Manual de Laboratorio

Contenidos Programticos
Laboratorio de Patologa Infecciosa
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PATOLOGIA INFECCIOSA
Manual del Laboratorio de prcticas
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
Elaborado por: Dra. Mara Victoria Figueroa Ramrez

Dra. Claudia Roco Chia Argote
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INDICE
Prctica 01 Bioseguridad, Tcnicas de desinfeccin y esterilizacin

Prctica 02 Principios bsicos de pruebas inmunolgicas
Prctica 03 Medio de cultivo
Prctica 04 Siembras y aislamientos
Prctica 05 Tipo de muestras tiles en microbiologa, estructuras
micticas, hongos ambientales, toma de muestra
Prctica 06 Protozoos intestinales, coprolgico, coproscpico
Prctica 07 Morfologa bacteriana Cocos Gram Positivos
Prctica 08 Enterobacterias, Antibiograma
Prctica 09 Tuberculosis
Prctica 10 Diagnstico de infecciones de piel, tejidos blandos y
anlisis de Liquido Cefalo-raquideo
Prctica 11 Diagnstico de infecciones del tracto genito-urinario
Prctica 12 Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo
Prctica 13 Diagnostico de dengue, hepatitis B, VIH
Prctica 01
Bioseguridad, Tcnicas de desinfeccin y
esterilizacin
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BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACION
OBJETIVOS GENERALES:
Dar a conocer las normas de bioseguridad y los procesos de desinfeccin
y esterilizacin en el mbito clnico.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar los conceptos que definen las normas de bioseguridad y su
aplicacin en el desempeo profesional en las instituciones de salud.
Identificar y reconocer los principios
para seleccionar
los mtodos
adecuados de desinfeccin y esterilizacin.
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO
1. El acceso al laboratorio estar limitado solo personal autorizado.
2. El personal que trabaje en laboratorio debe responsabilizarse con el
cumplimiento de las normas de bioseguridad.
3. Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo
biolgico y el nivel de contencin.
4. Ingrese al laboratorio con bata manga larga, abotonada, y limpia, una vez
ingrese, coloque los abrigos, libros, y dems en localizaciones especificadas
pero nunca sobre los bancos o mesones.
5. Lave sus manos al entrar y al terminar cada sesin, limpie la superficie de
trabajo con una solucin desinfectante.
6. El personal con cabello largo debe recogerlo para trabajar dentro del
laboratorio as como usar: bata, cofia, tapaboca, guantes y dems equipos
de barrera de proteccin segn el nivel segn el riesgo biolgico.
7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o al
trmino del mismo coloque el material contaminado o limpio en sus
respectivos lugares pero nunca sobre los mesones.
8. Comer, beber, fumar aplicarse cosmticos (en especial pestaina, pues
esta acelera el deterioro delo oculares del microscopio) y usar lentes de
contacto es una actitud prohibida dentro del laboratorio. Es necesario el uso
de zapato cerrado durante el trabajo de laboratorio igualmente como
mantener las uas cortas y limpias y sin esmalte.
9. Est prohibido pipetear con la boca, para ello emplee los dispositivos
adecuados.
10. Emplear los equipos segn las instrucciones o P.O.E (procedimientos
operativos estandarizados) al igual que emplear los protocolos
correspondientes a las prcticas. No manipular ni operar equipos sin la
autorizacin respectiva o si no tiene claro los P.O.E.
11. El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizara de tal
manera que en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo
recomendable es hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables, las
cuales debern ser rgidas y resistentes, contar con materiales absorbentes
en su interior, de fcil desinfeccin y no ser utilizadas con otros fines.
12. Todo personal debe poner especial cuidado en evitar contacto con la piel
con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin, debe usarse
guantes para la manipulacin de muestras o cultivos que contengan
posibles patgenos. Los guantes siempre sern desechados antes de salir
del rea de trabajo.

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13. Informar todos los derrames y accidentes al supervisor de forma

inmediata y al jefe del laboratorio.
14. Usar gafas protectoras y mascaras faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles.
15. Cada estudiante debe contar con su equipo bsico de trabajo, el cual
incluir entre otros laminas portaobjetos, laminas cubreobjetos, jabn,
tijeras, cinta de enmascarar, lpiz, marcador de vidrio permanente, papel
absorbente, algodn, alcohol, asas bacteriolgicas, guantes.
MARCO TEORICO.
DEFINICION
Se entiende por bioseguridad a toda una disciplina encargada de prevenir
accidentes biolgicos, valindose de un conjunto de medidas y controles
destinados a prevenir al mximo la exposicin a agentes potencialmente
infecciosos o patgenos en los sitios de trabajo donde exista dicho riesgo.
Principios de bioseguridad
Se describen mtodos seguros para manejar materiales infecciosos en el
laboratorio bien sea para manipulacin o conservacin; dicha descripcin se
conoce como CONTENCION, su aplicacin fundamental es la reduccin y/o
eliminacin de la exposicin de cualquier persona trabajador no, como
tambin al medio ambiente externo de agentes peligrosos.
Contencin primaria, propende por la proteccin del personal y del medio
ambiente propio e inmediato del laboratorio de la exposicin a agentes
infecciosos, mediante la utilizacin correcta de las tcnicas necesarias, los
equipos indispensables y con un uso apropiado. La vacunacin del personal
que labora en los laboratorios.
Contencin secundaria, se aplica en referencia al medio externo y la
combinacin entre la aplicacin de las practicas operativas, y un adecuado
diseo de la planta fsica, permite la consecucin de su objetivo.
Se debe evaluar el riesgo de trabajo con agentes especficos para lograr la
combinacin de los tres elementos de contencin que son: tcnicas y
practicas en le laboratorio, equipos de seguridad, y el diseo de la
instalacin.
Los trabajadores deben conocer los riesgos potenciales y tener experiencia
en las prcticas y tcnicas indispensables en la manipulacin de material
infeccioso, debe existir una persona que organice y capacite
adecuadamente al personal.
Los laboratorios estn obligados a elaborar e implementar un manual de
operaciones que identifique los posibles riesgos prcticas y operaciones.
Dicho manual debe ser socializado para su correcta aplicacin.
Es necesario implementar medidas adicionales cuando las prcticas
estndar no son suficientes para controlar los riesgos, es indispensable
que el director del laboratorio seleccione este tipo de prcticas, en relacin
a los riesgos tanto con los agentes o los procedimientos.
BARRERAS PRIMARIAS
Son aquellas que ofrecen niveles significativos de proteccin al personal y al
medio ambiente brindando proteccin contra la contaminacin externa de
los materiales (cultivos celulares, stocks microbiolgicos). Ej.: Gabinetes de

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seguridad biolgica (BSCs), recipientes cerrados, cubetas de centrifugas.

Tambin se incluyen elementos de proteccin personal, tales como guantes,
delantales batas, cobertores de zapatos, botas respiradores, cofias, tapa
bocas, anteojos de seguridad y mascaras faciales.
BARRERAS SECUNDARIAS
Son las que contribuyen en la proteccin de quienes trabajan en el
laboratorio y la comunidad evitando el escape de agentes infecciosos al
medio ambiente. Se refieren al diseo y construccin de la planta fsica,
sistemas de descontaminacin del sitio de trabajo y del personal, dichas
caractersticas
incluyen procesos de ventilacin especializados para
asegurar el flujo del aire direccional, zonas de acceso controladas.
GRUPOS DE RIESGO BIOLOGICO
GRUPO DE RIESGO 1
Microorganismos que representan escaso riesgo para el individuo y la
comunidad, tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el
ser humano o los animales por
Ejemplo agentes como: Naegleria gruberi, Bacillus subtilis, entre otros.
GRUPO DE RIESGO 2(GR2)
Microorganismos que representan riesgo moderado para el individuo y
limitado o bajo para la comunidad; pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero tienen bajas probabilidades de entraar un riesgo
grave para el personal de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio
ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin
grave, pero existen medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo
de propagacines limitado por ejemplo existe disponibilidad de tratamiento
y medidas preventivas y el riesgo de diseminacin est limitado, por
ejemplo agentes como; Micobacterium (excepto M. Boris y M. tuberculosis),
Helicobacter, Salmonella, E. coli, Shigella, Streptococcus, Staphilococcus,
HIV, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, entre otros.
GRUPO DE RIESGO 3 (GR3):
Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y escaso
para la comunidad; usualmente causan enfermedades serias a humanos y
animales que resultan en importantes consecuencias econmicas, la
diseminacin no es ordinaria y depende del contacto casual de un individuo
a otro, puede haber disponibilidad de medidas preventivas y teraputicas
eficaces, por ejemplo agentes como; Micobacterium tuberculosis. M. bovis,
M. leprae, Histoplasma capsulatum, virus de la Influenza incluyendo HPAI
(H7 y H5),
Virus del Nilo, entre otros.
Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y para la
comunidad; causa serias infecciones a humanos o animales, en ocasiones
sin tratamiento y puede transmitirse fcilmente de un individuo a otro, o de
un animal a humano o viceversa directa o indirectamente o por contacto
casual; normalmente no existen medidas preventivas y teraputicas
eficaces, por ejemplo agentes como; Ebola, Hanta, virus de la rabia de
murcilagos, Nipah, Junin, entre otros.

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Agentes que desarrollan enfermedades que no estn reportadas en el pas

(exticas); su introduccin y presencia estn reglamentadas por leyes
sanitarias locales, por ejemplo agentes como; Enfermedad de Aujeszky,
CAE, virus de la hepatitis en patos, Nairobi, enfermedad Teschen, virus
serotipo BT, enfermedad del caballo africano, entre otros.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Las recomendaciones de la CDC describen cuatro niveles de bioseguridad
que constan de combinaciones de prcticas y tcnicas de laboratorio,
equipos de seguridad e instalaciones, representando las condiciones bajo
las cuales el agente pueda manipularse de una forma segura.
La adopcin de los diferentes se efecta de forma dinmica, y se clasifica
de acuerdo:
-Grupo de microorganismos infectantes
- Tcnicas y prcticas de laboratorio
-Equipos de seguridad.
-Tipo de laboratorio.
Nivel 1: Representa un sistema bsico empleado en prcticas
microbiolgicas estndar, sin ninguna barrera primaria y secundaria.
Nivel 2: es adecuado cuando se trabaja con sangre humana fluidos
corporales, tejidos, etc., donde puede existir la presencia de un agente
infeccioso desconocido
Nivel 3: Trabajo con agentes exticos con potencial de transmisin
respiratoria que puede provocar una infeccin grave o potencial mente letal,
se enfatizan barreras primarias y secundarias.
Nivel 4: trabajo con agentes peligrosos o txicos que representa un alto
riesgo individual de enfermedades que ponen en peligro la vida, para las
cuales no existen vacunas o terapias disponibles.
EQUIPOS DE SEGURIDAD.
Es un hecho aceptado que una buena parte de las infecciones adquiridas en
los laboratorios son debidas, adems de los accidentes que pueden tener
lugar (roturas, salpicaduras, cortes y pinchazos), a la inhalacin de
aerosoles con potencialidad infectiva que se generan en las diversas
operaciones del laboratorio clnico.
Se debe implementar una medida donde para la correcta manipulacin de
materiales peligrosos. Es evidente que la eliminacin de materiales
peligrosos debe conllevar a la evolucin del fundamento de las tradicionales
campanas de humos, las cuales precisan la proteccin del producto
manipulado como la del trabajador, sumndose a esta
necesidad la
proteccin del medio ambiente laboral y comunitario.
CABINAS DE SEGURIDAD BIOLGICA.

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Son equipos que proporcionan una barrera de contencin para trabajar de

forma segura con agentes infecciosos. Presenta diversos nombres tales
como cabinas de seguridad, campanas microbiolgicas, o campanas de flujo
laminar.
Figura 1. Cabina de seguridad biolgica

Estos equipos han sido diseados para mantener un rea denominada zona
de trabajo libre de partculas y de contaminantes tales como bacterias que
puedan alterar el producto con el cual se trabaja, al trabajador o al medio
ambiente.
La proteccin se logra mediante la combinacin de elementos
electromecnicos/electrnicos (motor, ventilador, filtro, ductos, eliminacin,
etc.) y procesos fsicos (flujo laminar, diferencias de presiones) que
impulsan el aire a travs de unos filtros especiales de gran superficie,
estratgicamente ubicados que tienen una eficiencia mnima de retencin
de partculas de 99,99%, estos filtros son conocidos como FILTROS HEPA y
resultan adecuados para retener aerosoles que se generan cuando se
realizan procedimientos experimentales con agentes biolgicos como
agitacin, centrifugacin o mezcla.
ESTERILIZACION
MARCO TEORICO
Es la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, utilizando,
medios fsicos como la filtracin, y el calor, medios qumicos como
alcoholes, fenoles, desinfectantes.
ASEPSIA: se define como la eliminacin de material orgnico extrao de la
superficie de los objetos, se logra con la accin manual directa o mecnica
con el uso de agua y jabn o soluciones detergentes y algunos germicidas.
Etapas del proceso de esterilizacin

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Limpieza y descontaminacin: es la remocin de toda materia extraa en la

superficie de objetos inanimados mediante el uso de agua y soluciones
jabonosas. La descontaminacin disminuye la carga microbiana de los
materiales dejndolos seguros para su manipulacin.
Inspeccin:
corresponde a la evaluacin visual de los artculos lavados
buscando desperfectos o suciedad que pueda interferir en los mtodos de
esterilizacin.
PREPARACION /EMPAQUE
Se debe preparar, empaquetar los artculos facilitando su uso y evitando
daos y deterioro del material.
ESTERILIZACION
ALMACENAMIENTO
Los artculos se conservan hasta su uso asegurndose la esterilidad o
proceso de desinfeccin
ENTREGA DE MATERIALES
Es la distribucin de los elementos de trabajo en sus areas
correspondientes, teniendo en cuenta la cantidad y la calidad necesaria
para su utilizacin.
Tipo de material
Procedimiento
Material critico: aquel Esterilizacin
que entra en contacto
con tejidos estriles o
con el sistema vascular.
Material
semicrticos: Desinfeccin
aquellos que estn en nivel
contacto
con
membranas, mucosas y
piel no intacta
Material no critico: aquel

que entra en contacto
con piel intacta no con
membranas mucosas
de
alto
Desinfeccin de nivel
intermedio o bajo

Ejemplo
Instrumental quirrgico
Implantes
Aparatos de endoscopias
Catteres,
sondas,
drenajes, agujas
Aparatos de endoscopia
Endoscopios flexibles
Maquinas de dilisis
Otoscopio, sinuscopio
Equipos
de
terapia
respiratoria
Especulo vaginal
Termotetos rectales
Termmetros de axila
Orinales planos
Fonendoscopios
Desfibriladores
Manguitos de tensin
arterial.
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Principales mtodos de esterilizacin

MTODOS QUMICOS: Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los
microorganismos.
1) OXIDO DE ETILENO:
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles
como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es
utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria
farmacutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para
esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plstico,
papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc.
Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems
cancergeno.
2) ALDEHIDOS: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas,
provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad
enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas.
3) GLUTARALDEHIDO: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y
sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague
de 10 minutos. Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico
esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc.
4) FORMALDEHIDO: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las
cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o
algodn, que despus pueden ser expuesta al calor para una rpida
esterilizacin (accin del gas formaldehdo). Tambin pueden ser usadas en
Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las
pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de
ltex, goma, plsticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura
ambiente esterilizan en 36 hs.
5) GAS PLASMA DE PEROXIDO DE HIDROGENO: Se usa la forma en gel
del perxido de hidrogeno usado a baja temperatura es biocida, no deja
residuos txicos se convierte en agua y oxigeno su actividad se logra entre
54 y 75 minutos, su utilizacin es muy costosa.
Posee como ventajas:
No deja ningn residuo txico.
Se convierte en agua y oxgeno al final del proceso.
El material no precisa aireacin.
El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos.
Desventajas:
No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodn, lquidos,
humedad, madera o instrumental con lmenes largos y estrechos.
Es el mtodo de esterilizacin ms caro de entre los descritos.
MTODOS FSICOS:
1.CALOR: la efectividad de este mtodo depende del tiempo de exposicin
y la temperatura debido a que todos los microorganismos son susceptibles
a diferentes grados de temperaturas provocando desnaturalizacin de

protenas, desorganizacin de las membranas

irreversibles.
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y procesos oxidantes
2. CALOR HMEDO: produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas

debido a que el agua genera reacciones en estructuras biolgicas debido a
que posee un coeficiente de calor mucho mas elevado que el aire,
presentando como ventajas rpido calentamiento y penetracin, destruye
las bacterias y esporas en corto tiempo, sin dejar residuos txicos, hay un
bajo deterioro del material expuesto y es econmico
2.1.AUTOCLAVE : Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin
utilizando 120 (estas condiciones pueden variar) durante 20- 30 minutos,
constituido por una caldera de cobre sostenida por una camisa externa
mecnica recibiendo calor por combustin de gas o por una resistencia
elctrica que se cierra por una tapa en bronce en la parte superior
presentando tres orificios uno para el manmetro, otro para el escape de
vapor y el tercero para una vlvula de seguridad que funciona como resorte,
se debe colocar agua en la caldera si alcanzar los objetos que se encuentra
en la rejilla de metal, se cierra asegurando la tapa, si ajustar las grapas,
dejando abierta la vlvula de escape hasta que libere todo el vapor en
forma de chorro continuo y abundante.
2.2. TYNDALIZACION: esterilizacin por accin discontinua del vapor de
agua, aplicando el principio TYNDAL, donde las bacterias son destruidas por
la repeticin de la misma operacin con intervalos separados y en varias
sesiones, efectundose por medio del autoclave, dejando abierta la vlvula
de escape, es decir funcionando a la presin normal, tambin puede
realizarse a temperatura
menores como 56 - 80 evitando la
descomposicin de las sustancias a esterilizar.
Ventajas del calor hmedo:
Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico
Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos
3. CALOR SECO:
Produce desecacin de las clulas debido a los elevados niveles de
electrolitos y fusin de membranas mediante la transferencia de calor desde
los materiales a los microorganismos la accin destructiva del calor sobre
protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material esta seco
o la actividad del medio son bajos.
La utilidad del calor seco no permite una actividad corrosiva en metales e
instrumentales, permitiendo la esterilizacin de sustancias en polvo y no
acuosas, viscosas y no voltiles.
3.1. ESTUFAS

