3

22
2
Transporte de Frmacos
2.1
Dendrmeros
2.1.1
Carreadores de Medicamentos
Nanopolmeros carreadores de frmacos so uma grande promessa nos dias
atuais por transportarem medicamentos at o alvo de interesse, diminuindo assim
os efeitos colaterais (Hannah et al., 2007) (Frchet, 2005) (Emmanuele, 2005)
(Ding et al., 2012).
Uma analogia pode ser feita com a guerra entre os antigos troianos e gregos.
Nesta guerra um grande cavalo de madeira foi construdo pelos gregos e
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presenteado aos troianos. A estratgia era o fato de o cavalo ter escondido em seu
interior soldados gregos que, assim, conseguiram entrar em Tria sem que os
soldados troianos oferecessem resistncia. To logo os soldados troianos
adormeceram os inmeros soldados gregos saram do cavalo e a batalha foi
facilmente vencida pelos gregos. Deste modo funciona um nanotransportador,
liberando de forma controlada vrias molculas do medicamento no alvo
desejado. Devido a este fato podemos citar algumas de suas vantagens:
1) Aumentam a atividade teraputica por liberarem a droga no local
indicado;
2) Prolongam a atividade da droga no organismo por tornarem possvel a
sua liberao de forma controlada;
3) Reduzem a toxicidade por reduzirem o metabolismo da droga, evitando
que atinja rgos no desejados.
O mecanismo de entrega da droga depende das caractersticas do
nanotransportador e do alvo de ao podendo ser utilizadas as vias normais de
administrao para a insero destes carreadores no organismo como, por
exemplo, nasal, oral, vaginal, retal, intradrmica, transdrmica e intravenosas.
23
2.1.2
Dendrmeros
O termo dendrmero derivado das palavras gregas dendrom e mero que
significam rvore e partes, respectivamente.
A sntese do dendrmero feita a partir de um ncleo polifuncionalizado, s
camadas, atravs de reaes repetitivas que multiplicam a cada etapa, o nmero de
grupamentos funcionais da superfcie, formando as geraes de nmeros
crescentes (Majoros, 2008) (Walter & Michael, 2012). Dependendo do ncleo,
tendem a uma geometria esfrica que possui cavidades no seu interior e uma
superfcie altamente funcionalizada.
Nos dendrmeros, podem ser identificadas trs regies distintas: o ncleo, o
interior e a superfcie como indica a figura 1. A geometria e reatividade dos
dendrmeros so definidas pela escolha das funes qumicas que iro compor
estas trs regies.
Figura 1: Representao esquemtica das partes de um dendrmero

(ncleo, interior e superfcie).
24
Figura 2: Representao esquemtica da estrutura do dendrmero.
Alguns
tipos
de
dendrmeros
so
comercializados
por
empresas
especializadas como, por exemplo, os dendrmeros do tipo PAMAM pela empresa

Dendritech, do tipo poli(propilenoimina), PPI, tambm chamado de Astramol ou
DAB-Am-X, comercializados pela SyMO e dendrmeros do tipo polister
comercializados pela POLYMER FACTORY Figura 3, a, b e c, respectivamente).
Todos estes dendrmeros so comercializados com diferentes tipos de ncleo e
grupos de superfcie.Esta grande variedade de grupos funcionais e ncleos dos
dendrmeros fazem com que estas estruturas possam ser usadas para uma vasta
gama de aplicaes.
(a)
25
(b)
(c)
Figura 3: Representao de dendrmeros com diferentes caractersticas.
2.1.3
Dendrmeros PAMAM
Os dendrmeros do tipo PAMAM poli(amidoamina), foram os primeiros a
serem sintetizados, em 1983 por Donald A.Tomalia (Tomalia, Poly(amidoamine)
(PAMAM) dendrimers: from biomicry to drug delivery and biomedical
applications, 2001).
Tomalia utilizou o mtodo denominado divergente, ou seja, partindo de um
ncleo polifuncionalizado (amnia, etilenodiamina, por exemplo) e adicionando
camadas atravs de reaes repetitivas, formando as geraes crescentes G1, G2,
G3.
26
Figura 4: Dendrmero de Gerao 1. Fonte: (Prabal, 2005).
O crescimento do dendrmero PAMAM limitado pelo congestionamento

da superfcie, quando nenhuma reao adicional possvel devido ao
impedimento estrico. A maior gerao alcanada a gerao 10 (G10). O quadro
da Tabela 1 ilustra o nmero de grupamentos da superfcie, peso molecular e
dimetro das geraes crescentes do dendrmero PAMAM.
Figura 5: Representao de um dendrmero PAMAM de gerao 10.
27
N DA
GERAO
PM
0,5
1.269
1,0
1.429
1,5
2.935
2,0
3.256
2,5
6.011
3,0
6.909
3,5
12..419
4,0
14.215
4,5
26.258
5,0
28.826
5,5
50.865
58.048
7
8
N DE GRUPOS
AMINO
NA SUPERFCIE
DO DENDRMERO
DIMETRO
MDIO (A)
22
16
29
32
36
64
40
128
53
256
67
116.493
512
81
233.383
1024
97
467.162
2048
10
934.720
4096
N DE GRUPOS
CARBOXILA
NA SUPERFCIE
DO
DENDRMERO
8
16
32
64
128
256
135
Tabela 1: Tabela representativa das propriedades do dendrmero PAMAM.
2.1.4
Matemtica do Dendrmero PAMAM
O nmero de ligaes covalentes existentes em cada gerao, bem como o
nmero de aminas primrias terminais ou de aminas tercirias e amidas do interior
do dendrmero PAMAM podem ser calculadas a partir de frmulas propostas por
Tomalia (Tomalia, 2001).
1) Nmero de grupos na superfcie

