UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGA

Obtencin, Aislamiento e Identificacin de Cepas Bacterianas

Presuntas Productoras de Poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

TESIS
TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

QUE PRESENTA:

ELIZABETH ORTIZ GARCA

DIRECTOR:
Biol. S. Augusto Hernndez Rivera

Xalapa, Ver.

2009

Dedicatoria

Me gustara dedicar esta Tesis a toda mi familia, ya que el esfuerzo y dedicacin que he puesto en
esta Tesis va con mucho cario hacia ellos. Principalmente a mis padres, los ms importantes y
los verdaderos responsables de que hoy est aqu, este es buen momento para dejar en claro mi
ms profundo agradecimiento a mi madre por los sacrificios y esfuerzos que realiz a lo largo
de siempre, porque me ayudo a seguir adelante frente a cada una de las adversidades
presentadas a mi hermana y hermanos, as como los dems integrantes de mi familia.
Muchas gracias a todos

Agradecimientos
Quiero expresar mi ms sincero agradecimiento a todas las personas que de distintas maneras han
contribuido a que culmine esta tesis de licenciatura.
Agradezco especialmente a mi director de Tesis el Bilogo S. Augusto Hernndez Rivera por el
apoyo brindado y por la confianza depositada.
Agradezco de forma especial tambin, a mi comit revisor; a la Dra. Beatriz Palmeros Snchez
por la ayuda y apoyo brindado a los largo del desarrollo y conclusin de mi trabajo, as como a la
Dra. Ma. Carmen Ramrez por cada una de las sugerencias valiosas, que fueron de gran ayuda.
Al laboratorio de Toxicologa Ambiental especialmente a la Dra. Ma. del Socorro por permitir
utilizar su equipo.
Tambin me gustara agradecer a la maestra Guille por todos los consejos recibidos durante mi
estancia en la Facultad y por todo su apoyo brindado.
A mis amigas a las cuales agradezco su motivacin y optimismo en momentos crticos y por su
sincera amistad.
Y una vez ms agradezco a mi Familia.

ii

NDICE
Pg.
ndice de tablas

ndice de figuras

vi

ndice de anexos

ix

Indice de Abreviaturas

Resumen
I.-Introduccin

xiii
1

II.- Antecedentes:
2.1.- Organismos productores de polmeros biolgicos

2.2.-Material de almacenaje

2.3.-Estructura Qumica y Tipos de PHAs

2.4.- Propiedades fisicoqumicas y caractersticas de los PHAs

2.5.- Tipos de PHAs ms importantes

10

2.6.- Organismos productores de PHAs

12

2.7.-Biosntesis de Poli--hidroxialcanoatos

13

2.7.1.- Descripcin de las enzimas que intervienen en la biosntesis de PHAs

15

2.7.2.- Biosntesis de PHAs-ssc

17

2.7.3.- Biosntesis de PHAs-msc

19

2.7.4.-Formacin de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de cidos grasos

19

2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos

19

2.8.- Caractersticas de los grnulos

21

2.8.1.- Modelos para la formacin del grnulo de PHAs

22

2.8.2.- Formacin in vivo de partculas de polisteres

22

2.9.- Degradacin de los PHAs

26

2.10.- Biodegradabilidad

27

2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs

27

2.12.- Aplicacin de los Poli--hidroxialcanoatos

28

2.13.- Sustratos y costos

30

III.-Justificacin

33

IV.-Objetivo

35

V.-Material y Mtodos
5.1.- Obtencin de muestras

36

5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal

36

5.3.- Procesamiento de muestras de suelo

37

5.4.- Obtencin y Aislamiento de cultivos puros por mtodo de siembra en placa

37

iii

5.5.-Produccin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

39

5.6.-Determinacin cuantitativa de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

40

5.7.- Evaluacin cualitativa de la acumulacin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

41

5.8.- Anlisis de crecimiento celular

41

5.9.-Caracterizacin qumica y bioqumica de cepas bacterianas

43

5.10.-Caracterizacin qumica y bioqumica de Fermentadores

43

5.11.- Caracterizacin qumica y bioqumica para no fermentadores

47

VI.-Resultados

51

6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas

6.2.- Caracterizacin qumica y bioqumica de las cepas productoras de PHAs y
cuantificacin de PHAs

53

6.3.- Concentracin de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum

57

6.4.- Concentracin de PHAs de las cepas aisladas de Musa paradisiaca

6.5.- Concentracin de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum
esculentum

58
59

6.6.- Concentracin de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

5.9

6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs

60

6.8.- Evaluacin cualitativa de la acumulacin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

70

VII.- Discusin
VIII.- Conclusiones

50

72
76

IX.- Anexos

78

X.- Referencias Bibliogrficas

84

iv

ndice de tablas

Pag.
Tabla 1. Principales caractersticas del polihidroxibutirato, polihidroxialcanoato y el
propileno (Tomada de Carminatti et al., 2006)
9
Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Tomada
de Luzier, 1992)
27
Tabla 3. Componentes del MSM suplementado con sacarosa
38
Tabla 4. Solucin de microelementos
38
Tabla 5. Componentes del medio de cultivo para la produccin de PHAs
39
Tabla 11. Nmero de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo
51
Tabla 12. Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores ptimos en
cuanto a la lectura en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm
51
Tabla 13. Cepas bacterianas identificadas como productoras de PHAs
54
Tabla 14. Concentracin de PHAs de cepas bacterianas aisladas de Saccharum
officinarum
57
Tabla 15. Concentracin de PHAs de cepas bacterianas aisladas de Musa paradisiaca
58
Tabla 16. Concentracin de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Lycopersicum
esculentum
59
Tabla 17. Concentracin de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus
lanatus
60
Tabla 18. Cepas con mayor produccin de PHAs de cada cultivo
69
Tabla 19. Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su produccin y
curva de crecimiento

69

ndice de figuras

Pag.
Fig. 1. Estructura qumica general de los PHAs, generalmente estn compuestos de (R )-cidos grasos hidroxi, donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil

Fig. 2. Polihidroxialcanoatos ms conocidos (Tomada de Segura et al., 2007)

Fig. 3. Micrografas de transmisin electrnica de grnulos de PHB. A y B, producidos por

R. esphaeroides (Cetin et al., 2006); C, PHB producidos por W. eutropha (Tomada de Tian
et al., 2005)

11

Fig. 4. Protenas requeridas para la homeostasis de PHA (Tomada de Stubbe y Tian 2003)

13

Fig. 5. Biosntesis y degradacin de PHB. En condiciones de exceso de energa, el NADH

inhibe la despolimerizacin de PHB y el ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA). La
disminucin de la concentracin de CoA-SH aumenta la inhibicin de la acetil-Coaciltransferasa que cataliza la condensacin del acetil-CoA en acetoacetil-CoA y la sntesis
de PHB. En deficiencia de energa, el control acta en el otro sentido. Los signos (+) y (-)
corresponden a una regulacin positiva o negativa (Tomada de Cabello, 2007)

18

Fig. 6. Ruta biosintetica para PHAs-msc a partir de hidratos de carbono. Esta va est ligada
a la biosntesis de los cidos grasos, puesto que la biosntesis de estos procede de la va (R)3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP es convertido (R)-3-hidroxiacil-CoA por un
acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene phaG (Tomada de Madison y Huisman,
1999)

21

Fig. 7. Modelo Micela, la formacin de grnulo PHB, las esferas coloreadas mostradas
sobre PHB amorfo representan las protenas que estn asociadas a la superficie del grnulo.
Esferas grises PhaC; esferas azules PhaP; esferas rojas PhaR esferas verdes, PhaZ1a, esfera
prpura, PhaZ1b, esfera de naranja, PhaZ1c. (Tomada de Tian et al., 2005)

24

Fig. 8. Modelo Budding, donde se puede observar la formacin del grnulo (Tomada de
Tian et al., 2005)

25

Fig. 9. Degradacin de P (3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aerbicas. Las

botellas hechas de P (3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura
promedio de 20C). El progreso de degradacin es demostrado con las botellas que han sido
sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de la izquierda a la derecha)
(Tomada de Madison y Hiusman, 1999)

27

Fig. 10. Productos elaborados utilizando los polihidroxialcanoatos como materia prima
(Tomada de Segura et al., 2007)

29

Fig. 11. La grfica muestra el nmero de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de
donde se obtuvieron las cepas bacterianas

50

Fig. 12. Distribucin porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de Musa

50

vi

paradisiaca, Saccharum officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y

Nicotina tacabum L
Fig. 13. Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo

53

Fig. 15. Pruebas bsicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b)
prueba de catalasa, c) prueba de oxidasa

55

Fig. 16. a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reaccin negativa, fue observado en todas
las cepas caracterizadas, el segundo tubo reaccin positiva caracterstica de E. coli que fue
seleccionado como control positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reaccin
positiva caracterstico de algunos organismos fermentadores, el segundo tubo es reaccin
negativa caracterstica de organismos no fermentadores c) Prueba VP, en el primer tubo
reaccin positiva, la reaccin negativa se puede apreciar en el segundo tubo caracterstico
de organismos no fermentadores

55

Fig. 17. Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la produccin de H2S; una
caracterstica fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, adems se observa la
reaccin Alc/Alc caracterstico de un organismo no fermentador a 24 h de incubacin a
35C

56

Fig. 18. a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido

por P. aeuroginosa; b) Placa de Agar sangre, se observa la pigmentacin amarilla de las
colonias pertenecientes a P. cepacia; c) Prueba de acides de hidratos de carbono y alcoholes
de P. cepacia

56

Fig. 19. Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus

61

Fig. 20. Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de

Citrullus lanatus
Fig. 21. Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUVEMP54), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

61
62

Fig. 22. Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de Musa
paradisiaca
62
Fig. 23. Curva de crecimiento de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de
Lycopersicum esculentum
63
Fig. 24. Curva de Crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum
64
Fig. 25. Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de
Saccharum officinarum, adems podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas
a las 24, 48 y 72 horas

Figura 26.- Curva de crecimiento de E. spp. (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de Saccharum
officinarum

Fig. 27. Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de

Saccharum officinarum

64
65
65

vii

Fig. 28. Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo
de S. officinarum

66

Fig. 29. Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28)
aislada de Musa paradisiaca

67

Fig. 30 Curva de crecimiento de Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de

Musa paradisiaca

67

Fig. 31. Curva de crecimiento de la cepa bacteriana identificada como P. pseudomallei

(IIBUV-ESP2), aislada del cultivo de Saccharum officinarum

68

Fig. 32. Curva de crecimiento de la cepa A. latus (IIBUV-EMP30), aislada del cultivo de
Musa paradisiaca

68

Fig. 33. Tincin lipofilica con Sudn negro. Se observan grnulos PHA a un aumento de
100X, en la cepa bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs

70

Fig. 34. Tincin lipofilica con Sudn negro, se observan grnulos PHA a un aumento de
100 x, en la cepa bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs

71

viii

ndice de anexos

Pag
Tabla 6. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a
214nm de las 15 cepas bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que
obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para su determinacin
cuantitativa y cualitativa en cuanto a produccin de PHAs, as como su caracterizacin
qumica y bioqumica

78

Tabla 7. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a

214nm de las 12 cepas bacterianas aisladas Lycopersicum esculentum, las 2 cepas que
obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinacin
cuantitativa y cualitativa de PHAs, as como su caracterizacin qumica y bioqumica

79

Tabla 8. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a

214nm de las 30 cepas bacterianas aisladas Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron
las mayores lecturas fueron seleccionas (sombredas) para determinar cuantitativa y
cualitativa la produccin de PHAs, as como su caracterizacin qumica y bioqumica

79

Tabla 9. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a

214nm de las 11 cepas bacterianas aisladas Citrullus lanatus, las 3 cepas que obtuvieron las
mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinacin cuantitativa y
cualitativa de PHAs, as como su caracterizacin qumica y bioqumica

81

Tabla 10. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a

214nm de las 2 cepas bacterianas aisladas N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo
presentaron valores muy bajos por lo cual no se seleccionaron para determinar cuantitativa
y cualitativamente a PHAs, as como su caracterizacin qumica y bioqumica

82

Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs,

adems de que su cinetica de crecimiento mostr que concentraciones relativamente
mayores de PHAs fue hasta las 72 h por lo cual no es factible.
82
Fig. 14. a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa E. hormaechei, aislada de S.
officinarum utilizados para la lectura en el espectrofotmetro UV/VIS a 214nm, por el
mtodo espectrofotomtrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martnez et al.,
2004
Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31 aislada de M.
paradisiaca ( no seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotmetro UV/VIS A 214 nm,
por el mtodo espectrofotomtrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martnez et al., 2004

82

ix

Abreviaturas
AMC

Acetil-metilcarbinol

B. megaterium

Bacillus megaterium

C/N

Relacin carbono- nitrgeno

CO2

Dixido de carbono

C-3

Tercer tomo de carbono

C1

Metil

C13

Tridecil

Da

Daltons

EDP

Ruta metablica de Entner- Doudoroff

EDTA

cido-etilen-diamino-tetra-actico

Fig.

Figura

Hora

H2O

Agua

H2O2

Perxido de hidrogeno

H2S

cido sulfurico

ICI

Industrias Qumica Imperial

KCN

Cianuro de Potasio

kDa

Kilodalton

Kg

Kilogramo

Kg/km2

Kilogramo/kilometro cuadrado

ml.

mililitro

MSM

Medio de sales minerales

Mw

Peso molecular

NADH
NAD

Nicotinamida adenn dinucletido reducida

Nicotinamida adenina dinucletido oxidada

NH4

Amonio

nm

Nanmetro

mM

milimolar

O2

Oxgeno molecular

pH

Potencial de hidrgeno

PhaC

Sintasa

PhaP

Fasinas

CoA

Coenzima A

PHAs

Poli--hidroxialcanoatos

PHAsSCL

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud corta

PHAsMCL

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud media

Pha P

Fasina

PhaC

Sintasa

Pha Z

Depolimerasa

PHB P (3HB)

Poli- -hidroxibutirato poli-3-hidroxibutirato

PHV

Polihidroxivalerato

PHB-V

Poli(hidroxibutirato-co-valerato)

P(HHX-co-HO)

Poli--hidroxihexanoato-co-octanoato

PHO

Poli--hidroxioctonoato

Radical

R. eutropha

Ralstonia eutropha

RM

Prueba de Rojo de Metilo

rpm

Revoluciones por minuto

spp.

Especie

TCA

Ciclo de los cidos tricarboxilicos Ciclo de Krebs

(Tg)

Temperatura de transmisin vtrea

TSA

Agar de Soya y Tripticaseina

TSI

Agar Triple azcar y hierro

TTC

2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio

UV

Ultravioleta

VP

Prueba de Vogues-Proskauer

Zn

Zinc

Microgramo

xi

xii

Microlitro

Micrometro

Grados centgrados

3HO

3-hydroxioctonoato

3HD

3-hidroxidecanoato

Resumen

Actualmente, varios estudios han demostrado la produccin de polihidroxialcanoatos (PHAs) por

una variedad amplia de procariotas, as como tambin por varias plantas y animales. Sin
embargo, slo los microorganismos acumulan PHAs de peso molecular alto; la capacidad de
acumular PHAs favorece su establecimiento y sobrevivencia bajo condiciones de estrs. Estos
polmeros son considerados como buenos candidatos para remplazar a los plsticos obtenidos a
partir de hidrocarburos.
Las investigaciones ms recientes en esta rea centran su atencin hacia dos objetivos: la
optimizacin de los parmetros de cultivo de organismos productores de PHAs, y la seleccin de
linajes bacterianos con la capacidad de producir altas concentraciones de PHAs. En este trabajo a
partir de muestras de cultivos de Musa paradisiaca, Saccharum officinarum, Lycopersicum
esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tabacum se aisl un total de 70 cepas bacterianas, las
cuales fueron caracterizadas para la produccin de PHAs mediante el mtodo espectrofotomtrico
reportado por Law y Slepecky (1961) y modificado por Martnez et al., (2004).
Concluida la primera etapa, se seleccionaron 20 cepas bacterianas que presentaron
concentraciones ptimas de PHAs, las cuales fueron caracterizadas por tincin de Gram y anlisis
bioqumicos y se les realizo la prueba de Tincin Lipoflica con Sudn Negro. Los anlisis
bioqumicos de las cepas bacterianas productoras de PHAs permitieron establecer que estos
aislados pertenecen a los gneros de Pseudomonas, Citrobacter, Enterobacter y Alcaligenes.
Adems de la identificacin de los aislados bacterianos, se determin su cintica de crecimiento y
el anlisis de las curvas de crecimiento permiti establecer que cepas producan PHAs en menor
tiempo. Al final de este estudio se concluyo que el 10% de las 70 cepas bactaerianas aisladas de
los cultivos presentan concentraciones elevadas de PHAs.

xiii

I.- I n t r o d u c c i n.
La basura generada por las actividades humanas hasta mediados del siglo XX consista
principalmente de desechos biodegradables o reciclables (Fras et al., 2003). Los polmeros
sintticos se han hecho significativos desde los 40s, y desde entonces han ido substituyendo al
cristal, la madera y otros materiales de construccin, y an a metales en muchos usos industriales,
domsticos y ambientales (Can, 1992; Poirier et al., 1995). Al incorporarse el plstico a la vida
cotidiana e ir aumentando su utilizacin en diferentes reas, una parte considerable de los
desechos producidos comenz a acumularse en el ambiente, debido a la resistencia de estos
materiales a la corrosin, a la intemperie (Segura et al., 2007) y por el carcter recalcitrante a la
degradacin de la mayora de los polmeros sintticos (Lasala et al., 2004a). Adems, el
crecimiento exponencial de la poblacin humana ha llevado a la acumulacin de enormes
cantidades de material de desecho no degradables en nuestro planeta, y trayendo como
consecuencia que las condiciones de vida en la biosfera estn cambiando drsticamente (Arshad
et al., 2007; Zinn et al., 2001).
En el pasado inmediato, era importante descubrir materiales cada vez ms durables para su uso
diario; entre estos estn los plsticos debido a que por sus propiedades son utilizados en una gran
cantidad de aplicaciones, adems de que su costo es bajo. Por lo anterior, el uso de los plsticos
sigue en aumento en todo el mundo (ms de 100 millones de toneladas/ao de plsticos
producidos). El aumento en su consumo no solo se debe a sus propiedades mecnicas y trmicas
favorables, sino principalmente a la estabilidad y durabilidad de los mismos (Rivard et al., 1995).
En consecuencia, el uso indiscriminado de estos materiales tiene como consecuencia que una
grande cantidad de residuos de plstico sean descartados al medio ambiente, aproximadamente el
20% del volumen total. Actualmente, en promedio el consumo de plsticos per capita en el
mundo es de 19kg, pero estos valores se modifican si se toman en cuenta determinadas regiones,
as en EUA es de 80kg, en Europa de 60 kg y en India de 2 kg (Franchetti y Marconato, 2006). A
causa de su persistencia en nuestro ambiente, los ecosistemas son ahora ms sensibles al impacto
de plstico desechado sobre el ambiente, incluyendo efectos deletreos sobre la fauna y sobre las
calidades estticas de ciudades y bosques (Fras et al., 2003).