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Se mantiene una temperatura estable mediante termostato de metal que al

dilatarse por el calor cortan el circuito elctrico generando una resistencia
la cual circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas
cmaras, a temperaturas de 170 para el instrumental metlico.
Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de
sustancias viscosas no voltiles.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo,
debido a la baja penetracin del calor.
3.2. LLAMA DIRECTA
Se usa para esterilizar asas bacteriolgicas, agujas de diseccin y se
realiza a travs del mechero.
4. RADIACIONES: su accin depende de: tipo de radiacin, tiempo de
exposicin y la dosisi. Se utilizan en salas de ciruga.
4.1. IONIZANTES:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos
nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para
la viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales
termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se
utilizan a escala industrial por sus costos.
4.2. RAYOS ULTRAVIOLETAS:
Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente
penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin
en quirfanos.
4.3. RAYOS GAMMA:
Su empleo est basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este
tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de
gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos,
vacunas, alimentos, etc.
5. FILTRACIN
Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El
tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los
filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn
en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice.
La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Su
usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones
oftlmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnsticas, radiofrmacos,
medios para cultivos celulares, y soluciones de antibiticos y vitaminas.
Materiales
Estufa
Autoclave
Horno esterilizador
Cmara de flujo laminar

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Mecheros
Cajas de petri
Papel kraft
Cinta de enmascarar
CONSULTA
1. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiologa y un
laboratorio convencional.
2. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo lquido bacteriano se
derrama sobre una superficie.
3. Qu caractersticas de un material o sustancia se requieren conocer para
elegir el mtodo adecuado de esterilizacin?
Prctica 02
Principios bsicos de pruebas inmunolgicas
Comprender el fundamento y la utilidad de los diferentes tipos de
enzimoinmunoensayos.
Establecer diferencias entre los diversos tipos de pruebas serolgicas.
Conocer el mecanismo de accin y las propiedades de las enzimas y
sustratos empleados en los enzimoinmunanalisis.
Realizar el procedimiento para la reaccin antgeno-anticuerpo.
MARCO TEORICO.
El sistema inmune es aquel conjunto de estructuras y procesos biolgicos
que en el interior de organismo genera una protege contra enfermedades
identificando y matando clulas patgenas y cancergenas. 1Detecta una
amplia variedad de agentes, desde virus hasta parsitos intestinales 23 y
necesita distinguirlos de las propias clulas y tejidos sanos del organismo
para funcionar correctamente. El sistema inmune est compuesto de
leucocitos, anticuerpos, citoquinas, macrfagos, entre otros componentes
que ayudan a su funcionamiento.
La deteccin es complicada ya que los patgenos pueden evolucionar
rpidamente, produciendo adaptaciones que evitan el sistema inmunitario y
permiten a los patgenos infectar con xito la clula husped. Sin embargo,
existen tcnicas de laboratorio que han sido diseadas para evidenciar bajo
diversas formas la reaccin antgeno-anticuerpo.
PRUEBAS DE AGLUTINACION DE PARTICULAS.
Es una reaccin serolgica clsica que comprende la aglomeracin de una
suspensin celular mediante un anticuerpo especfico. Este fenmeno se
puede observar cuando antgenos corpusculares, como las clulas
sanguneas o bacterias se exponen a un anticuerpo especfico en
condiciones adecuadas. Las reacciones con antgenos solubles se pueden
adaptar a las pruebas de aglutinacin mediante el recubrimiento o

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acoplamiento covalente del antgeno o del anticuerpo especifico o un

transportador corpuscular, es decir, eritrocitos, partculas de ltex, etc.
En esta reaccin primero se une el anticuerpo con el antgeno y luego se
produce la aglutinacin, el anticuerpo recibe la denominacin de completo.
Si el anticuerpo se une a un antgeno especfico de los hemates sin producir
aglutinacin se trata de un anticuerpo incompleto. Estos se determinan a
travs de la prueba de antiglobulina donde se produce la aglutinacin de los
eritrocitos en solucin salina cuando la mezcla contiene 20-30% de
concentracin de albumina o las clulas rojas han sido tratadas con ciertas
enzimas proteolticas. Presenta como ventaja el alto grado de sensibilidad y
la gran cantidad de antgenos que se pueden detectar mediante el uso de
partculas recubiertas de antgeno o anticuerpo. Las reacciones de
aglutinacin se pueden clasificar en directas, indirectas (pasivas) o
antiglobulinas.
Precipitacin.
Se trata de la mezcla de un anticuerpo con un antgeno homologo, estando
ambos en solucin, conduciendo a la formacin de un precipitado
frecuentemente referido como precipitado inmune. Presentan un alto ndice
de sensibilidad y pueden ser cualitativas y cuantitativas.
Clases de inmunoanalisis.
Los inmunoanalisis son tcnicas para detectar y cuantificar los antgenos o
los anticuerpos. Pueden emplearse reactivos marcados o sin marcar. Los
inmunoanalisis sin marcar presentan limitaciones en cuanto a su
sensibilidad, ya que para conseguir la deteccin deben formarse grandes
complejos antgenos-anticuerpo. Ej.: inmunoprecipitacion, de aglutinacin y
de dispersin lumnica, para detectar dichos complejos por tcnicas de
equilibrio o cinticas emplendose en el anlisis de protenas.
Las tcnicas de inmunologa clnica son de naturaleza variable tcnicas
como la fijacin del complemento que hoy son consideradas obsoletas van
siendo reemplazadas por tcnicas ms finas
como el anlisis
inmunoenzimatico
y nefelometra , por esto es indispensable estar
familiarizados con la nueva tecnologa existente y emergente lo que
conlleva a mejorar la atencin del paciente .
RADIOINMUNOANALISIS (RIA)
Consiste en le marcaje de antgenos o anticuerpos con isotopos radiactivos
para la deteccin del Ac o Ag correspondiente en la muestra del paciente,
este mtodo presenta alta sensibilidad y especificidad donde pueden ser
usadas para dosificacin de hormonas, frmacos, Antgenos y Anticuerpos.
Ejemplo cuantificacin de hormona del crecimiento, tiroideas, testosterona,
marcadores tumorales, y PSA. Estas tcnicas pueden ser de tipo en
Sandwich, competitivo.
INMUNOFLUORESCENCIA
Se utiliza para demostrar la presencia de Ag o Acs especficos buscando
visualizar la unin Ag-Ac con la ayuda de sustancias fluorescentes
(isotiocianato de fluorescena). Se utilizan dos variantes: directa e indirecta,
las cuales permiten detectar Chlamydia tracomatis, y Bordetella pertusis,
Acs antinucleares, antimitocondriales.

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ANALISIS INMUNOENZIMATICO (ELISA)

Esta tcnica dispone de un gran nmero de Acs monoclonales al desarrollo
de Ags recombinantes especficos, para muchas enfermedades infecciosas
y autoinmunes. Han tomado el lugar del radioinmunoanlisis ofreciendo
una sensibilidad comparable, sin los problemas de disponibilidad y corta
vida media asociada con materiales radioactivos aparte de la contaminacin
con estas sustancias, estas pruebas tienen la ventaja de permitir procesar
un gran nmero de muestras en corto tiempo determinando la
concentracin de un Ag o Ac por medio del uso de uno de ellos en fase
solida y el otro en solucin, detectndose posteriormente el complejo Ag- Ac
mediante una enzima catalizada por un sustrato (fosfatasa alcalina,
peroxidasa, glucosa oxidasa ).
Existen diversos tipos de ELISA: Anlisis inmunoenzimatico indirecto,
competitivo.
NEFELOMETRIA
Esta tcnica se basa en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la
refraccin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen
pasar por el tubo con el antgeno y el anticuerpo correspondiente.
Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la
cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados.
INMUNODIFUSION
Es la deteccin de complejos inmunes antgeno-anticuerpo visualizado por
precipitacin en una placa de agar pueden ser sencillas o dobles.
FIJACION DE COMPLEMENTO
Permite detectar una gran variedad de anticuerpos, el suero del paciente es
sometido a diluciones a las que se le agrega cantidades constantes del
antgeno correspondiente si hay presencia de anticuerpos en el suero se
presenta la formacin de complejos inmunes. Al adicionar complemento ala
reaccin dichos complejos fijan el complemento y lo consumen. Como paso
final se agregan a la reaccin glbulos rojos de carnero sensibilizados con
un Anticuerpo especfico (hemolisina). Que requiere del complemento
para producir lisis celular
CITOMETRIA DE FLUJO
Es un mtodo que permite la determinacin simultanea de mltiples
caractersticas fsicas de una clula, mientras pasan
a travs del
instrumento de medicin formando una sola fila a una velocidad de 5004000 clulas por segundo permitiendo estimar el tamao de la clula las
caractersticas de su superficie y citoplasma y su contenido de DNA.
RADIOINMUNOELECTROFORESIS
Es desarrollada usando antgenos o haptenos marcados con radioistopos
para la investigacin de anticuerpos.
El suero en ensayo es recorrido por una capa de gel en la canaleta
longitudinal se coloca una mezcla de antgeno radioactivo y antisuero contra
la fraccin globulnica del suero en ensayo. El antgeno se combina con el
anticuerpo especfico formando complejos que luego son precipitados por el
suero antigammaglobulina. Despus el precipitado es lavado para eliminar
las protenas no precipitadas, el preparado es secado y previa coloracin o

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sin ella las placas son puestas en contacto con una pelcula sensible a rayos
X. despus de la exposicin conveniente la pelcula es revelada.
WESTERN-BLOT
Esta tcnica es de gran ayuda en la identificacin de muchos autoanticuerpos que reaccionan con complejos antignicos relacionados, y que
por fluorescencia dan patrones de tincin muy similares difciles de
diferenciar , comienza con la degradacin del DNA a travs de una
electroforesis en el cual se evidencian las bandas luego se transfieren a una
membrana de nitrocelulosa o nailon agregando sondas marcadas con
fluorocromos la cual es complementaria a la secuencia evidencindose a
travs de rayos x.
CONSULTA.
1.- Defina que es la inmunoquimica?
2.- defina que es un anticuerpo, antgeno, precipitar y aglutinar.
3.- que son anticuerpos monoclonales y policlonales.de ejemplo de cada uno
de ellos.
4.- defina hemoaglutinacin directa e indirecta y de ejemplos.
Prctica 03
Medio de cultivo
Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de
microorganismos y aplicar los conceptos bsicos de el diagnostico
microbiolgico (coloraciones, aislamiento, e identificacin bacteriana).
Conocer las coloraciones ms utilizadas en microbiologa.
Analizar la definicin, clasificacin y propiedades de los medios de cultivo.
Determinar la descripcin microscpica de las bacterias.
MARCO TEORICO.
Como todos los organismos vivos, microorganismos requieren ciertos
nutrientes bsicos y factores fsicos para el mantenimiento de su vida,
estas necesidades varan segn el tipo de microorganismo y es necesario
conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.las necesidades nutricionales
bsicas pueden suministrarse en el laboratorio por la variedad de medios
de cultivo; estos en general suministran:
1) Fuente de carbono
2) Fuente de nitrgeno

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3) Elementos no metlicos
4) Elementos metlicos
5) Vitaminas
6) Agua
7) Energa
Las necesidades fsicas involucran factores como la temperatura, PH, gases
los cuales se encuentran en un rango
ptimo especifico para cada
microorganismo generando una variacin que acelere o disminuya su
crecimiento.
De manera general estos medios pueden ser artificiales o qumicamente
definidos en el cual los microorganismos toman sus requerimientos
nutricionales a partir de la composicin de estos medios.
Medios de cultivo
Es una solucin acuosa en las que estn presentes todas las sustancias
necesarias para el crecimiento de un determinado microorganismo.
PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La humedad: indispensable para el crecimiento de microorganismos, su
carencia (desecacin) puede llevar a la muerte del microorganismo.
Fertilidad: Se refiere a los elementos o compuestos bsicos que permiten el
crecimiento bacteriano.
PH: Es la condicin optima para el desarrollo bacteriano indispensable para
su aislamiento; variaciones acidas alcalinas pueden inhibir su crecimiento.
Transparencia: Permite la observacin bacteriolgica, evidenciar morfolgica
y fsicamente su crecimiento en medios de cultivo adecuado.
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS
SEGN SU ESTADO FISICO
Slidos = 1.5-2.0 % de agar-agar.

Semislidos = 0.5% de agar-agar.
Lquidos = no contienen agar.
Bifsicos = Contienen fase solida y fase liquida/ listos para utilizar.
SEGN SU NATURALEZA O COMPOSICION
Naturales = utilizados para cultivar m.o tal y como se encuentran

en la naturaleza, se usan con base a la experiencia y no a su
composicin. Ej. sangre diluida, leche, jugos vegetales.
Sintticos = de composicin exactamente conocida. Los ms
utilizados son los medios deshidratados comerciales.
Vivos = contienen clulas u organismos vivos, como las clulas de
rin de mono o huevos embrionados.
SEGN SU PROPOSITO
Medios enriquecidos = Con adicin de sangre, suero o extractos

de tejidos de animales o plantas al caldo o agar, proporcionando

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sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de m.o

exigentes.
Medios selectivos = con adicin de algunas sustancias que no
permiten el desarrollo de un grupo de m.o sin afectar el desarrollo de
los grupos de inters. En principio se pueden seleccionar los m.o que
se desarrollan en medios orgnicos poco comunes, caso en el cual se
omiten otros compuestos de carbono.
Medios diferenciales = contienen reactivos qumicos que traen
como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano despus
de la incubacin (observacin de hemolisis y coloraciones de las
colonias).
Medios para identificacin = para determinar el tipo de
crecimiento producido por los microorganismos as como la capacidad
para producir cambios qumicos, se utiliza de manera convencional
una amplia variedad de medios de cultivo.
Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas en la cual favorece el

aislamiento del microorganismo y muestra una reaccin o cambio qumico
especifico del metabolismo cumpliendo una funcin de medios selectivos y
diferenciales al tiempo.
La presentacin comercial de los medios sintticos y deshidratados puede
ser en polvo o granulados. En l mercado se pueden encontrar medios listos
para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos.
ALMACENAMIENTO Y CONSERVACION.
Los medios de cultivo deshidratados se deben conservar en un lugar seco,
protegidos contra la luz, a una temperatura entre 15-30
C y en envase
bien cerrados. Despus de haber sido retirada una cantidad de medio en los
envases, estos debes cerrarse firmemente. Los medios de cultivo
preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos
cortos, mximo de una semana y lo ms conveniente es almacenarlos a
temperatura de refrigeracin (mximo 4 C), aunque algunos medios que
contienen tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, y
protegidos de la luz por un tiempo mximo de 4 das. Bajo condiciones
ptimas de almacenamiento los medios deshidratados conservan sus
cualidades el tiempo indicado de caducidad impreso en la etiqueta del
recipiente.
A los medios de cultivos se les realiza Test de esterilidad, ya sea cuando
estn deshidratado (ecomtrico), o preparados. En el ltimo caso se toma
del lote una muestra no inferior al 5% incubndose estas muestras a 37C/24
horas. Finalizado el tiempo de incubacin se observa si presenta crecimiento
microbiano con el fin de descartar los medios contaminados.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
1.-DISOLUCION DEL MEDIO DE CULTIVO DESHIDRATADO.
Se debe emplear agua limpia, recin destilada o desmineralizada y con pH
lo mas cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo
suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad.