(1)
2) Nmero de ligaes covalentes formadas a cada gerao
(2)
3) Nmero de aminas Tercirias
28
(2)
Onde
o nmero de tomos do ncleo,
que partem de cada brao, G a gerao.
o nmero de ramificaes
nmero de aminas tercirias no ncleo.
2.1.5
Propriedades Estruturais
A sntese do dendrmero PAMAM feita a partir de um ncleo
poliaminado, atravs de duas reaes subsequentes, reao com acrilato de metila
seguida da reao com etilenodiamina, onde a segunda reao responsvel pela
duplicao da funcionalidade como mostra a Figura 6.
Figura 6: Reaes sucessivas da formao do dendrmero PAMAM.
As geraes de nmero inteiro crescentes, G0, G1, G2, etc, so terminadas

em aminas primrias. Quando a sntese interrompida na primeira reao, com
acrilato de metila, o dendrmero denominado de meia gerao, G 0,5 - G1, 5,
etc.
29
O nmero de grupamentos amina na superfcie dobra a cada nova gerao

sendo que o dendrmero PAMAM tem acrscimo de 1nm em dimetro a cada
gerao (Kitchens et al., 2004) (Labieniec et al., 2009).
A geometria esfrica dos dendrmeros PAMAM leva formao de
cavidades no seu interior onde podem ser encapsuladas pequenas molculas (Babu
et.al, 2010). Estas cavidades so formadas por amidas e aminas tercirias, um
ambiente menos polar do que a superfcie, formada por aminas primrias nas
geraes inteiras. As molculas que podem ser encapsuladas nestas cavidades
dependem menos do seu tamanho e mais da interao qumica destas molculas
com o ambiente qumico das cavidades. A caracterstica anfiflica de sua estrutura
faz tambm com que os dendrmeros PAMAM sejam solveis em meio aquoso e
em alguns solventes orgnicos (metanol, DMSO, por exemplo).
A grande reatividade das aminas primrias da superfcie do PAMAM e a
menor reatividade dos demais grupamentos funcionais presentes no seu interior,

permite que sejam feitas alteraes na superfcie sem que o interior seja
modificado. Desta forma os dendrmeros PAMAM podem funcionar como
excelente plataforma para construo de novos materiais.
Quando se trata de aplicaes biolgicas, modificaes na superfcie do
dendrmero PAMAM so geralmente feitas com diferentes objetivos como, por
exemplo, para alterar a solubilidade, diminuir a toxicidade, para fixar uma droga
na produo de um conjugado para atuar como uma pr-droga ou na fixao de
molculas alvo.
Como ilustrao, podemos citar dois exemplos que tm levado a bons
resultados dentro do que estava sendo proposto com a modificao da superfcie
do dendrmero.
O primeiro deles, trata-se da modificao da superfcie do PAMAM com o
objetivo de otimizar uma das importantes propriedades destes dendrmeros, a
facilidade em atravessar membranas celulares, propriedade esta utilizada na
transfeco de genes. A superfcie do dendrmero PAMAM de gerao 4 foi
modificada com os aminocidos hidrofbicos a L-fenilalanina e leucina e foram
formados complexos com o DNA em pH neutro. Foi verificado que o conjugado
com L-fenilalanina apresentou um aumento considervel na capacidade de
transfeco de genes (Kono et al., 2005).
30
Figura 7: Dendrimero PAMAM de gerao 4, Adaptado de (Kono et al., 2005).
Outro importante estudo avaliou a citotoxicidade de dendrmeros PAMAM

modificados em sua superfcie com polietilenoglicol (PEG-dendrmeros)(Zhang et
al, 2011). Este estudo mostrou atravs de testes in vitro que a droga doxorubicina,
um frmaco para tratamento de tumores no crebro, tem sua toxicidade reduzida

comparada aesta droga conjugada a outros tipos de polmeros. Estes resultados
tornam dendrmeros PAMAM a serem importantes agentes para quimioterapia
envolvendo tumores no crebro.
Alm destes importantes exemplos, os dendrmeros PAMAM so
biocompativeis, sendo que possuem semelhanas qumicas com protenas. As
geraes G4 ou maiores se assemelham em tamanho a pequenas molculas
biolgicas globulares, como a insulina (3nm), citocromo C (4nm) e a
hemoglobina (5,5nm). Seu tamanho tambm compatvel com o tamanho das
bicamadas lipdicas celulares, como mostra a Figura 8.
Figura 8: Propriedades estruturais dos dendrmeros PAMAM.
31
Estas caractersticas estruturais, alm da razovel biocompatibilidade e

solubilidade, permitiram que o dendrmero PAMAM fosse o dendrmero mais
utilizado em aplicaes biolgicas at a atualidade (Karatasos et al., 2009),
(Labieniec et al., 2009).
2.1.6
Dendrmeros como Nanocarreadores
Quando uma droga entra no organismo, este comea imediatamente a
process-la: absoro, distribuio, metabolismo e excreo. A absoro a
transferncia do seu local de administrao para o local de ao. No caso de
preparaes slidas, a absoro depende inicialmente da dissoluo do
comprimido ou cpsula que ento libera o frmaco. Aps a absoro ou
administrao sistmica para a corrente sangunea, o frmaco se distribui para os
lquidos intersticiais e intracelulares. A excreo ocorre eliminando os frmacos

