HEMATOLOGA CLNICA

TRABAJOS PRCTICOS

ALUMNO:
GRUPO:.......
AO: 2011

NMINA DE TRABAJOS PRCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINMA, VSG, COLORACION MGG)
TP2: HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)
TP3: FRMULA PATOLGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA
TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)
TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)
TP6: INMUNOHEMATOLOGA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)
TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA
TP8: CITOQUMICA (MPO-PERLS-KLEIHAUER BETKE) - MEDULOGRAMA
TP9: LMA (MICROSCOPIA)
TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)
TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)
TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRA,
TIEMPO DE COAGULACIN, RETRACCIN DE COGULO)
TP13: HEMOSTASIA SECUNDARIA (TP, KPTT, MTODOS MANUALES Y
AUTOMATIZADOS)

MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)

TP N
GRUPO DE LABORATORIO:
FECHA
NOMBRE Y APELLIDO
1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades
realizadas)
2- RESULTADOS HALLADOS
Determinacin
Valor hallado
Mtodo
Valores de referencia
3- ELEMETOS OBSERVADOS
Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados
(coloracin y aumento) as como tambin, en caso de disponer de ellos, datos referentes
al cuadro en que fue encontrado (edad, datos de hemograma, patologa, tratamiento,
etc).
Ej. Se observ un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un
cuadro de anemia ferropnica en recuperacin (Nio 8 aos, GB: 7300 cel/mm3 GR:
4,18 x 106 cel/mm3 Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM
30,2 g%, RDW 18 %, Pq 323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)
Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un
paciente con AHAI.
4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiolgicas, patolgicas, posibles
causas de error, procedimientos para la validacin del resultado)

TRABAJO PRCTICO N 1
Ojetivos Generales
- Puesta en prctica de normas de bioseguridad bsicas.
- Prctica de los pasos para la obtencin de muestras de sangre venosa para la
realizacin de las determinaciones incluidas en el hemograma.
- Aplicacin de los criterios necesarios para la eleccin de anticoagulantes en funcin de
las determinaciones a realizar.
- Manejo del material necesario para las prcticas a desarrollar.
- Interpretacin de resultados.

1 -Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin

venosa
1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene.
2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez
manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo.
3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales
usados en recipientes para ese fin.
4. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se
mantendrn puestos durante todo el procedimiento.
5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado.
6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por
palpacin. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y
cierre el puo para facilitar la extraccin.
7. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en
alcohol. Dejar secar.
8. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la
jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo.
9. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la
sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la
jeringa debe estar visible (hacia arriba).
10. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete
y luego la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco.
11. LA AGUJA SE DESCARTAR EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE
FIN.
12. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen
los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando
inmediatamente por inversin suave.
13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.
14. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms
sangrado.
15. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de
muestra y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.
16. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro
de muestras.

2 - Descripcin de los anticoagulantes usados en Hematologa

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para
estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben
intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al
fisiolgico. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los
leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin
plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la
muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C).
Los anticoagulantes ms utilizados son:

EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido

etilendiaminotetraactico, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++),
impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza
fundamentalmente para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los
autoanalizadores y permite adems la realizacin del hematocrito y del frotis
sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo
que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja,
respecto a las de sodio, de ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos
a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del
eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por
espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in
Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para
recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao
celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la
calibracin de los contadores automticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso
molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una
solucin al 1% es de 4.8 1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la
sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso
entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a la cual se
producen las alteraciones celulares. TENER SIEMPRE PRESENTE QUE 10L
DE ANTICOAGULANTE PUEDEN ANTICOAGULAR HASTA 2,5 mL de
SANGRE.

HEPARINA SDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiolgico que

acta impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es
un mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas
anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y
una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La
proporcin adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice,

evitando as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en
una proporcin sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250L
anticoagulante); as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una
proporcin sangre: anticoagulante 4:1 (Por Ej.: 2 mL sangre con 500 L
anticoagulante).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades

de sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin
de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada

cuatro volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de:

Acido Ctrico 0.9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.
3 - Recuento de hemates
RECUENTO MANUAL
Consiste en hacer el recuento en una dilucin de sangre entera anticoagulada. Es un
mtodo poco usado debido al elevado error que presenta.
Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%., o Solucin de Hayem
(HgCl2 0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)
La dilucin empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:
Solucin fisiolgica o citratada:
3,98 mL
Sangre:
0,02 mL
El recuento se realiza en la cmara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hemates se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados

que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeos, como se muestra a
continuacin:

Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que
contiene los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La
superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm.
Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cmara y se
cuentan los glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara
puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede
cargada uniformemente.
Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo
que se debe hacer es el siguiente:
N x D x FC x ST = n de glbulos rojos/mm3
TC
Donde:
N: nmero de eritrocitos contados.
D: Ttulo de la dilucin realizada (200).
FC: Factor de correccin de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10).
ST: Total de cuadrados pequeos en la superficie de 1 mm2 (400).
TC: Total de cuadrados pequeos contados.
Causas de error en el recuento en cmara de Neubauer
El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:
1. Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial.
Hemlisis.
2. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre.
3. Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo.
4. Falta de suficiente agitacin de la sangre diluida.
5. Cmara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.
6. Llenado incompleto de la cmara Neubauer.
7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rgido.
8. Clulas mal distribuidas en el fondo de la cmara.
9. Errores del operador al realizar el recuento.
10. Errores al efectuar los clculos.
VALORES DE REFERENCIA
Edad
Recin nacidos
Nios (2-12 aos)
Adultos jvenes (12-18 aos)

Sexo
ambos
ambos
mujeres
varones
Adultos jvenes (19-60 aos) mujeres
varones

Intervalo de referencia
4,7x1012/L - 6,3x1012/L
4,0x1012/L - 5,3x1012/L
4,1x1012/L - 5,1x1012/L
4,5x1012/L - 5,3x1012/L
4,1x1012/L - 5,2x1012/L
4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - Hematocrito
DEFINICION
El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el
volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con
la concentracin de hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el
procedimiento ms simple para el diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es
indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.
El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre
total en tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a
laboratorios de baja complejidad.
En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del
contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo
electrnico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o
campo oscuro) y la concentracin de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido
electrnicamente difiere del obtenido por centrifugacin en que no considera el efecto
del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes clulas sanguneas,
por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %).
Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un
buen parmetro del estado de la serie eritroide.
El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por Ej., un
paciente en estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser
normal o alto, an cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre.
Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia
o una transfusin.
METODO MANUAL
Micromtodo (microhematocrito)
Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y
poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo.
Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro
interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera
anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota
despus de la puncin.
Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre
(aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad,
favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando.
Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo
a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con
el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente
equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene

la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar

con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darn el resultado directamente, o
con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:
A------- 100
B------- x

x: hematocrito en tanto por ciento

A: longitud total
B: longitud de la parte corpuscular

La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos
valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.
Causas de error

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una
disminucin en el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma.
El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra
En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los
lquidos tisulares que provoca hemodilucin.
En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce
hemoconcentracin.
La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya
tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( x 2 DE)

El valor de Hto vara con la edad y el sexo.
Edad y sexo
Recin Nacidos
Nios (hasta 10 aos)
Mujeres (18-50 aos)
Embarazadas
Varones (18-50 aos)

Hematocrito %
54 10
38 5
42 5
39 5
45 5

Fraccin
0,54 0,1
0,38 0,05
0,42 0,05
0,39 0,05
0,45 0,05

5 - Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO
Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en
cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya
absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones
de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de
referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la
sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el
siguiente proceso:
Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6] metahemoglobina
Metahemoglobina + [CNK] cianmetahemoglobina
MATERIAL
1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados
peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las
especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology
(ICSH)
2. Tubos: 12 x 100 mm.
3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10
UI/ml). Puede emplearse sangre capilar.
4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 mL.
5. Pipetas automticas: de 20 L, debidamente calibradas.
6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:
Composicin (pH 7-7,4)
Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6]
Cianuro potsico [CNK]
Fosfato monopotsico [KH2PO4]
Detergente no inico*
Agua destilada hasta