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Inicialmente, se aade la mitad de agua y se agita y se agita

suficientemente para conseguir una suspensin homognea; despus se
incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es
sensible al calentamiento, no debe calentarse ms de lo estrictamente
necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser
sometido a esterilizacin en autoclave, es imprescindible prestar atencin
en su disolucin completa, esto se conforma cuando al agitar no se adhiere
a la pared interna del recipiente ninguna partcula de agar o medio y la
solucin resbala libremente.
2.- ESTERILIZACION
Antes de su esterilizacin y despus de su completa disolucin se debe
repetir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que se lleva
a cabo el trabajo de investigacin, excepto si corresponde a cajas de Petri.
La esterilizacin, si as lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en el autoclave
121 C a 15 libras de presin por 15 minutos.
Tras la esterilizacin y despus de haber alcanzado el equilibrio de presiones
(vlvula abierta) y para evitar la sobrecarga trmica del medio de cultivo,
este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes
rpidamente a temperatura de vertido entre 45-50C, evitando la alteracin
del medio de cultivo.
3.-VERTIDO EN PLACA.
Remover previamente el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido
circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las cajas
de Petri a la temperatura de vertido evitando la formacin de humedad en
la tapa de la caja de Petri. Las burbujas de aire en la superficie de la placa
se eliminan abanicando brevemente con la llama no luminosa de un
mechero de bunsen.
4.-TUBOS DE AGAR INCLINADO Y SIN INCLINADO.
Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan
en una posicin inclinada de tal forma que se forme una placa de
aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones.
(Agar inclinado en pico de flauta). En los casos en los cuales se requiere el
medio sin inclina, estos deben dejarse solidificar en posicin vertical sobre
una gradilla.
POSIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACION Y PREPARACION DE
MEDIOS DE CULTIVO
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una

conservacin en ambiente exclusivamente hmedo, puede ser la causa
de envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase
despus de su uso o por ultimo que el medio de cultivo este pasado de
fecha. Se recomienda despus de usarlos, cerrarlos muy bien y
almacenarlos en posicin horizontal.
Desviacin del pH causado por utilizacin de agua no neutra, envase mal
cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparacin
o medio pasado de fecha.

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Turbidez, precipitacin causada por uso de recipientes incorrectamente

limpios, sobrecalentamiento, prdida de agua por evaporacin del
medio.
Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporcin inadecuada del medio
de cultivo deshidratado, mala disolucin, ineficiencia en la agitacin.
Medios de cultivo contaminados
por esterilizacin deficiente o
contaminacin en su preparacin.
Colonias incorrectas o desledas causada por superficie del medio
hmeda y por demasiado inoculo en la siembra.
CLASES DE MEDIO DE CULTIVO

MEDIOS SIMPLES
Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar
comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo.
Agar nutritivo = contiene extracto de carne, peptona, agar.
Caldo nutritivo = contiene extracto acuoso de carne adicionado de
peptona al 1% y cloruro de sodio al 0.5% EJ. BHI (brain heart infusin),
TSB (caldo de soya tripticasa).
Blood Agar base o Trypticasa soya Agar = medio solido que
contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%
usando para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para
observar la actividad hemoltica.
MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan
una serie de factores
indispensables para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de
sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.)
que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos
artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej.
Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena
para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada
adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
Agar sangre = al medio Blood agar sangre se le aade sangre de

conejo desfibrinada al 7 % estril cuando este tenga una temperatura de
45C luego de su esterilizacin.
Agar chocolate = consiste en un agar sangre que antes de su
solidificacin se lleva a 100C por 1 minuto (ebullicin) rompiendo los
glbulos rojos tomando un color marrn. Se usa para el aislamiento de
Haemophillus y Neisseria.
Medio Tioglicolato = permite el aislamiento de aerobios tolerante y
anaerbicos. Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de
manera que la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en
la superficie.

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MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El
fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el
crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio
selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de
salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas
bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un
azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El
medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo
son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS
(que es doblemente diferencial), etc.
Agar Mac Conkey = medio selectivo para el crecimiento de
enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa, y rojo neutro.
Agar SS = contiene sales biliares en mayor concentracin que el Agar
Mac Conkey y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias
coliformes pero permite el crecimiento de Salmonella y Shigella.
Agar EMB (eosina azul de metileno) = contiene colorante que impide el
crecimiento de bacterias Gram positivas, las colonias de E. coli generan
un brillo metlico caracterstico.
MEDIO DE TELURITO
Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus, Listeria. El
telurito de potasio al 2% es reducido por las Corynebacterias reductoras
apareciendo colonias de color gris-negro.
Medio de Sabouraud = contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH
entre 5-5.5 inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean
hongos.
MEDIOS DE TRANSPORTE
Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se
procesen, las conservas evitando su multiplicacin y su muerte.
Medio de Stwart = se utiliza para transportar muestras de materiales

purulentos recogidos con escobilln estril, contiene un medio de buffer
glicerinado, permitiendo el transporte de muestras de materia fecal para
coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella.
MATERIALES Y EQUIPOS
CAJAS DE PETRI
TUBOS DE ENSAYO
PIPETAS
ERLENMEYER

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AUTOCLAVE
CINTA DE ENMASCARAR
GASA
ALGODN
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS
MECHERO DE BUNSEN
ESTUFA ELECTRICA
BALANZA
ESPATULAS
AGUA DESTILADA
PROBETAS
PAPEL FILTRO
FRASCOS TAPA AZUL 250 ML
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Hacer el clculo correspondiente para la preparacin del medio de
acuerdo con las indicaciones del profesor.
Medir el volumen de agua destilada segn los clculos
Teniendo en cuenta el volumen de agua que debe utilizar, hacer la
relacin de medio a pesar de acuerdo a lo especificado por la etiqueta
del medio.
Pesar la cantidad de medio necesario de acuerdo a sus clculos.
Mezclar el medio deshidratado con la mitad del agua, agitar
suficientemente y agregar el agua restante. Llevar a ebullicin si es
necesario (en el caso de agares).
Esterilizar en autoclave segn las indicaciones que menciones la casa
comercial
Finalizada la esterilizacin servir aspticamente aproximadamente 15 o
20 ml del agar en la caja de petri o el volumen adecuado segn el
tamao de los tubos.
COLORACIONES APLICADAS EN MICROBIOLOGIA.
Las bacterias o procariotas, son microorganismos unicelulares que se
reproducen por fisin binaria (divisin simple). Muchos tienen vida libre.
Contienen informacin gentica, sistemas de produccin de energa y
sistemas biosintticos necesarios para el crecimiento y reproduccin.
Las bacterias se presentan con una morfologa definida que est
determinada por su pared rgida. Se pueden presentar como esfricas,
ovaladas, denominndose cocos. Si la forma es cilndrica se denominan
bacilos o bastones. Estos bastones pueden ser rectos, curvos o con forma de
espiral, en este ltimo caso les llamamos espirilos.
TINCION DE GRAM
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin
diferencial empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias,

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sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans

Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar
una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose
bacterias gram positivas a las bacterias que se visualizan de color moradas
y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa o rojo.
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas
bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la
pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en
equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el
yodo, y acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I 2 entra en las clulas y
forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la
decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta.
Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram
negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una
coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como
la safranina o la fuscina. Despus de la coloracin de contraste las clulas
Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para
hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azulviolceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

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PROCEDIMIENTO COLORACION DE GRAM

1.-Agregar reactivo cristal violeta sobre la lmina durante 1 minuto, lavar y
escurrir la lamina.
2.- Adicionar reactivo de lugol sobre la lmina por 1 minuto, lavar y escurrir.
3.- Adicionar alcohol cetona por 30 segundos o hasta decolorar la lamina.
4.- Agregar fuscina sobre la lmina por un minuto, lavar y escurrir.
C
CULTIVO SLIDO
E
B
CULTIVO LQUIDO
F
D
CONSULTA
Preparacin y fijacin de frotis.
1. Por qu es necesario esterilizar los medios de cultivo y realizar

controles a cada lote que se fabrica?
2. Mtodo de esterilizacin utilizado para la esterilizacin de placas de
Petri de plstico.
3. Cmo puede determinar si la colonia que se eligi para aislar es un
cultivo puro?
4. Escriba el fundamento de las siguientes coloraciones tambin aplicadas
en el campo de la microbiologa.
Coloracin Ziehl Neelsen
GIEMSA
Tinta china.

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Prctica 04
Tcnicas de Siembras y aislamientos
Que el alumno aplique diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de
cultivos de bacterias en medios slidos.
Realizar coloracin de Gram para determinar la morfologa de las bacterias
utilizadas y para adquirir destreza en la elaboracin del frotis.
MARCO TEORICO.
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del
conocimiento de tcnicas de siembra o inoculacin y de aislamiento para
transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es
indispensable para realizar diversos estudios morfolgicos, de identificacin,
bioqumicos, de patogenicidad y ecolgicos, entre otros.
El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de
SIEMBRA, esta la podemos realizar a partir de muestras biolgicas (orina,
pues, secreciones, etc.), o de un cultivo bacteriano a otro denominado
subcultivo o repique.
Para el estudio de las bacterias es necesario conocer tanto su morfologa
microscpica como macroscpica a partir de su crecimiento en medios de
cultivos; estas se observan en las colonias bacterianas; se puede evaluar el
comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o
proporcionales a aquellos nutrientes que favorezcan su desarrollo.
Los elementos importantes para realizar la siembra son: el mechero, asa
bacteriolgica y los medios de cultivo incubados y atemperados a 37C en la
incubadora, contando con estos implementos podemos realizar la siembra.
TIPOS DE SIEMBRA.
SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN CAJA DE PETRI.
Mediante ella se busca obtener colonias separadas a partir de un inoculo
para ello se toma con el asa previamente esterilizado al mechero. La
muestra; se coloca en un rea perifrica de la caja de petri haciendo
movimientos circulares para homogenizar el inoculo, precedindose a usar
estras horizontales con el asa de argolla hasta la mitad o una tercera parte
de la caja de petri. Recordar la constitucin del medio, por lo tanto, deslizar
el asa con suavidad y sin romper el agar. Gire la caja de petri hacia la
izquierda y realizar el mismo procedimiento hasta lograr el objetivo final.

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SIEMBRA EN TUBO INCLINADO.

Para la siembra en tubos con medio solido inclinado en bicel, se realiza
movimiento en zic-zac deslizando el asa sobre la superficie y marcando
surcos o estrias. Para este tipo de siembras aunque se puedan utilizar los
dos tipos de asa bacteriolgicas se prefiere el asa recta. Es importante
mantener siempre el tubo inclinado para evitar contaminacin por bacterias
ambientales que proceden de la muestra. Los tapones de algodn o las
tapas roscas de los tubos deben manipularse con el dedo meique y anular
de la mano derecha y nunca dejarlo sobre los mesones, ellos pueden
contaminar la siembra.
Es importante flamear el asa antes de tomar la muestra, y flamear la boca
del tubo, no tocar las paredes del tubo con la muestra y devolver el asa a su
lugar previamente esterilizada despus de haber realizado el procedimiento.
SIEMBRA POR PICADURA EN TUBO.
Se realiza con el asa recta en medio solido generalmente sin inclinar aunque
puede ser en agar inclinado en algunas ocasiones. Se introduce el asa con el
inoculo por el centro de la superficie del medio de cultivo y hasta el fondo.
No olvidar inclinar el tubo, flamear la boca junto al mechero y manipular
correctamente los tapones.

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SIEMBRA MIXTA EN TUBO.

Se realiza en forma combinada en picadura hasta el fondo del tubo y
deslizando el asa por la superficie del agar en bisel marcando estras.
SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO EN TUBO.
Se puede utilizar el asa bacteriolgica, pipetas estriles, escobillones. Si se
utilizan asas bacteriolgicas, inocular el asa en el medio liquido hacindola
rotar.
Se debe marcar las cajas los tubos con sus respectivos nombres y fechas.
Luego de realizar la siembra se debe proporcionar la temperatura y el
tiempo adecuado para la proliferacin o crecimiento bacteriano disponiendo
de la incubadora o en dado caso un lugar adecuado a temperatura
ambiente. Recuerda que las cajas de petri se incuban invertidas para evitar
que la condensacin que pueda formarse en la tapa de la caja caiga sobre el
medio y disperse el crecimiento bacteriano.
La morfologa de las colonias es un parmetro importante en el proceso de
identificacin bacteriana siendo las caractersticas comunes entre cada
gnero bacteriano. Sin embargo esta morfologa puede alterarse por tiempo
de incubacin, composicin del medio de cultivo excesiva desecacin de
humedad etc.
OBSERVACION MACROSCOPICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO.
Se realiza a travs de las caractersticas de las colonias aisladas,
evalundose de la siguiente manera:
Tamao= grande, mediano, pequeo, puntiforme.
REDONDEADO
ESPICULADO
PLANA
ACUMINADA
PUNTIFIORME
IRREGULAR
ONDULADO
FILAMENTOSO
PLANO CONVEXA
UMBONADA
CIRCULAR
RIZOIDE
LOBULADO
RIZOIDE
CONVEXA
PAPILALDA
FILAMENTOSA
FUSIFORME
PLANA
ACUMINADA
REDONDEADO ESPICULADO
PUNTIFIORME
IRREGULAR
PLANO CONVEXA
UMBONADA
ONDULADO
CIRCULAR
RIZOIDE
FILAMENTOSO

CONVEXA
PAPILALDA
Forma
LOBULADO
RIZOIDE
Borde
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FILAMENTOSA
FUSIFORME
Elevacin
Superficie = lisa o rugosa.

Consistencia = blanda, dura o mucoide.
Aspecto = brillante u opaco, traslucido.
Pigmento= amarillo, rojo, verde, etc.
hemolisis= parcial o alfa, total o beta, no hemolisis o gamma.
PROCEDIMIENTO.
1.-Limpiar y desinfectar el rea de trabajo.
2.- Realizar el frotis para la coloracin.
3.- Sembrar por agotamiento en las respectivas cajas de medios de cultivo.
4.- Observar macroscpicamente el crecimiento bacteriano: tamao, forma,
borde, color, hemolisis.
Consulta
1. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin y
fijacin de frotis?
2. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la tincin de Gram?
3. Cules son las ventajas y desventajas de la tcnica de estra cruzada o
por agotamiento? Proponga otras tcnicas de aislamiento en medios slidos
que se aplican en microbiologa.
4. fundamento de los medios de cultivo EMB, AN, MAC CONKEY Y TSI.
Prctica 05
Tipo de muestras tiles en microbiologa, estructuras
micticas, hongos ambientales, toma de muestra.
Reconocer morfolgicamente las estructuras microscpicas de los diversos
hongos.
Reconocer las estructuras propias de los hongos filamentosos o mohos.
Conocer e identificar las diversas formas de toma de muestra y su
correspondiente transporte en el rea de microbiologa.
Observar diferentes cultivos de hongos ambientales identificar su aspecto,
color y pigmento.
Reconocer las estructuras de reproduccin de los hongos ambientales con
las cuales se pueden hacer su caracterizacin en el laboratorio.
MARCO TEORICO.
TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS.
La calidad diagnostica del laboratorio de microbiologa clnica depende de
la calidad de la muestra recibida y su optima recoleccin y transporte,
debido a que un error en estos parmetros conlleva a errores diagnsticos y
un posterior tratamiento inadecuado.

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La muestra debe cumplir las siguientes indicaciones:

1.-nombre completo
2.-documento identidad
3.-gnero.
4.- paciente hospitalizado = piso, sala, cama.
5.- solicitud de examen
6.- impresin diagnostica.
CRITERIOS DE RECHAZO DE LAS MUESTRAS
Inconsistencia en la identificacin del paciente
Muestra enviada en un frasco no estril o con conservante.
Muestras con prdidas o derrames
Muestra con cantidad insuficiente
Muestras con evidencia de contaminacin
MUESTRAS PROCESADAS EN MICROBIOLOGIA.
1.-TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
EXUDADO FARINGEO
CAVIDAD OROFARINGEA
SENOS PARANASALES
EXUDADO NASAL
2.- MUESTRAS DE OIDO.

CONDUTO AUDITIVO EXTERNO
OIDO MEDIO TIMPANOCENTESIS.
3.- MUESTRAS OCULARES
EXUDADO CONJUNTIVAL
RASPADOS CORNEALES
4.- MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR
EXPECTORACION
ASPIRADO TRAQUEAL
SECRECIONES TRAQUEALES.
PUNCION TRANSTRAQUEAL
5.- MUESTRAS OBTENIDAS A TRAVES DEL FIBROBRONCOSCOPIO.
ESTRUCTURAS MICOTICAS
Los hongos ambientales son contaminantes que circulan en la atmosfera de
cualquier lugar, contaminan medios de cultivo, dentro de sus beneficios
participan en el control biolgico de plagas, degradan desechos orgnicos,
se utilizan en la produccin de alimentos antibiticos y qumicos.

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Dentro de su forma de condicin encontramos: blastoconidias,

hialinos septados, aseptados y dematiaceos.
mohos
ESTRUCTURAS SOMATICAS DE LOS MOHOS

Conidiforo
Esterigma
Vesculas
Microconidias
Metula
Esporangioforo
Esporangio
Esporangiosporas
Columnela
Rizoide
Fialides
Macroconidias.
ESTRUCTURAS MICOTICAS DE LAS LEVADURAS.
BLASTOCONIDIAS.
HONGOS TELEOMORFOS = reproduccin sexual, se encuentran ascos con
ascosporas basidios con basiodiosporas.
HONGOS ANAMORFOS = REPRODUCCION ASEXUAL artroconidos,
blastoconidias, clamidoconidias, dictioconidios, aleurioconidios.
HONGOS HOLOMORFOS
reproduccin.
PERFECTOS = tienen los dos tipos de
PROCEDIMIENTO
1.- Observar y describir la morfologa mictica.
2.-montaje y observacin de los hongos.
3.- descripcin de los elementos observados.
4. realizar subcultivos de otros cultivos micoticos en agares slidos.
CONSULTA
1. medios de cultivo utilizados para el aislamiento de hongos
2. Tcnicas de laboratorio utilizadas para la identificacin de hongos
3. mencione 5 hongos ambientales (gnero y especie) y dibuje su estructura
clave de identificacin.