La degradacin de los plsticos sintticos es muy lenta, por ejemplo, la descomposicin de

productos orgnicos tarda 3 4 semanas, la de las telas de algodn 5 meses, mientras que la del
plstico puede tardar hasta 500 aos o ms dependiendo de su tipo. Adems, en buena medida la
degradacin de estos plsticos simplemente genera partculas ms pequeas que, a pesar de ya
no ser evidentes, se acumulan en los ecosistemas; al respecto, recientemente se han realizado
estudios sobre la presencia de microplsticos o fragmentos de plstico de tamao inferior a 5
milmetros, y han demostrando que stos se estn acumulando de forma considerable en los
mares, en la arena de las playas y estuarios. Los ms abundantes son los microfragmentos de
acrlico, polipropileno, polietileno, poliamida (nylon), polister, polimetacrilato, etc. (Fras et al.,
2003); la presencia de estos polmeros en los mares es variable, pero hay reportes de que su
abundancia va de 3 a 5 kg/km2 hasta 30 kg/km2, lo que s es seguro es que esa cantidad aumenta
considerablemente cada ao.
En el norte del ocano Pacfico se ha determinado que la cantidad de microplsticos se ha
triplicado en la ltima dcada, y cerca de la costa de Japn la cantidad se multiplica por diez cada
2 o 3 aos. Se calcula que cientos de miles de las muertes de mamferos marinos al ao se deben
a esta causa; tambin se determin que 82 de 144 especies en aves estudiadas contenan
fragmentos de plstico en sus estmagos, y en algunas de estas especies hasta el 80% de los
individuos de una poblacin los presentan (Fras et al., 2003). Adems, se ha demostrado que los
plsticos acumulan compuestos qumicos txicos como los bifenilos policlorados, el
diclorodifenil dicloroeteno y los nonifenoles, que no son muy solubles en agua y por lo tanto se
adhieren y acumulan en los plsticos. As, los fragmentos de plstico funcionan como
transportadores de contaminantes a los mares y otros cuerpos de agua (Fras et al., 2003).
En la actualidad, y dado a que la acumulacin de plsticos se ha incrementado de manera
alarmante en los ltimos aos, se estn implementando medidas dirigidas a enfrentar esta
problemtica. Una de las estrategias que se ha utilizando para deshacerse de los plsticos
derivados del petrleo es la incineracin, pero la quema de estos materiales es altamente
contaminante y causa efectos negativos en el ambiente, tales como el incremento de CO2 en la
atmsfera y la liberacin de compuestos qumicos muy peligrosos, como las dioxinas, el cloruro
y el cianuro de hidrgeno. Otra estrategia es reciclar, en lo posible, la mayor variedad y cantidad
de plsticos, algunos de los principales inconvenientes de esta alternativa son que para su

reciclaje los plsticos deben ser manejados adecuadamente, no slo en su recoleccin y

procesamiento, sino en la limpieza, seleccin y separacin adecuada de los diferentes materiales a
reciclar, lo cual en la mayora de los casos no sucede. Aunado a lo anterior, los artculos plsticos
no se pueden reciclar indefinidamente, slo se pueden reciclar tantas veces como lo permitan las
condiciones fsicas y qumicas en las que queda el material despus de su procesamiento. En
Mxico se estima que del total de los plsticos que son desechados, nicamente se colecta el 12%
(Segura et al., 2007). En pases como Mxico y algunos otros de Amrica Latina el reciclado de
plsticos an se encuentra en su primera etapa, pero en pases como Alemania, Japn y Estados
Unidos de Amrica se han desarrollado programas de recoleccin de residuos que han tenido
xito despus de varios aos (Fras et al; 2003).
De acuerdo con el Instituto Nacional de Recicladores, A.C. (INARE), uno de los mayores
problemas a los que se enfrenta nuestro pas en materia ambiental, es el consumo de plstico;
(Fras et al; 2003). La contaminacin ambiental por los plsticos sintticos es un problema con
repercusin mundial muy grande, como una solucin adecuada a estos problemas se plantea la
sustitucin de estos materiales, que adems de ser de naturaleza qumica se obtienen por procesos
industriales altamente contaminantes, por polmeros de tipo natural (Carballo et al., 2003).
Actualmente los polmeros naturales ms utilizados son las mezclas de almidn, como los cidos
polilcticos y los polihidroxialcanoatos (PHAs). El potencial que presentan los PHAs se debe a
que son polisteres de origen natural, producidos por bacterias, y por lo tanto son biodegradables
(Lasala et al., 2004a); se caracterizan por ser compuestos biocompatibles, con propiedades fsicas
similares a los termoplsticos sintticos y a los elastmeros actualmente en uso, como el
polipropileno y el caucho sinttico (Rojas et al., 2006). Los PHAs en una gran variedad de
especies bacterianas constituyen materiales de reserva no nitrogenados (Carballo et al., 2003).
La degradacin de estos biopolmeros, en primera instancia se lleva a cabo por accin de
microorganismos tales como hongos, bacterias y algas, generando bixido de carbono (CO2),
concentraciones no significativas de gas metano, diferentes componentes celulares y otros
productos, segn lo establecido por la American Standard for Testing and Methods (ASTM-D833). De forma similar, estos materiales se degradan en CO2, H2Oy biomasa como resultado de la
accin de organismos vivos, como se acaba de mencionar, o de sus enzimas (Franchetti y
Marconato, 2006). La produccin de polmeros no contaminantes al medio ambiente

(biopolmeros), se ha impulsado de forma significativa en ciertos pases desarrollados mediante la

aprobacin de leyes que obligan a que se reemplace cierta cantidad de materiales construidos a
partir de polietileno y poliestireno, por plsticos degradables (Lasala et al., 2004a).

II.- A n t e c e d e n t e s

2.1.- Organismos productores de polmeros biolgicos.

Los procariotas han desarrollado numerosos mecanismos de resistencia bajo condiciones de
estrs. Por ejemplo, muchos microorganismos en su ciclo biolgico tienen la capacidad inherente
de permanecer en etapas de reposo (cistos o esporas) que les permiten sobrevivir en ambientes
desfavorables para llevar a cabo su ciclo de vida, por lo general condiciones de falta de agua
(disecados) o la falta de algn nutriente. Otros como la espiroqueta Spirosymplokos deltaiberi
aumenta y forma cuerpos refrctales resistentes a la exposicin al aire; alternativamente, otras
bacterias exhiben una versatilidad metablica amplia que les permite hacer frente a fluctuaciones
qumicas que se presentan en su ambiente.
Por otro lado, en algunos otros casos la acumulacin de polmeros almacenados intracelularmente
es otra estrategia bacteriana que incrementa la supervivencia de muchos microorganismos en un
ambiente cambiante (Berlanga et al., 2006). Consecuentemente, la necesidad de algunos
organismos de adaptarse a fluctuaciones ambientales extremas da como resultado la produccin y
utilizacin de componentes sintetizados y almacenados dentro de los mismos organismos; esto,
puede explicar la acumulacin in situ de Poli--hidroxialcanoatos (PHAs) en muchos organismos
presentes en diferentes ambientes (Berlanga et al., 2006; Navarrete et al., 2000). Los PHAs en los
microorganismos sirven como una fuente endgena de carbono y energa durante etapas de
inanicin-hambre (Berlanga et al., 2006). Varios estudios han demostrado la produccin de
PHAs por una variedad amplia de procariotas, as como tambin por varias plantas y animales.
Sin embargo, solo los procariotas acumulan PHAs de peso molecular alto en grnulos
citoplasmticos; adems, las bacterias que producen PHAs tienen la ventaja de almacenar
nutrientes a un costo de mantenimiento relativamente bajo y con la seguridad de obtener el aporte
de energa cuando sea necesario (Berlanga et al., 2006). Rrecientemente, la explotacin
comercial de estos polisteres biodegradables se ha convertido en un rea sumamente interesante
(Moreno et al., 2007; Page et al., 1992).

2.2.-Material de almacenaje
Los poli--hidroxialcanoatos (PHAs) representan una de las ocho clases de biopolmeros que son
producidos y acumulados en una gran variedad de bacterias y archae (Ewering et al., 2002); los
microorganismos que capaces de acumular PHAs, normalmente son bacterias de tipo Gramnegativas y Gram-positivas que se encuentran en diferentes ecosistemas, como: agua de mar,
suelo, efluentes, etc. (Carminatti et al., 2006).
Estos biopolmeros son almacenados intracelularmente en gran cantidad por una gran variedad de
microorganismos sin afectar la presin osmtica de las clulas (Carminatti et al., 2006), ya sea
como material de reserva de energa y de carbono o como equivalentes de reduccin (Aldor y
Keasling, 2003; Choi y Lee, 1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et
al., 2006; Steinbchel y Fchtenbusch, 1998). Los PHAs al ser depositados intracelularmente en
formas de cuerpos de inclusin, pueden llegar a representar ms del 90% del peso seco celular
(De Almeida et al., 2004).
La sntesis de estos biopolmeros se induce cuando se presentan condiciones de crecimiento no
balanceado durante el ciclo de crecimiento de algunos organismos, las cuales son principalmente
ocasionadas por la ausencia de algn o algunos nutrientes en el medio, como por ejemplo
nitrgeno, fosforo o magnesio, y por un exceso en la fuente de carbono principal (Aldor y
Keasling, 2003; Choi y Lee ,1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et
al., 2006; Steinbchel y Fchtenbusch, 1998). La sntesis de estos compuestos, generalmente
involucra reacciones catalizadas por enzimas o reacciones de crecimiento de la cadena del
polmero a partir de monmeros activados que son formados dentro de las clulas por procesos
metablicos complejos (Franchetti y Marconato, 2006).
Cuando la fuente de carbono externa se agota o si el nutriente limitante se suministra
nuevamente, el PHA es depolimerizado y posteriormente metabolizado como fuente de carbono y
energa (Park et al., 2001). La degradacin de PHAs cumple un papel muy importante en la
supervivencia bacteriana y en los mecanismos de resistencia al estrs, en condiciones de baja
concentracin de nutrientes, la utilizacin de dicho polmero se considera una estrategia
desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes y
adversos (De Almeida et al., 2004).

2.3.- Estructura Qumica y Tipos de PHAs.

Los PHAs, primariamente, son molculas lineales largas formadas por monmeros de un cido
graso 3-hidroxilo unidos entre si por enlaces steres (Madison y Huisman, 1999). As, los PHAs
son polisteres de cidos 3-hidroxi-alcanoicos formados por la policondensacin del grupo
carboxilo de un primer monmero con el grupo hidroxilo ubicado en el carbono de un segundo
monmero (Rojas et al., 2006). La mayora de estos monmeros poseen el grupo hidroxilo en la
posicin 3 (C3) carbono , aunque en algunos PHAs este grupo sustituido fue encontrado en las
posiciones 4, 5 6 (Carminatti et al., 2006).
El tomo de carbono del hidroxilo sustituido es de configuracin R, excepto en algunos casos
especiales donde no hay quilaridad; Adems, en este carbono est posicionado un grupo alquilo,
el cual puede variar desde un metil (C1) hasta un tridecil (C13) (figura 1) (Madison y Huisman,
1999). La cadena principal de los PHAs presenta centros quirales con un radical R, as si este
radical es un metilo (CH3-) se forma el polihiroxibutirato (PHB), si es un etilo (C2H5-) se trata del
polihidroxivalerato (PHV), etc. (Hermida y Daz, 2004). La quilaridad del carbono de la cadena
lineal de estos polisteres permite que presenten actividad ptica y que se comporten de forma
isotctica (Moreno et al., 2006).

Figura 1. Estructura qumica general de los PHAs, generalmente estn compuestos de (R )--cidos grasos hidroxi,
donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil.

Basndose en el nmero de tomos de carbonos y las unidades monomricas, los PHAs se

pueden dividir en dos grupos:
1. PHAs de cadena corta (HAsSCL del ingls HydroxiAcids of Short-Chain-Lenght) que
contienen de tres a cinco tomos de carbono en su cadena principal.
2. PHAs de cadena media (HasMCL del ingls HydroxiAcids of Medium-Chain-Lenght),
que comprenden de seis a diecisis tomos de carbono en su cadena principal (Ojumu et
al., 2003).
A la fecha, se han identificado alrededor de 130 tipos diferentes de PHAs (Niamsiri et al., 2004;
Sheu et al., 2000). Los PHAs ms conocidos son el PHB, PHV, y el polihidroxibutiratocovalerato (PHB-V) (Franchetti y Marconato, 2006) y el poli--hidroxihexanoato-co-octanoato
(PHHX-co-HO) (Moreno et al., 2006), ver figura 2.

Figura 2. Polihidroxialcanoatos ms conocidos (Segura et al., 2007).

2.4.- Propiedades fisicoqumicas y caractersticas de los PHAs

Debido a que los PHAs son polmeros alifticos, dependiendo de la composicin del polmero y
del tamao de los grupos alquilos ramificados, muestran una gran variedad de propiedades desde
comportarse como materiales rgidos y quebradizos a plsticos con propiedades de impacto como

elastmeros resistentes. Debido a las diversas propiedades que presentan, en aos recientes los
PHAs han atrado la atencin, no solo porque poseen propiedades similares a los plsticos
convencionales sino porque son completamente biodegradables (Tabla 1).

Tabla 1: Principales caractersticas de los polmeros polihidroxibutirato P(3HB), polihidroxioctanoato

(PHO) y el propileno (PP). (Carminatti et al., 2006).

Las propiedades fsicas y mecnicas de estos materiales dependen de su composicin

monmrica, peso molecular y la distribucin del peso molecular del polmero, siendo las dos
ltimas caractersticas las ms importantes para su comercializacin adecuada. El peso molecular
de estos polmeros, vara de 2x105 a 6x10 3 Dalton (Da), y en consecuencia sus caractersticas
fsicas dependen de los microorganismos que los producen, de las condiciones de crecimiento, de
la posicin del radical R o del grupo hidroxilo (n), as como del grado de polimerizacin.
Dentro de las propiedades termoplsticas destacan: el elevado punto de fusin, baja rigidez,
resistencia alta a la presin, adems de propiedades como la temperatura de transicin vtrea (Tg),
cristalinidad y tiempo de cristalizacin. Los polmeros de cadena de longitud media, PHAsMCL,
difieren de los de cadena de longitud corta, PHAsSCL, posen menor nivel de cristalinidad y son
ms elsticos (Carminatti et al., 2006).
En la dcada de los 60s se descubrieron las propiedades termoplsticas de estos materiales por lo
que el inters sobre el plstico biodegradable aumento, y as se produjo a nivel comercial P(3HB)
por la empresa W.R. Grace Co. Durante la poca de los 70s se present la primera crisis del
petrleo y la British Chemical Giant e Industrias Qumica Imperial (ICI) iniciaron la
9

investigacin formal de las propiedades del polmero presente en las bacterias para poder
moldearlo (Katircioglu et al., 2003). A partir de 1974, se descubrieron otros hidroxialcanoatos y
en 1976 la empresa ICI inici el desarrollo de metodologas para la produccin y aplicacin de
P(3HB); esta misma empresa produca PHAs con el nombre comercial de Biopol. En Alemania,
en 1990, fue lanzado al mercado un embase de shampoo fabricado a partir de plsticos
biodegradables; en 1991 en se iniciaron las investigaciones para producir P(3HB) a partir de
procesos fermentativos (Carminatti et al., 2006).
La gran mayora de los microbios sintetizan PHAs-ssc conteniendo primariamente unidades de
3HB o PHAs-msc conteniendo 3-hydroxioctonoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) (Madison
y Huisman, 1999).

2.5.- Tipos de PHAs ms importantes

En 1926 en el Instituto Pasteur, el microbilogo Maurice Lemoigne obtuvo por vez primera a
partir de Bacillus megaterium un compuesto determinado como PHAs. Fue el primer polmero de
este tipo que se aisl y se le denomin cido 3-hidroxibutirico (P[3HB]); en 1958, Macre y
Wilkinson estudiando Bacillus megaterium verificaron que este microorganismo almacena este
homopolimero, y concluyeron que el P(3HB) era una fuente de reserva de carbono y energa
(Katircioglu et al., 2003).
El poli--hidroxibutirato (PHB) es uno de los PHAs ms abundantes, y es el que se ha estudiado
ms extensamente (Berlanga et al., 2006; Cetin et al., 2006; Floccari et al., 1995). Es un polister
de almacenaje que se produce como cuerpo de inclusin insoluble en el citoplasma. Las
inclusiones de PHB aparecen como cuerpos transparentes y refringentes al observar y explorar
por medio de microscopia de transmisin electrnica secciones delgadas de bacterias conteniendo
PHB, ver figura 3 (Cetin et al., 2006). Reusch y Sadoff (1983) demostraron que el PHB es una
molcula importante en el citoplasma y la pared celular (Katircioglu et al., 2003); puede ser
sintetizado por muchas bacterias a partir de diferentes fuentes de carbono (Haywood et al., 1990).

10

Figura 3. Micrografas de transmisin electrnica de grnulos de PHB. A y B, producidos por R. esphaeroides (Cetin
et al., 2006); C, grnulos producidos por W. eutropha (Tian et al., 2005).

El homopolmero P(3HB) posee unidades monmericas con una configuracin D(-) debido a la
esteroespecificidad de las enzimas involucradas en su sntesis (Moreno et al., 2007); es un
polmero

lineal y cristalino

acumulado

intracelularmente por muchas

especies

de

microorganismos en respuesta a un exceso de carbn y energa, y como un mecanismo de

almacenaje (Ramsay et al., 1988), por lo que tiene un papel fisiolgicamente importante. Desde
el punto de vista aplicativo ha sido valorado como un termoplstico biodegradable natural (Page
et al., 1997). Dentro de la clula el P(3HB) existe en estado fluido y amorfo, pero despus de
extraerlo de la clula con solventes orgnicos es altamente cristalino, en este estado es rgido por
lo cual es un material quebradizo.
Las propiedades fsicas y qumicas del PHB son similares a las del polipropileno, sin embargo,
otros PHAs pueden tener subunidades de -hidroxicidos de cadena larga, ordenados de C5 a C10.
La adicin de un porcentaje pequeo de subunidades laterales de cadena larga dentro del PHB
causa un incremento en la flexibilidad de estos copolmero, marcando esta opcin como un
substituto para la mayora de los termoplsticos (Page et al., 1992).
Desafortunadamente, el proceamiento del homopolimero del PHB presenta dos inconvenientes: el
primero de ellos es que la fusin se lleva a cabo a temperaturas suficientemente altas que

11

provocan una disminucin en su peso molecular volvindolo frgil (Ramsay et al., 1988), lo cual
limita el procesamiento del homopolmero (Galindo, 2007). Sin embargo, el PHB es un
termoplstico que presenta muchas propiedades deseables, por ejemplo: se le pueden adicionar
facilmente fibras de vidrio para incrementar su potencia. Adems tiene la ventaja de ser
pticamente activo, por ejemplo contiene esteroismeros idnticos como monmeros por lo que
tiene propiedades piezoelctricas; tambin, inmunolgicamente es compatible con el tejido
humano. Por otra parte, como el PHB es biodegradable es probable que permita que otros
polmeros que generalmente no son considerados como biodegradables, adquieran parcialmente
esta propiedad al ser mezclados con el PHB. Estudios realizados mostraron que algunas bacterias
en ambientes naturales, como sedimentos estuarinos, pueden acumular copolmero de cidos poli3-hidroxialcanoatos, este tipo de polmeros tienen una fusin baja y son ms flexibles que el
homopolimero PHB (Ramsay et al., 1988).
Otros tipos de PHAs, como los PHAs-msc, se diferencian del P(3HB) por su nivel de
cristalinidad bajo, y como adems son ms elsticos presentan un rango diferente de aplicaciones
(Galindo, 2007), ejemplos de este tipo de PHAs son: poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)
(PHBV), polister de origen bacteriano de creciente importancia por ser biodegradable y
biocompatible, y aunque puede sustituir a polmeros petroqumicos an no es econmicamente
competitivo (Hermida y Daz, 2004). Otro PHAs importante es el poli--hidroxioctonoato (PHO),
el cual se caracteriza por tener una temperatura de transicin vtrea de -35C por lo cual es un
elastmero, amorfo y pegajoso a temperatura ambiente, lo cual si bien es cierto dificulta su
procesamiento permite que pueda ser usado como ltex, adems es muy estable debido a que
tiene una densidad muy cercana a la del agua. La temperatura de fusin reportada para los PHAsmcl est entre 39 y 61C; el peso molecular depende de la fuente de carbono, el mtodo de
recuperacin y la cepa empleada (Moreno et al., 2006).

2.6.- Organismos productores de PHAs

La acumulacin de estos polmeros se ha reportado que se lleva a cabo en una larga lista de
gneros (Quagliano y Miyasaki, 1997). Estos polisteres son sintetizados por varios
microorganismos, tales como R. eutropha (Carminatti et al., 2006), Alcaligenes latus (Page et al.,

12

1997), bacterias del gnero Azotobacter (Lakshman y Ramachandriah, 2003), bacterias

Metilotrficos (Carminatti et al., 2006; Choi y Lee, 1999), Comamonas acidovorans y P. putida
(Franchetti y Marconato, 2006), y P. oleovorans (Haywood et al., 1990), entre otras.
Bacterias del gnero Pseudomonas pueden producir PHAs de cadena media o larga a partir de
substratos conteniendo alcanos o cidos alcanoicos (Carminatti et al., 2006; Haywood et al.,
1990). Algunas especies de Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monmeros de PHAs-ssc
como PHAs-mss en la misma cadena polimrica, normalmente, estos PHAs se forman cuando
estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como lo son los
carbohidratos o 1,3-butaneidol; en este tipo de PHAs mezclados la acumulacin de ellos es
individual, es decir, hay grnulos compuestos de P(3HB) y grnulos compuestos de otro tipo de
PHAs (Madison y Huisman,1999).

2.7.-Biosntesis de Poli--hidroxialcanoatos
La produccin de PHAs competitivamente econmicos y con propiedades nuevas ha sido la
motivacin para que muchos grupos de investigacin estudien la sntesis, degradacin y
homeostasis de PHAs en microorganismos (Tian et al., 2005). La regulacin de la produccin de
PHAs es considerablemente compleja, se lleva cabo en diferentes niveles fisiolgicos a travs de
la inhibicin de cofactores de las enzimas y la disponibilidad de metabolitos, a nivel gentico a
travs de factores- alternativos, sistemas reguladores de dos componentes, y molculas de
autoinduccin (Fig. 4). Otro nivel de regulacin relaciona el tamao del grnulo y el control del
peso molecular por medio de las polimerasas de PHA y las fasinas (Madison y Huisman, 1999).

Figura 4. Protenas requeridas para la homeostasis de PHA (Stubbe y Tian 2003).

13

La mayora de los PHAs sintetizados va microbiana estn constituidos por monmeros

intermediarios de rutas bioqumicas establecidas, como el ciclo de biosntesis o -oxidacin de
cidos grasos, el ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA) o a travs de la biosntesis de
aminocidos polimerizados por una clase especial de enzimas llamadas polimerasas (Rojas et al.,
2006). Las vas de biosntesis y degradacin de PHAs incluyen las enzimas clave de estos
procesos, las PHA-sintasas (PhaCs sntesis de PHA), y PHA-depolimerasas (PhaZs degradacin
de PHA). Ambos grupos de enzimas han sido estudiadas por muchos grupos de investigacin por
cerca de tres dcadas (Jendrossek et al., 2006), todos los microorganismos que sintetizan PHAs
contienen un sistema de depolimerasa intracelular que consiste de un dmero de una PHAdepolimerasa y una hidrolasa (Stubbe y Tian, 2003).
La sntesis de PHAs requiere de la PHA-sintasa (PhaC), la cual usa -hidroxiacil-CoA como
substrato para la polimerizacin; la produccin de tales substratos puede ocurrir a travs de varias
rutas metablicas incluyendo: la simple que utiliza la enzima -cetiolasa (codificada por phaA) y
acetoacetil-CoA reductasa (codificada por phaB), la -oxidacin, y una ruta de sntesis de cidos
grasos de novo (Sheu et al., 2000).
En general, los mecanismos de iniciacin, elongacin y terminacin de la cadena en la mayora
de los sistemas, an no son comprendidos adecuadamente, y quedan muchas preguntas por
contestar: La funcin de las protenas involucra la homeostasis del polmero?, Cmo estos
modulan la fase de transicin y el flujo del unin monomerica?, Interceptan fuera del
metabolismo central bajo diferentes estados metablicos? (Stubbe y Tian, 2003).
A partir del acetil-CoA obtenido del catabolismo de carbohidrato, diversas bacterias sintetizan el
homopolimero 3-hidroxibutirato (3HB) que incluye la accin de tres enzimas. Inicialmente, se
condensan dos molculas de acetil-CoA por accin de la 3-cetotiolasa, generando acetoacetilCoA que sufre una reduccin para formar 3-hidroxibutiril-CoA que se une a la cadena polimrica
en crecimiento (Floccari et al., 1995). La sintasa (PhaC) y fasina (PhaP) son protenas que juegan
un papel importante en la produccin de PHB y la formacin del grnulo (Stubbe y Tian, 2003).