sem qualquer alterao ou transformando este em um metablito. O rim o
principal rgo para a eliminao do frmaco e seus metablitos. A excreo
atravs das fezes se d por frmacos ingeridos oralmente que no foram
absorvidos ou frmacos excretados pela bile. A excreo pulmonar importante
para a eliminao de gases txicos.
Os frmacos so liberados em regies que no so o seu alvo de ao,
diminuindo a sua biodisponibilidade tornando necessria a administrao de uma
quantidade maior do que a suficiente da droga para manter a dose teraputica.
Uma alternativa para contornar estes problemas a utilizao dos
denominados sistemas de liberao controlada. Diferentemente de sistemas de
liberao imediata (comprimidos, cpsulas) este sistema libera de forma gradual
quantidades especficas de um frmaco por um maior perodo de tempo(Pandit,
2008). Suas principais vantagens so:
Menor freqncia de doses;
Melhor eficcia e menor efeito colateral, por liberar o frmaco diretamente
no local de ao;
Melhor adeso do paciente ao tratamento por este tomar um menor nmero
de doses;
32
Proteger o medicamento no trnsito do organismo at este atingir o alvo

desejado;
Reduzir toxicidade.
Os dendrmeros PAMAM possuem caractersticas que os tornam

nanocarreadores ideais. Drogas podem ser encapsuladas no seu interior, reduzindo
assim sua toxicidade, melhorando a solubilidade e protegendo-as da
decomposio no trnsito pelo organismo. Direcionadores podem tambm ser
ligados covalentemente sua superfcie, de tal forma a conduzir a droga a um alvo
especfico. Sua superfcie pode ser modificada de forma a possibilitar o controle
da liberao da droga.
Alm destas propriedades, os dendrmeros PAMAM so biocompatveis,
apresentando toxicidade controlvel, no so imunognicos e apresentam
bioeliminao ou biodegradabilidade aceitveis. Possuem adeso celular

apropriada, capacidade de sofrer endocitose e trfego intracelular para permitir a
liberao da droga no citoplasma ou no ncleo.
2.1.7
Interaes entre Dendrmeros e Drogas
O transporte de drogas utilizando dendrmeros PAMAM como
nanocarreadores pode ser feito atravs do encapsulamento da droga no interior do
dendrmero, formando os chamados complexos, ou ligando-se a droga
covalentemente superfcie do dendrmero, formando conjugados. A interao
droga/dendrmero pode ocorrer tambm na superfcie do dendrmero, atravs de
interaes eletrostticas. No caso de molculas maiores, o dendrmero se organiza
volta destas, como o que acontece quando utilizado na transfeco de genes.
A constituio qumica do interior do dendrmero o fator determinante na
interao droga/dendrmero e o nmero de molculas que podem ser inseridas. A
gerao do dendrmero (tamanho) tambm influencia na capacidade de transporte
de pequenas molculas. Estruturas nas geraes mais baixas so abertas e nas
geraes mais altas so mais fechadas, contendo um nmero maior de
cavidades(Prabal & Goddard III et al, 2004).
Como exemplo da formao de complexo, podemos citar o dendrmero
PAMAM com o ibuprofeno (Karatasos et al., 2009). Neste trabalho foi observado
33
que o nmero mximo de molculas acopladas ao dendrmero nunca excedia o

nmero de aminas primrias na superfcie do PAMAM,ou seja,32 molculas de
ibuprofeno, j que o dendrmero utilizado foi o PAMAM G3 que tem 32 aminas
primrias na superfcie.
Este fato mostrou que as interaes se davam
preferencialmente na superfcie principalmente atravs da formao de pares

inicos entre as aminas do PAMAM e as carboxilas das molculas de ibuprofeno.
Muitos outros frmacos foram acoplados aos dendrmeros PAMAM e
diferentes formas de administrao so estudadas para avaliar a atuao destes
dendrmeros como vetores. A tabela 2 apresenta um resumo de algumas drogas
estudadas, o tipo de interao com o dendrmero e a razo entre a atividade do
complexo ou conjugado e da droga livre(Cheng et al., 2008).

Drogas
sulfamethoxazola
Prulifloxacina
Nadifloxacina
Sulfadiazina
Ibuprofeno
Paclitaxel
Metotrexato
Cisplatina
metotrexato
Interao
Complexado
Complexado
Complexada
Complexada
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Ao
bactericida
bactericida
bactericida
Toxoplasmica
Anti-inflamatrio
Anti-Cncer
Anti-Cncer
Anti-Cncer
Anti-Cncer
Tabela 2: Drogas complexadas ou conjugadas com o dendrmero PAMAM.
2.1.8
Toxicidade
Dendrmeros PAMAM tm sido avaliados sistematicamente in vitro, atravs
de clulas epiteliais. Entretanto poucos estudos tm sido realizados in vivo, para o
transporte e liberao de drogas atravs de vias orais. At o ano de 2012 no
houve nenhum resultado publicado in vivo da translocao intacta intestinal de
complexos de dendrmeros. Estudos in vivo so crticos por ser difcil de manter o
complexo formado por um determinado tempo para avaliar a toxicidade intestinal.
O estudo de enzimas especficas que clivam o dendrmero pode ajudar a avaliar e
entender o processo. Sendo assim estudos in vitro, no podem ser extrapolados
para casos in vivo. Deste modo muitos estudos tm ainda que ser realizados para
avaliar com preciso a toxicidade do dendrmero PAMAM in vivo. Uma de suas
vantagens est em poder mudar seus grupos de superfcie, o que pode ser til para
34
diminuir a toxicidade. Outro fator para a reduo da toxicidade reduzir a