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Prctica 06
Protozoos intestinales, coprolgico, coproscpico
Identificar la morfologa de los diversos parsitos que causan alteraciones
intestinales en el organismo.
Reconocer los equipos, materiales, reactivos que se utilizan en el laboratorio
de parasitologa, y recordar los principios fundamentales de trabajo en el
laboratorio.
Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las muestras
de materia fecal utilizadas en el coprolgico.
Visualizar e identificas estructuras parasitarias en el microscopio.
MARCO TEORICO.
El diagnostico de las enfermedades parasitarias no siempre es posible
hacerlo por medio de la clnica y aun cuando este sea posible, siempre es
necesario comprobarlo por la demostracin del agente etiolgico o por la
comprobacin de las reacciones que puede presentar
el organismo
parasitado. As pues los mtodos de diagnostico parasicolgico en el
laboratorio se puede dividir en:
Mtodos directos = permiten ver al parasito, o sus estructuras (quiste,
huevos, larvas, trofozoito).

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Mtodos indirectos = se investigan las reacciones citolgicas o humorales

del organismo parasitado (presencia de anticuerpos, estados alrgicos, etc.)
estos mtodos tienen un valor diagnostico inferior al de los mtodos
directos.
Tcnicas comunes para detectar parsitos intestinales.
Coprolgico.
Coproscpico (sangre oculta-azucares reductores)
Tcnicas de concentracin
Ziehl neelsen modificado.
Mtodo de Graham.
INTERPRETACION DEL COPROSCOPICO:
Este examen incluye, adems de un examen coprolgico corriente, las
siguientes pruebas: leucocitos, pH y azcares reductores.
El pH fecal puede ser til para la determinacin etiolgica, pH cidos indican
EDA de tipo viral y pH alcalinos indican EDA invasivas.
El pH fecal est alterado en la intolerancia de los azcares, porque la
reduccin de los azcares por las bacterias en el colon produce cido. Los
micelios nos indican EDA producida por hongos (las levaduras no tienen
importancia).
Los azucares reductores estn representados principalmente por lactosa y
glucosa. Se consideran como indicadores de infecciones virales, infecciosas
o indeterminadas en los nios.
Interpretacin: Reaccin intensa cualitativa a la lactosa es compatible con
diarrea bacteriana txica. A la glucosa, con diarrea viral. La deficiencia de
discaridasa manifestada por no desdoblar la lactosa de la leche materna, da
intensa reaccin positiva a la lactosa. Los leucocitos estn presentes en las
heces en enfermedades intestinales inflamatorias, esto puede ser el
resultado de una EDA bacteriana o parasitaria, es as que entre 10-20
leucocitos (principalmente polimorfonucleares) indican EDA bacterianas
invasivas 24.
Preparacin del material a observar.
La solucin salina se usa para la investigacin de todos los parsitos
intestinales y de sus formas derivadas (trofozoito-huevos- larvas) y en
ella podemos ver sus movimientos, y realizar su respectiva
caracterizacin. Los huevos inmviles se ven con su morfologa
especfica que ayudan a reconocerlos, los quistes de los protozoarios se
vern refringentes, incoloros y muchas veces no es posible determinar a
qu especie pertenecen.
Con el lugol, los quistes de protozoarios y los huevos se colorean
detallando sus estructuras, los ncleos, flagelos, membrana, etc.
Recoleccin.
Las muestras fecales deben recogerse durante las deposiciones en un
recipiente limpio, seco, de boca ancha y tapa hermtica que mantenga la
humedad. En el caso del Coproscpico se debe evitar comer carnes rojas,
tomates, remolachas debido a que pueden ocasionar interferencias en la
lectura de sangre oculta. El uso de laxantes y antibiticos debe suspenderse

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porque puede inhibir o bloquear momentneamente la aparicin de los

parsitos.
EXAMEN FISICO.
En este examen se describen los siguientes aspectos:
Cantidad
Color
Consistencia
Cantidad = normalmente se excretan aproximadamente 100gr de materia
fecal en 1 da. Este vara segn el estado del aparato digestivo y la ingestin
de alimentos.
Color = debido a la presencia de urobilina, los alimentos, medicamentos y
patologas varan. Normalmente van de pardo claro a pardo oscuros,
observndose a veces de color amarillo, negro, blanco, verdoso, etc. Se
presentan variaciones de color por enfermedades como la hepatitis, TBC,
gastritis erosivas.
Consistencia = Normalmente son blandas pero moldeadas, segn la
consistencia se clasifican en:
Liquidas o acuosas en diarreas
Blandas
Pastosas
Duras o formadas en estreimiento
Mucoide.
Residuos alimenticios de origen animal.
Fibras musculares = tienen forma rectangular, color amarillo y estras
transversales y longitudinales. Con lugol toman color rojizo.
Grasas = gotas refringentes de diferentes tamaos amarillas o
transparentes, con bordes netos de color negro y se tien con el lugol de
amarillo claro.
Residuos alimenticios de origen vegetal.

Almidn = tienen forma irregular, en solucin salina son transparentes y
en el lugol se colorean, cuando estn no digeridos toman un color violeta
o negro y los parcialmente digeridos toman un color morado o rojo.
Clulas o fibras vegetales = en ocasiones se ven formando un retculo
en forma de panal, las fibras, a veces, se presentan como estructuras
alargadas de doble pared con un canal central marcado o en forma de
espiral.
Pelos vegetales = se parecen a las larvas de algunos parsitos, pero un
examen cuidadoso permite diferenciarlos con facilidad por su falta de
movilidad: su pared es muy refringente y homognea y adems poseen
un conducto central que recorre toda su longitud.
PRODUCTOS DE IRRITACION DE LA MUCOSA INTESTINAL.

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Cuando se presentan patologas a nivel intestinal, de cualquier origen,

puede observarse microscpicamente diferentes estructuras propias de la
mucosa intestinal irritada, que son de gran ayuda para establecer el
diagnostico de dichas patologas. Estas pueden ser:
Clulas epiteliales = indican irritacin solo cuando se encuentran muy

aumentadas en materia fecal.
Moco = cuando es abundante se aprecia a simple vista, debe
confirmarse con otras estructuras como leucocitos, hemates, etc.
Bacterias = constituyen el 30% del volumen de la materia fecal son de
importancia cuando se encuentran aumentadas o disminuidas.
Hemates = estructuras pequeas, redondeadas, que solo aparecen en
materia fecal cuando la lesin se halla en la parte baja del intestino, ya
que se desintegran rpidamente.
Leucocitos = son de mayor tamao que los eritrocitos, en ocasiones es
posible observar su ncleo. Generalmente estn asociados con moco y
son de ayuda para diferenciar el tipo de diarrea.
Levaduras y micelios = normalmente se observan algunas levaduras
en las muestras de materia fecal presentan forma ovalada cuando estn
aumentadas presentan importancia clnica.
Blastocystis hominis = presenta un corpsculo interno homogneo o
finalmente granuloso y un citoplasma granular rodeado de una capsula
delgada con ncleos alrededor de la periferia.
Protozoos = son organismos unicelulares en forma y tamao variable,

poseen diferentes organelos de locomocin, flagelos, cilios, y pseudpodos.
Los protozoos existen en dos formas: la vegetativa o trofozoito que es la
forma patgena y la qustica o quiste que es la forma infectante. Los
quistes son resistentes y sobreviven en el medio a condiciones adversas.
Entamoeba histolytica.
Este protozoo presenta 4 estadios: trofozoito, prequiste, metaquiste, quiste,
puede causar abscesos hepticos.
Trofozoito = se observa en materias fecales frescas es la forma mvil de la
amiba, tamao de 20-60 micras. Ectoplasma y endoplasma claramente
separados.
Ectoplasma = hialino, transparente, refringente.
Endoplasma = granuloso
Pseudpodos = se originan en el ectoplasma, son delgados, digitiformes y
rpidos, tienen movimiento unidireccional.
Fagocitan glbulos rojos.
Quiste = es la forma mas frecuente utilizada para hacer el diagnostico de
amibiasis, se observan mejor en lugol.
Forma = redondeada, bien delimitada por la membrana.
Tamao = 10-20 um
Ncleos = de 1-4
Amebas no patgenas.

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Entamoeba coli = mide de 15-50 micras, con pseudpodos gruesos,

cortos, y emergen de manera lenta, fagocitan bacterias y otros materiales
nunca glbulos rojos.
Trofozoito = se observa en materia fecales frescas son muy lbiles a los
agentes externos, es la nica forma mvil de la ameba.
Quiste = es de forma redondeada, de 10-30 micras, de 1-8 ncleos.
Endolimax nana.
Los trofozoitos son muy pequeos miden de 6-26 micras, fagocita bacterias
y nunca glbulos rojos, el ncleo no presenta cromatina perifrica y el
cariosoma es grande irregular y colocado excntricamente en su interior.
Tiene una forma oval y elipsoide presenta de 1-4 ncleos membrana poco
aparente y tiene una coloracin ms plida que las otras amebas.
Iodamoeba bustchlii.
Presenta dos estadios: trofozoito y quiste presenta una vacuola de
glucgeno la cual se tie de oscuro y presenta sus contornos bien definidos
mide de 10-20 micras.
Giardia lamblia = se asocia a cuadros diarreicos en nios y menos
frecuente en adultos, el trofozoito tiene 8 flagelos y una ventosa centras con
la que se fija a la mucosa.
Chilomastix mesnili = habitante normal del ciego, en donde los trofozoitos
viven a expensas de bacterias entricas y se multiplica por fisin binaria.
MATERIALES
Lugol parasitolgico
Solucin salina fisiolgica
Microscopios
Laminas y laminillas
Marcador vidrio
Cajas de palillos
Jabn liquido
Gasas
PROCEDIMIENTO
Cada estudiante debe realizar el informe completo del examen fsico de

la muestra suministrada.
Hacer las preparaciones en fresco de la materia fecal.
Observar al microscopio y diferenciar restos de origen animal y vegetal,
flora bacteriana, presencia o ausencia de parsitos intestinales.
Consignar en el cuaderno de informes lo visto en la prctica, haciendo
grficos de lo observado.

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CONSULTA
1) A que se le llama Periodo de invasin parasitaria?
2) Examen de guayacol en heces explicar metodologa e interpretacin
clnica.
3) Nombre las amebas que pueden producir disentera?
4) Explique cmo se realiza el test de Graham.
Prctica 07
Morfologa bacteriana Cocos Gram Positivos
Diferenciar el gnero Staphylococcus de Streptococcus, y determinar la
capacidad de las bacterias para producir enzimas que degradan molculas,
invaden tejidos, colonizar o evadir sistemas de defensa de hospederos.
Identificar algunas enzimas producidas por bacterias realizando pruebas in
vitro.
Interpretar y reportar las reacciones bioqumicas que ocurren en cada
prueba de forma tal que se articulen a esquemas para identificacin
bacteriana.
Observar morfologa macroscpica y microscpica de Staphylococcus y
Streptococcus.
Realizar las pruebas de coagulasa, catalasa.
MARCO TEORICO.
Genero Staphylococcus.
Formado por organismos patgenos y no patgenos, comprende cocos gran
positivos agrupados irregularmente, mesofilicos no formadores de esporas
generalmente resistentes a desecacin especialmente en materia orgnica
como sangre, pues y fluidos, pueden sobrevivir fuera del cuerpo humano
hasta por varios meses.
Son microbiota de la piel y las mucosas del tracto respiratorio superior,
tienen importancia medica: Staphylococcus aureus, S. epidemidis, S
saprophyticus.
Crecen con facilidad en medios lquidos como caldo nutritivo y BHI, y medios
solidos como agar sangre, nutritivo y agar chocolate.
Se necesita una incubacin de 18-24H para un crecimiento optimo en
atmosfera de aerobiosis se recomienda dejar hasta 96H los cultivos de
muestras clnicas
cuando hay presencia de pacientes con terapia
antibitica.
El Staphylococcus aureus puede presentar hemolisis en agar sangre lo cual
demuestra la actividad metablica por la produccin de hemolisinas.
Ciertas caractersticas metablicas nos permiten identificar el gnero
(catalasa) y la especie (coagulasa).

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Los estafilococos que se desarrollan en aerobiosis producen la enzima

catalasa, para no obtener falsos positivos la prueba de catalasa no se debe
realizar en colonias que crecen en agar sangre porque los glbulos rojos
presentan esta enzima.
La identificacin de los estafilococos esta basada en sus caractersticas
macroscpicas y microscpicas, produccin de enzima como la catalasa,
coagulasa, DNAsa y fermentacin del manitol, donde esta ultima permite
diferenciar especies de S. aureus que utilizan esta fuente de carbohidratos.
Streptococcus sp.
Son gran positivos no esporulados catalasa, oxidasa negativo, con
temperatura optima de crecimiento de 37 grados, colonias puntiformes
circulares, de translucidas a opacas, con requerimientos nutricionales
exigentes los cuales son ofrecidos por el agar sangre al 5% permitiendo
evidenciar la produccin de hemolisinas. Son anaerobios facultativos
creciendo en atmosfera de dixido de carbono en una concentracin entre
el 5-10%.
Los estreptococos se pueden clasificar principalmente por dos puntos de
vista:
1) Segn su hemolisis
a) Alfa hemolisis = hemolisis incompleta, una zona verdosa alrededor de
la colonia a este pertenecen Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae.
b) Beta hemolisis = destruccin completa de los glbulos rojos y a estos
pertenecen Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae.
c) Gamma hemolisis = no presentan hemolisis alrededor de las colonias.
PRUEBAS
PRESUNTIVAS
DE
BETAHEMOLITICOS.
1) Prueba de susceptibilidad a la bacitracina
2) Resistencia al trimetopin sulfa (SXT)
3) Prueba d CAMP.
4) Determinacin de polisacrido de grupo.
IDENTIFICACION
PARA
PRUEBAS PRESUNTIVAS DE IDENTIFICACION ALFA HEMOLITICOS.

1) Prueba de Optoquina.
PRUEBAS CONFIRMATORIAS PARA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1) Solubilidad en bilis.
2) Fermentacin de la inulina.
PRUEBAS PRESUNTIVAS DE IDENTIFICACION GAMMA HEMOLITICO.
1) Prueba de hidrlisis de la bilis esculina
2) Prueba de tolerancia al NACL al 6.5%.
MATERIALES Y EQUIPOS.
Laminas portaobjetos (estudiante)
Cubreobjetos (estudiante)
Asas bacteriolgicas (estudiante)
Palillos de dientes (estudiante)

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Cepas: Staphylococcus sp, Streptococcus sp.

Agar sangre, Agar nutritivo, Agar manitol.
Solucin salina al 0.9%.
PROCEDIMIENTO.
A partir de las cepas de Staphylococcus sp realice:
1) Pruebas catalasa
2) Pruebas coagulasa
3) Coloracin de gran
4) Siembras en agar sangre y salado manitol.
A partir de cepas de Streptococcus sp realice:
1) Siembra en agar sangre
2) Coloracin de gran
3) Prueba de catalasa
4) Pruebas confirmatorias segn la hemolisis.
CONSULTA
1) Investigue la utilidad del medio salado manitol.
2) Metodologa e interpretacin clnica de la prueba de CAMP
3) Metodologa e interpretacin clnica de la prueba DNAsa.
Prctica 08
Enterobacterias, Antibiograma
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Identificar los gneros ms representativos de la familia enterobacteriaceae,
por observacin de sus caractersticas macroscpicas, microscpicas y
bioqumicas.
Realizar pruebas bioqumicas en diferentes gneros de Enterobacterias para
llevar a una identificacin segn sea su metabolismo.
Determinar la aplicacin de los medios de identificacin bioqumica.
Identificar la clasificacin de los antibiticos y el mecanismo de accin en la
clula bacteriana.
Conocer el fundamento de la tcnica de antibiograma de difusin en agar.
MARCO TEORICO.
La familia enterobacteriaceae est formada por bacilos gram negativos
pleomorficos no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, fermentan
la glucosa con o sin produccin de gas, reducen nitratos a nitritos, oxidasa
negativo, catalasa positiva, muchos son patgenos para seres humanos,
animales o plantas.
Su papel como microbiota normal del intestino grueso es el de la sntesis de
vitamina k ayudando a la absorcin de nutrientes y el de la defensa contra
la colonizacin de otros microorganismos, dependiendo esta de
la
competencia por nutrientes esenciales de la elaboracin activa de
sustancias bactericidas y de cidos grasos de cadena corta, su hbitat es el
intestino de all su nombre, pueden estar presentes en faringe, genitales
externos, suelo y agua.
Pueden ser divididas en serotipos con base en el anlisis antignico por
reacciones de aglutinacin o precipitacin de tres antgenos, somtico O,
flagelar H y capsular K.
IDENTIFICACION.
Las Enterobacterias pueden ser bacilos muy cortos de tamao medio, cortos
o muy largo, depende de la edad del cultivo y de las condiciones de
crecimiento.
Son muy fciles de cultivar, se observan una variedad de colonias
dependiendo el gnero y especie a identificar.
Para su identificacin se emplean medios de cultivo que segn su aplicacin
pueden ser:
Escasa selectividad = Mac Conkey, Eosina Azul de Metileno (EMB),
Moderadamente selectivos = Agar Salmonella-Shigella, Hecktoen
Enteric (HE), Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).
Altamente selectivos = Bismuto Sulfito.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Posterior al aislamiento en medios diferenciales y selectivos se debe realizar
identificacin basada en la fermentacin de carbohidratos, descarboxilacion
o desaminacion de aminocidos, produccin de ciertos metabolitos como el
H2S, La utilizacin de determinados sustratos como nica fuente de carbono
como el citrato de sodio y la movilidad.