200 mg
50 mg
140 mg
1 mL
1000 mL

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.
El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la
transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3
min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente
transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm
utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin
utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente
(el fro modifica el color del reactivo).
7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya
absorbancia corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo

patrn de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de
HiCN.
METODO
Se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo
los pasos detallados a continuacin:
1. Conectar el espectrofotmetro.
2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico
(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por
inversin del tubo 20 veces.
3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo
limpio.
4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene
5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el
exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de
introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las
paredes internas de la pipeta.
5. Agitar el tubo mediante inversin (4 o 5 veces) con el fin de conseguir
homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para
que se produzca la hemlisis total y se complete la transformacin de toda la
hemoglobina en cianmetahemoglobina.
6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.
7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una
curva de calibracin.
Curva de calibracin de hemoglobina
Se toma un Kit. de calibracin con estndar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de
una CC .baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de
CC. conocida y se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las
absorbancia y se determina un factor que es el promedio de las tres diluciones.
Teniendo que A= . b. C y como b=1 cm => A/ = C para facilitar el calculo A . (1/
) = C donde (1/ )= F y es la inversa de la pendiente de la curva tendremos que C=
F.A
Grafico:

De esta manera controlo:

La linealidad del equipo
El deterioro que sufre el reactivo
Puedo trabajar con un estndar diario, procesado por cada operador que realiza la
determinacin de hemoglobina, como si fuese una muestra ms y determino el factor
del estndar:
Procesando un estndar todos los das:
CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE
EL DIA QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZ LA CURVA.
CONTROLO EL FACTOR HUMANO
CAMBIOS EN LA TENSIN DE LA RED O DESGASTE DE LA
LMPARA DEL FOTOCOLORMETRO
Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina
La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser
tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen
como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/l). No obstante, la
mayora de las veces los errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el
anlisis del espcimen.
Errores en la obtencin del espcimen de sangre:
1. Errores de extraccin
2. Empleo de anticoagulantes no recomendados
3. Coagulacin parcial de la sangre
Errores de la dilucin:
1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas
2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar
antes de introducirlo en el reactivo
3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo
Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN:
1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido
2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en
HiCN
Errores de la determinacin:
1. Empleo de instrumentos no calibrados
2. Cubetas sucias o deterioradas
3. Soluciones turbias de HiCN
Errores en la conservacin del reactivo:
1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3 Fe(CN) 6 en K4
Fe(CN) 6 y una oxidacin parcial de la Hb.

Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con

formacin exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de
concentracin de Hb obtenidos son inferiores a los reales.
6 - Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o Eritrosedimentacin
FUNDAMENTO
El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de
eritrocitos en su plasma nativo.
VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de
enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas
como los procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y
tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de
Hodgkin, linfomas y mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves
como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los
tests ms utilizados como screening en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo
sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple.
MECANISMO
El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente
dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los
GR y diversas protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o
disminuyen (albmina) la agregabilidad de estas clulas.
Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores:
a.
b.
c.
d.

Tamao de los GR
Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,
Viscosidad del plasma.
Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera

al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R
que encuentra una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de
viscosidad a una velocidad v: R = 6vr
La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de
los GR con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo
durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa
final donde la velocidad de sedimentacin se hace ms lenta al mismo tiempo que los
GR se acumulan en el fondo del recipiente.
La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la
velocidad de todo el proceso. As, cuanto ms pequeo sean los agregados, ms
lentamente se producir la sedimentacin y viceversa.

Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma
y el tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la
anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.
La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de
fibringeno y otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la
VSG. El mecanismo por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin
de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza
de repulsin que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial
zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la
superficie de los GR, lo que explica que estas clulas se mantengan separadas. La
intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composicin proteica del
plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones de albmina, globulinas
y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial zeta, las
globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto
el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin
menos esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y
reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene
como consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas
pilas de moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta
del equilibrio entre las principales protenas plasmticas.
METODOLOGIA
Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de
Westergren y el mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo
de Westergren es menos sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la
sedimentacin de los GR y as puede ser levemente menos confiable como un
procedimiento de screening.
El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la
VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a
la relacin entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un
aumento no especfico de la VSG probablemente acelerando la agregacin y
reduciendo las fuerzas de friccin entre los agregados en sedimentacin. Se trataron de
aplicar factores de correccin para anemias, pero no resultaron confiables.
Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de
Westergren que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council
for Standardization in Hematology (ICSH).
Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG
que emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos
sistemas, aunque reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de
ste por su carcter cerrado (recogida de los especmenes en tubos al vaco que
incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material
complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisin del llenado
de las pipetas.
MTODO DE WESTERGREN

Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo
poco reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la
necesidad de prediluir la sangre.
A. MATERIALES.
A.1 Anticoagulante
Si utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solucin acuosa 32,08 g/l.
A.2 Tubo de sedimentacin
Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y
de un dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm)
todo a lo largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm
numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen
las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comits de Estandarizacin en los
diferentes pases.
Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el
uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.
Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las
especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos
plsticos resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los
problemas de taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de
agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.
A.3 Gradillas
Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una
posicin vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte
integral de la gradilla para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de
un lmite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan prdidas de
sangre cuando el tubo est colocado en ella.
B. TCNICA
A) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales
utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol
de sangre a 1 Vol de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en
0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre
es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.
B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin
repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la
sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura

ambiente (18-25C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y
corrientes de aire, mantenindolo exactamente 60 min.
D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de
la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel
de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm,
corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).
C. VALORES DE REFERENCIA
EDAD (aos)
Nios mayores y 0-15
jvenes
Varones adultos 17-50
51-60
61-70
Mujeres adultas 17-50
51-60
61-70

Valores de
referencia
5 a 10

Lmite superior
de la normalidad
15

43
63
64
63
95
10 5

10
12
14
12
19
20

Factores tcnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento
Desviacin de verticalidad de la pipeta
Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta
Elevacin de la temperatura ambiente
Dilucin de la sangre
Causas de disminucin:
Reduccin del dimetro de la pipeta
Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido)
Cambio de anticoagulante
D. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan
fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de
referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos
orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos
circadianos.
Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas
anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo
que no se recomienda su empleo.
Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con
modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro

de enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin

en el embarazo normal y el puerperio.
Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas.
La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR
(hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.),
hipofibrinogenemia, defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa
aparente.
Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual
obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que
no existe enfermedad orgnica.
7-OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE
Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea
de sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en
pediatra) o de la ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la
luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las
clulas.
Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos
(extensor), se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de
45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre
y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de
contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene
una fina pelcula de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se
extiende.

Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas.

Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin
tambin distinta de leucocitos:
1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida
de la extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos.
2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se
observa un exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

1
3

Para que un frotis sea valido:

1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarn retenidos y no sern
identificados.
2) No debe ser demasiado delgado (ser muy pobre en elementos lo que impedira
una lectura conveniente).
3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderan los
elementos mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta.
4) No debe presentar agujeros (utilizacin de portas mal desengrasados) ni estras o
flecos (provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares).
Conviene elegir el extensor observando sus bordes en el microscopio para
asegurarse de que sean bien lisos.
5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogneo y por tanto el
recuento variara segn los campos examinados).
6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos:
hemates festoneados por ejemplo).
Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:
El tamao de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseara la experiencia.
Si ha cado un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodn. Repetir el
procedimiento las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la
adecuada.
Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo,
pero lo ideal es que ocupe partes de la lamina.
Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos
inconvenientes: los hemates aparecen poligonales con su claridad central
desaparecida, las plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o
distorsionados.
Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque producira
erosin de las clulas.
Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central
mediana (espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en
un borde convexo sin estras prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un
buen extendido luce como una pincelada sobre el vidrio.
Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogneo no se puede evitar una cierta
segregacin de los elementos. Los linfocitos (mas pequeos) predominan en el
centro de la extensin. Los polimorfonucleares y los monocitos son atrados hacia
los bordes y cola.
FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos estn en la cola. Deben rechazarse
para la formula.

Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1) Impide agrupacin de plaquetas.
2) Los ncleos de los monocitos aparecen como con lbulos, inclusive pueden estar
desintegrados o coloreados ms homogeneamente, ms compactos que con
sangre fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.
Importante:
Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensin
Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados
minuciosamente.
8-COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE
La coloracin se realiza por el mtodo de May Grnwald-Giemsa.
Fundamento
Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan
en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.
Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras
celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina
(colorante cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente
el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas
presentes en el ncleo (nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul,
mientras que otros componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren color
rosado.
De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos
colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los
que la granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes
simultneamente, resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin
especfica contiene sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los
colorantes cidos, dando un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin
especfica posee sustancias de carcter cido, que fijan colorantes bsicos dando un
color azul oscuro.
Reactivos

Solucin May Grnwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado

oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluorescena).