14

2.7.1.- Descripcin de las enzimas que intervienen en la biosntesis de PHAs

PHA-Sintasa. Las PHA-sintasas son enzimas cruciales en todos las vas para la sntesis de PHAs,
estas sintasas se pueden clasificar bajo diferentes criterios, como son secuencia de aminocidos y
la especificidad por su substrato in vivo (Sheu et al., 2000). Los grupos principales son:

Clase I/Clase II. Estas sintasas de polisteres comprenden enzimas que constan de un slo
tipo de subunidad (PhaC), con pesos moleculares (M W) entre 61 y 73 kDa (Qi y Rehm,
2001).

Clase III. Grupo de polister-sintasas que comprende las enzimas que consta de dos
diferentes tipos de subunidades: la subunidad PhaC (Mw de alrededor de 40 kDa) que
muestran una similitud a nivel de secuencia del 21-28% con las enzimas clase I y II; y por
la subunidad PhaE (Mw de alrededor de 40 kDa) sin similitud con otras polister-sintasas.

Clase IV. Estos sintasas son similares a las enzimas que pertenecen a la clase III, pero la
subunidad PhaE se sustituye por PhaR (Mw de aproximadamente 20 kDa) (McCool y
Cannon, 2001).

-cetoacil-CoA tiolasa. La enzima -cetoacil-CoA tiolasa cataliza el primer paso en la formacin

de P(3HB); esta tiolasa biosintetica (acetil-CoA: acetil-CoA-acetil transferasa) es miembro de
una familia de enzimas que participan en la divison tiolitica de sustratos en acil-CoA ms acetilCoA. Estas -cetoacil-CoA tiolasas se encuentran representadas en toda la naturaleza, y estn
presentes desde eucariotas superiores hasta levaduras y procariotas.
En base a su especificidad por el sustrato se dividen en dos grupos:

El primero agrupa a las tiolasas con una amplia especificidad de -cetoacil-CoA que van
desde cadenas de cuatro a diecisis carbones (C4 a C16). Esta clase de enzimas estn
involucradas principalmente en la degradacin de los cidos grasos y se encuentra en el
citoplasma de procariotas, en la mitocondria y en los peroxisomas de los mamferos y las
clulas de plantas.

15

El segundo grupo de -cetoacil-CoA tiolasas se considera biosinttico y tiene una

especificidad estrecha por la longitud de la cadena, de C3 a C5.

En la naturaleza, estos tiolasas biosintticas estn especializadas en diversas funciones, entre las
que se encuentran la formacin de cetonas, esteroides, isoprenoides, sntesis y biosntesis de
P(3HB). La tiolasa que participan en la formacin de P(3HB) principalmente es una tiolasa
biosintetica con la especificidad de acetoacetil-CoA.

Acetoacetil-CoA reductasa. La acetoacetil-CoA reductasa es una (R)-3-hidroxiacil-CoA

deshidrogenasa que cataliza el segundo paso en la va biosintetica de P(3HB) mediante la
conversin de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA (Madison y Huisman, 1999)

PHA-polimerasa. En general, las polimerasas tienen masas moleculares de alrededor de 63,000

Da a excepcin de las polimerasas de C. vinosum, T. violace y Synechococcus spp. que se
componen de dos subunidades con una masa molecular de 40 y 45 kDa (Madison y Huisman,
1999).

Fasinas. Las protenas PhaP desempean su papel como protenas estructurales, se encuentran
conectadas no-covalentemente al corazn de polister de grnulos por su dominio amino terminal
(N-terminal), adems promueven la biosntesis de PHAs y su nmero de copia tiene impacto
sobre el tamao del grnulo de PHA. La simulacin de la cintica del proceso de autoensamblaje
mostr que las fasinas tienen impacto con la cintica de formacin de los grnulos reduciendo la
fase de retraso (Jurasek y Marchessault, 2004). PhaP es una protena abundante asociada al
grnulo y puede tener tambin una funcin de proteccin para reducir la adherencia de protenas
citoplasmticas a la superficie del grnulo (Madison y Huisman, 1999).
Con el desarrollo de la gentica de estas vas a partir de 1987, se ampli el conocimiento sobre el
metabolismo, la bioqumica y la fisiologa de los PHAs. Se cree que cuando la primera bacteria
formadora de PHAs us esta va, el objetivo de la ruta probablemente era diferente a la de la
sntesis de un material de almacenaje, la formacin de PHAs probablemente era una ruta

16

metablica menor en estos organismos, posiblemente como resultando de un slo lado de la

reaccin. Cuando la formacin de PHAs se convirti en benfico para el microorganismo, la
evolucin la seleccion para mejorar las condiciones de supervivencia de los microorganismos
(Floccari et al., 1995). No todas las bacterias usan la misma ruta biolgica para la biosntesis de
PHAs, ya que sus tipos metablicos indudablemente varan. Sin embargo, organismos como R.
eutropha y Z. ramigera, de manera generalizada utilizan tres pasos para la biosntesis de PHAs
que incluyen las reacciones catalizadas por la tiolasa, reductasa y las polimerasas (Madison y
Huisman, 1999).

2.7.2.- Biosntesis de PHAs-ssc

Aunque la acumulacin de P(3HB) esta ampliamente distribuida entre los procariotas, las
investigaciones bioqumicas referentes a los mecanismos enzimticos de la -cetoacil-CoA
tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y P(3HB) polimerasa se han centrado en slo dos de los
productores naturales, Zoogloea ramigera (Mandon et al., 1998) y Ralstonia eutropha,
anteriormente conocida como Alcaligenes eutrophus (Peoples y Sinskey, 1989).
La ruta biosinttica para PHB en Alcaligenes eutrophus (Fig. 5) es muy semejante a la sntesis de
PHB en otras bacterias (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006), el proceso inicia con la
condensacin de dos molculas acetil-CoA (Peters y Rehm, 2005). Sin embargo, en estas
bacterias el acetil-CoA se a dirigido hacia la sntesis de PHAs y no al TCA, este es un efecto de
las condiciones ambientales, especialmente cuando la limitacin por oxgeno hace que la relacin
NADH+/NAD+ aumente. El NADH+ inhibe las enzimas citrato sintasa e isocitrato
deshidrogenasa, logrando que el acetil-CoA no entre en TCA (Cabello, 2007) y entonces es
convertido a acetoacetil-CoA catalizado por la enzima -cetotiolasa. Posteriormente, el
acetoacetil-CoA se reduce a (R)-3-hidroxibutiril-CoA por medio de la actividad de la acetoacetilCoA reductasa NADPH-dependiente, estas enzimas han sido encontradas y estudiadas en varias
bacterias acumuladoras de PHB (Peters y Rehm, 2005). Finalmente, la PHB-sintasa, codificada
por el gen phbC polimeriza los residuos de -hidroxibutiril a una molcula polister.
La molcula PHB puede ser depolimerizada y convertida de vuelta a la va del acetil-CoA por
accin de una PHB-depolimerasa y una -hidroxibutirato dehidrogenasa NAD-dependiente. La

17

regulacin de la sntesis de PHB y la degradacin esta controlada a nivel de -cetotiolasa y de hidroxibutirato dehidrogenasa, permitiendo una modulacin rpida del nivel de poder reductor en
la clula. La adecuada sincronizacin del poder reductor puede prevenir la inhibicin de varias
enzimas de TCA (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006, Peters y Rehm, 2005).

Figura 5. Biosntesis y degradacin de PHB. En condiciones de exceso de energa el NADH inhibe la

despolimerizacin de PHB y el ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA). La disminucin de la concentracin de
CoA-SH aumenta la inhibicin de la acetil-Co-aciltransferasa que cataliza la condensacin del acetil-CoA en
acetoacetil-CoA y la sntesis de PHB. En deficiencia de energa, el control acta en el otro sentido. Los signos (+) y
(-) corresponden a regulacin positiva o negativa (Cabello, 2007).

18

2.7.3.- Biosntesis de PHAs-msc

PHAs-msc no fueron descubiertos hasta 1983, cuando Witholt et al. encontraron que creciendo a
P. oleovorans en octano al 50% se formaba un material flexible. La composicin de estos PHAs
y su relacin directa con la estructura del sustrato de crecimiento sugiere que la ruta de
biosntesis de PHA-msc es una rama directa de la ruta de oxidacin los cidos grasos. En esta
ruta los cidos grasos son degradados para remover unidades de C2 que forman el acetil-CoA
(Madison y Huisman, 1999).

2.7.4.-Formacin de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de cidos grasos

Se han probado sustratos baratos para la produccin de PHAs por especies de Pseudomonas, un
ejemplo de lo anterior es el sebo, una grasa barata con potencial de sobrecapacidad de produccin
ya que es una mezcla de triglicridos con cidos oleico, esterico, y palmtico como componentes
principales de cidos grasos, el sebo representa un sustrato interesante para la produccin de
PHAs. En este sentido, algunas de las cepas caracterizadas como Pseudomonas convierten el
sebo hidrolizado a PHAs en niveles entre 15 y 20% de su peso seco; estos organismos no
secretan una enzima lipasa para facilitar la hidrlisis del sebo, sin embargo P. resinovorans
proporciona tanto actividad de lipasa como de PHA-sintasa (Madison y Huisman, 1999).

2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos

Inicialmente, fue sorprendente observar que cepas de P. putida fueron capaces de acumular PHAs
a partir de glucosa y otros azcares siendo esta especie la primera productora de PHA-msc, a
diferencia de P. oleovorans que es incapaz de sintetizar este tipo de PHAs debido quiz a que la
ruta de PHA-msc podra estar basada exclusivamente en la ruta metablica de los cidos grasos.
Varios estudios mostraron que cepas de P. putida y P. aeuroginosa son capaces de convertir
acetil-CoA a monmeros de cadena de longitud media para la sntesis de PHAs; de hecho, ahora
la regla es que, P. oleovorans es la excepcin entre Pseudomonas por su incapacidad para
sintetizar PHAs a partir de azcares.

19

Los PHAs formados a partir de gluconato o azcares relacionados tienen una composicin
diferente a los PHAs formados a partir de cidos grasos, es decir el 3-hidroxioctanoato es el
componente principal de los PHAs formados a partir de cidos grasos, mientras que a partir de
azcares se acumulan PHAs en los cuales el 3-hidroxidecanoato es el monmero principal y
pequeas cantidades de monmero insaturado estn presentes.
Cuando P. fluorescentes es cultivada en azcares, el PHA formado consiste principalmente de
monmeros de C10 y C8. Algunas pruebas sugieren que estos monmeros son derivados de los
intermediarios de la biosntesis de los cidos grasos, y que la composicin de PHAs es
probablemente una reflexin del fondo de los intermediarios biosintticos de la ruta de los cidos
grasos. Adems, la corroboracin de la participacin de la biosntesis de cidos grasos en la
formacin de PHAs por glucosa y la -oxidacin desde los cidos grasos se obtuvo mediante
experimentos de inhibicin.
P. putida es capaz de sintetizar PHAs ya sea a partir de glucosa o de cidos grasos cuando estn
presentes como fuentes de carbono en exceso. Sin embargo, cuando la cerulina (un cido graso
inhibidor de sntesis) es aadido a esas suspensiones de clulas los PHAs no se forman a partir de
la glucosa, lo que sugiere que los PHAs se siguen sintetizando a partir de cidos grasos. Del
mismo modo el cido acrlico, bloqueador de la -oxidacin, impide la formacin de PHAs desde
octanoato pero no a partir de la glucosa. Estos experimentos confirmaron que la formacin de
PHAs a partir de la glucosa est ligada a la biosntesis de los cidos grasos, y puesto que la
biosntesis de cidos grasos procede de la va (R)-3-hidroxiacil-ACP se requiere una actividad
enzimtica nueva para convertir este intermediario a (R)-3-hidroxiacil-CoA; recientemente,
Rehm et al. (1998) determinaron que el producto gnico de phaG es el responsable de esta
conversin (Fig. 6) (Madison y Huisman, 1999).

20

Fig. 6. Ruta biosintetica para PHA-msc a partir de hidratos de carbono. Esta va est ligada a la biosntesis de los
cidos grasos, puesto que la biosntesis de stos procede de la va (R)-3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP
es convertido a (R)-3-hidroxiacil-CoA por una acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene phaG (Madison y
Huisman, 1999).

2.8.- Caractersticas de los grnulos

Debido a que los PHAs son de naturaleza lipdica, estos bioplsticos se acumulan como
materiales de almacenamiento en forma de grnulos lquidos amorfos y mviles. El nmero y
tamao de los grnulos, la composicin del monmero, la estructura macromolecular y las
propiedades fsico-qumicas varan dependiendo de la especie del organismo productor (Arshad
et al., 2007).
Segn Byrom (1994), se han observado aproximadamente de 8 a 13 grnulos por clula de
Alcaligenes latus, los cuales presentan un dimetro de 0.2 a 0.5m (Jendrossek et al., 2006;
Ojumu et al., 2003). Hay muchos mtodos de deteccin fenotpica para los grnulos

21

intracelulares de PHA los cuales son aplicados para identificar los PHAs producidos, incluyen la
tincin de Sudn Negro y tincin con Azul Nilo A (Ojumu et al., 2003; Sheu et al., 2000).
Los grnulos de PHAs estn rodeados por una membrana de fosfolipidos con una serie de
protenas integradas (Berlanga et al., 2006; Ptter y Steinbchel, 2005) o estn unidos a una
polister-sintasa, Pha-depolimerasa intracelular, fasinas, protenas anfipticas, protenas PHAreguladoras especificas y protenas adicionales con funcin desconocida. Adems requieren
depolimerasas intracelulares para la movilizacin del polister de reserva y estn conectados a la
superficie del grnulo; el dominio carboxilo terminal (C-terminal) une estas protenas al corazn
de polister por interaccin hidrfoba (Jurasek y Marchessault, 2004).

2.8.1.- Modelos para la formacin del grnulo PHAs

Existen varias protenas involucrada en la regulacin de la biosntesis del polmero y en la
formacin de los grnulos intracitoplasmticos, una de ellas son las fasinas que se encuentran
asociados a los grnulos de PHA; estas protenas podran afectar el tamao y la pureza de los
grnulos, ya que son importantes para la forma que el grnulo adquiere intracelularmente e
impide que otras protenas pueden asociarse a el inespecficamente, lo cual simplifica la
purificacin del polmero (De Almeida et al., 2004).
Gerngross y Martin (1995) demostraron por primera vez la sntesis in vitro de PHAs (Hezayen et
al., 2002; Madison y Huisman, 1999) y el autoensamblaje de los grnulos utilizando nicamente
polister sintasa purificada y su substrato. Este estudio defini que la polister sintasa posee todas
las caractersticas requeridas para la auto-reorganizacin en partculas esfricas (Hezayen et al.,
2002).

2.8.2.- Formacin in vivo de partculas de polisteres

La biosntesis de PHA in vivo empieza cuando el sustrato, tioesteres de (R)-3-hidroxiacil-CoA,
est disponible intracelularmente y la polister sintasa se est expresando de forma constitutiva
an a niveles bajos, por lo que la disponibilidad del sustrato favorece que esta enzima comience a
catalizar la polimerizacin de polisteres de alto de peso molecular (n> 1000). Por otro lado, el

22

crecimiento de la cadena del polister, cuyos residuos estn covalentemente ligados a la enzimas
(Hezayen et al., 2002), se da cuando la enzima inicialmente soluble se convierte en una molcula
anfiptica.
Actualmente se han descrito dos modelos de formacin de grnulos de PHA: el modelo micela y
el modelo en ciernes budding. Ambos modelos consideran la posicin definida de la polister
sintasa, y en cierta medida la protena fasina, sobre la superficie del grnulo. El modelo de micela
es apoyado por la formacin de grnulos de PHA in vitro y en ausencia de membranas (Fig. 7).
En primer lugar, un aumento de la concentracin de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma
promueve la interaccin con la P(3HB)-polimerasa, teniendo como resultando el cebado de la
enzima por un mecanismo desconocido.
Durante una primera fase, los oligomeros de HB son formados lentamente y extruidos por la
enzima. A continuacin estos oligomeros forman micelas con otros oligmeros incrementando la
longitud e hidrofobicidad, en consecuencia, la enzima rpidamente procede con la sntesis de
P(3HB), una mayor extrusin del P(3HB) incrementando el tamao del grnulo. Finalmente, se
cree que las micelas se unen en grandes grnulos y estos pueden ser visualizados por medio de
microscopa (Tian et al., 2005). Cuando la activacin de la PHA-polimerasa se reduce en el
proceso de cebado, se combina con una polimerizacin rpida y la actividad enzimtica que
forman las estructuras de micelas, con lo cual se asegura la formacin de materiales "de alto peso
molecular (Madison y Huisman, 1999). Los PHAs se consideran como macromolculas
osmticamente inertes cuya relevancia depende su peso molecular alto (Stubbe, 2003; Tian et al.,
2005).

23

Figura 7. Modelo de Micela para la formacin de grnulos de PHB, las esferas coloreadas mostradas sobre PHB
amorfo representan las protenas que estan asociadas a la superficie del grnulo. Esferas grises PhaC; esferas azules
PhaP; esferas rojas PhaR; esferas verdes, PhaZ1a; esfera prpura, PhaZ1b; esfera de naranja, PhaZ1c (Tian et al.,
2005).

El modelo budding o ciernes fue propuesto recientemente, los primeros estudios de

microscopia electrnica mostraron la presencia de un material parecido a una membrana rodeado
a los grnulos de PHAs en clulas intactas o grnulos aislados (Fig. 8). Estas observaciones son
las que se pruebas que sustentan el modelo en ciernes Budding, en el cual se postula que la
sintasa hidrofbica est ligada a la cara interior de la membrana plasmtica, provocando se
desarrolle una membrana que cubre la superficie del grnulo, est cubierta de una capa lipdica;
en este modelo, la biologa del sistema y las propiedades fsicas del polmero son requeridas para
la formacin del grnulo (Stubbe, 2003; Tian et al., 2005). En general, estudios in vivo apoyan el
modelo en ciernes localizando la formacin del grnulo cerca de la membrana citoplasmtica de
la clula (Gerngross et al., 1993).

24

Fig. 8. Modelo Budding, donde se puede observar la formacin del grnulo (Tian et al., 2005)

En los dos modelos que se han propuesto para explicar la formacin de los grnulos de PHAs, la
polister sintasa es convertida en una molcula anfiptica durante la sntesis de la cadena del
polister, y el proceso de autoensamblaje ocurre en la membrana o en el citosol, de tal forma que
pequeas inclusiones insolubles en agua y esfricas forman el ncleo del polister amorfo con la
polister sintasa conectada covalentemente a la superficie (Gerngross et al., 1993).
Varios reguladores PHA-especificos como PhbR de C. nector, PhaF de Pseudomonas y PhaR de
Paracoccus denitrificans fueron encontrados unidos de forma no-covalente a los grnulos de
PHA. Adems, se han localizado protenas adicionales asociadas a los grnulos en Pseudomonas,
cuya funcin an no es clara, pese a que la expresin de sus genes es co-regulada con otros genes
de la biosntesis de PHA, estas protenas (PhaI, PhaD, PhaS) son consideradas como protenas
estructurales tambin implicadas en la biosntesis y la movilizacin, aunque no son esenciales
para la formacin del grnulo PHA, la regulacin de genes para la biosntesis y la movilizacin
de PHA. Sin embargo, slo las polister sintasas conectadas covalentemente son integradas o
asociadas con una monocapa de fosofolpidos que rodea el corazn del grnulo de PHA segn un
modelo, mientras que el otro modelo perfila una estructura mucho ms compleja con dos
membranas formadas de fosfolpidos (Rehm, 2003).
25

2.9.- Degradacin de los PHAs

Puesto que el origen de los PHAs es biolgico, estos son completamente degradables (Niamsiri et
al., 2004; Sudesh et al., 2000). En la naturaleza un consorcio amplio de microorganismos son
capaces de degradar los PHAs hasta CO2, H2O y humus en condiciones aerbicas (Carminatti et
al., 2006; De Almeida et al., 2004; Madison y Huisman, 1999), en condiciones anaerobias
tambin se produce metano (Carminatti et al., 2006; Madison y Huisman, 1999; Moreno et al.,
2007) mediante la accin de PHA-depolimerasas y PHA-hidrolasas extracelulares (Carminatti et
al., 2006; De Almeida et al., 2004; Madison y Huisman, 1999). Las actividades de estas enzimas
pueden variar y dependen de la composicin del polmero, su forma fsica (amorfa o cristalina),
las dimensiones de la muestra son importantes y las condiciones ambientales (Fig. 9) (Carminatti
et al., 2006; Madison y Huisman, 1999; Moreno et al., 2007).

Figura 9. Degradacin de P(3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aerbicas. Las botellas hechas de
P(3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura promedio de 20C). El progreso de degradacin es
demostrado con las botellas que han sido sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de izquierda a
derecha) (Madison y Hiusman, 1999).