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ANTIBIOGRAMA
Es una prueba In Vitro de sensibilidad a los antibiticos cuya finalidad es la
orientacin mdica sobre la sensibilidad o resistencia a un antibitico de un
microorganismo que ha sido aislado de una muestra clnica.
SELECCIN DE LOS ANTIBIOTICOS
De acuerdo a la localizacin del proceso infeccioso o segn el tipo de
microorganismo se debe seleccionar el antibitico a utilizar.
En el caso de infecciones urinarias, siempre se deben seleccionar los
siguientes antibiticos, trtese de grmenes Gram positivos o Gram
negativos:
Nitrofurantoina
Acido Nalidixico.
Acido Pipemidico.
Norfloxacina.
Acido oxolinico.
Estos antibacterianos se utilizan exclusivamente sobre patgenos de vas
urinarias ya que solo se concentran adecuadamente a dicho nivel, son
conocidos como ANTISEPTICOS URINARIOS.
Adems de los antispticos urinarios en los pacientes con cistitis o
pielonefritis, se deben incluir los siguientes antimicrobianos.
Trimetopin sulfa
Ampicilina
Aminoglucosidos.
Cefalosporinas de segunda y tercera generacin.
No incluir discos de tetraciclina y cloranfenicol porque son poco eficaces en
la patologa urinaria, tampoco incluir penicilinas naturales ni Cefalosporinas
de primera generacin porque no presentan actividad bactericida contra
Enterobacterias que son los grmenes ms comunes e procesos de infeccin
urinaria.
Los antibiticos mas utilizados en infecciones de vas urinarias son los
Aminoglucosidos, donde se destacan:
Gentamicina
Kanamicina
Amikacina
Netromicina
Streptomicina.
Netilmicina.
Las Cefalosporinas son betalactamicos que se clasifican en:

o Primera generacin = cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefadroxil, y
cefradina.
o Segunda generacin = cefurozima, cefamandol.

o
o
Tercera generacin = cefotaxima,

cefoperazona.
Cuarta generacin = cefepima.
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ceftazidima,
ceftriaxona,
Para la infeccin de Pseudomona se utiliza independiente de su localizacin,

siempre:
Aminoglucosidos,
Cefalosporinas
de
tercera
generacin
(ceftazidima) y una penicilina antipseudomona tambin llamada
ureidopenicilina (como la piperacilina y la combinacin de piperacilina y el
tazobactam), Cefalosporinas de cuarta generacin como el meropenem y
imipenem (carbapenem).
Cuando se trata de un Staphylococcus nunca debe faltar en el antibiograma
una penicilina resistente a la penicilinasa, ejm: oxacilina, cloxacilina,
dicloxacilina,
Cefalosporinas
de
primera
generacin:
cefazolina,
Aminoglucosidos como Gentamicina y Amikacina.
La vancomicina y la teicoplanina (glucopeptidos) son absolutamente
necesarios porque son antibiticos de eleccin porque se utilizan en casos
de Staphylococcus aureus meticilino resistentes y se debe utilizar linezolid,
daptomicina para las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la
vancomicina.
En infeccin por otras bacterias gram positivas debe colocarse penicilina G y
eritromicina.
En el caso de Salmonella se debe utilizar cloranfenicol, trimetopin sulfa,
ampicilina, ciprofloxacina, adems el ceftriazone.
METODOS DE REALIZACION DE ANTIBIOGRAMA.
1) ANTIBIOGRAMA POR DILUCIN = permite cuantificar la sensibilidad
del microorganismo frente a diferentes concentraciones de antibitico
determinando la concentracin mnima que inhibe el crecimiento
bacteriano (CMI). Es importante en procesos infecciosos donde se hace
necesario un esquema de dosificacin y cuando los resultados del
antibiograma en difusin son de dudosa interpretacin.
2) ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR. Se conoce como
antibiograma de disco, procedimiento estandarizado para bacterias
comnmente aisladas y de crecimiento rpido como Enterobacterias y
Staphylococcus.
MATERIALES Y METODOS.
Asas bacteriolgicas redonda y recta.
Coloracin de gram
Fsforos
Gradillas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Solucin salina 0.9%
Lpiz marcador.
PROCEDIMIENTO PARA EL PRIMER DIA.

1)
2)
3)
4)
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Observacin y descripcin de la morfologa de las colonias.

Realizar coloracin de gram y observar morfologa microscpica.
Repicar la cepa en los medios de cultivo.
Incubar a 37 durante 24 horas.
PROCEDIMIENTO PARA EL SEGUNDO DIA.

1) Observar y describir el aspecto de las colonias en los diferentes medios
de cultivo.
2) Revelar, leer e interpretar las pruebas de identificacin bioqumica.
3) Identificar gnero y especie de la cepa. .
RECUERDA
AL INFORMAR UNA COLORACION DE GRAM SE DEBE ESCRIBIR LA
MORFOLOGIA Y EL TIPO DE TINCION. NO OLVIDAR QUE LOS NOMBRES DE
LAS BACTERIAS SE ESCRIBEN SIGUIENDO LAS NORMAS PREESTABLECIDAS.
CONSULTA
1) Fundamento de la tcnica de Kirby Bauer.
2) En que casos no se deben hacer un antibiograma?
3) Nombre otras tcnicas utilizadas para la realizacin de los
antibiogramas.
4) Cul es la tcnica ms utilizada en la actualidad para la realizacin de
los antibiogramas y porque?
Prctica 09
Tuberculosis
Conocer las condiciones para la recoleccin de muestras en el diagnostico
de tuberculosis.
Conocer los protocolos para el diagnostico de tuberculosis pulmonar y
extrapulmonar.
Realizar leer e interpretar la baciloscopia.
MARCO TEORICO.
La tuberculosis es una infeccin bacteriana crnica, granulomatosa
localizada en los pulmones afectando cualquier otro rgano del cuerpo
humano.
El agente causal en la gran mayora de los casos es el Mycobacterium
tuberculosis presentando caractersticas de bacilos acido alcohol
resistentes, aerobios estrictos, inmviles, no forman endosporas, de
crecimiento lento con una envoltura de cidos micolicos, son bacterias
intracelulares.
Es transmitida de persona a persona principalmente por va respiratoria.

La
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posibilidad de invasin depende de cuatro factores:

Caractersticas del enfermo.
Entorno en que tiene lugar la exposicin.
Duracin de la exposicin.
Susceptibilidad del receptor.
Los pulmones son los rganos principalmente afectados, sin embargo, es

una enfermedad sistmica ocasionando alteraciones en diversos rganos.
El derrame pleural puede ocurrir en la primo infeccin, liberando pequeas
cantidades de protenas de los bacilos.
La tuberculosis miliar se produce por la erosin de un vaso sanguneo que
permite la entrada al sistema circulatorio de gran cantidad de bacilos
permitiendo la diseminacin a numerosos rganos.
Diagnostico bacteriolgico
Es el mtodo que permite la confirmacin de la tuberculosis activa el
diagnostico se establece mediante el crecimiento e identificacin del
Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras clnicas dicho estudio debe
realizarse en todas las personas con sospechas de tuberculosis activa, en el
cual se deben recoger tres muestras de ESPUTO especialmente en la
maana y de ser posible antes de iniciar el tratamiento antituberculoso.
Otras muestras orgnicas pueden ser procesadas tales como: orina, LCR,
liquido pleural, aspirado ganglionar, pus, sangre. Deben ser recogidas en
envases estriles y enviadas al laboratorio lo ms pronto posible o
conservarlas refrigeradas a 4 grados centgrados hasta el envi.
RECOLECCION DE MUESTRAS
El envase debe ser desechable, estril, de cierre hermtico, boca ancha.
El paciente debe recolectar la muestra de esputo por tres das consecutivos
en las horas de la maana para realizar el examen o proceso de cada da.
En caso de que no pueda asistir tres das consecutivos al laboratorio deben
platearse las siguientes alternativas:
Debe recolectarse la primera muestra en el momento de la consulta
La segunda al despertar al da siguiente.
La tercera en el momento de entrega de la segunda muestra.
ASPIRADO GASTRICO
Ideal en los casos donde no se obtiene la muestra ni siquiera en forma
inducida, frecuentemente se aplica en los nios, en horas de la maana con
el paciente en posicin supina y en ayunas, suele realizarse a pacientes
hospitalizados.
LAVADO BRONCOALVEOLAR
FIBROBRONCOSCOPIA. Es utilizado para obtener una buena muestra del
lavado
broncoalveolar,
del
broncoaspirado,
cepillado
y
biopsia
transbronquial.
ORINA

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Se toma de la misma forma que para urocultivo, procesando mnimos tres

muestras de diferentes das.
LCR
Debe ser recolectado en tubo estril con tapa rosca.
LQUIDO PLEURAL, PERITONEAL, PERICARDICO O ARTICULAR.
Se deben recolectar en frasco estril con tapa rosca y aadirle citrato de
sodio o heparina al 1% para evitar coagulacin.
ASPIRADO GANGIONAR, PUS, BIOPSIAS.
Se transporta en tubo o frasco estril con tapa estril sin aadir ninguna
sustancia.
BACILOSCOPIA O BK
Se utiliza por medio de la coloracin de Ziehl Neelsen, basndose en las
caractersticas de la bacteria por ser acido alcohol resistente, debido a su
envoltura lipidica que impide la decoloracin del alcohol acido.
La muestra se recoge en un frasco de boca ancha, y con un bajalenguas
partido por la mitad se procede a tomar el esputo, en el cual se extiende
sobre la lmina portaobjetos previamente limpia y totalmente estril.
PROCEDIMIENTO
1.- Realizar el extendido de la muestra sobre la lmina portaobjeto con un
baja lenguas partido por la mitad.
2.- Agregar fuschina fenicada por 10 minutos, flamear previamente la
lamina y evitar que se seque. Lavar y escurrir.
3.- Agregar alcohol acido al 3% hasta decolorar. Lave nuevamente.
4.- Adicionar azul de metileno por 2 minutos y lave con agua de la llave.
5.- Observar al microscopio.

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MATERIALES
Laminas cubreobjetos.
Laminas portaobjetos.
Marcador de vidrio verde, azul, negro.
Papel kraf.
Bajalenguas.
CONSULTA
1) Nombre otras tcnicas utilizadas en la identificacin de micobacterias.
2) Diga la escala de lectura del cultivo de Ogawa kudoh.
3) Criterios utilizados en el laboratorio clnico para rechazar o aceptar una
muestra de esputo.
Prctica 10
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Diagnstico de infecciones de piel, tejidos

blandos y anlisis de Liquido Cefalo-raquideo
Identificar las bacterias asociadas a cuadros infecciosos de piel y tejidos
blandos y sus mtodos de aislamiento.
Interpretar la lectura de la baciloscopia para el diagnostico de Lepra.
Interpretar los diversos estudios que se realizan en una muestra de LCR.
Conocer las diversas tomas de muestra de piel y tejidos blandos.
MARCO TEORICO.
1) INFECCIONES EN PIEL Y TEJIDOS BLANDOS.
A nivel de piel y estructuras adyacentes se presentan patologas variadas,
todas ellas con su etiologa, localizacin y caractersticas.
Proceso
infeccioso
Imptigo
Localizacin
Caractersticas
Agentes etiolgicos.
Piel
Celulitis
Tejido celular
subcutneo
profundo
Vesculas
pequeas
con
formacin de exudado no
purulento; las vesculas pueden
convertirse
en
pstulas
y
sobreinfectarse.
Lesiones de tipo eritematoso,
hiperemicas y dolorosas de
bordes irregulares.
Erisipela
Tejido celular
subcutneo
superficial.
Se observan placas rojas,

hiperemicas, y dolorosas, de
bordes elevados, y regulares,
acompaadas
de
fiebre
y
escalofro.
Forunculo
sis
Afecta
el
folculo
piloso, es de
localizacin
profunda.
Vasos
linfticos
a
nivel
subcutneo.
Ppula enrojecida que progresa

en
tamao
con
exudado
purulento.
Streptococcus
pyogenes, y en menor
proporcin
por
Staphylococcus
aureus.
Streptococcus
pyogenes,
Streptococcus
beta
hemolticos de los
grupos C y G en el
adulto y B en el recin
nacido.
Streptococcus
pyogenes,
Streptococcus
beta
hemolticos de los
grupos C y G en el
adulto y B en el recin
nacido.
Staphylococcus
aureus.
Piel,
tejido
celular
Exudado purulento, maloliente,

mionecrosis,
gas
con
Linfangiti
s.
Gangrena
gaseosa
Adenopatas dolorosas a nivel

regional con formacin de
edemas.

Streptococcus
pyogenes.
Staphylococcus
aureus.
Crnica=
Nocardia,
Micobacterias.
Anaerobios:
Peptoestreptococcus,
subcutneo y
musculo
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crepitacin al tacto.
Clostridium,
Bacteroides.
Streptococcus
pyogenes.
RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS.

Las muestras de piel deben ser obtenidas de varias de las lesiones que se
observan, las cuales son desinfectadas previamente. Si se presenta
exudado, debe descartarse el material de la superficie y se utilizan los
exudados del interior.
Si las lesiones son cerradas la muestra debe ser recolectada por aspirado
con una jeringa estril de insulina, si no es posible obtenerla as, se debe
hacer una inyeccin con solucin salina estril y volver aspirar para obtener
la muestra.
En procesos de gangrena el exudado purulento debe obtenerse por
aspiracin profunda en jeringa sellada para estudio de bacterias
anoxigenicas.
Con las muestras obtenidas se realiza un frotis para colorear con Gram y se
siembra en Agar Sangre, agar chocolate, Agar Mac Conkey, y caldo BHI, los
cuales se incuban por 24 horas a 37 C en atmosfera de C02 al 5%.
El reporte se realiza en base a la coloracin de Gram (cantidad de reaccin
leucocitaria, cantidad morfologa y tincin bacteriana).
Cultivo: se escribe gnero y especie del microorganismo de importancia
clnica aislado e identificado.
Antibiograma: segn el microorganismo aislado se realiza o no.
ABSCESOS
Es un exudado purulento o material necrtico que se genera producto de la
inoculacin directa del microorganismo a travs de un traumatismo o de un
proceso quirrgico, por la extensin de focos adyacentes o por colonizacin
de va hematogena, originando una respuesta inflamatoria acumulndose
secreciones en espacios cerrados o drenaje en casos que tiene va de salida.
Se pueden presentar en diversos rganos como tejidos subcutneos,
musculares, abscesos intrabdominales, hepticos, esplnicos, perinefrticos.
Son polimicrobianos en su gran mayora predominando bacterias
anoxigenicas.
La toma de muestra se realiza por puncin con jeringa estril, donde se
sella de una vez y se remite rpidamente al laboratorio de microbiologa.
Debe realizarse frotis de gram, cultivo, antibiograma.
LEPRA
Enfermedad crnica causada por el Mycobacterium leprae, afecta la piel,
produciendo afecciones a nivel de clulas nerviosas perifricas, riones,
mucosas, parpados, manos, pies, testculos, presenta un periodo de
incubacin promedio de 10 aos, no es hereditaria ni congnita.
Se debe realizar la baciloscopia para la clasificacin y el control
bacteriolgico.
Para la toma de muestra se realiza de moco nasal y linfa.