dosagem, que pode contribuir para amenizar estes efeitos (Sadekar et al., 2012).
2.1.9
Solubilidade
Nos complexos, devido s molculas das drogas estarem inseridas nos
dendrmeros, a solubilidade em gua determinada pela capacidade de solvatao
da superfcie do dendrmero. Sendo a superfcie do dendrmero hidroflica, o
complexo aumenta o tempo de trnsito do medicamento no organismo.
A indometacina, um antiinflamatrio com caractersticas hidrofbicas foi
investigado quanto ao aumento da sua solubilidade quando includo em
dendrmeros PAMAM G4 (Chauhan et al., 2004). Foi observado que a
concentrao de indometacina complexada com PAMAM na regio de inflamao
muito maior quando comparada droga livre.

Outro estudo realizado com um bactericida denominado sulfonamida,
mostrou que dendrmeros PAMAM de gerao 3 dobram a solubilidade desta
molcula, quando h formao do complexo (Minglu et al., 2006).
No caso de frmacos oftalmolgicos, um trabalho usando coelhos como
modelos in vivo (Brobeck, 2004), permitiu um prolongamento da droga
complexada com dendrmero na rota oftalmolgica. Neste estudo foi mostrado
que o uso de dendrmeros PAMAM no aumentou a irritabilidade comparada a
outros dendrmero no catinicos.
Os anti-inflamatrios lipoflicos flurbiprofeno e ketoprofeno complexados
com o PAMAM de gerao 4(Yiyun, 2005) tambm foram testados em modelos
in vivo (ratos albinos) (Asthana et al., 2005). O estudo mostrou que o dendrmero
interage com as drogas aumentando sua solubilidade.
2.1.10
Interaes com Membranas
Muitos grupos tm estudado a interao entre dendrmeros e membranas
celulares (Emanuele, 2006). A eficincia em atravessar a membrana ou romper a
mesma est intimamente relacionada com o tamanho da gerao do dendrmero
PAMAM, estrutura qumica, bem como sua concentrao (Sayed et a., 2003).
35
Um estudo realizado com clulas de fgado de ces (Madin-Darby) (Irvine

et al., 1999), determinou a permeabilidade de dendrmeros PAMAM da gerao 0
a 4 atravs destas membranas. A ordem de permeabilidade encontrada foi G4
G1
G0 > G3 >G2. Este estudo concluiu que a transposio dos dendrmeros
atravs destas membranas dependente do tamanho e dos grupamentos da

superfcie (Tarajobi et al., 2001).
O trabalho realizado em tecidos vasculares, que so tecidos com uma grande
quantidade de glicosaminoglicanos negativamente carregados, envolvidos com a
mobilidade celular, proliferao e regulao de atividades enzimticas, observou
uma grande quantidade de dendrmeros PAMAM acoplados a paredes vasculares.
Estas ligaes tornam os dendrmeros promissores carreadores de drogas
cardacas (Sakharov et al, 2003). Outro estudo sobre o endotlio microvascular
(Sayed et al., 2001), mostrou grande dependncia de tamanho e peso molecular do
dendrmero em atravessar o endotlio. Geometrias e cargas de drogas acopladas

ao dendrmero tambm influenciam a passagem por este.
Interaes entre dendrmeros e membranas celulares de bactrias foram
estudadas por (Chen et al., 2002), onde foram testadas bactrias gram-positivas e
gram-negativas por tcnica de ultravioleta, espectroscopia e calorimetria
diferencial. Grandes concentraes de dendrmeros foram precipitadas com
vesculas fosfolipdicas sugerindo uma forte interao destas membranas com
estes dendrmeros. Estes precipitados desestabilizaram a parede das clulas da
bactria destruindo-a e assim tendo seu efeito bactericida.
Estudos experimentais da interao de dendrmeros PAMAM com
bicamadas lipdicas mostraram que dendrmeros com terminao CH3, provocam
poucas mudanas de conformaes na estrutura da camada lipdica, concluindo
que estes tipos de dendrmeros hidrofbicos podem se acomodar no interior de
membranas sem criar alguma ruptura na camada lipdica. Quando se tem grandes
concentraes de dendrmeros, estes formam agregados que no so facilmente
incorporados a membranas (Epand et al., 2005).
2.1.11
Entrada do Dendrmero na Clula
O mecanismo de endocitose o processo pelo qual as clulas vivas
ativamente absorvem materiais atravs da membrana celular. Dendrmeros
36
catinicos como o PAMAM tm sido estudados quanto a sua entrada na clula

atravs de endocitose (Wiwattanapatapee et al., 2000).
Trabalhos realizados concluram que para pequenas concentraes de
PAMAM G4, a velocidade de endocitose no varia significativamente e aumenta
rapidamente para concentraes maiores do dendrmero (Kelly M. Kitchens,
2007). Estes trabalhos concluram tambm que atravs de inibidores de endocitose
a entrada de dendrmeros nas clulas reduzida rapidamente, o que comprova a
internalizao do PAMAM atravs deste processo. Esta entrada ocorre atravs de
interaes eletrostticas entre grupamentos amina carregados na superfcie do
PAMAM e a membrana celular.
Em um trabalho realizado com dendrmeros de gerao 3 para avaliar o
potencial destes em transpor clulas Caco-2 foi verificado que a endocitose est
intimamente envolvida no transporte epitelial de dendrmeros(Rachaneekorn
Jevprasesphant et.al, 2004).