Las velocidades de biodegradacin dependen de una serie de factores, incluyendo rea

superficial, actividad microbiana, ambiente propicio, pH, temperatura, nivel de la mezcla y
presencia de otros nutrientes (Tabla 2). La degradacin de estos materiales suministra a los
microorganismos degradadores precursores de componentes celulares y de energa (Carminatti et
al., 2006), adems de que la produccin de PHAs se basa en la utilizacin de recursos renovables
26

(Carminatti et al., 2006; De Almeida et al., 2004). Lo anterior contraste con los residuos
termoplsticos sintticos que se acumulan en grandes cantidades en el ambiente y su degradacin
es lenta; adicionalmente, estos plsticos derivados de los hidrocarburos utilizan las escasas
reservas petroqumicas del planeta (De Almeida et al., 2004).

2.10.- Biodegradibilidad
Aparte de las propiedades polimricas tpicas, una caracterstica importante de los PHAs es su
Biodegradibilidad (Madison y Huisman, 1999), por lo que han sido extensamente estudiados por
la academia y la industria (Sheu et al., 2000). Los polihidroxialcanoatos se consideran buenos
sustitutos de los plsticos derivados del petrleo por ser completamente biodegradables despus
de desecharlos una vez de haber sido utilizados (Cho et al., 1997; Park et al., 2001). Los tiempos
de permanencia de los PHAs en diferentes ambientes naturales se resumen en la tabla 2.

Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Luzier, 1992).

2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs

Trabajos relacionados en el laboratorio con cepas silvestres y cepas deficientes (mutantes) en la
sntesis de PHB de R. eutropha y B. megaterium, demostraron que las que eran capaces de
sintetizar el polmero de reserva tenan mayor sobrevivencia en agua de ro y mayor capacidad de
competencia con las bacterias autctonas, que sus correspondientes mutantes. Estos experimentos
sugirieron que la sntesis y la utilizacin del polmero aumentaban la sobrevivencia y la
27

capacidad de competencia bacteriana en ambientes cambiantes naturales. Los PHAs juegan un

papel importante en la supervivencia bacteriana ante condiciones de estrs. Sin embargo, aunque
ya se ha establecido que estos polmeros se utilizan como fuente de carbono cuando los
microorganismos que los producen se enfrentan a condiciones de inanicin, se conoce poco
acerca de los mecanismos mediante los cuales la utilizacin de PHAs favorece la supervivencia
bacteriana en condiciones desfavorables.
En un trabajo realizado con R. eutropha en 1967, se sugiri que exista una asociacin entre la
utilizacin de los PHAs y la fosforilizacin oxidativa (De Almeida et al., 2004). Se sabe que ante
condiciones adversas, las bacterias son capaces de responder con diversos mecanismos de control
activos que les permiten hacer frente a dichas condiciones, uno de estos mecanismos es la
respuesta general a estrs que se induce en bacterias Gram-negativas ante condiciones de estrs
ambiental, tales como las provocadas por escasez de nutrientes, estrs osmtico, estrs oxidativo
y cambios bruscos de temperatura.
Dado que los PHAs son un reservorio de carbono, energa y equivalentes de reduccin, tanto su
sntesis como su degradacin tienen un efecto importante sobre el metabolismo central de la
clula procariota (De Almeida et al., 2004), ya que evolutivamente la bacteria no desarroll la
capacidad de producir PHAs como medio para la sntesis de plsticos tiles a la humanidad, la
produccin y acumulacin de PHAs por la bacteria debe haberse desarrollado de un fenotipo
ventajoso relacionado con la deposicin de estos materiales, y adems como material de
almacenaje de carbono y equivalentes de reduccin (Madison y Huisman, 1999).

2.12.- Aplicacin de los Poli--hidroxialcanoatos

En general estos biomateriales se caracterizan por ser biocompatibles y biodegradables; estas
propiedades les confieren un potencial industrial grande para ser utilizados como sustitutos de los
plsticos sintticos, adems de utilizarse en un espectro amplio de aplicaciones biotecnolgicas
(Niamsiri et al., 2004; Rojas et al., 2006, Sheu et al., 2000). La produccin actual de PHAs va
fermentacin microbiana todava no puede competir con los mtodos utilizados para la
produccin comercial de plsticos, por lo que lograr el aprovechamiento de los PHAs en esta y
otras aplicaciones es de importancia crucial.

28

La gama tan amplia de propiedades fsicas de la familia de los polmeros biolgicos,

especficamente PHAs, aunado a la posibilidad de obtener buenos rendimientos por la
composicin y mezcla, proporcionan una gama mur extensa de posibles aplicaciones finales, tal
como se describe en numerosas patentes. Los esfuerzos inciales se centraron en las aplicaciones
de moldeo, particularmente para los consumidores de envases tales como botellas, envases
cosmticos, plumas, etc. (Fig. 10).

Figura 10. Productos elaborados utilizando polihidroxialcanoatos como materia prima (Segura et al., 2007).

Una de las reas de aplicacin de PHAs es su monmero quiral como intermediario para la
sntesis de algunos productos farmacuticos y pesticidas. Sin embargo el proceso de produccin
es complicado y la eficiencia baja, por estos motivos se buscan otras alternativas ms atractivas
(Madison y Huisman, 1999).
Como ya se mencion lneas arriba, el monmero P(3HB) se ha encontrado en gran variedad de
plantas y tejidos de origen animal, as como en el plasma humano y tambin se ha encontrado
asociado con lipoprotenas de baja densidad pero no con lipoprotenas de alta densidad.
Adicionalmente, una parte significativa de P(3HB) se ha encontrado asociada con la albmina del
suero; se piensa que dichas molculas de lpido y albumina que actan como transportadores de
P(3HB) en la sangre, especficamente con la albumina que es el portador principal (Madison y
Huisman, 1999). Segn Sotavento (1996) el producto de degradacin del PHB es el D(-)-3hidroxibutirato, el cual se ha encontrado en cantidades relativamente grandes en el plasma de la
sangre humana, por lo tanto, es sumamente plausible que la implantacin de PHB en tejidos de
mamferos no sera txico (Ojumu et al., 2003). Otras aplicaciones mdicas son utilizarlo para la
29

liberacin controlada de medicamentos (Carminatti et al., 2006), aunque la gama de aplicaciones

industriales para utilizarlo en el empaquetamiento de frmacos es muy baja (Quagliano y
Miyasaki, 1997). Estos materiales se han utilizado en implantes re-absorbidos y en la ingeniera
de tejidos; el uso de PHAs en el rea biomdica es comn en suturas quirrgicas como
monmeros que se degradan en el cuerpo humano formando productos que son reabsorbidos por
los organismos.
Adems, en la agricultura los PHAs pueden ser utilizados como productos de liberacin de
reguladores de crecimiento de plantas pesticidas; los PHAs tambin puede utilizarse para
sustituir polmeros petroqumicos en el tner como conductores de iones de polmeros; tambin
pueden ser utilizados como un ltex, por ejemplo, para el revestimiento de aplicaciones de papel
o puede ser utilizado para producir sustitutos lcteos o agentes de sabor en los alimentos.
Adems de la amplia gama de propiedades de estos materiales y las consiguientes aplicaciones,
los PHAs prometen ser una nueva fuente de molculas pequeas que pueden ser hidrolizados
qumicamente y los monmeros se pueden convertir en productos comercialmente atractivos,
tales como molculas de -hidroxicidos, cido 2-alkenoico, -hidroxialcanoles, -acilactonas, aminocidos, steres y -hidroxicido; la ltima clase de productos qumicos est recibiendo
mucha atencin por sus posibles aplicaciones como disolventes biodegradables (Madison y
Huisman, 1999).

2.13.- Substratos y costos

Debido a los problemas ambientales que ha ocasionado la acumulacin de plsticos no
biodegradables, los PHAs como polmeros biodegradables han cobrado mucha importancia. Sin
embargo, presentan una gran desventaja en cuanto a su comercializacin, lo que deriva en su
costo de produccin muy elevado comparado con materiales plsticos sintticos de origen
petroqumico (Wang y Lee, 1997; Choi y Lee, 1999) como el polipropileno, polietileno (Chen y
Page, 1997) u otros polmeros biodegradables como el cido polilctico (Wang y Lee, 1997).
ltimamente, el inters por estos polmeros ha aumentado en todo el mundo, a pesar de su alto
costo en relacin a los polmeros convencionales, basta comparar el costo de produccin de PHB
estimando en US $2.65/kg para una planta de 100.000 ton/ao utilizando sacarosa como substrato
30

y el valor del propileno US $ 1.00/kg (Franchetti y Marconato, 2006). Sin embargo, el precio alto
de los PHAs comparado con el plstico obtenido a base de petrleo es justificado por sus grandes
ventajas (Arshad et al., 2007); adems, los PHAs se pueden procesar con el mismo equipamiento
que se emplea para los termoplsticos sintticos de uso convencional (Hermida y Daz, 2004). La
produccin comercial de Bioplsticos PHAs ha sido conducida por Zeneca BioProductos en
Billingham, Reino Unido (Chen y Page, 1997).
En los ltimos aos gran parte de las investigaciones realizadas sobre los PHAs se han
concentrado en reducir los costos de produccin y aumentar la productividad utilizando diversas
estrategias, entre ellas se encuentra el rastreo de nuevas cepas productoras (De Almeida et al.,
2004). Para esto, es importante la seleccin de microorganismos que permitan la produccin
industrial de PHAs y adems cumplan con otras consideraciones importantes como: competencia
celular, habilidad para usar fuentes de carbono de precio bajo, velocidad de crecimiento,
habilidad para la sntesis del polmero y el porcentaje de acumulacin del polmero (Khanna y
Srivastava, 2005; Moreno et al., 2005).
Nuevas cepas que puedan usar substratos econmicos y con alto porcentaje de acumulacin
deben ser aisladas para resolver estos problemas. En este punto, el inters se ha centrado en
bacterias Gram-negativas presente en muestras de suelo donde es cultivada la caa de azcar
debido a la riqueza microbiana presente, y a la presin selectiva causada por el desbalance de la
proporcin carbono/nitrgeno generada por la descomposicin de residuos en el suelo,
principalmente por un exceso de carbono y una limitacin de nitrgeno (De Lima et al., 1999;
Moreno et al., 2007).
Se ha demostrado que uno de los principales factores que afectan e impactan el costo final de los
PHAs son los costos del substrato, principalmente la fuente de carbono (Moreno et al., 2007;
Khana y Srivastava, 2005; Arshad et al., 2007). Varios estudios han demostrado que los residuos
de la agricultura y comida pueden ser utilizados como substratos para reducir costos (Niamsiri et
al., 2004). Se pueden utilizar los carbohidratos, sobretodo los provenientes de fuentes naturales
renovables como glucosa, sacarosa o bien desechos de la industria alimenticia como mosto de
uva u olivo, melaza de caa de azcar, etc. (Chen y Page, 1997).

31

Actualmente, en un esfuerzo para reducir el costo de P(3HB) el inters industrial ha iniciado

programas para desarrollar sistemas de produccin de este polmero en plantas de cosecha, por lo
que las perspectivas de producir P (3HB) son alentadoras, ahora que varios estudios han descrito
la sntesis de PHAs en la levaduras, clulas de insecto y varias especies de plantas. Aunque la
sntesis de P(3HB) se ha alcanzado en plantas, los resultados obtenidos hasta ahora, claramente
indican que es un camino largo en contraste con la utilizacin de microorganismos como las
bacterias, debido aque el metabolismo en las plantas es categorizado y esto complica las tareas
extras (Madison y Huisman, 1999).
En conclusin, la reduccin de los costos de produccin de los poli--hidroxialcanoatos, depende
de la obtencin de linajes altamente eficientes, la conversin del substrato al producto deseado, la
utilizacin de substrato de bajo costo, y el desarrollo de procesos de extraccin-purificacin para
la obtencin y recuperacin del producto (Carminatti et al., 2006).

32

III.- JUSTIFICACIN
Actualmente en el mundo y especficamente en nuestro pas, existe un problema relevante,
relacionado con la contaminacin presente en agua, aire y suelo, mismo que se agrava puesto que
la basura contiene gran cantidad de materia orgnica e inorgnica que generalmente se mezcla
durante el proceso de recoleccin, lo que dificulta el manejo final. La contaminacin ambiental se
debe principalmente a las enormes cantidades de plstico que se generan diariamente y que
reciben un tratamiento inadecuado.
En Mxico, la cifra anual para consumo de artculos de plsticos terminados es de 4,809 miles de
ton (ANIPAC, 2006), estas cifras se reportaron en el 2006 y se presume que han aumentado en
los dos ltimos aos, lo que sugiere un incremento importante en la acumulacin de este material
dando lugar a problemas ambientales serios. Por lo tanto, muchas de las ventajas de estos
polmeros como la facilidad de que pueden ser trabajados o moldeados, su impermeabilidad, su
baja densidad y conductividad elctrica, as como la resistencia a la corrosin, intemperie y a
diversos factores qumicos y biolgicos, se convierten en una gran desventaja en el momento en
que se desechan, reflejndose como un problema de magnitud considerable al contaminar el
medio ambiente.
Lo anterior a despertado el inters de quienes laboran en la investigacin, dando origen a la
bsqueda de alternativas que lleven al desarrollo de un producto con caractersticas similares a
las que presenta el plstico pero que no impacte negativamente al ambiente; es decir, que sea
preferentemente biodegradable y que su produccin sea de recursos renovables y no a travs de
un recurso finito, como los hidrocarburos que sirven de materia prima para la produccin de
plsticos sintticos.
La produccin y obtencin de un plstico natural al precio y costo adecuados, recae en la
familia de los polihidroxialcanoatos (PHAs), polisteres que por sus caractersticas parecen ser el
sustituto perfecto para el plstico. Sin embargo, su utilizacin no se ha dado ampliamente debido
a lo difcil del aislamiento de las cepas bacterianas que los sintetizan y a los altos costos de
produccin, ya que las bacterias para generar algn tipo de polihidroxialcanoatos necesitan de
una fuente de carbono y esta es costosa, por lo cual en este trabajo se pretende obtener, aislar y
caracterizar cepas bacterianas prometedoras en la produccin de PHAs.

33

Lo anterior, nos lleva a reflexionar que una vez que sean superados los obstculos que se
presentan en el campo de la investigacin con respecto a la produccin de PHAs, en cuanto a su
produccin en masa y abatimiento de costos, la utilizacin de los plsticos actuales se vern
reducidos con lo cual podremos observar efectos positivos en el medio ambiente, puesto que los
desechos de los PHAs podrn ser degradados y absorbidos sin afectar nuestros ecosistemas.

34

IV.- OBJETIVOS

4.1.- Objetivo General

Obtener, aislar y seleccionar cepas bacterianas autctonas capaces de producir poli-hidroxialcanoatos (PHAs).

4.2.- Objetivos particulares

a. Obtener y aislar cepas bacterianas a partir de muestras obtenidas de cultivos de
Saccharum officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus, Nicotina
tacabum L. y Musa paradisiaca.
b. Seleccionar cepas bacterianas capaces de producir poli--hidroxialcanoatos
(PHAs).
c. Cuantificar los PHAs producidos por las cepas bacterianas encontradas.
d. Caracterizar mediante pruebas qumicas y bioqumicas las cepas bacterianas
seleccionadas.

35

V.- MATERIALES Y MTODOS.

5.1.- Obtencin de muestras
Se procesaron muestras de diferentes tipos de tejido vegetal afectado, es decir que presentaran
necrosis. Las muestras seleccionadas fueron de hoja y seudotallo provenientes de plantas de
Musa paradisiaca; adems, se colectaron muestras de suelo del rea de la rizosfra adyacente al
cultivo de pltano, en la localidad de Xalapa, Ver. Aparte de las muestras colectadas de Musa
paradisiaca, tambin se colectaron muestras provenientes del suelo de cultivos de Saccharum
officinarum, Lycopersicon esculentum y Citrullus lanatus en la localidad de Tamarindo, Ver. y
muestras de suelo pertenecientes a cultivos de Nicotina tabacum L. en la regin de San Andrs
Tuxtla, Ver.
Las muestras de los diferentes tipos de tejido vegetal afectado (seudotallo, hoja) se seleccionaron
de la planta, teniendo la precaucin de tomar fragmentos que presentaran los sntomas iniciales
de alguna enfermedad, acompaados de tejido sano con el fin de disminuir la presencia de
microorganismos saprfitos presentes en la planta; Los fragmentos de tejido se obtuvieron con
ayuda de bistur y pinzas previamente esterilizados. Las muestras de suelo se colectaron en el
rea cercana a la rizsfera a una profundidad de 15-20 cm. Las muestras tanto de suelo como de
tejido vegetal se colocaron en bolsas plsticas etiquetadas y se conservaron a 4C, al final de la
colecta las muestras fueron transferidas al Laboratorio de Microbiologa en el Instituto de
Investigaciones Biolgicas para su posterior procesamiento.
5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal.
Los fragmentos de tejido que se utilizaron fueron de un tamao de 1 x 1cm, se lavarn en un vaso
de precipitado de 250 ml conteniendo agua destilada durante 30 minutos y en agitacin.
Posteriormente los cortes se trasladaron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo solucin
de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto para evitar la contaminacin externa.
A continuacin, se realiz u n lavado con agua destilada estril en un vaso de precipitado de 250
ml y enseguida el tejido se sumergi durante un minuto en una solucin de etanol al 70%.
Finalmente, los cortes se enjuagaron una vez con agua destilada estril para remover los residuos
de los desinfectantes utilizados. Este procedimiento se llev a cabo con material esterilizado y en
condiciones estriles.
36

Con el fin de obtener las bacterias presentes en el tejido vegetal, los fragmentos de tejido tratados
fueron macerados en un mortero con una solucin buffer de fosfatos (23.0 g KH2PO4, 43.2,
Na2HPO47 H20, en 1000 ml de H2O). La suspensin obtenida del macerado de los tejidos se
sembr en condiciones estriles con un asa estril en placas de Agar Soya Triptocaseina (TSA).
5.3.-Procesamiento de muestras de suelo
Se prepararon suspensiones de las muestras de suelo adicionando 3gr de suelo en 30 ml de buffer
de fosfatos mezclando muy bien con el vortex. Se tomo 1ml de esta suspensin y se sembr en
placas de TSA. Las cajas se incubaron a 30C durante 24 h para obtener el ccrecimiento de
colonias de bacterias (Gmez, 2005).
5.4.- Obtencin y Aislamiento de cultivos puros por mtodos de siembra en placa
Una vez crecidas las colonias, obtenidas tanto de las muestras de tejido vegetal como de suelo, se
efectu la siembra individual de cada colonia obtenida en medio TSA para lograr la purificacin
de las bacterias. Se utiliz la siembra por estra (Koneman et al., 1998), ya que por lo general es
el mtodo ms til de siembra en placa. Este procedimiento se realiz en repetidas ocasiones
hasta purificar las colonias.
Una vez obtenidas las cepas purificadas, fue necesario sembrarlas por duplicado en tubos
inclinado conteniendo medio TSA para su conservacin y posterior utilizacin.
5.5.-Produccin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)
Una vez aisladas y purificadas las cepas se procedi a iniciar la etapa de cultivo para realizar las
pruebas de la determinacin cuantitativa de PHAs. La cuantificacin se realiz con el mtodo
espectrofotomtrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martnez et al. (2004).
Determinacin de la Produccin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs) por cada cepa bacteriana.
Condiciones del medio de crecimiento para la obtencin de biomasa.
Primera etapa: Las cepas bacterianas aisladas se cultivaron en 50 mL de medio MSM (Tabla 3),
el cual se caracteriza por no presentar un desbalance en las cantidades de Nitrgeno/Carbono.
Este medio permiti aumentar la cantidad de biomasa a partir de la cual se extrajo un inculo que
37

se utiliz en la siguiente etapa, la de produccin de PHAs. El medio utilizado es una

modificacin del medio usado por Barbosa et al.,. (2005) donde la fructosa fue remplazada por
sacarosa.
Tabla 3. Componentes del medio MSM suplementado con sacarosa
Reactivo:

Cantidad:

Fuente de carbono Sacarosa

10 g/L

NH4SO4

2.75 g/L

K2HPO4

2.0 g/L

NaH2PO4

1.6 g/L

MgSO4 .7 H2O

0.5 g/L

Solucin de microelementos (Tabla 4)

2.0 ml/L

Tabla 4. Solucin de microelementos

Reactivo

Cantidad

FeSO4

2.0 g/L

MnCl2 4 H20

0.03 g/L

CaCl22 H20

2.0 g/L

CuCl 2 H20

0.01 g/L

ZnSO4 7 H20

0.1 g/L

CoCl 6 H20

0.2 g/L

NiCl2 6 H20

0.02 g/

Na2MoO4 2 H2O en HCl 0.1 N

0.03 g/L

El medio de cultivo se inocul con la cepa bacteriana en estudio y se incub a 28-30C y 200rpm
durante 24 h (Barbosa et al., 2005).
Segunda etapa: Para determinar la produccin de PHAs se utiliz medio MSM pero con un
desbalance en las cantidades de C/N; se utiliz Sacarosa como fuente de carbono a una
38

concentracin de 40 g/l y el nutriente limitado fue NH4SO4, del cual se utiliz una concentracin
de 1.11 g/L, consultar Tabla 5 (Haywood et al., 1990)
Tabla 5: Componentes del medio de cultivo para la produccin de PHAs.
Reactivo

Cantidad

Fuente de carbono a evaluar: Sacarosa

40 g/L

NH4SO4

1.11 g/L

K2HPO4,

4.3 g/L

KH2PO4

1.6 g/L

MgSO47H2O

1.2 g/L

cido Ctrico

1.7 g/L

Solucin de microelementos (Tabla 4)

10 ml/L
Barbosa et al., 2005.

Condiciones de las Fermentaciones para la produccin de PHAs.

