diferentes volmenes y puntas de distintos tamaos

Prctica 3

Deteccin de ToLCNDV por PCR en calabacn:

Componentes de la reaccin
Cada grupo realizar 4 reacciones de PCR (ADN positivo para ToLCNDV, ADN negativo para ToLCNDV,
ADN que no se sabe si porta el virus (OJO, PUEDE NO TENER SINTOMAS Y PORTAR EL VIRUS), NTC
(CONTROL NEGATIVO DE REACCIN), una reaccin de ms
porque estamos aprendiendo!
Componente

Concentracin
stock

Concentracin
final

Agua

Volumen (l)
Por muestra

Volumen a aadir al
Premix
(5 X)

33

165

10X Red Taq Buffer

10X

1X

25

Cl2Mg

25mM

2mM

20

Primer Forward

10 M

0,2 M

Primer Reverse

10 M

0,2 M

Mezcla de dNTPs

2.5mM cada
dNTP

200 M cada
dNTP

ADN molde

20 ng/ul

20 ng

EN TUBOS DE PCR

Red Taq Polymerase

(1U/l)

1 U/ul

1U

5 (justo antes de
servir el premix)

__

50 ul

Total

20

PASO A PASO:
1 Preparar un premix para las 5 reacciones en un tubo eppendorf de 1.5 mL sin el ADN
2 Servir ADN en tubos de PCR
3 Aadir la Red Taq al premix

Prctica 3

Deteccin de ToLCNDV por PCR en calabacn:

Condiciones de amplificacin
Programa de amplificacin
Fase PCR

Temperaturas

Prctica 3
tiempo

Ciclos de
repeticin

Desnaturalizacin
inicial

94C

2 min

1 ciclo

Desnaturalizacin

94C

20s

37 ciclos

Anillamiento

55C

30s

Extensin

72C

45min

Extensin

72C

10min

16C

infinito

1 ciclo

Algunos datos
Anillamiento: la Ta se asocia a la Tm de los primers y se elige en
funcin de esta
Extensin:: el tiempo de elongacin depende del tamao del
fragmento a amplificar segn la actividad de la Taq empleada
Red Taq amplifica 1 kb en 1 minuto

Comprobamos
el tamao

Ladder

NTC

Ladder

Muestras

Resultados

Practica 3

Practical session 3. Identificacin de presencia de ToLCNDV

mediante marcadores PCR. PCR (2 horas)

Tarea a realizar por el alumno:

Resumen breve de la prctica
Responder estas preguntas:
Qu temperatura de anillamiento habra que elegir en funcin de las caractersticas de la combinacin 1 de
primers para amplificar el virus?
Cul sera el tiempo de elongacin aproximado para el fragmento amplificado con la combinacin 1 de primers,
si la Taq empleada puede generar 1kb por minuto?
Qu es un marcador molecular?

Tiempo mximo de entrega: 30.03.15 23:59h

Referencias
Boualem A, Fergany M, Fernandez R, Troadec C, Martin A, Morin H, Sari MA, Collin F, Flowers JM, Pitrat
M, Purugganan MD, Dogimont C, Bendahmane A (2008) A conserved mutation in an ethylene biosynthesis
enzyme leads to andromonoecy in melons. Science 321: 836-838
Idriss M, Abdallah N, Aref N, Haridy G and Madkour M.(1997). Biotypes of the castor bean whitefly Trialeurodes
ricini (Misra) (Hom., Aleyrodidae) in Egypt: biochemical characterization and efficiency of geminivirus
transmission. Journal of Applied Entomology-Zeitschrift fur Angewandte Entomologie 121: 501-509
Lpez C, Ferriol M, Pic MB (2014) Mechanical transmission of Tomato Leaf Curl New Delhi virus in cucurbit
germplasm: selection of tolerance sources in Cucumis melo. Euphytica (in press)
Monci F (2004) Bsqueda de estrategias de control frente a begomovirus que afectan a tomate y juda en Espaa.
Tesis doctoral. Universidad de Crdoba
Universidad Nacional del Nordeste Fac. de Agroindustrias, Saenz Pea, Chaco Repblica Argentina
(http://www.biologia.edu.ar/viruslocal/LosVirus.htm)

Gentica y
Mejora Vegetal
Practical sessions
Curso: 2014/2015

Gentica y
Mejora Vegetal
Prcticas
Curso: 2014/2015

Prctica 3. Identificacin de presencia

de ToLCNDV mediante PCR. (2 horas)

Cecilia Martnez Martnez