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Moco nasal = se toma la muestra con un aplicador sobre los orificios de la

nariz.
Linfa
Realizar una isquemia sobre el lbulo derecho e izquierdo de las orejas
de tal forma la zona se coloque plida procediendo a hacer una puncin
con una lanceta estril y colocar una gota de linfa en cada rea marcada
en la lmina.
Hacer presin sobre los codos con la pinza y realizar la puncin hasta
lograr la isquemia, colocar la gota sobre el rea marcada en la lmina
portaobjetos.
Fijar la muestra y proceder a hacer la coloracin de Zielh Neelsen.
1.2.3.4.5.-
linfa codo izquierdo.

linfa codo derecho.
linfa lbulo de oreja izquierda.
linfa de lbulo de oreja derecha.
muestra de moco nasal.
INTERPRETACION.
Lectura de baciloscopia = es igual empleada en tuberculosis y se procede a
elaborar el informe con el clculo del ndice bacilar (IB), este corresponde al
promedio aritmtico de las cruces encontradas en cada una de las muestras
tomadas y ledas.
(-) Negativa
+(una cruz)
++(dos cruces)
+++(tres
cruces)
Si no se observan BAAR durante 10 minutos de lectura

de cada preparacin en 100 campos observados.
Si se observan menos de 1 BAAR por campo en
promedio, en cien campos observados por cada una de
las 5 muestras.
Si se observan entre 1 a 10BAAR por campo en
promedio, en cincuenta campos observados para cada
una de las 5 muestras.
Si se observan mas de 10 BAAR por campo en promedio,
en 20 campos observados para cada una de las 5
muestras.
Para cada una de las muestras se registra el nmero de cruces, de acuerdo

con la escala.
Ej:
Moco (+), linfa lbulo derecho (++), linfa lbulo izquierdo (++), linfa codo
izquierdo (-), linfa codo derecho (+).
El clculo del indicie bacilar para este ejemplo sera el siguiente:

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IB = (1+2+2+0+1)5 = 1.2
El rango del ndice bacilar cuando es positivo oscila entre 0.2 (1/5) hasta 3
(15/5), si se emplean las 5 muestras.
La clasificacin bacteriolgica ser:
Multibacilar (MB): IB > 0
Paucibacilar (PB): ndice igual a 0
La presencia de globias en cualquier muestra indica una gran cantidad de
bacilos, por lo cual se le asignan (+++).
REPORTE CLINICO = debe incluir si es positivo o negativo, indicando el
numero de cruces por muestra y el ndice bacilar.
PROCEDIMIENTO
1) Realizar la toma de muestra de linfa y moco nasal.
2) Realizar la coloracin de Zielh Neelsen.
3) Observar la lamina al microscopio.
4) Interpretar los resultados.
CONSULTA
1) Cules son las pruebas de identificacin que se utilizan para bacterias
del genero Clostridium.
2) Elabore el esquema de identificacin de bacterias anoxigenicas.
3) En qu consiste la prueba de Lisado de Limulus.
4) Que es Xantocroma, y cuando se presenta?
5) Cul es el mejor mtodo para detectar protenas en LCR.
LIQUIDO CEFALO RAQUIDEO (LCR)
Es el tercer lquido importante del cuerpo y proporciona un sistema
fisiolgico para abastecer de nutrientes al tejido nervioso, eliminando
desechos metablicos, y produciendo una barrera mecnica que amortigua
al cerebro y la medula espinal contra traumatismos. Casi 20 ml de liquido se
producen cada hora en los plexos coroideos y se reabsorben en las
vellosidades aracnoideas para conservar un volumen total de 140-170ml en
adultos y 10-60 ml en recin nacidos. La unin apretada entre las clulas
endoteliales de los capilares y los plexos coroideos, restringe la entrada de
macromolculas como protenas, lpidos insolubles y substancias unidas a
las protenas sricas. El trmino de barrera hematoencefalica se emplea
para representar todos los intercambios bidireccionales entre sangre, LCR y
encfalo.
OBTENCION DE LA MUESTRA.
Se obtiene mediante la puncin lumbar entre la tercera, cuarta o quinta
vrtebra lumbar. Se debe tener en cuenta la medicin de la presin
intracraneal y una tcnica cuidadosa para evitar la introduccin de infeccion
o dao al tejido neural. Las muestras se obtienen en tres tubos de ensayos

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estriles etiquetados con numero 1, 2,3, segn el orden en el q se extrae el

LCR. El tubo numero uno se emplea para pruebas qumicas, y serolgicas, el
tubo dos se usa para microbiologa, y el tubo tres se emplea para el conteo
celular. Los tubos de qumica y serologa se congelan, los de hematologa se
refrigeran y los de microbiologa se mantienen a temperatura ambiente.
SIGNIFICADO CLINICO DEL ASPECTO DEL LCR.

ASP
CAUSA.
SIGNIFICADO PRINCIPAL.
ECTO
Transpa
rente.
Brumoso,
turbio,
nublado,
humeado,
lechoso.
Aceitoso.
Sanguinolento
.
Xantocromico.
Coagulado.
Formacin de
pelcula.
Normal.
Leucocitos,
hemates,
microorganismos,
protenas.
Material
de
radiogrfico.
Eritrocitos.
Meningitis,
hemorragia,
puncin
traumtica, transtornos que afectan la
barrera hematoencefalica, produccin
de IgG en SNC.
contraste
Hemoglobina, bilirrubina,
mertiolato,
carotenos,
protenas.
Protenas y factores de la
coagulacin.
Protenas, factores de la
coagulacin
Hemorragia.
Hemorragia antigua, clulas lisadas por
puncin traumtica, desdoblamiento de
eritrocitos, bilirrubina srica elevada,
contaminacin, concentracin srica
elevada.
Introducidos por la puncin traumtica.
Meningitis tuberculosa.
DETERMINACION CELULAR
Tipo de clula
Linfocito
Neutrofilos
Monocitos
Eosinofilos
Significado clnico principal

Normal, meningitis viral,
tuberculosa, y micotica,
esclerosis mltiple.
Meningitis
bacteriana,
casos
tempranos
de
meningitis
viral,
tuberculosa
o
micotica,
hemorragia cerebral.
Meningitis
bacteriana
crnica, meningitis viral,
tuberculosa
y
micotica,
esclerosis mltiple.
Infecciones
parasitaria,
reacciones
alrgicas,
derivaciones intracraneales
(hidrocefalia).

Hallazgos microscpicos
Se pueden encontrar en
todas las etapas de
desarrollo.
Los grnulos pueden ser
menos prominentes que
en la sangre las clulas
se
desintegran
rpidamente.
Se
encuentran
mezclados con linfocitos
y Neutrofilos
Mismo aspecto que en la
sangre.
Macrfagos
Meningitis
tuberculosa
LCR.
Formas blasticas
Leucemia aguda
Clulas plasmticas.
Esclerosis
mltiples,
reacciones linfocitarias
Carcinoma metastasico
Clulas malignas
Clulas mesoteliales de la
piracnoides.
viral
y
eritrocitos en
Normal, reacciones mixtas

incluyendo
Neutrofilos,
linfocitos,
monocitos
y
clulas plasmticas.
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Pueden
contener
eritrocitos
fagocitados
con aspecto de vacuolas
vacas
o
clulas
fantasmas y grnulos de
hemosiderina.
Linfoblastos
o
mieloblastos.
Se
observan
formas
transicionales y clsicas.
Se observan en grupos
con
fusin
de
los
ncleos
y
mrgenes
celulares.
Semejan
monocitos
jvenes con un ncleo
redondo sin muescas.
DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE MENINGITIS.

BACTERIANA
Leucocitosis.
Neutrofilos
Aumento
importante
protenas
Disminucin
glucosa
VIRAL
Leucocitosis
Linfocitos
de
Aumento
moderado
protenas
de
Glucosa normal
Lactato elevada
LD4
y
LD5
elevadas
de
Lactato normal
LD2
y
LD3
elevadas.
TUBERCULOSA
Leucocitosis
Linfocitos
y
monocitos
Aumento
moderado
a
importante
de
protenas
Disminucin
de
glucosa
MICOTICA
Leucocitosis
Linfocitos
y
monocitos.
Aumento
moderado
a
importante
de
protenas.
Glucosa normal o
disminuida.
Lactato elevado
Lactato elevado

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Prctica 11
Diagnstico de infecciones del tracto genito-urinario
Identificar las principales bacterias asociadas a infecciones genito-urinaria.
Establecer las condiciones requeridas para la recoleccin y procesamiento
de las secreciones vaginales, endocervicales, y uretrales.
Conocer los protocolos de procesamiento de muestras segn el agente
etiolgico del proceso infeccioso a nivel de tracto genito-urinario.
MARCO TEORICO.
Las infecciones del tracto genital femenino pueden ser causadas por
bacterias, hongos, virus, parsitos, el agente etiolgico implicado puede ser
de tipo exgeno o puede pertenecer a la microbiota normal que bajo ciertas
circunstancias puede producir cuadros infecciosos. La microbiota vaginal
est conformada por lactobacilos, productores de perxido de hidrogeno que
producen un balance adecuado en la microbiota exigente, pues inhibe el
desarrollo de bacterias catalasa negativa como Gardnerella vaginalis,
Mobiluncus y otros anaerobios como Bacteroides y Peptoestreptococcus.
VAGINOSIS BACTERIANA.
Es la asociacin de flujo vaginal homogneo y cambios en la composicin
bacteriana y bioqumica de la secrecin vaginal, tales cambios se
evidencian por el aumento del pH por encima de 4.5 disminucin de los
lactobacilos y del acido lctico, facilitando el aumento de otras bacterias y
del acido succnico, generando la aparicin de aminas y del fenmeno
llamado clulas guas. Suele ser asintomtica cuya etiologa es desconocida,
se presenta con un cambio de la microbiota vaginal, cuyos lactobacilos
disminuyen o desaparecen, ocasionando el crecimiento de microbiota mixta
o de Gardnerella vaginalis, (cocobacilos gram variables), o anaerobios

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estrictos (Bacteroides, Peptoestreptococcus, Mobiluncus, Eubacterium,

Fusobacterium, y Mycoplasma).
El flujo es abundante Mucoide y grisceo, con aparicin de aminas
generando un olor desagradable (pescado podrido).
DIAGNOSTICO
Presencia de clulas guas, (clula del epitelio vaginal, con borde mal
definido de aspecto granuloso por el gran nmero de cocobacilos unidos a la
superficie), y test de aminas positivo. Se realiza un examen directo para
observar las clulas epiteliales leucocitos y le presencia de bacterias.
Tambin se realiza una coloracin de gram para observar la morfologa
bacteriana.
VAGINITIS Y URETRITIS BACTERIANA.
Es un crecimiento anormal en las secreciones vaginales, que se presenta
con inflamacin de las mucosas vaginales y la mucosa adyacente vulvar.
Nesseria gonorrhoae.
Afecta los rganos sexuales, anorectal, y farngea, se produce cervicitis y
uretritis gonococcica. Los hombres manifiestan secrecin
purulenta
acompaado de disuria, edema del meato. Como complicacin se genera
una infeccion persistente crnica, epididimitis, estrechez uretral e
infertilidad.
Las mujeres pueden ser asintomticas y presentan una secrecin vaginal
atpica, acompaada o no de disuria, el 80% son asintomticas y las
complicaciones son severas, ocasionando enfermedad plvica inflamatoria
(EPI), y subsecuentemente la esterilidad y una infeccion diseminada que
genera un peligro de muerte.
El periodo de incubacin en el hombre es de dos a cinco das, y en la mujer
antes de diez das. En el embarazo, una infeccion no tratada genera como
resultado un parto prematuro, y en los recin nacidos puede causar oftalmia
neonatal, ceguera y diseminacin de la infeccion.
DIAGNOSTICO
Se realiza a travs de la clnica y pruebas de laboratorio para la
identificacin de Neisseria gonorrhoeae.
En los hombres se observan diplococos gram negativos intra y
extracelulares en la secrecin uretral y en las mujeres aislamiento por
cultivo selectivo, y demostracin de colonias morfolgicamente tpicas,
reaccin positiva a la oxidasa y gram con la tpica morfologa de la bacteria.
La confirmacin de la bacteria se realiza a travs del cultivo y mtodos
bioqumicos o determinacin enzimtica o de cidos nucleicos.
Infeccion por Chlamydia trachomatis.
Es una bacteria gram negativa intracelular, su ciclo de multiplicacin es
nico entre las bacterias, produce cuadros de vaginitis, este proceso se
observa principalmente en jvenes sexualmente activas con flujo discreto,
no presentan mal olor, acompaado de un proceso de endocervicitis
mucopurulenta ocasionando disuria, infeccion postparto, y dolor plvico
generando una EPI. Las cepas pertenecientes a la especie de Chlamydia
trachomatis se clasifican en una serie de serotipos A-K y los pertenecientes
al linfogranuloma venreo (LGV) L1, L2, L3. Estos serotipos se agrupan en
biovariedades. En hombres puede ser asintomtica, puede haber disuria y

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secrecin uretral escasa de aspecto Mucoide. Complicaciones ms

frecuentes, epididimitis e infertilidad, tambin es responsable entre un 50%
de la uretritis no gonoccica, presentndose frecuentemente en pases
desarrollados y son indistinguibles de la infeccion gonococcica. Se
caracteriza por la secrecin purulenta, disuria. En las mujeres presenta
secrecin mucopurulenta en el endocervix la cual va ascendiendo por las
estructuras plvicas ocasionando endometritis, salpingitis, generando una
EPI.
Complicaciones = uretritis aguda, infeccion durante el embarazo (2-37%),
EPI, esterilidad, infertilidad, endometritis postparto, embarazo ectpico,
aborto, ruptura de membranas, mortinatos, infeccion neonatal.
DIAGNOSTICO
Identificacin, aislamiento y confirmacin de la bacteria en secrecin
cervical, rectal, uretral, por medio de tcnicas de laboratorio:
Inmunofluorescencia directa, EIA, cultivo celulares, PCR.
Cndida albicans
Los sntomas aparecen cuando estos organismos proliferan en grandes
cantidades, est asociado en el embarazo, personas diabticas, y pacientes
sometidas a tratamiento con inmunosupresores y personas con SIDA.
Se caracteriza por una secrecin blanquecina, de moderada cantidad
aspecto grumoso, viscoso, adherido a las paredes vaginales, acompaado
de eritema, prurito vulvar y compromete la regin perianal. Cuando la
cndida se vuelve infecciosa estn presentes las hifas y las pseudohifas,
identificndose en el frotis directo de flujo vaginal.
Trichomona vaginalis
La nica especie patgena de los protozoos flagelados del gnero
Trichomona, se reproduce en las mucosas de las vas urinarias y genitales
en forma de trofozoito, la transmisin del parasito ocurre durante el acto
sexual o muy pocas veces por contacto de artculos contaminados. Produce
vaginitis en la mujer y uretritis en el hombre donde se presenta un curso
asintomtico.
Se manifiesta por una secrecin vaginal profusa, espumosa, amarilloverdosa, maloliente, acompaada de disuria, eritema, y prurito vulvar,
crvix edematososo con petequias signo de crvix en fresa fcilmente
sangrante. En el hombre la infeccion cursa asintomtica y es autolimitada.
DIAGNOSTICO
Se establece por el cuadro clnico y los hallazgos en la exploracin clnica, y
la determinacin del parasito en solucin salina o a travs del sedimento
urinario.
Vaginitis no especificas
Otro grupo de microorganismos que deben tenerse en cuenta para su
aislamiento e identificacin como productores de vaginitis son:
Emterococcus faecalis, streptococos del grupo B, enterobacterias, y
Ureaplasma. Para considerarlos como agentes etiolgicos debe tenerse en
cuenta el cuadro clnico de la paciente, presentando una verdadera
descarga vaginal, presencia de PMN, en el frotis directo coloreado con gram

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y un crecimiento en cultivo monomicrobiano, con un desplazamiento casi

total de la microbiota normal.
Uretritis no gonocccicas
Es un sndrome causado por varios agentes sexualmente transmitidos. El
50% de los casos se dan por Chlamydia trachomatis. Otros agentes
etiolgicos son Ureaplasma urealyticum, virus Herpes, Moraxella uretralis,
Enterococcus faecalis, Corynebacterium genitalicum. El diagnostico se
establece por la exclusin del hallazgo de los diplococos gram negativos en
el examen de gram, se deben realizar pruebas de ELISA y de IF para
Chlamydia y pruebas microbiolgicas para los microorganismos
mencionados.
INFECCIONES ULCERATIVAS
Son causadas por bacterias y virus y generan ulceras alrededor del sistema
genito urinario, la sfilis, el chancro blando, linfogranuloma venreo, son
producidas por bacterias el herpes tipo 2 es producido por un virus, el
condiloma es un tipo de lesin tumoral producido por el virus de papiloma
humano VPH.
SFILIS
Es causada por la Treponema pallidum, enfermedad de evolucin crnica,
comprometiendo muchas partes del cuerpo, se caracteriza por la aparicin
de un chancro de bordes definidos indoloro que dura de 10-14 das y
desaparece con o sin tratamiento, luego al implantarse en la piel y las
mucosas se multiplica localmente y pasa a los ganglios linfticos, de ah se
distribuye a todos los tejidos del cuerpo. Entre dos y cuatro semanas
despus aparecen las lesiones secundarias en la piel, que pueden ir desde
erupciones mucocutaneas a ppulas, ndulos o ulceraciones superficiales,
las cuales pueden continuar por cuatro aos en 25% de los casos no
tratados. Se clasifica en sfilis primaria, secundaria, terciaria, se presenta
tambin la sfilis congnita.
DIAGNOSTICO
En el laboratorio se emplean tcnicas serolgicas para presumir y confirmar
el diagnostico, se dispones de los siguientes exmenes:
Campo oscuro
Pruebas de VDRL o RPR
Pruebas de FTA-abs y la fraccin IgM para la sfilis congnita.
Se puede disponer de pruebas treponemicas y no treponemicas:
Pruebas no treponemicas = no son especificas para los anticuerpos de la
infeccion, sin embargo son altamente sensibles y practicas: VDRL o RPR.
Pruebas treponemicas: son mas especificas y se emplean para confirmar
la infeccion, FTA-abs y la fraccin IgM para la sfilis congnita.
Chancro blando
Es conocido como cancroide, se caracteriza por la presencia de ulceras
grandes, bordes irregulares, muy dolorosa, acompaando de un ganglio
ulcerado o bubn, es producido por Haemophilus ducreyi, bacteria gram

