Trayendo una enzima de vuelta a la vida:

Alrededor de 1950, cientficos se dieron cuenta de que el ADN sostiene el cdigo

que permite a las protenas ser sintetizadas. No obstante, l como una cadena de
amino cidos se pliega en una protena completamente funcional, con la apropiada
estructura tridimensional, an sigue siendo un misterio. Un mecanismo debe existir
para asegurar el correcto plegamiento de las protenas. Pero de donde vino esta
informacin? En 1957, Christian Anfinsen public la primera evidencia de que la
informacin sobre el correcto plegamiento se encuentra dentro de la protena.

Tema de fondo:
Las protenas estn hechas de 20 combinaciones de amino cidos que luego se
pliegan en estructuras ms complejas. El despliegue de la cadena de amino
cidos se llama la estructura primaria. Para tener actividad biolgica, la protena
se debe plegar en estructuras secundarias y terciarias. Estas estructuras se
mantienen unidas por las interacciones qumicas entre las cadenas laterales de los
amino cidos, incluyendo puentes de hidrogeno, interacciones hidrofobias y a
veces, enlaces covalentes. Como se forman estas grandes estructuras ha sido
siempre un misterio. Se pliega correctamente la protena as como se sintetiza o
requiere la accin de otras protenas para plegarse correctamente? Se puede
plegar completamente por si sola?
En 1950, Anfinsen fue un bioqumico interesado en el correcto plegamiento de
protenas. En especifico, el estaba investigando la formacin de puentes de
disulfuro, que son enlaces covalentes entre las cadenas laterales de la cistena
que sirven como una de las principales uniones para mantener unida la
estructura de las protenas secretadas. El crea que la protena en si contena
toda la informacin necesaria para que la protena se plegara. El propuso "La
hiptesis de la termodinmica", la cual dice que la estructura biolgicamente
activa de una protena era tambin la ms estable termodinmicamente en
condiciones vivas. En otras palabras, si las condiciones intracelulares pudieran
ser imitadas en un tubo de ensayo, un protena naturalmente podra plegarse
de forma activa. Comenz su trabajo en una enzima ya secretada, la
ribonucleasa pancretica bovina, y estudi su capacidad para plegarse
correctamente fuera de la clula.

El experimento:
Las protenas realizan una amplia variedad de funciones en la clula.
Independientemente de su funcin, una protena debe estar correctamente
plegada para llevar a cabo su funcin biolgica. Para estudios de plegamiento de
protenas es mejor estudiar una enzima cuya actividad biolgica pueda ser
fcilmente monitoreada en un proceso in vitro. Anfinsen eligi una pequea
protena ya secretada, la enzima ribonucleasa la cual poda controlar su
plegamiento fcilmente, pudiendo analizar la habilidad de catalizar los
segmentos de ARN.

Ribonucleasa, una protena secretada, est activa bajo condiciones oxidantes

in vitro. La estructura terciaria de la ribonucleasa activa se mantiene unida por
cuatro puentes de disulfuro. Agregando un agente reductivo el cual reduce los
enlaces de disulfuro entre las dos cadenas laterales de cistena a dos grupos
sulfhidrilos libres que pueden interrumpir la interaccin de los enlaces covalentes.

Para desnaturalizar completamente a la ribonucleasa se requiere el tratamiento

de un agente reductor. Anfinsen monitore la reduccin de rubonucleasa
midiendo el nmero de grupos sulfhidrilos que quedaron libres en la protena.
En el estado de oxidacin, no hay presente grupos de sulfhidrilos libres en la
ribonucleasa porque cada residuo de cistena est envuelto en un puente de
disulfuro. Por otra parte, en el estado completamente reducido la ribonucleasa
contiene grupos de sulfhidrilos libres. Anfinsen aprovech esta diferencia para
evaluar el grado de reduccin mediante un ensayo espectrofotomtrico para
contar el nmero de grupos sulfhidrilos.
Para estudiar el pliegue de la protena afuera de la clula, primero se debe
desnaturalizar la protena. Las protenas son fcilmente desnaturalizadas
usando calor, disrupcin mecnica como agitar, y tratamientos qumicos. Las
protenas con puentes de disulfuro requieren una medida adicional de
tratamiento con un agente reductor para romper los enlaces covalentes. Para
desnaturalizar la ribonucleasa, Anfinsen primero redujo los puentes de disulfuro
con cido tiogliclico. Luego la protena es desnaturalizada mediante una alta
concentracin de urea y se dej incubar la solucin a temperatura ambiente. El
demostr que con este tratamiento haca inactiva a la enzima, mostrando que la
ribonucleasa ahora era incapaz de catalizar los segmentos de ARN. Utilizando el
ensayo espectrofotomtrico, se lleg a demostrar que la ribonucleasa inactiva
contena 8 grupos sulfhidrilos, que representaban los 4 puentes de disulfuro
rotos. Con la completa reduccin y la protena desnaturalizada en sus manos,
Anfinsen se pregunt: Puede una enzima desnaturalizada realizar

correctamente pliegues in vitro si se activa de nuevo? . Para encontrar esta

respuesta, Anfinsen permiti una solucin reducida de ribonucleasa desnaturalizada
oxidarse. Removi la urea de la enzima desnaturalizada mediante precipitacin.
Luego suspendi a la ribonucleasa libre de urea en una solucin reguladora y la
incubo durante dos a tres das. La exposicin a oxigeno molecular en la atmosfera
oxid los residuos de cistena. A partir de esto, Anfinsen compar la actividad de la
ribonucleasa re naturalizada a la de una enzima normal. En los experimentos
iniciales, entre el 12% y el 19% de las protenas que fueron inactivadas fueron
capaces de catalizar segmentos de ARN. Las protenas fueron agregadas a altas
concentraciones, lo que les hace difcil para ellas plegarse correctamente. Al
disminuir la concentracin total de la ribonucleasa en la disolucin, Anfinsen demostr
que hasta el 94% de las protenas podran ser replegadas. (Ver Tabla). La enzima se
doblo de nuevo a su conformacin activa fuera de la clula, lo que demuestra que la
informacin para el plegamiento de la protena est contenida en ella misma.

Concentracin de protena (mg/ml)

Porcentaje
de
actividad
en
la
concentracin en equivalente a la de
una ribonucleasa negativa (mg/ml)

7.0
4.8
2.3
0.9
0.35

31%
70%
75%
77%
94%

Discusin:

A travs de cuidadosos experimentos, Anfinsen demostr que la informacin

requerida para plegar correctamente una protena est contenida en su secuencia
primaria. Su cuidadoso analisis de la qumica de este proceso respondi una
pregunta primordial en la biologa. El continu demostrando el re plegamiento
libre de clulas de otras enzimas, incluyendo las protenas que carecen de
puentes de disulfuro. Aunque es posible doblar correctamente un numero de
protenas fuera del medio celular, este proceso se acelera enormemente "in vivo"

por un numero de enzimas. A pesar de la hiptesis de termodinmica no se

mantiene cierta para todas las protenas, la demostracin de Anfinsen sobre el
repliegue de clulas libres de la ribonucleasa hizo una marca en el campo de la
bioqumica. En 1972, recibi el Premio Nobel de Qumica por su Trabajo .