Para cada experimento se us 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 47.5 mL de medio MSM con
el cociente C/N antes mencionado y al cual se le agregaron 2.5 mL de inoculo (representando el
5% del cultivo total) para llegar a un volumen de 50 mL. Las condiciones de cultivo fueron: 28 a
30C, pH de 7 y agitacin de 225 rpm durante 72 horas.
A los tiempos de 24, 48 y 72 horas se tomaron muestras para los anlisis de crecimiento celular y
determinacin cuantitativa de PHA (Martnez et al., 2004).
5.6.-Determinacin cuantitativa de poli--hidroxialcanoatos (PHAs) por el mtodo
espectrofotomtrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martnez et al. (2004)
Para cuantificar el PHA producido y acumulado por cada cepa bacteriana, se tomaron 3 muestras
de 1 ml cada una a las 24, 48 y 72 horas y se midi la densidad ptica a 600nm.
Cada muestra de 1 ml se centrifug a 10,000 x g durante 5 min en una microcentrfuga
Eppendorf, la pastilla de clulas se lav con tampn fosfato y se digiri en solucin de
hipoclorito de sodio al 5% (Cl-) + EDTA 10mM, incubando durante 1.5 h a 37C. Posteriormente
se centrifug y se lav con 0.2 ml de agua destilada y despus con acetona (0.2ml). Finalmente,
39

el sedimento se lav con 0.2 ml de etanol y se dejo secar. Cada muestra se digiri con cido
sulfrico al 80% durante 30 minutos a 90C y se determin la absorbancia a 214nm en un
espectrofotmetro UV/VIS (Martnez et al., 2004).
Realizacin de la curva patrn para la cuantificacin de PHAs
La curva patrn utilizada como referencia en la determinacin de PHAs producidos por las cepas
bacterianas, es realizada a partir de una solucin estndar de 1mg/ml del homopolimero PHB
disuelto en H2SO4 al 80%; a partir de esta solucin concentrada se hicieron las diluciones. La
absorbancia de cada dilucin se determin en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm.
Despus de evaluar la produccin de PHAs por el mtodo espectrofotomtrico de Law y
Slepecky (1961) modificado por Martnez et al., (2004), se seleccionaron las cepas bacterianas
con mayor produccin. A estas se les determin cualitativamente la acumulacin de PHAs
mediante la tcnica de tincin lipoflica con Negro Sudn B (Diario Oficial de la Unin Europea
1997; Pandolfi y Pons, 2007), cinticas de crecimiento y caracterizacin mediante pruebas
qumicas y bioqumicas.
5.7.- Evaluacin cualitativa de la acumulacin de PHAs mediante de tincin lipoflica con
Negro Sudn B.
Las cepas bacterianas seleccionadas fueron sembradas en los medios utilizados para determinar la
produccin de PHAs, MSM sin desbalance de C/N y MSM con desbalance de C/N, con las
mismas condiciones y parmetros.
Despus de obtener cultivos a las 24, 48 y 72 h, se preparon frotis de cada cepa seleccionada. Los
frotis se dejaron secar y se pasaron varias veces con rapidez sobre la llama hasta que el frotis este
fijado. Cada preparacin se bao con una solucin de Negro Sudn B al 0.3% en etanol del 70%,
y se incub durante 10 min a temperatura ambiente. Se escurri la solucin de tincin y las
preparciones se lavaron suavemente con agua destilada; el agua sobrante se elimin con un
pauelo de papel (Pandolfi y Pons, 2007). Los frotis se sumergieron brevemente en xilol, se
secaron con un pauelo, y finalmente se cubrieron con safranina acuosa al 0.5% (p/v) dejando
incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar ligeramente con agua destilada 1 vez,
secar y tapar con un portaobjetos (Diario Oficial de la Unin Europea 1997). Cada preparacin se
examin con Microscopio ptico Nikon a un aumento 100x y bajo aceite de inmersin.
40

5.8.- Anlisis de crecimiento celular

Las curvas de crecimiento de las 14 cepas bacterianas seleccionadas aleatoriamente de un total de
20 se hicieron durante 108 h y se les dio seguimiento por medio de espectrofotometra a 600nm
(Spectronic 20, Milton Roy Company).
5.9.-Caracterizacin qumica y bioqumica de cepas bacterianas presuntas productoras de
PHAs.
A las cepas bacterianas aisladas y que fueron positivas para la produccin de PHAs, se les
realizaron las siguientes pruebas qumicas y bioqumicas: Tincin de Gram, Movilidad, Catalasa,
Citocromooxidasa, Prueba Oxidativa-Fermentativa de acuerdo al manual de Bergeys (Hendricks
y Holt, 1994), para determinar a que grupo pertenecen.
Tincin de Gram. Permiti catalogar el grupo al que pertenecen las bacterias aisladas y
purificadas. Esta prueba adems de determinar si se trata de bacterias Gram negativas o Gram
positivas, permite observar la morfologa celular que presenta cada cepa seleccionada, ya sean
bacilos o cocos.
Movilidad. Esta prueba se realiz utilizando el medio de cultivo con TTC (2,3,5-cloruro de
trifeniltetrazolio) que permite determinar si la cepa presenta movilidad. Un resultado positivo
(clula mvil) produce una nube turbia rosa que difunde en todo el medio ya que el TTC acta
como un aceptor artificial de electrones para las enzimas ligadas al nucletido piridina en la
cadena biolgica oxidativa. El TTC es un compuesto incoloro, soluble en agua que es tomado por
las clulas bacterianas que lo reducen enzimticamente con la liberacin de cido formazn, un
compuesto rojo altamente pigmentado, por lo que la pigmentacin permite observar
macroscpicamente la movilidad de la cepa. Se utiliz este medio debido a que en el medio MIO,
la turbidez que representa la movilidad en algunos casos es difcil de interpretar.
Catalasa. La presencia de la enzima catalasa se realiz por el mtodo del portaobjeto y a
temperatura ambiente (22-25C). Para ello, con una aguja de inoculacin se recogi el centro de
una colonia pura de 18 a 24 h de crecimiento y se coloc sobre un portaobjeto, con una pipeta
41

Pasteur se agreg una gota de perxido de hidrogeno (H2O2) al 3% sobre los microorganismos
colocados en el portaobjeto. La reaccin positiva se determina por el burbujeo inmediato que se
produce por la formacin de O2, actividad de la enzima.
Citocromooxidasa. Los citocromos, hemoprotenas que contiene hierro, actan como el ltimo
vnculo de la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno, con la
formacin de agua. El sistema de citocromos se halla en microorganismos aerobios, o
microaerfilos, y anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para
identificar microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es
muy til para evaluar colonias que se sospecha pertenecen a la familia Enterobacteriaceae (todas
negativas) y para identificar colonias que se sospecha pertenecen a otros gneros como el de
Pseudomonas.
La prueba se realiz por medio del procedimiento indirecto con tira de papel filtro, en el cual se
agrega 1 gota del reactivo de Reactivo de Kovac (clorhidrato de tetrametil-p-fenildiamina). Las
colonias bacterianas que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan un color morado en el
sitio de inoculacin en 10 segundos; el resultado negativo se caracteriza por no presentar el color
o por el desarrollo de color despus del tiempo establecido.

Prueba

Oxidativa-Fermentativa

(Hugh

Leifson).

Esta prueba determina

si

los

microorganismos en estudio degradan los azcares por la va fermentativa u oxidativa. Para la

prueba OF se requieren dos tubos, cada uno inoculado con el microorganismo desconocido, un
tubo se cubre con aceite mineral y el otro tubo se deja expuesto al aire; ambos tubos se incuban a
35C y la produccin de cidos orgnicos se detecta por la aparicin de un color amarillo. En el
caso de microorganismos oxidativos, la produccin de cidos se lleva a cabo en el tubo abierto,
sin aceite mineral, y en los microorganismos que degradan el carbohidrato por la va fermentativa
el color amarillo se aprecia en el tubo cubierto con aceite mineral (Koneman et al., 1998).
Conforme al manual de Cowan y Steels (1993), Diagnstico microbiolgico clnico de Koneman
et al. (1998), Bacterial Identification de Cullimore (2000), Libro de pruebas bioqumicas de
Identificacin Bacteriana de MacFaddin et al. (2003), se prosigui con la la realizacin de las
pruebas diferenciales para determinar el gnero y en algunas casos la especie a la cual pertenecen
42

los

aislados

obtenidos

de

las

familias

Enterobacteriaceae,

Pseudomononadaceae,

Alcaligeneaceae y el gnero, Shewanella.

5.10.-Caracterizacin qumica y bioqumica de Fermentadores

Pruebas diferenciales para la familia Enterobacteriaceae. Las pruebas diferenciales permitieron
determinar diferentes gneros de la familia, incluso algunas especies.
Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/Triple azcar y hierro (TSI). El medio KIA y TSI
son medios de cultivo diferenciales en tubo que cumplen un doble propsito: a) la determinacin
de la fermentacin de hidratos de carbono y b) la determinacin de H2S. Un microorganismo
puede utilizar varios sustratos incorporados en el medio, y el patrn de sustratos metabolizados se
usa para diferenciar entre los diversos grupos, gneros o especies de la familia
Enterobacteriaceae. El KIA contiene dos hidratos de carbono (glucosa y lactosa) y el TSI
(glucosa, lactosa y sacarosa), la fermentacin tiene lugar tanto en aerobios (en el pico de flauta)
como en anaerobiosis (en el fondo del tubo), este medio se siembra por puncin y estra
superficial.
Reduccin de nitratos. La realizacin de esta prueba permiti observar la capacidad de las
bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae de reducir nitratos a nitritos. Para esto, se
emple el medio nitrato de potasio, en la variante de caldo nitrato, el cual fue inoculado con el
cultivo puro que se estaba caracterizando. Se incub a 35C durante 24 h. Para determinar la
reduccin de nitratos fue necesario agregar primero los reactivos A y B de Griess, un resultado
positivo se caracteriza porque se produce un color rosa a rojo obscuro en 1-2 min, y un resultado
negativo se caracteriza por la falta de color. En este punto es necesario agregar una cantidad
pequea de polvo de Zn puro, la ausencia de desarrollo de color significa que el microorganismo
redujo el nitrato a nitrito y posteriormente redujo el nitrito a productos no gaseosos. La
desnitrificacin, un resultado negativo que se caracteriza por el desarrollo de color naranja a rojo
obscuro en 5-10 min confirmando el resultado negativo de la prueba, esto es que el nitrato est
presente y no es reducido por el microorganismo (Koneman et al., 1998; MacFadin, 2003).
43

Prueba de Indol. La prueba de Indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo

cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehido, que es la
sustancia qumica activa de los reactivos de Kovacs y Erlich.
Se utiliz el medio de casena, el cual se inocul con un cultivo puro y se incub a 35C por 24h;
despus del tiempo de incubacin se agreg el reactivo de Kovacs directamente al tubo antes de
interpretar los resultados. Una reaccin positiva presenta un anillo rojo en la interface del medio
con la porcin inferior de la fase alcohlica, sobre el medio, y es negativa cuando no hay ningn
desarrollo de color en la capa de alcohol (MacFadin, 2003).
Prueba de Rojo de Metilo (RM). Esta es una prueba cuantitativa para determinar la produccin
de cidos, pero requiere que los microorganismos produzcan cidos fuertes (lctico, actico,
frmico) a partir de glucosa a travs de la va de fermentacin de cidos mixtos; dado que
muchas especies de Enterobacteriaceae pueden producir una cantidad de cidos fuertes
suficientes como para que sea posible detectarlos por medio de RM durante las fases iniciales de
incubacin. El medio empleado fue el caldo rojo de metilo-Vogues-Proskauer, segn la frmula
de Clark y Lubs, el cual se inocul con un cultivo puro del microorganismo en estudio, y se
incub durante 72h a 35C. Concluido el tiempo de incubacin se agregaron directamente en el
caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo; slo los microorganismos capaces de mantener el pH
bajo (aparicin de un color rojo estable) despus de una incubacin prolongada, superando el
sistema amortiguador del pH del medio, pueden denominarse rojo de metilo-positivos (Koneman
et al., 1989).
Prueba de Vogues-Proskauer (VP). El medio utilizado fue caldo rojo de metilo-VoguesProskauer, segn la frmula de Clark y Lubs; el caldo se inocul con un cultivo puro del
microorganismo en estudio, se incubo a 35C durante 72 horas y despus de este lapso se
agregaron 0.6 ml de -naftol al 5% seguidos por 0.2 ml de KOH al 40%. El tubo se sacude
suavemente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico (O2) y luego se dej reposar durante
15 min.
Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final
neutro, acetil-metilcarbinol (AMC, acetona), a partir de la fermentacin de glucosa.
44

Microorganismos como Enterobacter spp. producen acetona como producto final principal del
metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de O2 y
KOH al 40%, en una reaccin positiva la acetona se convierte en diacetilo y el -naftol sirve
como catalizador para producir un complejo de color rojo; una reaccin negativa se caracteriza
por un color amarillo en la superficie (Koneman et al., 1998).
Utilizacin de Citrato. El citrato de sodio es una sal de cido ctrico, un compuesto orgnico
simple hallado como uno de los metablicos en el ciclo del cido tricarboxilicos (Ciclo de
Krebs), algunas bacterias pueden obtener energa de una forma que no es la fermentacin de
hidratos de carbono utilizando citrato como nica fuente de carbono. La evaluacin de esta
caracterstica es importante en la identificacin de muchas Enterobacteriaceae, la utilizacin de
citrato se detecta en un medio con citrato por la produccin de productos intermedios alcalinos.
El medio de Citrato utilizado fue conforme la frmula de Simmons, se toma una colonia aislada
del medio y se inocula estriando sobre la placa de citrato, se incuba durante 24 a 48 horas a 35C;
una prueba positiva est representada por la aparicin de un color azul oscuro, tambin puede ser
positiva en ausencia de color azul pero si hay crecimiento de colonias visibles (Koneman et al.,
1998).
Prueba de ureasa. Determina la capacidad de un microorganismo de hidolizar la urea en dos
molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad.
Se utiliz el medio Agar con urea de Christensen, se utiliza un inculo denso proveniente de un
cultivo puro de 18 a 24 h, se estra toda la superficie del pico de flauta, no se debe de punzar el
medio, se incuba a 35C, el tiempo de incubacin puede ser por periodos prolongados
(MacFadin, 2003).
Descarboxilasas (lisina y ornitina). Las descarboxilasas son un grupo de enzimas especficas
capaces de reaccionar con la porcin carboxilo (COOH) de aminocidos formando aminas de
reaccin alcalina. Esta reaccin, conocida como descarboxilacion, forma dixido de carbono
como producto secundario, cada descarboxilasa es especfica para un aminocido; lisina y
ornitina fueron evaluadas.

45

El medio de Falkow fue la base empleada para determinar la capacidad de descarboxilacion de

las Enterobacteriaceae, el aminocido a evaluar se agrego a la base antes de la inoculacin con el
microorganismo a estudio, de manera paralela debe disponerse de otro tubo que consiste solo en
la base sin el aminocido, ambos tubos se incuban de forma anaerobia cubrindolos con parafina
a 35C durante 24 horas. Durante los estadios iniciales de incubacin, los dos tubos se vuelven
amarillos debido a la fermentacin

de la pequea cantidad de glucosa en el medio, si el

aminocido es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio revierte a su color purpura

original es una reaccin positiva (Koneman et al., 1998).
Crecimiento en KCN. Utilizado en la diferenciacin de bacilos sobre la base de su capacidad de
desarrollarse rpidamente en presencia de cianuro. Se utilizo la base de caldo KCN de Moeller
adicionado una solucin al 1% de TTC para facilitar la observacin del desarrollo bacteriano, se
inocula el caldo y se incuba a 35C durante 24-48 horas, en caso positivo el caldo obtiene un
color rosa, que comprueba la capacidad del microorganismo de desarrollarse en presencia de
KCN (Cowan y Stells 1993, Cullimure, 2000).
Prueba de fermentacin de hidratos de carbono. La fermentacin es un proceso metablico
anaerobio de oxidacin-reduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como un aceptor final de
hidrgeno (aceptor de electrones), en lugar de oxgeno, la fermentacin de sustratos orgnicos
como los hidratos de carbono y alcoholes da por resultados productos finales reducidos y
oxidados. El medio base liquido estndar con rojo fenol como indicador fue el empleado, en esta
prueba se utilizaron distintos azcares y alcoholes (Sacarosa, Dulcitol, Sorbitol, Lactosa,
Celobiosa, Inositol, Maltosa, Manitol, Trehalosa, D-xilosa),

el medio es inoculado con el

microorganismo, se incuba a 35C durante 18 a 24 h, las reacciones son; positiva el medio vira a
un color amarillo, negativo cuando se presenta un color rosa rojizo esto quiere decir que las
peptonas son utilizadas con la resultante alcalinidad (MacFaddin, 2003).
Prueba de Licuefaccin de gelatina a 22C. Determina la capacidad de un microorganismo de
producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que lican/hidrolizan la gelatina o muestran
cambios caractersticos debido a los productos de degradacin. La produccin de gelatinasa se

46

usa como ayuda taxonmica para la identificacin y la clasificacin de bacterias fermentadoras y

no fermentadoras.
El medio de gelatina nutriente en placa fue el que se emple, la inoculacin fue por estra, se
incubo a 22C de 18 a 24 horas, la licuefaccin se presenta como una turbidez en la zona
alrededor del desarrollo, el resto del medio permanece lmpido, el resultado positivo muestra un
precipitado de color blanco lechoso, el halo es de 3 a 6 mm de ancho (MacFaddin, 2003).
5.12.- Caracterizacin qumica y bioqumica para no fermentadores
Las bacterias no fermentadoras se les realiz las Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/
Triple azcar y hierro (TSI) para asegurar que estas cepas no son fermentadoras, ya que al ser
oxidativas estas bacterias no pueden obtener sus nutrientes a partir de los hidratos de carbono de
manera fermentativa, entonces, dependen de la peptona del medio, por lo cual producen dos
reacciones ya sea en medio KIA/TSI, alcalino/alcalino o alcalino/ sin cambios, as como la
prueba de RM/VP se realizaron obteniendo resultados negativos, caracterstico de este grupo de
microorganismos.
Adems se utiliz el medio Agar diferencial de Sellers para estudiar determinadas caractersticas
bioqumicas tiles en la identificacin de bacilos Gram negativos no fermentadores, el medio de
Sellers se siembra por picadura hasta el fondo del tubo y por estra en la superficie, se incuba
durante 24 horas a 35C y se observa el color de la superficie, color del fondo, color de la banda,
fluorescencia en la superficie, gas nitrgeno (MacFaddin, 2003)
Pruebas diferenciales para la determinacin de Pseudomonas
Crecimiento en Agar PIA (Pseudomonas Isolation Agar): Utilizado para el aislamiento de
Pseudomonas, se sembr en placa las bacterias caracterizadas como no fermentadoras para
diferenciar las cepas que pertenecen al grupo de las Pseudomonas y a las que pertencen a otros
gneros no fermentadores que no crecen en este medio.
Prueba de Indol: Se utiliz el mismo medio utilizado para Enterobacterias a diferencia de que el
reactivo no fue el de Kovacs, sino el reactivo de Ehrlich, ya que este es ms sensible para probar
bacilos no fermentadores ya que tienen un produccin mnima de Indol (MacFaddin, 2003)
47

Produccin de pigmento piocianina en Agar Miuller-Hington a 22C: Las cepas bacterianas

caracterizadas como Pseudomonas fueron crecidas en este medio para poder diferencia si
producan el pigmento piocianina, se incubo a 22C durante 48 horas (Merino, 2007).
Descarboxilasas(lisina y ornitina): Determina la capacidad de un microorganismo de
descarboxilar un aminocido para formar una amina con la resultante alcalinidad; se decidi
utilizar para la prueba de Ornitina descarboxilasa el mtodo de Fay y Barry, este medio de
descarboxilasa est modificado es decir sin glucosa, la inoculacin es a partir de un cultivo
puro de 18 a 24 h, los tubos inoculados son cubiertos con parafina estril, se incuba a 37C
durante 2-4 h, una interpretacin positiva se determina por el color purpura y un resultado
negativo por un color amarillo.
Para el caso de lisina descarboxilasa se utiliz el Mtodo de Brooker, Lund y Blazevic, la
inoculacin es de una ansada densa en el medio, se cubre de parafina y se incubaron a 35C
durante 4 h, un resultado positivo se interpreta por un color verde o azul y un resultado negativo
por la presencia de un color amarillo.
Estos mtodos son recomendados para la identificacin de no fermentadores, ya que son ms
sensibles que el medio de Falkow (MacFaddin, 2003).

Arginina dihidrolasa:

Para detectar la presencia de arginina dihidrolasa se emple el caldo

para arginina descarboxilasa de Falkow, pero para determinar la arginina dihidrolasa se necesita
agregar el reactivo de Nessler, despus de agregarlo vira el medio a un color castao e indica que
la degradacin de la arginina se llev a cabo por el sistema de arginina dihidrolasa (Cowan y
Steels, 1993).
Prueba de Oxido-Fermentacin: Es el mismo medio realizado para las pruebas preliminares, la
diferencia son los azcares utilizados, los cuales fueron: sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa,
manitol, inositol y trehalosa.