2.1.12
Simulao Computacional dos Dendrmeros
Devido a no serem esclarecidas as estruturas dos dendrmeros atravs de
mtodos experimentais, muitos estudos tericos tm sido realizados para tal fato,
e estes estudos so feitos atravs de dinmica molecular ou mtodos de Monte
Carlo. Atravs destes clculos podemos esclarecer a estrutura tridimensional
destes e avaliar suas possibilidades quanto a transporte de molculas em seu
interior. Estes clculos so realizados, e aps a simulao muitas propriedades so
medidas, tais como: o raio de giro, que mede a compactao espacial da estrutura
do dendrmero, RMSD ( Root Mean Square Deviation), que apresenta a diferena
espacial entre duas molculas, entre outras medidas, que definem as propriedades
estruturais de molculas. Quando so realizadas dinmicas moleculares at o
equilbrio da estrutura, foram observados que no pH neutro a estrutura possui uma
conformao mais fechada, contendo vrias cavidades em seu interior (Maiti et
al., 2006). Quando so considerados dendrmeros carregados, as repulses de
cargas entre grupos amina afastam os monmeros fazendo com que a estrutura
tenha um raio de giro maior e consequentemente seja mais aberta (Liu et al.,
2009),
37
Para que o dendrmero possa ser usado como um nanotransportador deve

interagir com muitas molculas. Sejam elas molculas no interior do dendrmero,
com a dupla camada lipdica, com protenas ou com o DNA. (Lee et al, 2006)
Estudaram a interao entre a bicamada lipdica e os dendrmeros. Estas
simulaes mostraram que os dendrmeros acetilados G3 e G5 no so inseridos
na membrana. O no acetilado e o parcialmente acetilado G5 totalmente inserido
na membrana plasmtica. Estes estudos foram importantes para uma avaliao da
penetrao destes dendrmeros na bi-camada lipdica.
Embora muitos campos de fora sejam usados para simular os dendrmeros,
os resultados mostram resultados quantitativos semelhantes (Goddard III et al.,
2006)(Roberts et al., 2009). Este fato indica a robustez de dinmicas moleculares
do tipo atomsticas onde simulao feita considerando tomo a tomo dando
uma maior preciso a simulao. Outro tipo de dinmica denominada CoarsePUC-Rio - Certificao Digital N 0821502/CA
Grained, onde a simulao une conjuntos de tomos para se tornar mais rpida,
mas perde preciso a nvel atmico.
Os trabalhos tericos realizados com dendrmeros nos ltimos tempos
chegaram a concluses de que a dinmica molecular de tomos unidos prev de
uma forma global as propriedades geomtricas de dendrmeros bem como sua
interao com membranas celulares (Lee et al., 2008).
Estudos de dinmicas moleculares e insero de porfirinas em diferentes
geraes de dendrmeros PAMAM (Roberts B. a., 1999) foram avaliados. Atravs
destes modelos verificou-se que o dendrmero de gerao 3 tem uma estrutura
assimtrica e quando esta gerao sobe para 4, o dendrmero se torna mais
esfrico, mas ainda assimtrico. Estes resultados foram tambm observados por
(Goddard III et al, 2009). Muitas aminas na superfcie do dendrmero esto
voltadas para dentro, indicando interaes da superfcie com o interior do
dendrmero. Estas aminas voltadas para o interior diminuem a interao destes
dendrmeros com molculas acopladas em sua superfcie. Outros trabalhos
tambm verificaram a insero de porfirinas em dendrmeros PAMAM (Bhalgat
et l., 1997). Tendo como concluso que a insero de um nmero maior de
porfirinas na superfcie do dendrmero diminui a chance de outras molculas
serem acopladas por diminuir o nmero de interaes da superfcie do dendrmero
com as mesmas.
38
Sobre a estrutura do dendrmero foram realizadas dinmicas moleculares