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negativa con un periodo de incubacin de tres a seis das. Est asociado a

una coinfeccion por sfilis o herpes genital. Se presentan en el sitio de la
infeccion una o varias ulceras dolorosas con fondo plano que sangra
fcilmente al limpiar el exudado necrtico, que se expande por
autoinoculacion, en la mujer casi siempre ocurre en los labios mayores y
menores y regin perianal, y en el hombre en el prepucio, glande y regin
perianal. En dos a tres semanas evoluciona la enfermedad, presentndose
adenopata inguinal, inflamatoria, casi siempre unilateral, los ganglios
pueden ablandarse, hasta formar un absceso (bubn), que puede abrir al
exterior y formar una fistula que drena lquido purulento.
DIAGNOSTICO
Se realiza mediante los siguientes criterios: el paciente tiene una o ms
ulceras genitales sin evidencia de infeccion por Treponema pallidum,
presencia clnica de linfoadenopata regional y prueba negativa para virus
del herpes genital. El diagnostico definitivo de cancroide requiere de
identificacin de Haemophilus ducreyi por medio de cultivo especifico o por
PCR.
LINFOGRANULOMA VENEREO
Chlamydia trachomatis tipo L1,L2,L3 es el agente causal, presenta un
periodo de incubacin de 5-35 das, la lesin primaria aparece en el sitio de
la inoculacin, luego de adquirir una infeccion que inicia con una sola lesin
papovesicular, pequea, e indolora que en ocasiones pasa inadvertida y
desaparece sola, en el varn ocurre con ms frecuencia en el surco
balanopapular, frenillo, pene, uretra, glande, y escroto, y en la mujer se
presenta en la pared posterior de la vagina, la horquilla, el labio posterior
del crvix, y la vulva, solo en 20-30% de las mujeres presentan el sndrome
inguinal debido al drenaje de los ganglios plvicos.
Entre cuatro das y cuatro meses posteriores a la lesin primaria, ocurre una
adenopata inguinal, unilateral, que involucra los ganglios linfticos y
produce la tumefaccin inicial, estos ganglios se adhieren a la piel la que se
torna de color rojo oscuro, formando ulceras grandes, hemorrgicas, y
dolorosas, la curacin puede durar meses o aos, dejando cicatriz retrctil
con transtornos linfticos obstructivos resultando en edema de pene y
escroto en el hombre, y en la mujer del perin y miembros plvicos.
TOMA DE MUESTRA
REQUISITOS
No estar recibiendo tratamiento con antibiticos.
No estar menstruando
No haber realizado duchas vaginales, ni aplicacin de vulos, jaleas, etc.
No haber tenido relaciones sexuales 24 horas antes del examen.
No haber orinado 2 horas antes de la toma de muestra.
MUESTRA VAGINAL

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En tres hisopos de algodn estriles se recoge la muestra a travs de los

labios vaginales, en el cual en uno se realiza el extendido de la lamina, el
otro se coloca en un tubo de ensayo con solucin salina, y el otro en un tubo
de ensayo con KOH al 10%, se realiza la observacin microscpica entre
lamina y laminilla, y se realiza la coloracin gram para la identificacin de
morfologa bacteriana.
MUESTRA ENDOCERVICAL
Se obtiene para el diagnostico especifico de Neisseria gonorrhoae y
Chlamydia trachomatis, se introduce en la vagina el especulo con un
escobilln estril, se introduce en el endocervix rotndolo suavemente y
permitiendo que permanezca all por unos segundos. Se retira
inmediatamente y se siembra sobre los medios especficos como Thayer
Martin, y frotis directo para la coloracin de gram.
MUESTRAS URETRALES
En el hombre con cuadro clnico de uretritis aguda, con exudado uretral
purulento y abundante, se introduce un escobilln muy fino y hmedecido
con solucin salina fisiolgica estril 1-2cm en el canal uretral, imprimiendo
un movimiento suave de rotacin, la muestra se debe sembrar
inmediatamente en Agar Thayer Martin y a continuacin hacer un frotis para
colorear el gram.
MUESTRAS DE CHANCROIDE
Cuando un paciente presenta una lesin cancroide es importante limpiar
perfectamente la lesin con una torunda de algodn impregnada con
solucin salina estril desechando cualquier cascara o absceso formado,
tomar luego la muestra con un hisopo impregnado con solucin salina
estril o con un asa de argolla tratando de raspar la superficie de la lesin
para realizar cultivo y frotis directo para colorear con gram.
MATERIALES
Lminas y laminillas.
2 tubos de ensayo
Hisopos de algodn estril
Marcador de vidrio
Solucin salina y KOH al 10%.
PROCEDIMIENTO
1) Realizar la toma de muestra de frotis de flujo vaginal o secrecin uretral.
2) Hacer el extendido de la muestra sobre la lmina portaobjetos, y colocar
los hisopos con la muestra obtenida en los tubos de ensayo
correspondientes con solucin salina y KOH al 10%.
3) Realizar la coloracin de GRAM.
4) Observar al microscopio.

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CONSULTA
1) Cules son las caractersticas clnicas y agentes etiolgicos del herpes
genital y el condiloma acuminado.
2) Fundamento de las pruebas VDRL, RPR, FTA-abs, y MHT-TP.
3) Cules son las alteraciones que puede ocasionar el Mobiluncus sp.
4) Que es el Sarcoptes scabiei y que patologa genera.
Prctica 12
Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo
Identificar, las diversas tcnicas que permiten el aislamientos e
identificacin bacteriana a partir de muestras de orina, materia fecal y
sangre.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Establecer condiciones de toma de muestra para el anlisis de una muestras
de orina, materia fecal, sangre.
Conocer los protocolos de procesamientos de muestras segn el agente
etiolgico a nivel gastrointestinal, urinario, sanguneo.
MARCO TEORICO
UROCULTIVO
Recoleccin de la muestra.
Esta muestra necesita un gran cuidado porque se puede contaminar con
flora normal de la uretra y la vagina, existen cuatro mtodos para la
obtencin de la muestra de orina.
Orina de la mitad de la miccin espontanea.
Uso de bolsa de plstico estril (bebes).
Cateterismo.
Puncin suprapubica.
Se le debe informar al paciente en forma clara y precisa la correcta
recoleccin de la orina.
Se debe hacer limpieza del rea genitourinaria, recoger la muestra de la
mitad de la miccin en un frasco previamente estril y de boca ancha.
La puncin suprapubica se basa en la aspiracin de la orina vesical a travs
de la piel en la zona suprapubica.
EXAMEN DIRECTO.
GRAM DE ORINA SIN CENTRIFUGAR.
Homogenizar la muestra de orina.
Colocar una gota de orina sin centrifugar sobre una lamina portaobjeto.
Dejar secar sin extender.
Fijar al calor
Realice tincin de Gram.
LECTURA

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Observar la presencia de clulas epiteliales, leucocitos, bacterias y

microorganismos en objetivo de 100x.
Reportar el nmero de polimorfonucleares, morfologa bacteriana en la
observacin microscpica de la coloracin de gram.
UTILIDAD
La presencia de clulas epiteliales y microbiota mixta indican contaminacin
con flujo vaginal, determina bacteriuria > 100000 UFC/ml de orina.
Brinda orientacin sobre la morfologa y la reaccin leucocitaria, lo cual
permite la orientacin para el inicio de una terapia antimicrobiana.
Determina la presencia o ausencia de piuria.
RECUENTO DE COLONIAS.
METODO DE KASS.
1) Mezclar la muestra durante tres minutos evitando el derrame.
2) Tome el inoculo con el asa calibrada.
3) Deposite la cantidad de muestra tomada con el asa en el centro del agar
y a partir de ah trazar una lnea recta de extremo a extremo de la caja.
4) Con la misma asa y sin tomar mas muestra y sin esterilizar realizar una
estriacin en zig-zag, de tal manera, intercepte la lnea de lado a lado.
5) Incubar a 37 de 18-24H a 37.
6) Observar el crecimiento bacteriano e interpretar los resultados
expresados en UFC/ml.
Los parmetros utilizados para obtener el recuento de UFC son:
Si existe crecimiento en todas las lneas de siembra es un recuento
mayor a
1OO.OOOUFC/ml.
Si crece en la lnea central y en la mitad de las lneas que las intercepta
el recuento es de 75000 UFC/ml.
Cuando se tiene crecimiento sobre la lnea central corresponde a
50.000UFC/ml.
Cuando no se presenta crecimiento en una lnea se hace una
aproximacin al parmetro que el lector considera ms apropiado.
1000
10000
60000
UFC/ml
SIGNIFICADO
100- No tiene significado clnico, excepto en
puncin suprapubica
1000- Presenta contaminacin vaginal en cultivo
mixto.
10000- Urocultivo dudoso debe repetirse en
muestra diferente si no hay sintomatologa
clnica.
>30000
Con
crecimiento
monomicrobiano
y
sintomatologa clnico debe procesarse.
>100000 Presencia de infeccin urinaria franca.

Recuento.
< 10000UFC/ml
<10000UFC/ML
10000-100000
10000-100000
10000
100000
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# de tipo de Realizar pruebas No se contina el

colonias
de identificacin proceso o se repite.
y
susceptibilidad
Uno
X
Ms de uno
X
Uno
X
Ms de uno
X
Uno o dos
X
Ms de dos
X
COPROCULTIVO.
Es el anlisis en el laboratorio por el cual se investiga y se identifica el
germen causal de un proceso diarreico y la sensibilidad del microorganismo
causante a los antibiticos recomendados para este tipo de cuadro clnico.
RECOLECCION DE MUESTRAS.
Recolectar la muestra en los tres primeros das, es decir, en la fase aguda
del cuadro clnico.
Recolectar antes del tratamiento antimicrobiano.
Cuando hay demora en el procesamiento de la muestra se pueden utilizar
medios de transporte como Clary Blair o solucin salina buffer glicerinada.
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.
Examen macroscpico = bsqueda de moco, sangre, alimentos sin
digerir.
Examen microscpico = observar la presencia de leucocitos en el frotis
en fresco.
Recuento de leucocitos en materia fecal = se realiza en el frotis en fresco
o con azul de metileno.
Determinacin de azucares reductores.
Cultivo.
CULTIVO
Se realiza una suspensin de un gramo de materia fecal en 5ml de solucin
salina, si tiene sangre o moco tomar la sangre de ah.
Inocular varias asadas o 1ml de la muestra liquida en los medios de
enriquecimientos como medio tetrationato de muller o caldo selenito.
Se debe incubar de 18-24 horas, estos cultivos deben ser repicados a
medios selectivos: agar SS, Bs, Mck, HE, EMB, se incuban a 37 por 24
horas.
Para Campylobacter se usan medios especficos como CAMPY BAD o Skirrow
a 42 en condiciones microaerofilicas por 48 horas.
Si se sospecha de un cuadro de clera, se desarrolla el protocolo especifico
para Vibrio cholerae.
IDENTIFICACION

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Realizar pruebas bioqumicas a las bacterias consideradas de inters

teniendo en cuenta los datos clnicos de la muestra. Para Campylobacter se
tienen en cuenta los siguientes resultados: bacilos gram negativo, oxidasa
negativo, catalasa positivo, crece a 42, reduce nitratos a nitritos, hidroliza
el hipurato, sensible al acido nalidixico y resistente a la cefalotina.
REPORTE
Se debe reportar el gnero y la especie de la bacteria aislada e identificada.
ANTIBIOGRAMA
Se recomienda utilizar trimetopin sulfa, ciprofloxacina, gentamicina,
netilmicina, cefaperazona, cefoxitin, y ampicilina.
HEMOCULTIVO.
Es el cultivo microbiolgico de una muestra de sangre cuando se sospecha
de casos de bacteremia en pacientes con o sin foco aparente de infeccin.
CLASIFICACION DE LOS HEMOCULTIVOS.
SEGN TIPO DEL PACIENTE = peditrico, adulto, inmunocompetentes,
inmunosuprimidos.
SEGN TOMA DE LA MUESTRA = centrales, perifricos.
SEGN TIPO DE MICROORGANISMO = bacterias aerbicas, anaerbicas,
bacterias fastidiosas, micobacterias, hongos.
SEGN LA METODOLOGIA = manual, semiautomatizado, automatizado.
SISTEMAS SEMI-AUTOMATIZADOS: LISIS-CENTRIFUGACION
Consiste en tubo de lisis cuyo contenido es polianetol sulfonato de sodio SPS
como anticoagulante, saponina como agente ltico de eritrocitos, leucocitos
y macrfagos, polipropilenglicol como antiespumante y un fluoroquimico
inerte de alta densidad. Luego se somete a la muestra a una centrifugacin
a alta velocidad que permite la concentracin de microorganismos en el
sedimento que se siembra en medios de cultivo especficos. En general,
este mtodo permite mejorar en un 25-50% la deteccin de hongos
levaduriformes y filamentosos, se considera el mtodo de eleccin en
bacteremias por micobacterias (pacientes HIV) y permite realizar
hemocultivos cuantitativos que son tiles para diagnostico de bacteremia
relacionada a catter venoso central (CVC).
SISTEMAS AUTOMATIZADOS
Consisten bsicamente en botellas con diversos medios de cultivo
(aerbicos, anaerbicos, hongos, micobacterias, y con resinas que captan
antibiticos) que se incuban en equipos que agitan constantemente las
muestras y que poseen modernos sistemas de deteccin microbiana. Estos
se basan en la deteccin de productos del metabolismo bacteriano (CO2)
mediante tcnicas radiomtricas, espectrofotomtricas, fluorometricas, y/o
colorimtricas. El computador asociado a los equipos relaciona las
mediciones con ndices y/o graficas de crecimiento microbiano que dan un
aviso cuando la deteccin sobrepasa un punto de corte. Las botellas se
descargan, se hace una tincin de gran y se informan precozmente.

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PROCEDIMIENTO DE UN HEMOCULTIVO AUTOMATIZADO.

a) Inoculacin de la muestra (10ml)
b) Botella con medio de cultivo (aerbico-anaerbico-micobacteriasresinas).
c) Deteccin
del
desarrollo
(CO2)
continuo
(radiomtricoespectrofotmetrico- colorimtrico- fluorimetrico).
d) Computador: ndice de crecimiento, grafico de crecimiento.
e) Descarga de botellas tincin de gran- cultivo.
f) Eliminacin de botellas (sin subcultivo).
SISTEMAS MANUALES
El medio de cultivo debe contener 0.025 a 0.05% de polianetol sulfonato de
sodio (SPS) como anticoagulante. Este inhibe la actividad bactericida del
suero contra muchas bacterias y la fagocitosis, adems inactiva el
complemento, neutraliza lisozimas y algunos antibiticos del grupo de
aminoglucosidos Peptoestreptococcus, Gardnerella, y algunas cepas de
Neisserias spp son inhibidas por el SPS, este efecto puede ser neutralizado
suplementando el medio con gelatina al 1.2%.
El caldo de hemocultivo debe ser capaz de permitir el crecimiento de
cualquier bacteria de importancia clnica, algunos medios usados para
hemocultivo son: caldo cerebro corazn (BHI), caldo Brucella, caldo
Columbia, caldo peptonado suplementado, caldo tripticasa de soya, medio
bifsico de Ruiz Castaeda.
Una desventaja de este sistema con relacin al automatizado es el mayor
riesgo de contaminacin por la manipulacin de las botellas al realizar los
procedimientos de tincin y traspasos.
PROCEDIMIENTO PARA EL HEMOCULTIVO MANUAL.
a) Inoculacin de la muestra (10ml).
b) Botella con medio de cultivo (aerbico- anaerbico).
c) Deteccin visual del desarrollo microbiano (1 vez al da por 7 das:
turbidez, hemolisis, gas, velo).
d) Tincin de gram y subcultivo, subcultivo ciego a las 24 horas y a los 7
das.
PROCEDIMIENTO DE HEMOCULTIVO.
Para obtener la muestra de sangre es entre 2horas a 30 minutos antes del
pico febril, se recomienda obtener 2-3 hemocultivos en 24 horas separados
por 30 a 90 minutos o bien obtener las dos o tres muestras al mismo tiempo
de diferentes sitios de puncin, si se trata de un paciente que va a requerir
inicio inmediato de antimicrobianos.
La muestra debe obtenerse por puncin perifrica (venosa o arterial),
siempre por una nueva puncin y debe ser la primera muestra que debe
obtenerse si existe indicacin de otros exmenes.
Cuando se toma por catter venoso se considera inadecuado porque se
contamina por microorganismos de la piel, generando falsos positivos, la
piel se debe lavar con povidona yodada, jabn quirrgico, agua y jabn.
Dado que la mayora de las bacteremias son de baja magnitud (< 1-10
UFC/ml) a mayor volumen de muestra obtenido, mayor es la sensibilidad del

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hemocultivo. Se sabe que por cada ml adicional de muestra que se inocule

en la botella aumenta la positividad entre un 2-5%. Para la gran mayora de
los sistemas este volumen es de 10-20ml para adultos y es variable para los
nios segn la edad: 1-2ml para recin nacidos, 2-3ml para lactantes de un
mes a 2 aos, 3-5ml para nios mayores de 2 aos y 10ml para
adolescentes.
Para inocular la muestra en las botellas se debe descontaminar el tapn de
goma antes de puncionar la botella con alcohol y esperar que se seque,
cambiar la aguja con la que se va a introducir la muestra porque permite un
menor grado de contaminacin, no tocar las paredes de la botella con la
aguja, mezclar suavemente los frascos por inversin.
PROCEDIMIENTO DE LA PRCTICA
1) Tomar la muestra para hemocultivo.
2) Inocular los medios de cultivo e incubar a 37C por 24 horas.
3) Observar el aspecto de los medios de cultivo y realizar el gram y
subcultivo de acuerdo a lo observado.
4) Aislar e identificar el microorganismo de inters.
5) Realizar antibiograma.
REPORTE CLINICO DE UN HEMOCULTIVO.
Datos del paciente, Nombre, edad, sexo, servicio, habitacin, datos
clnicos.
Examen solicitado ______________________________
Resultados:
Hemocultivo: negativo o positivo a las __________
incubacin.
Se aisl e identifico _____________________
especie del microorganismo.
horas o das de
se escribe genero y
Antibiograma.
Observaciones_______________________________________
CONSULTA
1.) Cules son las bacterias aisladas con mayor frecuencia en los cuadros de
septicemia.
2.) Cules son los focos ms frecuentes de bacteriemia.
3.) Defina: sepsis, bacteriemia, septicemia.
4.) Fundamento y tcnica para la determinacin de sangre oculta y azucares
reductores en materia fecal.
5.) Describa los parmetros a tener en cuenta para considerar si el germen
recuperado en el urocultivo es el responsable de la infeccin.