Mtodo
Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A
continuacin, agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua

destilada en partes iguales, en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar

soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de
vaivn. Dejar 3-5 minutos. Volcar, enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el
preparado con una solucin de Giemsa, obtenida a razn de dos gotas del colorante por
ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar con agua, limpiar la cara inferior del
portaobjeto con un algodn y secar al aire.

TRABAJO PRCTICO N2
Objetivos generales
-Familiarizarse con el uso de la cmara de Neubauer
-Adquirir destreza en la preparacin de diluciones y manejo de muestras de sangre
entera
-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cmara de Neubauer para el
recuento de glbulos blancos
-Delinear los criterios para la identificacin de glbulos blancos en preparados
coloreados con MGG
-Realizar frmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos
-Interpretacin y validacin de resultados
1-RECUENTO DE LEUCOCITOS
Mtodo manual
1) Agregar 20 l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de
solucin de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el
agregado de una punta de esptula de azul de metileno. DILUCION 1/20
2) Homogeneizar la mezcla.
3) Cargar la cmara de recuento
4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de
burbujas y que la distribucin sea regular.
5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes
(4) de la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en
ms del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica

nuevamente el recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero
resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.
6) Clculo:
m x 10 x d
n

= N de leucocitos/ mm3

Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y

d=dilucin utilizada, n= nmero de cuadrantes contados.
Valores de referencia
Adultos
Recin nacidos
Nios de 1 ao
Nios de 4 a 7 aos
Nios de 8 a 12 aos

4.000 - 11.000 / mm3

10.000 - 25.000 / mm3
6.000 - 18.000 / mm3
6.000 - 15.000 / mm3
4.500 - 13.000 / mm3

2-DETERMINACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO

DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de
inmersin, aun para el pequeo aumento a seco. Si no se cumple este requisito la
refringencia de los elementos impide una buena observacin. Para esto es suficiente
depositar una gota en un extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que
puede contener otro extendido en cuyo caso se harn coincidir ambas caras que los
contengan y desplazarlos suavemente unos contra otros.
La observacin debe hacerse al principio de manera panormica con objetivo de 10X
para ver la dispersin de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de
clulas grandes como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe
evitarse la tendencia a usar e comienzo la inmersin.
Luego se pasa a 40 X aumento que resulta til para evaluar alteraciones de tamao de
los glbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los
glbulos blancos y para la observacin detallada de los elementos sanguneos.
Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para
establecer los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glbulos blancos se puede
expresar cada tipo de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.
Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos , recordar que se est haciendo
una estimacin porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta
relativamente sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de
referencia. Distinto es el caso de pacientes leucopnicos con recuento bajos por ej:
1500 GB / mm3 en estos casos resultar muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos
para poder expresar en % , por ello es aconsejable expresar literalmente lo que se vi al
observar el preparado por ej: se realiza la frmula leucocitaria en un paciente
leucopnico y solo se logr contar 80 elementos ( pueden ser 70, 90 dependiendo del
tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo aconsejable es
expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS CONTADOS x
son Neutrfilos, y son eosinfilos, z son linfocitos, etc, etc, es decir se expresa
cuantos elementos de cada serie se observ en el total de GB contados Y NO EN
PORCENTAJE!
FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS
LEUCOCITOS
(%)
ABSOLUTO (cel / mm3)
CAYADOS
0 1%
100 - 250
NEUTROFILOS SEGMENTADOS 55 70 % 3000 - 5000
EOSINOFILOS
14%
20 - 350
BASOFILOS
01%
10 - 60
LINFOCITOS
20 40 % 1500 - 4000
MONOCITOS
48%
100 - 500
No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad.
Nacimiento: 70% de neutrfilos.
Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos.
Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos
y 50% de neutrfilos.
10-12 aos: valores de referencia del adulto.
Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal
1. Neutrfilo: Ncleo lobulado (2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por
filamentos cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula
terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado,
cubierto por una granulacin fina especfica de color pardo rojiza.
2. Eosinfilo: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con
predominio del bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con ms
lbulos. El citoplasma es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de
mayor tamao que las del neutrfilo y que se colorean de anaranjado.
3. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado.
La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma.
Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo
quedar superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente.
4. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12
m. La forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste.

Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con

citoplasma ms abundante. El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener
una escotadura. La cromatina es densa.
5. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta
forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleocitoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo
y no presenta granulaciones.