(Canetta & Maimo, 2003) para confrontar com estudo de espalhamento de raios-x
(SAXS). Este estudo com dendrmeros PAMAM no inicos mostrou que para
geraes maiores (G>5) os dendrmeros so mais homogneos e esfricos. Tem
seu ncleo bastante denso com tomos da periferia mais espalhados. Estes
resultados comprovam o que foi obtido por (Canetta et al., 2002) atravs de
experimentos de raios-x.
Atravs do uso do algoritmo de simulated annealing na dinmica molecular
(Groman et al., 2000) foram estudadas as geometrias dos dendrmeros PAMAM.
A estrutura do dendrmero encontrada globular, mas no esfrica o que foi
atribudo ao fato de as aminas da superfcie estarem voltadas para o interior do
dendrmero.
2.2
Rifampicina e Tuberculose
O objetivo em estudos futuros do nosso grupo criar um nanodispositivo
que possa transportar drogas diretamente ao pulmo, para o tratamento da
tuberculose. Esta seo faz uma discusso desta doena e do principal frmaco
utilizado em seu tratamento, que ser usado neste trabalho como primeiro frmaco
acoplado nos dendrmeros.
2.2.1
Introduo Tuberculose
A tuberculose uma doena contagiosa conhecida desde os tempos da
Magna Grcia, mas que pode ter acometido humanidade h mais de 5000 anos,
sendo que o bacilo que provoca a doena pode ter surgido no solo terrestre h
mais de 15000 anos. Este bacilo adaptou-se em mamferos com a domesticao do
gado e posteriormente foi transmitido para o homem pelo convvio com estes
animais (Coura, 2003).Estudos de paleopatologia detectaram a presena do bacilo
M.tuberculosis em mmias egpcias com mais de 3000 anos. O filsofo grego
Hipcrates (460-377 A.C) tinha conhecimento da tuberculose pulmonar, mas esta
doena s ficou conhecida na Europa na idade mdia aps acometer reis e pessoas
importantes da sociedade. A tuberculose de grande contgio devido a ser
transmitida pelo ar atravs de doentes que contm a forma ativa da doena. Aliada
39
epidemia de AIDS e emergncia de bacilos multirresistentes considerada

pela OMS uma doena de emergncia mundial.
O agente etiolgico da tuberculose o M.tuberculosis ou bacilo de Koch.
Esta bactria foi descrita pela primeira vez em 1882 por Robert Koch, laureado
com o prmio Nobel por esta descoberta em 1905. uma bactria aerbica que se
divide a cada 16-20 horas e graas parede celular formada por lipdios (cidos
miclicos), resiste a desinfetantes fracos e ao cido gstrico, podendo ficar
semanas em estado latente e s se desenvolve quando inserida em um organismo.
O ressurgimento da tuberculose est relacionado com o HIV (vrus da
imunodeficincia adquirida). O HIV e o bacilo tm interao sinrgica, um
potencializando o outro. Segundo dados da OMS (Organizao Mundial de
Sade) o Brasil responsvel por 80% dos casos em todo o mundo, tendo em
mdia 110 mil pessoas contaminadas por ano com a tuberculose, atingindo
principalmente as classes menos favorecidas.

Ainda de acordo com a Organizao Mundial de Sade (OMS), tm-se trs
milhes de bitos por ano em todo o mundo. Este fato fez com que a OMS
declarasse a tuberculose como uma doena de emergncia global.
2.2.2
Genoma do Mycobacterium Tuberculosis
O bacilo de Koch uma bactria aerbica que se multiplica
lentamente a cada 25-32 horas (Coura, 2003). Apesar de sua lenta
multiplicao de grande periculosidade por ser transmitido pelas vias
nasais. Seu genoma possui por volta de 4000 genes(Domenech, 2001).
Aproximadamente 200 destes genes codificam enzimas para a produo
de cidos graxos. Foi descoberto tambm que 170 de seus genes podem
estar envolvidos na variao antignica do bacilo . Dois trabalhos
realizados (Banu et al., 2002) (Barrel, 1998) descobriram que um
grupamento de genes que corresponde a 10% do genoma, seria
responsvel pela variao antignica do bacilo, determina ndo os
mecanismos de escape da resposta imune do hospedeiro. O bacilo de
Koch tem parede celular complexa recoberta por lipdios, sendo
composta por cidos graxos de cadeia longa, que contribuem para a
sobrevivncia da bactria dentro dos fagcitos do hospe deiro.
40
Figura 9:Bacilo de Koch. Fonte: (Piedade, 2010).
2.2.3
Patologia
O M.tuberculosis eliminado pelas vias nasais por um indivduo
portador do bacilo, com a forma ativa da doena , sendo de grande
contgio(Coura, 2003). Existem trs vias de contaminao, a primeira
pelo leite tomado in natura, o que ocorre raramente nos dias atuais,
devido ao processo de pasteurizao. A segunda forma est relacionada
com a inoculao direta do bacilo pelos agentes de sade. A terceira
acontece quando este eliminado pelo ar atravs das vias nasais de um
indivduo portador do bacilo. Morrem 4600 pacientes vtimas da
tuberculose por ano no Brasil segundo o sistema nico de sade (SUS).
A fase inicial ocorre entre um e seis dias aps o contgio onde os
macrfagos fagocitam os bacilos. O bacilo uma vez dentro do
organismo liga-se a vrios receptores celulares. Depois de passar pelas
defesas inespecficas do trato respiratrio ser fagocitado pelos
macrfagos alveolares e pneumcitos tipo II. A interao entre bacilo e
macrfago o que vai determinar a progresso da doena. O macrfago
dotado de vrios receptores de superfcie que facilitam sua ligao
aos antgenos que permitem a invaso do hospedeiro. A concentrao
41
de alesterol na membrana celular tem grande influncia na ligao do

bacilo aos macrfagos. Quando o alesterol est em quantidade baixa a
fagocitose no acontece.
Aps ser fagocitado pelos macrfagos h formao de vacolo
(parte que uma clula isola do citoplasma para combater agentes
patognicos), cujo ambiente hostil para o parasita. A seguir acontece
um mecanismo de juno do fagossoma com o lisossoma, que contm
substncias que tentam destruir o patgeno, formando o que chamamos
de fagolisossoma. O bacilo ento por sua vez emprega mecanismos
para evitar a formao dos fagolisossomas, inibindo o processo de
fuso e inativando enzimas, facilitando assim sua proliferao. Este
processo feito atravs da expresso de uma protena denominada
coronina 1. Aps o processo de fagocitose, o bacilo fica preso ao
fagossoma atravs de receptores CR1, CR3, e CR4 e pelo receptor de