Reduccin de nitratos y desnitrificacin de nitratos y nitritos, utilizacin de citrato, prueba de

ureasa, crecimiento en KCN, prueba de licuefaccin de gelatina a 22C: Igualmente se

48

emplearon

los medios ya descritos en la seccin de pruebas diferenciales para

Enterobacteriaceae.
Prueba de hidrlisis de almidn: Determina la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el
almidn por medios enzimticos, el medio para almidn empleado fue en la variante de caldo; el
caldo inoculado es incubado a 35C durante 24 h o hasta que ocurra suficiente desarrollo,
despus se agrega el reactivo Yodo acuoso de Lugol para poder interpretar, y se registran los
resultados inmediatamente, un resultado positivo es representado por la ausencia de color, esto
significa que el almidn ha sido hidrolizado a glucosa con cidos, si se presenta un color azul en
el medio es negativo, es decir, el almidn no es hidrolizado (MacFaddin, 2003).
Crecimiento a 5C y 42C: El medio TSA fue inoculado, e incubado a temperaturas de 5C y 42
C para observar si hay crecimiento de los microorganismos catalogados como Pseudomonas a
estas temperaturas, ya que esto ayuda a la identificacin de especies de este grupo (Pichardo et
al., 1981).
Agar base sangre: Es una combinacin de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 %
de sangre humana, el agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento, se usa tambin
para ver la capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos (que es un factor de
virulencia).
Pruebas diferenciales para la especie Shewanella putrefaciens.
Se realizaron las pruebas de Indol, reduccin de nitratos, desnitrificacin, descarboxilasas (lisina,
ornitina), ureasa, prueba de Oxidativa-Fermentativa (xilosa, manitol, lactosa, sacarosa, maltosa),
se emplearon los mismos medios para estas pruebas ya explicados anteriormente.
Pruebas diferenciales para la familia Alcaligeneceae
Las pruebas realizadas fueron reduccin de nitratos, desnitrificacin de nitratos, licuefaccin de
gelatina a 22C, prueba Oxidativa- Fermentativa a partir de manitol, xilosa.

49

VI.- RESULTADOS
6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas
Un total de 70 cepas bacterianas Gram negativas fueron aisladas de los cultivos, de las cuales 30
cepas fueron aisladas de Musa paradisiaca, 15 cepas de Saccharum officinarum, 12 cepas de
Lycopersicon esculentum, 11 cepas de Citrullus lanatus y slo 2 cepas Nicotina tacabum L. (Fig.
11, 12).

35
30
25
20
15
10
5
0

Figura 11.-La grfica muestra el nmero de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de donde se obtuvieron las
cepas bacterianas.

16%

Musa paradisiaca
Saccharum officinarum
Lycopersicon esculentum
Citrullus lanatus
Nicotina tacabum L.

3%
43%

17%
21%

Figura 12.- Distribucin porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de Musa paradisiaca, Saccharum
officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tacabum L.

50

Las 70 cepas bacterianas aisladas fueron utilizadas en el proceso para determinar si producen
poli--hidroxialcanoatos (PHAs) conforme al mtodo espectrofotomtrico de Law y Slepecky
(1961) modificado por Martnez et al., 2004 (Anexo I) de las cuales slo 20 cepas bacterianas se
seleccionaron por presentar valores ptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotmetro
UV/VIS para producir PHAs, los resultados de la seleccin fue: 8 cepas bacterianas del cultivo de
Musa paradisiaca; del cultivo de Saccharum officinarum 6 cepas fueron elegidas, para el cultivo
de Lycopersicon esculentum se seleccionaron 3 cepas, de Citrullus lanatus tambin se
seleccionaron 3 cepas y en el caso de las cepas aisladas del cultivo de Nicotina tacabum L. no se
seleccion ninguna cepa ya que los valores de produccin resultaron muy bajos (Tabla 11 y Tabla
12).
Tabla 11: Nmero de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo.

Cultivo al que pertenecen los

Nmero de cepas

Nmero de cepas aisladas

aislados bacterianos

bacterianas aisladas de

que producen PHAs

los cultivos

considerablemente

Musa paradisiaca

30

Saccharum officinarum

15

Lycopersicon esculentum

12

Citrullus lanatus

11

Nicotina tacabum L.

Tabla 12: Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores ptimos en cuanto a la lectura en el
espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm (las cepas aisladas de S. offisanarum sombreadas en morado, L. esculentum en
rosa, M. paradisiaca en azul y C. lanatus en verde)

Cepa

Dilucin

IIBUV-ESP1

Lectura a

Lectura a

214nm (24 h)

214nm(48h)

.422

.989
.995

IIBUV-ESP2

1:10

1.036

1:20

.825

IIBUV-ESP

Dilucin

1:20

.847

Dilucin

Lectura a 214
nm( 72h)

1:100

.028
.750

1:10

.622

51

IIBUV-ESP

IIBUV-ESP

IIBUV-ESP

IIBUV-ELP 25

1:20

1:10

IIBUV-ELP 26
IIBUV-ELP 27

1:10

.952

1:10

.465

1:10

.677

.670

1:20

.757

1:20

.521

.655

1:10

.359

1:10

.588

.677

1:100

.106

1:100

.123

.597

.991

.813

.080

.672

.882

IIBUV-EMP28

.993

1:20

.897

1:20

.718

IIBUV-EMP

29

.345

1:20

.453

1:20

.548

IIBUV-EMP

30

.894

1:20

.720

1:10

1.004

IIBUV-EMP

52

.530

.532

.625

IIBUV-EMP

53

.383

.592

.598

IIBUV-EMP

54

.535

IIBUV-EMP

56

.993

1.078

IIBUV-EMP

57

.561

.736

1:10

.308

IIBUV-ECP 58

.990

1:10

.151

1:10

.288

1:10

.255

1:10

.486

.598

1:10

.698

1:20

IIBUV-ECP 60

1:10

.156

IIBUV-ECP 61

1:10

.120

1:10

.085

1:10

.416
.730

De acuerdo a estos resultados, el cultivo de S. officinarum, fue de donde se obtuvo el mayor

porcentaje de aislamiento bacteriano, es decir, el 40% del total de las cepas fueron seleccionadas.
En cuanto a las cepas elegidas de M. paradisiaca equivalen a un 26.66%, en el caso de L.
esculentum un 25% de los aislados fueron seleccionados, para C. lanatus solo el 18.18% fueron
elegidas y como se menciono anteriormente en el caso de N. tabacum no se selecciono ninguna
cepa debido a sus bajos niveles (Fig.13).

52

40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
S.
officinarum

M.
Lycopersicon
paradisiaca esculentum

Citrullus
lanatus

Nicotina
tacabum L.

Figura 13.- Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo

6.2.- Caracterizacin qumica y bioqumica de las cepas

productoras de PHAs y

cuantificacin de PHAs
Se

realiz la caracterizacin qumica y bioqumicamente de las cepas seleccionadas y los

resultados son:
Las cepas caracterizadas de S. officinarum fueron identificadas como Shewanella putrefaciens,
Pseudomonas pseudomallei, Enterobacter hormaechei, Alcaligenes spp., Pseudomonas
aeruginosa y Enterobacter spp.; para el caso de L. esculentum las cepas aisladas corresponden a
Enterobacter

spp.,

Shewanella

putrefaciens,

correspondientes a Musa paradisiaca fueron

Enterobacter

hormaechei:

las

cepas

Pseudomonas cepacia, Enterobacter spp.,

Alcaligenes latus, Citrobacter sp., Alcaligenes spp., Citrobacter spp., Pseudomona aeruginosa,
Enterobacter aerogenes y por ltimo las cepas identificadas para C. lanatus fueron Alcaligenes
desnitrificans, Enterobacter hormaechei y Enterobacter gergoviae (Tabla 13) (Fig. 15, 16,17,
18).

53

Tabla 13: Cepa bacterianas identificadas como productoras de PHAs

Tipo de cultivo

Clasificacin de la cepa

Cepas bacterianas productoras de

PHAs

S. officinarum

L. esculentum

M. paradisiaca

C. lanatus

54

IIBUV-ESP1

Shewanella putrefaciens

IIBUV-ESP2

Pseudomonas pseudomallei

IIBUV-ESP 3

Enterobacter hormaechei,

IIBUV-ESP 4

Alcaligenes spp.

IIBUV-ESP 5

Pseudomonas aeruginosa,

IIBUV-ELP 6

Enterobacter spp.

IIBUV-ELP 25

P. pseudomallei.

IIBUV-ELP 26

Shewanella putrefaciens,

IIBUV-ELP 27

E. hormaechei

IIBUV-EMP 28

Pseudomonas cepacia,

IIBUV-EMP 29

Enterobacter spp.

IIBUV-EMP 30

Alcaligenes latus,

IIBUV-EMP 52

Citrobacter spp.

IIBUV-EMP 53

Alcaligenes spp.

IIBUV-EMP 54

Citrobacter spp.

IIBUV-EMP 56

Pseudomonas aeruginosa,

IIBUV-EMP 57

Enterobacter aerogenes

IIBUV-ECP 58

Alcaligenes desnitrificans,

IIBUV-ECP 60

Enterobacter hormaechei

IIBUV-ECP 61

Enterobacter gergoviae

a) Tubo no
inoculado

+
Movilidad

b) Reaccin positiva a la
prueba de catalasa

c) Prueba de oxidasa: izquierda

reaccin negativa, derecha positiva

Figura 15.- Pruebas bsicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b) prueba de catalasa, c)
prueba de oxidasa

Figura 16.- a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reaccin negativa, fue observado en todas las cepas
caracterizadas, el segundo tubo reaccin positiva caracterstica de E. coli que fue seleccionado como control
positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reaccin positiva caracterstico de algunos organismos
fermentadores, el segundo tubo es reaccin negativa caracterstica de organismos no fermentadores c) Prueba VP, en
el primer tubo reaccin positiva, la reaccin negativa se puede apreciar en el segundo tubo caracterstico de
organismos no fermentadores.

55

H2S

Figura 17.- Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la produccin de H2S; una caracterstica
fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, adems se observa la reaccin Alc/Alc caracterstico de un
organismo no fermentador a 24 h de incubacin a 35C.

C
+

Figura 18: a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido por P. aeuroginosa, b)
Placa de Agar sangre, se observa la pigmentacin amarilla de las colonias pertenecientes a P. cepacia, c) Prueba de
acides de hidratos de carbono y alcoholes de P. cepacia

56

6.3.- Concentracin de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum

Los resultados obtenidos, en cuanto a la produccin de PHAs, de las cepas aisladas de S.
officinarum determinados con la ayuda de la curva patrn nos permite observar que, la cepa
IIBUV-ESP3 identificada como E. hormaechei presenta la mayor concentracin de PHAs dentro
de este grupo, siendo constante durante las primeras 48 horas, al cabo de las 72 horas desciende
la concentracin, sin embargo es una concentracin ptima comparndolas con las otras cepas
aisladas de este cultivo,

los gneros P. aeruginosa. y Alcaligenes spp. tambin presentan

concentraciones aceptables de PHAs pero estos valores estn por debajo de los observados en E.
hormaechei. En cuanto a P. pseudomallei

es hasta las 72 horas cuando se presenta una

concentracin relativamente alta y por ltimo S. putrefaciens que present muy baja
concentracin de PHA durante las 72 horas (Tabla 14)
Tabla 14: Concentracin de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Saccharum officinarum

Cepa

IIBUV-ESP1

Gnero/

Concentracin

Concentracin

Concentracin

especie

final de PHAs a

final de PHAs a

final de PHAs a

las 24h (g/l)

las 48h (g/l)

las 72 h (g/l)

3.2

8.54

8.8

86

8.55

8.15

166

167

76

8.5

39

80.8

80.7

40.0

45

8.0

26

70.5

S.
putrefaciens

IIBUV-ESP2

P.
pseudomallei

IIBUV-ESP3

E.
hormaechei

IIBUV-ESP4

Alcaligenes
spp.

IIBUV-ESP5

P.
aeruginosa

IIBUV-ESP6

Enterobacter
sp.

57

6.4.- Concentracin de PHAs de las cepas aisladas de Musa paradisiaca

En este cultivo la cepa aislada que produce considerablemente mayor cantidad de PHAs es
Alcaliges latus, seguida de Pseudomona cepacia, en esta la mayor produccin de PHAs fue a
partir de las 48 horas al contrario de Alcaligenes latus

que a las 24 horas present una

concentracin elevada, otra de las cepas que presento una concentracin alta es Enterobacter
spp., sin embargo fue hasta las 72 horas de cultivo; en el caso de Alcaligenes spp., Citrobacter
spp. y Enterobacter aerogenes los niveles de concentracin son muy bajos en comparacin con
las cepas ya mencionadas (Tabla 15).
Tabla 15: Concentracin de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Musa paradisiaca

Cepa

Gnero/especie

Concentracin

Concentracin

Concentracin

final de PHAs a fina de PHAs a final de PHAs a

IIBUV-

las 24h (g/l)

las 48h (g/l)

las 72 h (g/l)

P. cepacia

8.54

168

162

Enterobacter spp.

2.55

75

121

167.8

163

85.8

Citrobacter spp.

5.45

5.50

7.70

Alcaligenes spp.

2.8

7.15

7.25

Citrobacter spp.

5.75

8.5

31

P. aeruginosa

8.56

8.62

8.15

E. aerogenes

4.45

8.18

23.5

EMP28
IIBUVEMP29
IIBUV-

A. latus

EMP30
IIBUVEMP52
IIBUVEMP53
IIBUVEMP54
IIBUVEMP56
IIBUVEMP57

58

6.5.- Concentracin de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum esculentum

La cepa con mayor concentracin de PHAs para este cultivo fue P. pseudomallei, pero fue hasta
las 72 horas de cultivo, al contrario de cepas encontradas en otros cultivos que presentaron
concentraciones considerables a partir de las 24 h de cultivo, como fue el caso de E. hormaechei
aislada de S. officinarum , adems podemos observar que esta cepa fue aislada de este cultivo,
pero presentando muy bajas concentraciones de PHA en comparacin a la cepa aislada de S.
officinarum. En cuanto S. putrefaciens las concentraciones de PHAs son muy bajas, esto tambin
es observado en la cepa aislada de S. officinarum (Tabla 16).
Tabla 16: Concentracin de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Lycopersicum esculentum

Cepa Gnero/especie Concentracin Concentracin Concentracin

final de PHAs a final de PHAs a final de PHAs a
las 24h (g/l)

las 48h (g/l) las 72 h (g/l)

8.5

20.5

42.5

S. putrefaciens

7.20

8.52

8.25

E. hormaechei

.8

8.08

8.39

IIBUV- P. pseudomallei
ELP25
IIBUVELP26
IIBUVELP27

6.6.- Concentracin de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

La cepa con mayor concentracin de PHA en este cultivo fue Enterobacter hormaechei, otra cepa
identificada como Enterobacter gergovice tambin produce PHAs pero no en la proporcin de E.
hormaechei, ya que la concentracin mayor se observa hasta las 72 horas y en el caso de A.
desnitrificans es la cepa con menor concentracin de PHAs (Tabla 17).

59

Tabla 17.- Concentracin de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

Cepa

Gnero/especie

Concentracin Concentracin Concentracin

final de PHAs final de PHAs final de PHAs

IIBUV-ECP58

Alcaligenes

a las 24h

a las 48h

a las 72 h

(g/l)

(g/l)

(g/l)

8.45

7.5

22.5

denitrificans
IIBUV-EMC60

E. hormaechei

161

164

99.0

IIBUV-EMC61

E. gergoviae

4.5

7.25

80.9

6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs

Se realizaron las curvas de crecimiento a 14 cepas elegidas aleatoriamente del total de cepas
bacterianas seleccionadas durante un periodo de 108 horas a una temperatura de 28C a 30C.
Las cepas

bacterianas son: E. gergoviae (IIBUV-ECP61), E. hormaechei (IIBUV-ECP60),

Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), E. aerogenes (IIBUV-EMP57), P. pseudomallei (IIBUVELP25), E. hormaechei (IIBUV-ELP27), P. aeruginosa (IIBUV-ESP5), Enterobacter spp.
(IIBUV-ESP6),

E. hormaechei (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), P. cepacia

(IIBUV-EMP 28), Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) y

Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30).
Los resultados obtenidos nos mostraron que durante la fase exponencial, E. gergovice (IIBUVECP61), present las menores concentraciones, es decir, de 4.5g/l a las 24 h, y de 7.25 g/l
a las 48 h de cultivo y al momento de iniciar la fase estacionaria aument la concentracin de
PHA a 80.9g/l a las 72 h (Fig.19).

60

1.8
Absorbancia a 600 nm

80.9 g/l

7.25 g/l

1.6
1.4

4.5 g/l

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60
Tiempo (h)

80

100

120

Figura 19.- Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus.

Por otro lado, E. hormaechei (IIBUV-ECP 60) present una concentracin de 161 g/l de PHAs a
las 24 h y de 164 g/l

a las 48 h durante la fase estacionaria, a las 72 h inicio la fase de

muerte y con ello una disminucin en la concentracin, obteniendo slo 99 g/l (Fig. 20)

Absorbancia a 600 nm

2.5
164 g/l

161 g/l

99 g/l
1.5
1
0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 20.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de Citrullus lanatus.

61

La cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54),

concentracin

almacena PHAs en una

de 31 g/l a las 72 h en su fase estacionaria, en cambio durante la fase

exponencial las concentraciones son muy bajas (Fig. 21). Al igual que en Citrobacter spp., para
E. aerogenes (IIBUV-EMP57) su mayor concentracin de PHAs es a las 72 h durante fase
estacionaria, sin embargo es menor la acumulacin de PHAs en esta cepa (Fig. 22).

Absorbancia a 600 nm

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

31g/l

8.5 g/l
5.75 g/l

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)
Figura 21.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), aislada del cultivo
de Musa paradisiaca.

Absorbancia a 600 nm

2.5
23.5 g/l

8.18
g/l
4.45g/l

1.5
1
0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)
Figura 22.- Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de Musa paradisiaca.

62

Interesantemente P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), present una concentracin superior de

PHAs de 85 g/l durante fase de no crecimiento a las 24h, sin embargo a las 72 h vuelve a
aumentar tanto la concentracin celular y como de PHAs, despus de este perodo inicia fase de
muerte, pero esta concentracin es baja en comparacin a la obtenida a las 24h (Fig.23).

1.8
85g/l

1.6

42.5g/l

20.5g/l

Absorbancia 600 nm

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 23.- Curva de crecimiento de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de Lycopersicum
esculentum.

Para E. hormaechei (IIBUV-ELP27) aislada de L. esculentum y al igual que P. pseudomallei ,

su mayor concentracin de PHAs es de 8.39 g/l y ocurre durante la misma fase, sin embargo
esta es muy baja (Fig. 24), destaca el hecho de que en E. hormaechei la fase estacionara inicia
hasta las 72 h, adems de que tambin fue aislada de C. lanatus, no obstante, la cepa asilada de
C. lanatus presenta concentraciones muy favorables y altas durante las 72 h (Fig. 20), en
comparacin con la cepa aislada de L. esculentum.

63

Absorbancia a 600 nm

8.08
g/l

1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8

8.39
g/l

.8 g/l

0.6
0.4
0.2
0
-0.2 0

20

40

60
Tiempo (h)

80

100

120

Figura 24.- Curva de Crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum.

Los datos correspondientes a P. aeruginosa (IIBUV-ESP5), es que su mayor concentracin de

PHAs es de 80.7 g/l a las 24h fase estacionaria, presentando menores concentraciones en las
posteriores horas, adems podemos observar que a las 48 h entra en fase de muerte, pero a las 72
h vuelve aumentar un poco la concentracin de PHAsy celular comparando con la concentracin
obtenida a las 48 h (Fig. 25) esto tambin fue observado en P. pseudomallei (IIBUV-ELP25),

Absorbancia a 600 nm

aislada de L. esculentum (Fig. 23).

1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

80.7
g/l

20

45 g/l
40g/l

40

60

80

100

120

Tiempo (h)
Figura 25.- Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de Saccharum officinarum,
adems podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas a las 24, 48 y 72 horas.

64

Concerniente a Enterobacter spp. (IIBUV-ESP6), se puede observar que la mayor concentracin

de PHAs es a las 72 h de cultivo en fase estacionaria, y las menores concentraciones es durante la
fase exponencial (Fig. 26)

2.5

70.5g/
l

2
1.5
1

26g/
l

8.0g/l

0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Figura 26.- Curva de crecimiento de E. spp. (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de Saccharum officinarum.
En el caso de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) tambin inicia la fase estacionaria a las 24h y
termina despus de las 48 h, durante esta fase, se obtuvieron las mayores concentraciones, con lo
cual podemos mencionar

que E. hormaechei acumula PHAs considerablemente (Fig. 27).

Adems esta cepa aislada de S. officinarum tambin presenta concentraciones ptimas en

comparacin con la cepa obtenida de C. lanatus identificada tambin como E. hormaechei

Absorbancia a 600 nm

(IIBUV-ECP60) (Fig. 20).

2.5

166 g/l

167
g/l

1.5
1

76
g/l

0.5
0
0

20

40

60
Tiempo (h)

80

100

120

Figura 27.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de Saccharum officinarum.

65

Otra de las cepas a las que tambin se realiz su curva de crecimiento fue S. putrefaciens
(IIBUV-ESP1), que al igual que las cepas anteriores, su mayor concentraciones de PHAs fue
durante la fase estacionaria hasta las 72 h (Fig.28), sin embargo las concentraciones obtenidas,
al igual que en E. hormaechei aislada de L. esculentum son de las ms bajas.

Absorbancia a 600 nm

2.5

8.8 g/l

8.54g/l
1.5

3.2 g/l
1
0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 28.- Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo de S. officinarum

Las siguientes cepas se diferencian de las anteriores debido a que las concentraciones de PHAs
ms altas son durante la fase exponencial, es el caso de P. cepacia (IIBUV-EMP 28) quien
present la mayor concentracin de PHAs a las 48 h fue de 168 g/l, sin embargo tambin
present una buena concentracin a las 72 h de cultivo, momento en que entra en fase
estacionaria (Fig. 29).