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Prctica 13
Diagnostico de dengue, hepatitis B, VIH
Conocer los fundamentos de las diferentes pruebas serolgicas para
determinar anticuerpos contra el virus de la hepatitis B, HIV, dengue.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Establecer condiciones de toma de muestra para el anlisis de LCR.
Conocer los fundamentos de las tcnicas aplicadas durante la prctica de
laboratorio.
MARCO TEORICO.
El dengue es una enfermedad causada por el arbovirus, el cual es
transmitido por un vector llamado Aedes aegyptis, causando cuadros
clnicos acompaados de: fiebre, mialgias, artralgias, malestar general,
anorexia, rash, cefalea intensa.
DENGUE SIN
SIGNO DE ALARMA
LABORATORIOS
Leucocitosis
con
tendencia
a
la
linfocitosis.
Plaquetas
disminuidas
(<100.000 /mm3)
Hematocrito: Normal
IgM positiva en fase
aguda.
Aislamiento
viral
(Antes de 72 h de
instauracin
del
cuadro clnico).
Hematuria.
Prueba
del
torniquete:
Puede
dar positiva.
DENGUE CON SIGNO DE ALARMA
DENGUE GRAVE
(Shock por dengue)
LABORATORIOS
LABORATORIOS
Leucopenia o leucocitosis con tendenciaTrombocitopenia
a la linfocitosis.
<100000/mm,
Plaquetas disminuidas (<100.000 /mm3) extravasacin
del
Hematocrito: Aumentado 20% o mas deplasma
donde
el
lo normal en Hto de control y vuelve a la hematocrito
se
normalidad en la convalecencia.
encuentra aumentado
IgM positiva en fase aguda.
en un 20% sobre los
Aislamiento viral (Antes de 72 h de niveles
normales,
o
instauracin del cuadro clnico).
disminuido en un 20%
PRUEBA TORNIQUETE: Positiva
despus
de
Hematuria.
tratamiento,
puede
Hipoproteinemia, Hiponatremia
existir derrame pleural
EVIDENCIA DE EXTRAVASACION DEu
otros
derrames
PLASMA
(DERRAMES).PLEURAL,serosos,
e
ASCITICO,
PERICARDICO,Hipoproteinemia,
ARTICULAR. Engrosamiento de lashipoalbuminemia.
paredes del coldoco.
Fundamento prueba ELISA-Dengue.

Se basa en la tcnica de ELISA en Sandwich. Los micropozos son recubiertos
con antigenos del dengue. En la primera etapa de incubacin los
anticuerpos tipo IgM presentes en la muestra de suero se unen a la los
antigenos presentes en los pozos. El buffer de dilucin contiene anti Ig G

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humana para prevenir las interferencias con el factor reumatoide, y

competencia con IgG especifica presente en la muestra. Al final de la
incubacin los componentes excesivos son eliminados por lavados, en la
segunda etapa de incubacin se aade un anti-IgM (anticuerpos anti-IgM
marcados con peroxidasa) que se fija especficamente a los anticuerpos IgM,
formando inmunocomplejos. Despus de eliminar el conjugado especfico
por lavado (segunda etapa de lavado) y aadir TMB/substrato (etapa 3) se
forma un color azul que se transforma en amarillo despus de parar la
reaccin, la intensidad de color es directamente proporcional a la presencia
de anticuerpo IgM en la muestra. La lectura se realiza a travs de un lector
de los micro pocillos, los resultados se obtienen por la comparacin con un
punto de corte o expresados en unidades.
INTERPRETACION
La muestra es considerada positiva si los valores de absorbancia superan el
10% el valor de corte.
Valores de absorbancia 10% arriba o abajo del valor de corte son
considerados como indeterminados.
Valores de absorbancia 10% por debajo del valor de corte son considerados
negativos.
VIRUS DEL CHIKUNGUNYA
El chikungunya es una enfermedad vrica transmitida al ser humano por
mosquitos. Se describi por primera vez durante un brote ocurrido en el sur
de Tanzana en 1952. Se trata de un virus ARN del gnero alfavirus, familia
Togaviridae. Chikungunya es una voz del idioma Kimakonde que significa
doblarse, en alusin al aspecto encorvado de los pacientes debido a los
dolores articulares.
Signos y sntomas
La fiebre chikungunya se caracteriza por la aparicin sbita de fiebre,
generalmente acompaada de dolores articulares. Otros signos y sntomas
frecuentes son:
Dolores musculares
Dolores de cabeza
Nuseas
Cansancio
Erupciones cutneas.
Los dolores articulares suelen ser muy debilitantes, pero generalmente
desaparecen en pocos das.
La mayora de los pacientes se recuperan completamente, pero en algunos
casos los dolores articulares pueden durar varios meses, o incluso aos. Se
han descrito casos ocasionales con complicaciones oculares, neurolgicas y
cardiacas, y tambin con molestias gastrointestinales.
Las complicaciones graves no son frecuentes, pero en personas mayores la
enfermedad puede contribuir a la muerte. A menudo los pacientes solo
tienen sntomas leves y la infeccin puede pasar inadvertida o
diagnosticarse errneamente como dengue en zonas donde este es
frecuente.

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El virus se transmite de una persona a otras por la picadura de mosquitos

hembra infectados. Generalmente los mosquitos implicados son Aedes
aegypti y Aedes albopictus dos especies que tambin pueden transmitir
otros virus, entre ellos el del dengue.
La enfermedad suele aparecer entre 4 y 8 das despus de la picadura de un
mosquito infectado, aunque el intervalo puede oscilar entre 2 y 12 das.
Diagnstico
Para establecer el diagnstico se pueden utilizar varios mtodos. Las
pruebas serolgicas, como la inmunoadsorcin enzimtica (ELISA), pueden
confirmar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra el virus chikungunya.
Las mayores concentraciones de IgM se registran entre 3 y 5 semanas
despus de la aparicin de la enfermedad, y persisten unos 2 meses.
Las muestras recogidas durante la primera semana tras la aparicin de los
sntomas deben analizarse con mtodos serolgicos y virolgicos (RT-PCR).
El virus puede aislarse en la sangre en los primeros das de la infeccin.
Existen diversos mtodos de reaccin en cadena de la polimerasa con
retrotranscriptasa (RTPCR), pero su sensibilidad es variable. Algunos son
idneos para el diagnstico clnico.
Los productos de RTPCR de las muestras clnicas tambin pueden utilizarse
en la genotipificacin del virus, permitiendo comparar muestras de virus de
diferentes procedencias geogrficas.
HEPATITIS B
Enfermedad infecciosa causada por ocasionar una infeccin hepatocelular, e
inflamacin causando procesos agudos y crnicos ocasionando insuficiencia
heptica, cirrosis, cncer, y la muerte. Se replica en los hepatocitos, no se
ha determinado cual es el receptor q permite que el virus entre a la clula
aunque se ha establecido que puede ser el mismo del pato
(carboxipeptidasa D).
Los viriones se unen a la clula husped mediante el dominio preS del
antgeno de superficie viral generando la endocitosis. Los preS se expresan
en los hepatocitos aunque se ha detectado que se han detectado ADN y
protenas virales en sitios extrahepaticos establecindose que existen
receptores fuera del hgado. La respuesta adaptativa por los linfocitos T
citotxicos contra el virus generan el dao a nivel heptico, debido a que se
destruyen las clulas infectadas por el virus generando produccin de
citoquinas antivirales que protegen los hepatocitos viables.
El virus se encuentra en la sangre y en el hgado, ictericia durante 1-6 mes
se van desarrollando los sntomas. Fiebre, nausea, fatiga, dolor muscular,
diarrea, coluria, acolia, ictericia. Pacientes crnicos = cirrosis heptica,
ascitis, encefalopata heptica, insuficiencia heptica, sangrado de varices
esofgicas, cncer heptico.
PARTCULAS VIRALES
HBsAg = Antgeno de superficie = protena presente en la superficie del
virus presente en la fase aguda y crnica de la enfermedad. Esta partcula
se utiliza para detectar infecciones por el VHB indicador ms temprano de la
hepatitis B aguda y con frecuencia identifica a las personas infectadas antes
de que aparezcan los sntomas, no detectables en la sangre durante el

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perodo de recuperacin, es la principal forma de identificar a aquellos con

infecciones crnicas.
Anticuerpo de superficie hepatitis B (anti-HBs).= Son anticuerpos
producidos en respuesta a un antgeno de superficie del VHB, los niveles en
sangre aumentan durante la fase de recuperacin. Se utiliza para detectar
la exposicin previa al VHB, tambin se pueden adquirir a partir de la
vacunacin con xito. Este examen se realiza para determinar la necesidad
de la vacunacin (en caso de anti-HBs est ausente) o para determinar si
una persona se ha recuperado de una infeccin y la inmunidad (no puede
adquirir la infeccin de nuevo).
Anti hepatitis B core (anti-HBc IgM) = Anticuerpos IgM contra el
antgeno central (core) de la hepatitis B (antgeno de la hepatitis B). El core
est presente slo en las clulas hepticas infectadas, no se puede detectar
en la sangre). Primer anticuerpo producido despus de la infeccin por el
VHB, que se utiliza para detectar la infeccin aguda.
Anti-hepatitis B core (anti-HBc), Total= Ambos anticuerpos IgM e IgG
contra el antgeno core de hepatitis B. Puede ser utilizado para ayudar a
detectar infecciones de HBV aguda y crnica, se produce en respuesta al
antgeno del core y por lo general persiste de por vida.
Hepatitis B DNA (HBV DNA) = Detecta material gentico del virus de la
hepatitis B. Puede detectar una infeccin activa por VHB, su uso principal es
para monitorizar el tratamiento antiviral en pacientes con infecciones
crnicas del VHB.
Antgeno e Hepatitis B (HBeAG)= Protenas producidas y liberadas en la
sangre de forma activa por la replicacin del virus de la hepatitis B. A
diferencia del antgeno de superficie, el e-antgeno se encuentra en la
sangre slo cuando el virus VHB se est multiplicando activamente. HBeAG
se suele utilizar como un marcador de la capacidad de transmitir el virus a
otras personas (infeccion). Tambin puede ser usado para monitorear la
efectividad del tratamiento.
Anti-acs contra antigeno e del VHB (Anti-Hbe) = Anticuerpos
producidos en respuesta a antgenos de la hepatitis. En los pacientes que se
han recuperado de la infeccin hepatitis B aguda, el anti-HBe estar
presente junto con anti-HBc y anti-HBs. En las personas con hepatitis
crnica B, anti-HBe puede ser utilizado para controlar la infeccin y
tratamiento.
INTERPRETACION DE ANTIGENOS DE SUPERFICIE.
Ag
HBs IgM
HBVc
Negati
vo
IgG HBVc HBeAg
Negativo Positivo
Negativo
Anti HBs Anti HBe

Positivo

Positivo
Se
cur/
inmunizado.
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Positivo Negativo Positivo
Negativo
Negativo
Negativo Portador
Positivo Negativo Positivo
Positivo
Negativo
Negativo Portador con

virus
replicndose
propenso a
cirrosis
Positivo Positivo
Positivo/
negativo
Positivo/
negativo
Negativo
Negativo Paciente
agudo
Negativo Negativo
Negativo
Negativo
Negativo No tiene la
enfermedad.
Negati
vo
ELISA- Hepatitis B.
La muestra se pone en contacto con el antgeno HBcAg inmovilizado sobre
el soporte slido en presencia de anticuerpo anti-HBc conjugado con
peroxidasa.
Si la muestra contiene anticuerpos especficos, stos competirn con el
conjugado por el antgeno presente en el soporte. Luego de incubar y lavar
para eliminar la fraccin no unida, se agrega el sustrato enzimtico.
A mayor cantidad de anti-HBc presente en la muestra, menor ser el
desarrollo de color.
VIH
El virus se replica infectando a los linfocitos T CD4, recibiendo un ataque del
sistema inmunolgico mantenindolo de forma temporal controlado.
Pasando este periodo que puede durar aos el virus genera resistencia
contra el sistema inmune generando destruccin de las clulas y
permitiendo la entrada de diversas enfermedades hasta ocasionar la
muerte.
FORMAS DE TRANSMISION
Contacto con fluidos, saliva, lgrimas, semen, orina, lquido seminal, flujo
vaginal, lquido amnitico, leche materna, sangre y LCR.
Parenteral = drogas intravenosas, condiciones higinicas desfavorables,
trabajadores de la salud, piercing, tatuajes.
Vertical = ocurre durante el parto, en las ultimas semanas de gestacin o
cuando se amamanta al bebe, se mantienen tratamientos para evitar esta
forma de contagio por medio de retrovirales que se le dan a la mama, el
nio nace por cesrea y se somete tambin a tratamiento.

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PRUEBAS RAPIDAS.
Estas pruebas se basan en la misma tecnologa que las pruebas ELISA, pero
en lugar de enviar la muestra para su posterior anlisis en el laboratorio, la
prueba rpida puede producir resultados similares en 20 minutos. Las
pruebas rpidas pueden utilizar muestras de sangre o secreciones bucales.
Son fciles de usar y no se necesitan instalaciones clnicas ni personal
altamente capacitado para su realizacin.
Despus de haber obtenido resultados positivos en una prueba rpida, debe
realizarse una prueba confirmatoria. Los resultados de esta ltima pueden
tardar de varios das a varias semanas.
PRUEBA ELISA VIH.
El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno
o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada
y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato
especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple
vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un
colormetro.
WESTERN BLOT.

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Procedimiento de deteccin Ag-Ac en su etapa final. La dificultad de la

prueba es separar los antgenos virales desnaturalizados en sus distintas
bandas proteicas.
INTERPRETACION: Si hay anticuerpos
VIH-1 aparecern bandas
coloreadas al agregar el AHG. Las bandas que pueden aparecer incluyen:
1. Protenas 18, 24 y 55 (GAG).
2. Protenas p31, p51 y p66 (POL).
3. GP41, GP120, GP160 (ENV).
La p31 tiene una sensibilidad demasiada baja para utilizarse como
confirmatoria
CONSULTA
1.- Consulte el fundamento de la tcnica de PCR transcriptasa reversa, y
que finalidad tiene.
2.- Establezca los parmetros de los parmetros de casos probables y
confirmados del dengue y el dengue grave.
3.- Consulte las reglas de Walter Reed aplicadas al estudio del VIH.


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protenas, desorganizacin de las membranas

2. CALOR HMEDO: produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas

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Se mantiene una temperatura estable mediante termostato de metal que al

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acoplamiento covalente del antgeno o del anticuerpo especifico o un

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ANALISIS INMUNOENZIMATICO (ELISA)

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Slidos = 1.5-2.0 % de agar-agar.

SEGN SU NATURALEZA O COMPOSICION

Naturales = utilizados para cultivar m.o tal y como se encuentran

Medios enriquecidos = Con adicin de sangre, suero o extractos

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sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de m.o

Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas en la cual favorece el

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Inicialmente, se aade la mitad de agua y se agita y se agita

Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una

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Turbidez, precipitacin causada por uso de recipientes incorrectamente

CLASES DE MEDIO DE CULTIVO

Agar sangre = al medio Blood agar sangre se le aade sangre de

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MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Medio de Stwart = se utiliza para transportar muestras de materiales

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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

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sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans

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PROCEDIMIENTO COLORACION DE GRAM

Preparacin y fijacin de frotis.

1. Por qu es necesario esterilizar los medios de cultivo y realizar

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SIEMBRA EN TUBO INCLINADO.

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SIEMBRA MIXTA EN TUBO.

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Superficie = lisa o rugosa.

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