manose. Esta interao entre o bacilo e os receptores feita atravs de
lipoprotenas.
Com a fuso do fagossoma ao lisossoma o ambiente passa a ser
hostil para o bacilo, que sofre ao do pH cido, enzimas e peptdeos
txicos, podendo ocorrer trs aes:
1) Uma parte dos bacilos destruda;
2) Outra parte entra em estado latente podendo causar a doena no

futuro, quando o sistema imunolgico ficar deficiente;
3) A terceira parte so bacilos que escapam dos fagolisossomas

por processos ainda no esclarecidos ou por produo de amnia que
inibe a juno do fagossoma com o lisossoma.
Aps fagocitar o bacilo os macrfagos expressam enzimas que

recrutam moncitos, linfcitos e neutrfilos para a sua destruio. Com
a chegada dos linfcitos ao local da infeco, tem incio leso
granulomatosa caracterstica da tuberculose. Nesta fase os linfcitos e
as clulas gigantes derivadas dos macrfagos tentam destruir o bacilo.
42
Com o avano da imunidade, clulas vo sendo mortas formando

grnulos cercados por fibroblastos, linfcitos e moncitos, oriundos do
sangue. Neste estado que se torna hostil para o bacilo, este adormece,
podendo permanecer no corpo por dcadas.
2.2.4
Sintomas
Alguns infectados no apresentam sintomas aparentes, mas na
grande maioria das vezes uma tosse seca e continua no incio, seguida
da presena de secreo por mais de quatro semanas o que pode evoluir
para uma tosse com pus ou sangue. Cansao excessivo, feb re ao
entardecer,
falta
de
apetite,
palidez,
emagrecimento
acentuado,
rouquido, so tambm comuns. Nos casos mais graves pode ocorrer
dificuldade de respirao com eliminao de grande quantidade de

sangue. Acumulo de pus na pleura (membrana que reveste o pulmo).
Se esta membrana for comprometida pode haver dor no trax
(Ministrio da Sade, 2011).
2.2.5
Resistncia do Bacilo as Drogas
A resistncia do bacilo da tuberculose aos quimioterpicos a principal
preocupao no tratamento atual. No inqurito nacional brasileiro de resistncia s
drogas utilizadas no tratamento da tuberculose, realizado em 1995-1997 para
avaliar a multirresistncia izoniazida e rifampicina, foram constatadas algumas
formas resistentes. Entre os 5.138 pacientes em 13 estados amostrados a
resistncia encontrada foi de 10.6%.
2.2.6
Introduo aos frmacos
Um frmaco pode ser definido como uma substncia qumica que interage
com a estrutura corporal para alterar um determinado processo biolgico(Pandit,
2008). Pode aumentar ou diminuir a funo de um rgo, tecido ou clula. As
caractersticas de um frmaco ideal so:
. Ao farmacolgica desejada;
43
. Mnimos efeitos colaterais;
. Chegada ao stio de ao no tempo e quantidade desejada;
. Permanecer no stio de ao pelo tempo desejado;
. Rapidez de eliminao aps seu efeito.
2.2.7
Vias de Administrao e Excreo
Existem diversas vias de administrao para a entrada de um
frmaco no organismo, tais como as vias orais, retais, sublingual,
transdrmica, parenteral (intravenosa, subcutnea e intramuscular) e

aplicaes tpicas. Aps a administrao, os frmacos so absorvidos.
No caso de preparaes slidas a absoro vai depender inicialmente
da dissoluo do comprimido ou cpsula, que libera o medicamento.
Nestes casos de ingesto oral, primeiramente o frmaco deve ser
absorvido pelo estmago e intestino, alm disso, precisa passar pelo
fgado, onde ocorre seu metabolismo. Por estas razes uma f rao
administrada e absorvida ser inativada ou desviada antes de chegar
circulao sistmica e ao local de ao. Aps a fase de distribuio o
frmaco se distribui para os lquidos intersticiais e intracelulares. Estes
fatores dependem de processos fsico-qumicos destes frmacos.
Alguns
frmacos circulam
na corrente sangunea ligada
protenas plasmticas. Frmacos que possuem propriedades fsicas e

qumicas semelhantes podem competir entre si por stios de ligao,
provocando a troca significativa d e um frmaco pelo outro.
2.2.8
Membrana Celular
A atuao dos medicamentos dentro das clulas dependem de sua
capacidade de atravessar membranas celulares. A membrana plasmtica, que
reveste as clulas, consiste em uma cadeia de lipdios anfipticos, com sua cadeia
44
de carbonetos orientados para o interior formando uma regio hidrofbica,

enquanto suas extremidades esto voltadas para fora formando uma parte
hidroflica. Lipdios inseridos nesta membrana no so fixos e esta mobilidade
confere fluidez membrana celular alm de permeabilidade seletiva. Esto
inseridas tambm nesta membrana as chamadas protenas de membrana que
servem como canais inicos, transportadores de sinais eltricos ou qumicos e alta
seletividade para a passagem de molculas especficas pela membrana celular.
Atravs da membrana podem ocorrer dois tipos de transportes:
Transporte passivo As molculas neste tipo de transporte penetram na
membrana seguindo um gradiente de concentrao, esta passagem ocorre at o
momento do equilbrio, isto , a concentrao de uma determinada molcula
igual dos dois lados da membrana. No caso de compostos inicos, as
concentraes no estado de equilbrio dependem da diferena de pH atravs da
membrana que influncia o estado de ionizao das molculas. (Pandit, 2008),