66

Absorbancia a 600 nm

2.5

162 g/l

2
1.5

168 g/l
8.54 g/l

1
0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 29.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa
paradisiaca

Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), present su mayor concentracin a las 24h fase exponencial
pero tan slo es de 24g/l, en las siguientes horas descendi la concentracin (Fig. 30)

Absorbancia a 600 nm

2.5
7.15g/l

7.25g/l

1.5

28g/l

0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 30.- Curva de crecimiento de Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

67

P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) presenta su mayor concentracin a las 24 h durante fase

exponencial y durante las 48 h siguientes la concentracin descendi (Fig. 31).

1.8

8.55 g/l

Absorbancia a 600 nm

1.6

8.15 g/l

1.4
1.2
1

86 g/l

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)
Figura 31.- Curva de crecimiento de la cepa bacteriana identificada como P. pseudomallei (IIBUV-ESP2), aislada
del cultivo de Saccharum officinarum.

Por ltimo, Alcaligenes latus present las mayores concentraciones de PHAs durante la fase
exponencial, ya que al iniciar la fase estacionaria a las 72 h, los niveles de PHAs descendieron
hasta en 50% (Fig. 32).

m
Absorbancia a 600 nm

2.5

85.8 g/l

2
167.8 g/l

1.5

163 g/l

1
0.5
0
0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

Figura 32.- Curva de crecimiento de la cepa A. latus (IIBUV-EMP30), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

68

En la tabla 18 se muestran las cepas con mayor produccin de PHAs para cada cultivo, en la tabla
19 se muestran las cepas a las que se les realiz la curva de crecimiento con las mejores
concentraciones de PHA, conforme a la etapa y tiempo de produccin de PHA si se comparan
con las 13 cepas no seleccionadas por presentar menores concentraciones de PHAs (Anexo1,
Tabla 20)
Tabla 18: Cepas con mayor produccin de PHAs de cada cultivo

Cultivo

Cepas con mejores

concentraciones de PHA

S. officinarum

E. hormaechei, E. spp. P.
pseudomallei, E. aeruginosa

L. esculentum

P. pseudomallei

C. lanatus

E. hormaechei, E. gergoviae

M. paradisiaca

A. lanatus, P. cepacia, C. spp.

Tabla 19: Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su produccin y curva de crecimiento

Cepa seleccionada

Concentraciones
de PHA durante
las 72 h (g/l)

Fase de
crecimiento con
mayor [ PHA]

Cultivo

P. aeruginosa

80.7,40, 45

estacionaria

S. officinarum

E. hormaechei

166,167,76

estacionaria

S. officinarum

P. pseudomallei

86.8.55,8.15

exponencial

S. officinarum

P. pseudomallei

85,20.5,42.5

estacionaria

L. esculentum

E. hormaechei
P. cepacia

161,164,99
8.54, 168, 162

estacionaria
exponencial

C. lanatus
M. paradisiaca

A.latus

167.8, 163, 85.8

exponencial

M. paradisiaca

69

6.8.- Evaluacin

cualitativa de la acumulacin de poli--hidroxialcanoatos (PHAs)

mediante la tcnica de tincin lipoflica con Negro Sudn B

Se logr visualizar los grnulos de PHAs de las 20 cepas seleccionadas que presentaron valores
ptimos de concentracin, con lo cual se confirma uno de los objetivos de este trabajo, que fue
aislar cepas bacterianas capaces de producir poli-- hidroxialcanoatos. Las cepas en que se
observaron ms grnulos fueron A. latus y E. hormaechei aisladas tanto de los cultivo de
Saccharum officinarum y Citrullus lanatus, P. pseudomallei, P. cepacia, y P. aeruginosa (Fig.
32, Fig. 33).

Grnulos PHA

Figura 33: Tincin lipoflica con Sudn negro. Se observan grnulos PHA a un aumento de 100X, en la cepa
bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs.

70

Grnulos PHA

Figura 34: Tincin lipoflica con Sudn negro, se observan grnulos PHA a un aumento de 100 x, en la cepa
bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs.

71

VII.- DISCUSIN
De acuerdo a los conceptos vertidos por Wang y Lee (1997), quien considera a los Poli-hidroxialcanoatos producidos por bacterias como buenos candidatos para reemplazar los plsticos
obtenidos de hidrocarburos y debido a que los PHAs poseen propiedades similares a los plsticos
convencionales y que tienen la propiedad de ser completamente biodegradables y como Page y
colaboradores (1997) que establecieron que los biopolmeros producidos por diferentes
microorganismos tienen amplia importancia en

diversas reas de la ciencia, (economa,

agricultura, etc.), as, los datos obtenidos en este estudio cobran relevancia en cuanto a la
caracterizacin qumica y bioqumica de las cepas bacterianas capaces de producir PHAs.
De un total de 70 cepas aisladas y estudiadas, de las especies vegetales M. paradisiaca, S.
officinarum, L. esculentum C. lanatus; se seleccionaron 20 aislados bacterianos por presentar las
mayores lecturas en el espectrofotmetro UV/VIS, determinando los siguientes gneros y
especies: Pseudomonas cepacia (IIBUV-EMP28), Enterobacter spp. (IIBUV-EMP29),
Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30), Citrobacter spp. (IIBUV-EMP52), Alcaligenes spp. (IIBUVEMP53), Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), Pseudomonas aeruginosa (IIBUV-EMP56),
Enterobacter

aerogenes

Pseudomonas

pseudomallei

(IIBUV-EMP57),
(IIBUV-ESP2),

Shewanella
Enterobacter

putrefaciens

(IIBUV-ESP1),

hormaechei

(IIBUV-ESP3),

Alcaligenes spp. (IIBUV-ESP4) Pseudomonas aeruginosa (IIBUV-ESP5), Enterobacter spp.

(IIBUV-ELP6), P. pseudomallei. (IIBUV-ELP25), Shewanella putrefaciens (IIBUV-ELP26), E.
hormaechei (IIBUV-ELP27), Alcaligenes desnitrificans (IIBUV-ECP 58), Enterobacter
hormaechei (IIBUV-ECP60), y Enterobacter gergoviae (IIBUV-ECP 61).
Aun cuando Moreno y colaboradores (2007) mencionan que no se ha reportado que la Familia
Enterobacteriaceae sea acumuladora de PHAs, estudios realizados por Arshad y colaboradores
(2007) mostraron recientemente la caracterizacin bioqumica de cepas productoras de PHA
pertenecientes a los gneros Citrobacter y Enterobacter, lo cual viene a ser confirmado por
nuestros resultados al demostrar la produccin de PHA en especies de los gneros Enterobacter,
Citrobacter, esto cobra relevancia y sustenta los resultados obtenidos en este estudio referente a
estos gneros, como productoras de PHAs;

72

En cuanto a las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas aisladas en este estudio se pudo
confirmar que pueden producir PHAs en medios de cultivo conteniendo sacarosa, lo cual es
apoyado por Madison y Huisman (1999) ya que ellos sealan que las Pseudomonas son capaces
de convertir Acetil-CoA a monmeros de cadena de longitud media para la sntesis de PHA, con
la nica excepcin de P. oleovorans, que presenta la incapacidad para sintetizar PHAs a partir de
azcares, adems indican que los PHAs formados a partir de azcares, como es el caso de la
sacarosa, fuente de carbono utilizada en este estudio, tienen una composicin diferente de los
PHAs formados a partir de cidos grasos, pero son igual de eficientes; mientras que los PHAs
obtenido de cidos grasos tienen 3-hidroxioctanoato como el componente principal.
En este contexto, en los PHAs obtenidos a partir de azucares el monmero principal es 3hidroxidecanoato, adems algunas Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monmeros de
PHAs-ssc como PHAs-mss en la misma cadena polimrica. Normalmente, estos PHAs se forman
cuando estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como son los
carbohidratos, en el caso de este tipo de PHAs mezclados, se ha demostrado que el resultado
final es la acumulacin individual de grnulos compuestos de P (3HB) y otros tipos de PHAs,
por tanto las Pseudomonas aisladas en esta investigacin resultan ser eficientes en la produccin
de PHAs.
Los resultados obtenidos con las cepas A. latus y A. spp. coinciden con los reportados por
Madison y Huisman (1999), quienes reportan a la especie Alcaligenes latus como un productor
de biopolmeros que se encuentran asociados a su crecimiento. Este comportamiento es
fehacientemente observado en las cepas aisladas, ya que se puede observar que la mayor
concentracin de PHAs es durante la fase exponencial. En cuanto al gnero

Shewanella

putrefaciens no se tienen reportes que sealen a esta como productoras de PHAs; sin embargo
debe mencionarse que esta cepa fue anteriormente clasificada como Pseudomonas putrefaciens
segn el esquema de Weaver-Hollis, Koneman y colaboradores (1998), ya que el grupo de las
Pseudomonas son catalogadas como productoras de PHAs, lo que concuerda con los resultados
que se reportan.
Con respecto al comportamiento de las cepas aisladas, en cuanto a las concentraciones de PHAs,
hay que mencionar que difiere de una especie a otra, este comportamiento es similar al reportado
por Mandon y colaboradores (1998), quienes sealan que la acumulacin de PHAs en bacterias,
en presencia de un exceso de fuente de carbono difiere marcadamente de una especie a otra. As
73

tambin se pudo observar que la mayor acumulacin de PHA se presenta en algunas cepas
bacterianas en fase estacionaria y en otras en fase exponencial; de acuerdo a esto, Rojas y
colaboradores (2006) menciona que cuando no existe crecimiento (fase estacionaria) debido a la
ausencia total de nitrgeno en el medio, la cantidad de carbono excedente es utilizada en la
sntesis de PHAs, esto fue observado en las cepas bacterianas a las que se le determin su cintica
de crecimiento; E. gergoviae (IIBUV-ECP61), E. hormaechei (IIBUV-ECP60) aisladas de C.
lanatus, Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aisladas de Musa
paradisiaca, P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), E. hormaechei (IIBUV-ELP27) aislada de L.
esculentum, y P. aeuroginosa (IIBUV-ESP5), E. hormaechei (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens
(IIBUV-ESP1) aisladas de S. officinarum.
En el caso de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25) y P. aeruginosa (IIBUV-ESP5) se pudo observar
un crecimiento inestable, en ciclos de incremento y prdida de PHA, esto tambin es sealado por
estudios realizados por Lasala y colaboradores (2004b) con la cepa Mezorhizobium plurifarum
que establecieron que esto es debido a una oxigenacin elevada, que desva el metabolismo hacia
cuotas de respiracin ms altas, mayor oxidacin del sustrato y por tanto menor disponibilidad de
Acetil-CoA para la produccin de PHAs. Por lo tanto a bajos niveles de oxigenacin y exceso
de fuente de carbono, el metabolismo energtico genera elevadas concentraciones de NADH+ y
Acetil-CoA que deben ser convertidos en formas osmticamente neutras que no afecten el
balance redox de la clula y esto conlleva a la sntesis de PHAs.
En el caso de las cepas que produjeron mayor concentracin de PHAs, durante la fase
exponencial por ejemplo: P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa paradisiaca y P.
pseudomallei aislada de S. officinarum (IIBUV-ESP2), Durner y colaboradore(2001) y Klinke y
colaboradores (2000) confirmaron lo reportado, es decir,

que algunas especies del gnero

Pseudomonas acumulan PHAs durante el crecimiento exponencial. Rojas y colaboradores (2006)

explican que en esta fase, la disponibilidad de carbono intracelular se realiza por

la ruta

metablica Entner- Doudoroff (EDP), ya que la ruta oxidativa de las pentosas fosfato no est
activa y las reacciones para la generacin de Ribosa-5-fosfato (R5P) participan de acuerdo al
sentido inverso de la ruta de las pentosa fosfato (PP), por este motivo la generacin de Fructosa6-fosfato (F6P) se lleva a cabo por la enzima fosfoglucosa isomerasa de la ruta glucoltica para
cumplir con los requerimientos de biosntesis de precursores donde el flujo de Acetil-CoA se
dividen en tres fracciones: sntesis del polmero, sntesis de citrato en el TCA y en las rutas
74

anablicas involucradas en la conversin de precursores a bloques de construccin como

aminocidos, lpidos, etc., que forman las macromolculas de acuerdo a la composicin celular
fija. En este esquema la fraccin mayor de Acetil-CoA es utilizada para la generacin de PHAs,
lo cual disminuye el flujo hacia el ciclo TCA y hacia las rutas anablicas que lo consumen.
En cuanto a Alcaligenes spp. y A. latus tambin presentaron la mayor produccin durante la fase
exponencial, estos resultados concuerdan con lo mencionado por Martnez y colaboradores
(2004) para A. latus ya que segn el, las mayora de la especies bacterianas producen muy poco
PHB durante la fase exponencial de crecimiento, con excepcin del gnero ya mencionado, lo
que fue confirmado en el presente trabajo, al presentar la mayor produccin de PHAs durante
esta etapa de crecimiento. Adems de otras especies como Azotobacter vinelandi, Azotobacter
chrococcum y algunas Pseudomonas que producen PHAs durante fase exponencial.
Por ltimo, Gmez y colaboradores (1996) validaron la eficiencia de produccin de PHAs, por
diversas bacterias Gram negativas aisladas de suelo de plantaciones de caa de azcar, resultados
que fueron positivos tambin para en este estudio, ya que de las 7 cepas seleccionadas que
presentaron mayor produccin de PHAs, 3 de estas fueron aisladas de plantas de Sacharum
officinarum.

75

VIII. CONCLUSIONES

1. En este trabajo se logr obtener, aislar y purificar gneros y especies bacterianas

productoras de PHAs aisladas de Citrullus lanatus, Lycopersicum esculentum, Musa
paradisiaca y Saccharum officinarum
.
2. La metodologa aplicada permiti seleccionar las cepas bacterianas con capacidad de
producir PHAs, as como cuantificar la concentracin de los mismos para cada aislado.
3. La aplicacin de pruebas qumicas y bioqumicas permitieron la caracterizacin de cepas
bacterianas y cuyo comportamiento se desglosa posteriormente.
4. Los gneros y especies bacterianas aisladas en el presente estudio, pertenecientes a
Pseudomonas y Alcaligenes presentaron concentraciones ptimas de PHAs, adems de
ser bacterias ampliamente estudiadas; con respecto a los gneros y especies aisladas a la
Familia Enterobacteriaceae, arrojan resultados favorables y novedosos, debido a que
existen pocos datos sobre esta familia en cuanto a la produccin, esto abre un nuevo
campo para estudios futuros sobre este tema.
5. Se pudo observar que E. hormaechei aisladas de los cultivos de S. officinarum, C. lanatus,
y L. esculentum, no acumulan PHAs en la misma concentracin durante su curva de
crecimiento, mientras que la cepa aislada de L. esculentum present concentraciones muy
bajas en comparacin con las cepas aisladas de C. lanatus y S. officinarum.
6. Lo anterior, es debido a que las mayores concentraciones de PHAs en E. hormaechei
aislada de C. lanatus y S. officinarum, se da por la presin selectiva que enfrenta en su
ambiente, causada por el desbalance de la cantidad de carbono/ nitrgeno y por la
descomposicin de residuos en el suelo, que da como resultado un exceso de carbono y
una limitacin de nitrgeno.

76

7. Las cepas con mayor concentracin son: Alcaligenes latus aislada de M. paradisiaca, que
present mayor concentracin de PHAs de las cepas

bacterianas seleccionadas,

obteniendo las mayores concentraciones en fase exponencial de 167. 8 g/l y 163 g/l
durante las primeras 48 h, a las 72 h fase estacionaria acumulando 85.8 g/l. E.
hormaechei aislada de C. lanatus mostro concentraciones favorables durante las 72 h las
cuales fueron de 161 g/l y 164 g/l durante fase estacionaria, alcanzando los 99 g/l
durante fase de muerte.

P. cepacia aislada de M. paradisiaca mostro PHAs

considerablemente hasta las 48 h con 168 g/l y 162 g/l en fase exponencial. P.
pseudomallei aislada de L. esculentum logr biosintetizar 85 g/l en fase estacionaria,
20.5 g/l y 42.5 g/l y finalmente P. pseudomallei aislada de S. officinarum mostr
una concentracin favorable a las 24 h de 86 g/l en fase exponencial.
8. Pseudomonas pseudomallei (IIBUV-ESP2) result sensible a la concentracin de
aeracin, ya que present disminucin y aumento de PHAs durante las 72 h.
9. La determinacin cualitativa mediante la tincin lipofilica con Sudn Negro result
satisfactoria y permiti demostrar la acumulacin de PHAs por las cepas bacterianas en
estudio.
10. En general, podemos decir que el porcentaje final de aislamientos

bacterianos que

presentaron concentraciones de PHAs favorables, son el 10 % de las el 70 cepas

aisladas de los Cultivos.
11. Finalmente concluimos que de los 70 aislados bacterianos, 7 aislados son consideradas
de amplio aprovechamiento por sus concentraciones y anlisis concernientes a curvas de
crecimiento, ya que esto nos permiti observar cuales cepas acumulan PHAs en menor
tiempo, as como sus altas concentraciones, las cepas son : P. aeruginosa (IIBUV-ESP 5),
E. hormaechei (IIBUV-ESP 3 ), P. pseudomallei IIBUV-ESP 2) aisladas de S.
officinarum, P. pseudomallei (IIBUV-ELP 25) aislada de L. esculentum, P. cepacia
(IIBUV-EMP 28)y Alcaligenes latus (IIBUV-EMP 30)y E. hormaechei (IIBUV-ECP 60)
aislada de C. lanatus.

77

IX.- ANEXOS

Anexo I.- Promedio de la lectura en espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 70 cepas

bacterianas aisladas

a las cuales se le aplico el mtodo de Law y Slepecky (1961)

modificada por Martnez et al. (2004):

Tabla 6: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 15 cepas
bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (se
encuentran sombreadas) para su determinacin cuantitativa y cualitativa en cuanto a produccin de PHAs, as como
su caracterizacin qumica y bioqumica.
Cepas aisladas de

Dilucin

Saccharum officinarum
IIBUV-ESP1

P( tubo 1,2,3) a

Dilucin

P( tubo 1,2,3) a

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

cultivo

cultivo

cultivo

.422

.989
.995

1:100

.028

IIBUV-ESP2

1:10

1.036

IIBUV-ESP 3

1:20

.825

1:20

.847

1:10

.622

.952

1:10

.465

1:10

.677

.677

1:100

.106

1:100

.123

IIBUV-ESP 6

.655

1:10

.359

1:10

.588

IIBUV-ESP 7

.718

.282

.168

IIBUV-ESP 8

.368

.258

.228

IIBUV-ESP 9

.127

.341

.468

IIBUV-ESP 10

.315

.324

.358

IIBUV-ESP 11

.354

.388

.263

IIBUV-ESP 12

.262

.419

.532

IIBUV-ESP 13

.293

.249

.264

IIBUV-ESP 14

.578

.540

.186

IIBUV-ESP 15

.179

.688

.775

IIBUV-ESP 4
IIBUV-ESP 5

78

P( tubo 1,2,3) Dilucin

1:10

.750

Tabla 7: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 12 cepas
bacterianas aisladas Lycopersicum esculentum, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (
se encuentran sombreadas) para la determinacin cuantitativa y cualitativa de PHAs, as como su caracterizacin
qumica y bioqumica.
Cepas aisladas de

Dilucin

P( tubo 1,2,3) Dilucin

P( tubo 1,2,3) a

Dilucin

P( tubo 1,2,3) a

Lycopersicum

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

esculentum

cultivo

cultivo

cultivo

IIBUV-ELP16

.193

.512

.425

IIBUV-ELP 17

.214

.284

.125

IIBUV-ELP 18

.026

.085

.094

IIBUV-ELP 19

.071

.084

.100

IIBUV-ELP 20

.275

.415

.435

IIBUV-ELP 21

.459

.227

.187

IIBUV-ELP 22

.196

.124

.028

IIBUV-ELP 23

.343

.381

.270

IIBUV-ELP 24

.375

.420

.123

IIBUV-ELP 25

1:20

IIBUV-ELP 26
IIBUV-ELP 27

1:10

.670

1:20

.757

1:20

.521

.597

.991

.813

.080

.672

.882

Tabla 8: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 30 cepas
bacterianas aisladas Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (
sombredas) para determinar cuantitativa y cualitativa la produccin de PHAs, as como su caracterizacin qumica y
bioqumica.
Cepas aisladas de Musa
paradisiaca

Dilucin

P( tubo 1,2,3) Dilucin P( tubo 1,2,3) a 48 Dilucin

a 24 horas de

horas de cultivo

P( tubo 1,2,3) a
72 horas de

cultivo

cultivo

IIBUV-EMP28

.993

1:20

.897

1:20

.718

IIBUV-EMP 29

.345

1:20

.453

1:20

.548

79

IIBUV-EMP 30

80

1:20

.894

1:20

.720

1:10

1.004

IIBUV-EMP 31

.093

.078

.130

IIBUV-EMP 32

.537

.567

.617

IIBUV-EMP 33

.315

.404

.095

IIBUV-EMP 34

.912

.462

.493

IIBUV-EMP 35

.039

.339

.443

IIBUV-EMP 36

.356

.184

.137

IIBUV-EMP 37

.693

.275

.105

IIBUV-EMP 38

.584

.401

.632

IIBUV-EMP 39

.241

.212

.312

IIBUV-EMP 40

.565

.161

.086

IIBUV-EMP 41

.512

.075

.118

IIBUV-EMP 42

.212

.214

.320

IIBUV-EMP 43

.400

.170

.121

IIBUV-EMP 44

.404

.228

.430

IIBUV-EMP 45

.459

.132

.301

IIBUV-EMP 46

.282

.107

.100

IIBUV-EMP 47

.614

.154

.569

IIBUV-EMP 48

.705

.169

.222

IIBUV-EMP 49

.811

.221

.334

IIBUV-EMP 50

.643

.309

.559

IIBUV-EMP 51

.415

.414

.316

IIBUV-EMP 52

.530

.532

.625

IIBUV-EMP 53

.383

.592

.598

IIBUV-EMP 54

.535

IIBUV-EMP 55

.249

1:10

.085
.271

1:10

.416
.286

IIBUV-EMP 56

.993

1.078

IIBUV-EMP 57

.561

.736

.730
1:10

.308

Tabla 9: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 11 cepas
bacterianas aisladas Citrullus lanatus,

las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas

(sombreadas) para la determinacin cuantitativa y cualitativa de PHAs, as como su caracterizacin qumica y

bioqumica.
Cepas aisladas de

Dilucin

Citrullus lanatus

P( tubo 1,2,3) Dilucin

P( tubo 1,2,3) a

Dilucin P( tubo 1,2,3) a

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

cultivo

cultivo

cultivo

IIBUV-ECP 58

.990

IIBUV-ECP 59

.275

IIBUV-ECP 60

1:10

.156

IIBUV-ECP 61

1:10

1:10

.151

1:10

.255
1:10

.288
.210

.255

1:10

.486

.120

.598

1:10

.698

IIBUV-ECP 62

.322

.352

.362

IIBUV-ECP 63

.423

.322

.288

IIBUV-ECP 64

.403

.222

.230

IIBUV-ECP 65

.192

.338

.355

IIBUV-ECP 66

.573

.257

.182

IIBUV-ECP 67

.993

1.078

.730

IIBUV-ECP 68

.561

.736

1:10

.308

81

Tabla 10: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotmetro UV/VIS a 214 nm de las 2 cepas
bacterianas aisladas N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo presentaron valores muy bajos por lo cual no se
seleccionaron para determinar cuantitativa y cualitativamente a PHAs, as como su caracterizacin qumica y
bioqumica.
Cepas aisladas de

Dilucin

P( tubo 1,2,3) Dilucin P( tubo 1,2,3) a 48 Dilucin

a 24 horas de

Nicotina tabacum L.

horas de cultivo

cultivo

P( tubo 1,2,3) a
72 horas de
cultivo

IIBUV-ENP 69

.090

.118

.130

IIBUV-ENP 70

.098

.103

.123

Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs, adems de que su
cinetica de crecimiento mostr que concentraciones relativamente mayores de PHAs fue hasta las 72 h
por lo cual no es factible.
Cepa

Gnero/

Concentracin final

Concentracin final

Concentracin final

especie

de PHAs a las 24h

de PHAs a las 48h

de PHAs a las 72 h

(g/ l)

( g/l)

(g/ l)

IIBUV-ESP1

S. putrefaciens

3.2

8.54

8.8

IIBUV-ESP4

Alcaligenes spp.

8.5

39

80.8

IIBUV-ESP6

E. spp

8.0

26

70.5

IIBUV-EMP29

Enterobacter spp.

2.55

75

121

IIBUV-EMP52

Citrobacter spp.

5.45

5.50

7.70

IIBUV-EMP53

Alcaligenes spp.

2.8

7.15

7.25

IIBUV-EMP54

Citrobacter spp.

5.75

8.5

31

IIBUV-EMP56

P. aeuroginosa

8.56

8.62

8.15

IIBUV-EMP57

E. aerogenes

4.45

8.18

23.5

IIBUV-ELP25

P. pseudomallei

8.5

20.5

42.5

IIBUV-ELP26

S. putrefaciens

7.20

8.52

8.25

IIBUV-ELP27

E. hormaechei

.8

8.08

8.39

IIBUV-ECP58

A.denitrificans

8.45

7.5

22.5

IIBUV-EMC61

E. gergovice

4.5

7.25

80.9

82

Figura 14 a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa E. hormaechei , aislada de S. officinarum utilizados
para la lectura en el espectrofotmetro UV/VIS A 214 nm, por el mtodo espectrofotomtrico de Law y Slepecky
(1961) modificado por Martnez et al., 2004 .

Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31 aislada de M. paradisiaca ( no

seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotmetro UV/VIS A 214 nm, por el mtodo
espectrofotomtrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martnez et al., 2004

83

X.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Aldor, L., y Keasling, J.D. (2003). Process design for microbial plastic factories: metabolic engineering of
polyhydroxyalkanoates. Current Opinion in Biotechnol. 14: 475-483
2. ANIPAC

(2006).

Asociacin

Nacional

de

Industrias

del

Plstico

A.C.

En

lnea:

www.anipac.com.mx/anipac06/index.php
3. Arshad U. M., Jamil. N., Naheed N. y Hasnain, S. (2007). Analysis of bacterial strains from contaminated
and non-contaminated sites for the production of biopolymers. African Journal of Biotechnology Vol. 6,
No. 9: 1115-1121
4. Barbosa, M., Espinosa, H. A. y Malagn, R. D. (2005). Produccin de Poli--hidroxibutirato (PHB) por
Ralstonia eutropha ATCC 17697. Rev. Facultad de Ciencias. Vol.10, No.1. pp. 45-54
5. Berlanga, M., Montero, T. M., Hernndez, J. y Guerrero, R. (2006). Rapid spectrofluorometric screening of
poly-hydroxyalkanoate-producing bacteria from microbial mats. Int. Microbiol. Vol. 9:95-102
6. Cain, R. B. (1992). Microbial degradation of synthetic polymers. In: Frey et al. (eds) Microbial Control of
Pollution. 48th Symposium of the Society for general microbiology at University of Cardiff, pp. 293-338.
7. Cabello, F. (2007). Cultivo en birreactores de Rhodospirillum rubrum en condiciones fotoheterotrficas.
Tesis Doctoral. Universitat Autnoma de Barcelona. Pp. 1-351
8. Carballo, M. E., Iglesias, Martnez, J., Solano, R., Fernndez, A., y Villaverde, M. J. (2003) Evaluacin de
la produccin de polihidroxialcanoatos por cepas bacterianas marinas. Vol.17. No.1:52:58
9. Carminatti, C., Messana, F. E., Zanchet, M. C., y Pinheiro, R. V. (2006). Producao de Polihidroxialcanoatos
(PHAs). Engenharia Bioquimica. pp: 1-25
10. etin, D., Gndz, U., Eroglu, I., Ycel, M., y Trker, L. (2006). Poly-b hydroxybutyrate accumulation
and releasing by hydrogen producing bacteria, Rhodobacter sphaeroides O.U.001. A transmission electron
microscopic study. Afr. J. Biotechnol. Vol. 5, No. 22: 2069-2072
11. Chen, G. Q. y Page, W. J.(1997) Production of poly-b hydroxybutyrate by Azotobacter vinelandii in a twostage fermentation process. Biotechnology Techniques, Vol. 11, No 5: 347350
12. Cho, K. S., Ryu, H. W., Park, C. H. y Goodrich, P. R. (1997). Poly (hydroxybutyrate- co-hydroxyvalerate)
from swine waste liquor by Azotobacter vinelandii UWD. Biotechnol. Lett. 19:710.
13. Choi, I.J. y Lee, S.Y. (1999). High-level production of Poly (3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyvalerate) by
Fed-Batch Culture of Recombinant Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., Vol.65, No. 10: 4363-4368
14. Cowan, S. T. y Steel, K. J. (1993). Manual for Identification of Medical Bacteria. Cambridge 3a. de G. I.
Barrow. 351 p.
15. Cullimore, D. R. (2000). Practical Atlas for Bacterial Identification. Lewis Publishers. pp. 209
16. De Almeida, A., Ruz, J. A., Lpez, N. I., y Pettinari, M. J. et al. (2004). Bioplsticos: una alternativa
ecolgica. Qumica Viva. No.3. pp.122-133
17. De Lima, T, Breno, M, Christina B (1999). Bacteria isolated from sugarcane agro ecosystem: their potential
production of polyhydroxyalkanoates and resistance to antibiotics. Rev. Microbiol. 30: 241-224

84

18. Diario Oficial de la Unin Europea. (1997) .Decisin de la Comisin de 9 de Septiembre de 1997 por la que
se establece un mtodo provisional de pruebas para el diagnostico, deteccin e identificacin de
Pseudomonas solenacerum (Smith) Smith en las patatas. pp-0001-0025.
19. Durner, R., Zinn, M., Witholt, B. y Egli, T. (2001). Acumulation of poly [( R)-3-hydroxyalkanoates ] in
Pseudomonas oleovorans during growth in Batch and Chemostat culture with different carbon sources.
Biotechnology and Bioengineering. 72:278-288.
20. Ewering, C., Ltke-Eversloh, T., Luftmann, H. y Steinbchelet, A. (2002). Identification of novel sulphurcontaining bacterial polyesters: biosynthesis of poly(3-hidroxy-S-propyl--thioalkanoates) containing
thiother linkages in the side chins. Microbiology.148:1397-1406.
21. Floccari, M. E., Lpez, N. I., Mndez, B. S, Pieper-Frst, U. y Steinbchel A. (1995). Isolation and partial
characterization of Bacillus megaterium mutants deficient in poly (3-hydroxybutyrate) synthesis. Can. J.
Microbiol. 41:7779.
22. Franchetti, S.M., y Marconato, J.,C. (2006). Polmeros biodegradveis- uma solucao parcial para disminuir
a quantidade dos residuos plsticos. Qum. Nova. Vol.29, No.4
23. Fras, A.C., Lema, I.I., y Gaviln, A. (2003). La situacin de los envases de plstico en Mxico. Rev.
Gaceta ecolgica. No. 69: 67-82
24. Galindo, R. P. (2007). Estudio de mutantes de Burkhloderia sacchari incapaces de crecer en propianato
(prp) y afectados en el uso de intermediarios de la -oxidacin de este substrato. Trabajo de grado para
obtener el ttulo de Microbiloga Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. D.C. pp. 1-62
25. Gerngross, T.U., Reilly, P., Stubbe, J., Sinskey, A.J., and Peoples, O.P. (1993). Immunocytochemical
analysis of poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) synthase in Alcaligenes eutrophus H16, localization of the
synthase enzyme at the surface of PHB granules. J. Bacteriol. 175, 52895293.
26. Gmez , J.G.C., Rodrguez, M.F.A., Alli, R.C.P, Torres, B.P., Bueno, C. L., Oliviera y Silva, L.F. (1996).
Evaluation of soil Gram negative bacteria yielding polyhydroxyalkanoic acids from carbohydrates and
propionic acid. Appl. Microbiol, Biotechnol. 45: 785-791.
27. Gmez E.U. (2005). Aislamiento, Identificacin y caracterizacin del agente causal del moko de pltano,
Ralstonia solanacearum raza 2, proveniente de plantaciones afectadas en Colombia. Tesis para obtener el
grado de Microbilogo Agrcola. pp. 1-93
28. Haywood, G. W., A. J. Anderson, D. F. Ewing, and E. A. Dawes. (1990). Accumulation of a
polyhydroxyalkanoate containing primarily 3-hydroxydecanoate from simple carbohydrate substrates by
Pseudomonas sp. Strain NCIMB 40135. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 56 No 11 :33543359.
29. Hendricks Bergey, D. y Holt, J. G. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9 edicin.
Publicado por Lippincott Williams and Wilkins. 1054 p.
30. Jendrossek, D., Selchow O. y Hoppert M.(2006). Poly (3-Hydroxybutyrate) Granules at the Early Stages of
Formation Are Localized Close to the Cytoplasmic Membrane in Caryophanon latum. Vol. 73. No 2: 586593.

85

31. Jurasek, L., and Marchessault, R.H. (2004). Polyhydroxyalkanoate (PHA) granule formation in Ralstonia
eutropha cells: a computer simulation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 611617.
32. Khanna S, Srivastava A (2005). Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochem.
40: 607-619.
33. Hermida E. B. y Daz, G. (2004). Cambios microestructurales durante la cristalizacin de polisteres
biodegradables. CONGRESO CONAMET/SAM. pp-1-4
34. Hezayen, F.F., Steinbchel, A., and Rehm, B.H.A. (2002). Biochemical and enzymological properties of the
polyhydroxybutyrate synthase from the extremely halophilic archaeon strain 56. Arch. Biochem.
Biophys.403, 284291.
35. Katirciogli, H., Aslim, B., Yksekdao, Z. N., Mercan, N. y Beyatli, Y. (2003). Production of poly-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation of putative Bacillus mutant stranis by SDS-PAGE of total cell
protein. Afr. J. Biotechnol. Vol. 2, No. 6: 147149.
36. Klinke, S., Dauner, M., Scott, G., Kessler, B y Witholt, B. (2000). Inactivation of Isocitrate lyase leads to
increased production of medium-chain- length poly(3-hydroxyalkanoates) in Pseudomona putida. Appl.
Environ. Microbiol., Vol.66, No.3: 909-913
37. Koneman, E. W., Allen, S. D., Dowell, V. R., Janda, W. M., Sommers, H. M. y Winn, W. C. (1998).
Diagnstico microbiolgico: Texto y atlas a color. Editorial Mdica Panamericana. 3 edicin. Mxico, D.
F. 909p
38. Lakshman, K. y Ramachandriah, T. (2003). Enhanced biosynthesis of polyhydroxyalkanoates in a mutant
strain of Rhizobium meliloti. Biotechnology Letters 25: 115119..
39. Lasala F. et al. (2004a) Produccion de Polihidroxialcanoatos en bacterias Diazotrofas. Influencia de la
aeracin en la sntesis de poli- -hidroxybutirato en Azospirillum brasilence CEPA 7.Biologia. Vol.18,
No.1, pp 87-95
40. Lasala, F., Martinez, J., Nuez, R., Rozsa, C., Galego, N., Carballo, M., A. y Solano, R. (2004b).
Produccin de polihidroxialcanoatos (PHA) por bacterias diaztrofas II. Estudio de la sntesis a escala de
zaranda con Mesorhizobium plurifarium (4033). Rev. Biologa. Vol. 18, No. 2: 136-146
41. Luzier, W. D. (1992) Materials derived from biomass biodegradable materials. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
89: 839-842.
42. MacFaddin, J. (2003). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica.
Editorial Medica Panamericana S. A. 3 edicin. Buenos Aires, Argentina. 850 p.
43. Madison L. L. y Huisman,G. (1999) Metabolic Engineering of Poly(3 Hydroxyalkanoates): From DNA to
Plastic. Microbiol. Mol. Biol.Rev. Vol. 63. No. 1: 21-53
44. Mandon, K., Reydellet, N. M., Encarnacin, S., Kaminski, A.P.,, Leija, A., Cevallos, A., Elmerich,C., y
Mora, J. (1998) Poly-b-Hydroxybutyrate Turnover in Azorhizobium caulinodans Is Required for Growth
and Affects nifA Expression. Journal of Bacteriology. Vol.180, No19:5070-5076

86

45. Martnez J. et al. (2004). Produccin de Polyhidroxialcanoatos en bacterias diazotrofas. 1. Influencia de la

aeracin en la sntesis de poli--hidroxibutirato en Azospirillum brasilense cepa 7. Revista Biologa. Vol.18,
No.1.pp.87-95
46. McCool, G.J., and Cannon, M.C. (2001). PhaC and PhaR are required for polyhydroxyalkanoic acid
synthase activity in Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 183:4235 4243.
47. Merino, L.A. (2007). Pseudomonas aeruginosa: una bacteria con personalidades mltiples. Rev. Arg.
Microbiol.39:143.
48. Moreno, N., Gutirrez, I., Malagn, D., Grosso, V., Revelo, D., Surez, D., Gonzlez, J., Aristizbal, F.,
Espinosa, A. y Montoya, D. (2007) Bioprospecting and characterization of poly-bhydroxyalkanoate (PHAs)
producing bacteria isolated from Colombian sugarcane producing areas. Afr. J. Biotechnol. Vol. 6, No. 13:
1356-1343.
49. Moreno, S. A.,

Malagn, D., Cortzar, J., y Hernndez, E. (2006). Recuperacin de poli--

hidroxihexanoato-co-octanoato sintetizado por Pseudomonas putida mediante el uso de dispersiones

hipoclorito cloroformo. Rev. Fac. Ciencias. Vol. 11, No.1: 41-48
50. Navarrete, A., Peacock, A., Macnaughton, S.,J., Urmeneta, J., Mas-Castella, J., White, D.,C. y Guerrero, R.
(2000). Physiological status and community composition of microbial mats of the Ebro Delta, Spain, by
signature lipid biomarkers. Microb Ecol. Vol.39:92-99
51. Niamsiri, N., Delamare, S.C., Kim, Y. R. y Batt, C.A.

(2004). Engineering of Chimeric Class II

Polyhydroxyalkanoates Synthases. Appl. Environ. Microbiol., Vol.70, No. 11: 6789-6799.

52. Ojumu, F.V., Yu, J., y Solomon, B.O. (2004). Production of Polihydroxyalkanoate, a bacterial
biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology. Vol.3. No. 1:.18-24.
53. Pandolfi, D y Pons, M. N. (2007). Characterization of PHB storage in activated sludge extended
filamentous bacteria by automated color image analysis. Biotechnol. Letters. 29: 1263-1269
54. Park, S. J., Park, P. J. Y Lee, Y. (2001) Production of poly (3-hydroxybutyrate) from whey by fed-batch
culture of recombinant Escherichia coli in a pilot-scale fermenter. (2001) Biotechnol. Letters. 24:185-189
55. Page, W. J., Manchak, J. y Brent, R. (1992). Formation of Poly (Hydroxybutyrate-Co-Hydroxyvalerate) by
Azotobacter vinelandii UWD. Appl. Environ. Microbiol. Vol.58, No. 9:2866-2873.
56. Page, W.J.,Bhanthumnavin, N. y Manchak, J. (1997). Production of poly(-hydroxyvalerate) copolymer
from sugars by Azotobacter salinestris. Appl. Microbiol. Biotechnol.48: 88-93
57. Peoples, O. P., y Sinskey, A. J. (1989). Poly-b-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis in Alcaligenes
eutrophus H16. Identification and characterization of the PHB polymerase gene (phbC). J. Biol. Chem.
264:1529815303
58. Peters, V., y Rehm, B.H.A. (2005). In vivo monitoring of PHA granule formation using GFP-labeled
PHAsynthases. FEMS Microbiol. Lett. in press. 248: 93-100
59. Pichardo, A. E., Bale, M., Cannon, H.W. y Matsen, J.M.

(19881). Identification of Pseudomonas

aeuroginosa by Pyocyanin Production on Tech Agar. J. Clinical. Microbiol. Vol. 13, No3: 456-458.

87

60. Poirier, Y, Nawrath C,

y Somerville C. (1995). Production of polyhydroxyalkanoates, a family of

Biodegradable plastics and elastomers, in bacterial and plant. Biotechnol. 13: 142-150
61. Ptter, M., Muller, H., y Steinbchel, A. (2005). Influence of homologous phasins (PhaP) on PHA
accumulation and regulation of their expression by the transcriptional repressor PhaR in Ralstonia eutropha
H16. Microbiology 151: 825833.
62. Qi, Q., y Rehm, B.H.A. (2001). Polyhydroxybutyrate biosynthesis in Caulobacter crescentus: molecular
characterization of the polyhydroxybutyrate synthase. Microbiology 147:33533358.
63. Quagliano, J.C., y Miyasaky, S.S. (1997). Effect of aeration and carbon/nitrogen ratio on the molecular
mass of the biodegradable polymer poly-b-hydroxybutyrate obtainedfrom Azotobacter chroococcum 6B.
Appl Microbiol Biotechnol 48: 662-664
64. Ramsay, B. A., Ramsay, J.A. y Cooper, D.G. (1988). Production of Poly-.Hydroxyalkanoic Acid by
Pseudomonas cepacia. Appl. Environ. Microbiol.Vol.55, No.3: 584-589
65. Rehm, B.H.A. (2003). Polyester synthases: naturalcatalysts for plastics. Biochem. J. 376, 1533
66. Rivard C, Moens L, Roberts K, Brigham J, Kelley S (1995). Starch esters as biodegradable plastics: Effects
of ester group chain length and degree of substitution on anaerobic biodegradation. Enzyme and Microbial
Tech. 17: 848-852
67. Rojas, R. O., Villafaa, R.,J., Gonzalez, R.,O., y Nungaray A. (2006). Anlisis de rutas metabolicas en
Pseudomonas aeuroginosa para la produccin de polihidroxialcanoatos a partir de glucosa usando modos
elementales. e-Gnosis. Vol. 4, No. 12: 1-29
68. Segura, D., Noguez, R., y Espin, G. (2007). Contaminacin ambiental y bacterias productoras de plsticos
biodegradables. Rev. Biotecnol.. Vol. 14. No. 361: 361-372.
69. Sheu, D. S., Wang, Y. T. y Lee, C.Y. (2000). Rapid detection of polyhydroxyalkanoate-acumulating
bacteria isolated from the enviroment by colony PCR. Microbiology. 146: 2019-2025.
70. Steinbchel, A. y Fuchtenbusch, B. (1998). Bacteria and other biological systems for polyester production.
TIBTECH, 16: 419-427.
71. Stubbe, J., y Tian, J. (2003). Polyhydroxyalkanoate (PHA) homeostasis: the role of PHA synthase. Nat.
Prod. Rep. 20, 445457.
72. Sudesh K, Abe H, y Doi, Y. (2000). Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates:
biological polyesters. Prog. Polym. Sci. 25: 1503-1555.
73. Tian, J., Sinskey, A. j., y Stubbe, J. (2005) Kinetic Studies of Polyhydroxybutyrate Granule Formation in
Wautersia eutropha H16 by Transmission Electron Microscopy. J. Microbiol. Vol.187. No.11.3814-3824
74. Wang, F.

y Lee, Y. S. (1997). Production of Poly (3-Hydroxybutyrate) by Fed- Batch Culture of

Filamentation- Suppresed Recombinant Escherichia coli. Vol. 63. No 12: 4765-4769.

75. Zinn M, Witholt B, Egli T (2001). Occurrence, synthesis medical application of bacterial
polyhydroxyalkanoate. Adv. Drug. Rev. 53: 5-21.

88

89

90