(Goodman, 2006)
Transporte ativo Neste tipo de transporte atravs de membranas so
necessrias certas protenas inseridas na dupla camada para efetuar o transporte
(Rowland, 2009). A diferena que conseguem transportar molculas contra o
gradiente de concentrao. Necessitam de energia celular, conseguida atravs do
ATP (Trifosfato de Adenosina). Um modelo de membrana celular mostrado na
figura 10.
Figura 10: Esquema de uma membrana celular adaptada de

Lehninger (Cox & David, 2011).
45
2.2.9
Tratamento da Tuberculose
Os seguintes medicamentos so padronizados no Brasil para o tratamento da
tuberculose (Misra, 2010):
. Isoniazida;
. Rifampicina;
. Pirazinamida;
. Etionamida;
. Etambutol;
. Estreptomicina.
Segundo (Coura, 2003), (Dalcomo et al., 2007) podem-se ter os seguintes

tratamentos da tuberculose no Brasil:
Esquema 1 - Para o tratamento de todos os casos de tuberculose. Nos dois

primeiros meses rifampicina, isoniazida, pirazinamida. Nos quatro meses
seguintes rifampicina e isoniazida. Em caso de tratamentos de reincidncia ou
casos de abandono do esquema 1, nos dois primeiros meses as 3 drogas do
esquema 1 mais etambutol. Nos quatro meses seguintes as duas drogas do
esquema 1 mais etambutol.
Esquema 2 - Para o tratamento de meningoencefalite com outras formas

associadas. Dois primeiros meses, rifampicina, isoniazida, pirazinamida e
prednisona. Nos sete meses seguintes rifampicina mais isoniazida.
Esquema 3 - Este esquema para falha dos anteriores. Nos trs primeiros
meses, estreptomicina, etionamida, etambutol, pirazinamida. Nos nove meses
seguintes etambutol e etionamida.
46
2.2.10
Rifampicina
Este frmaco foi descoberto em 1957 pelo cultivo de uma cepa de
Streptomyces mediterranei, (Rieder, 2009). Sendo introduzida na dcada de 70
para o tratamento da tuberculose. A rifampicina inbe o crescimento da maioria
das bactrias gram-positivas e de muitas gram-negativas. Em concentraes de
0,005 a 0,2 g/ml inibe o crescimento do M.tuberculosis. As concentraes
plasmticas mximas ocorrem de 2 a 4 horas aps administrao, com a ingesto
de 600mg do frmaco. Sua eliminao ocorre rapidamente pela bile. A meia vida
varia de 1,5 a 5 horas. solvel em solventes orgnicos e em gua em pH cido.
Figura 11: Molcula de Rifampicina. Fonte: (DRUG BANK, 2012).
2.2.11
Mecanismos de Ao da Rifampicina
A rifampicina inibe a RNA polimerase DNA-dependentedas micobactrias e de outros organismos, atravs da supresso da iniciao da cadeia na
sntese de RNA. A subunidade desta enzima o local de ao da rifampicina. A
sntese de RNA no afetada nas clulas de eucariotos, pois estas no se ligam
rifampicina.
Em altas concentraes a rifampicina pode inibir a sntese de RNA nas
mitocndrias de mamferos, as RNA polimerases DNA dependentes virais e
transcriptases reversas (Goodman, 2006).
A eliminao da rifampicina ocorre rapidamente na bile, sendo que aps 6
horas toda a rifampicina se encontra na forma desacetilada retendo toda sua
atividade antibacteriana. A presena de alimentos e desacetilao reduzem a
47
reabsoro intestinal. Ameia vida da rifampicina de 1,5 a 5 horas. Por volta de

30% da rifampicina excretada na urina e cerca de 60-65% nas fezes.
2.2.12
Resistncia a Rifampicina
A rifampicina o principal frmaco no esquema teraputico contra a
tuberculose(Fiuza, 1997). Os indivduos com cepas resistentes rifampicina tm
grandes chances de serem resistentes a outras drogas. (Mitchison, 1986), (Fischl,
1992)(Carvalho et al., 2007). Devido a esta resistncia estes pacientes tem que ser
submetidos a um tratamento com frmacos de segunda ordem (Iseman, 1993),
(Drobniewski, 1997). Estes frmacos de segunda ordem possuem um custo mais
elevado e alm deste fato so mais txicos. A resistncia do Mycobacterium
tuberculosis rifampicina ocorre atravs de mutaes no gene rpoB, que o gene
responsvel pela codificao da cadeia da RNA-polimerase (Yamanda, 1985),

(Telenti et al., 1993), (Kapur et al., 1994), (Williams et al., 1994), (Lucia et al.,
2002). Das cepas isoladas resistentes rifampicina, 95% tem mutaes em uma
regio especfica que compreende 69 pares de bases do gene rpoB correspondendo
aos cdons 511 a 533 (Spindola et al., 2001). Para os restantes 5%, o local
especfico da mutao ainda no determinado com exceo dos cdons
381(Tanigichi et al., 1996), e dos cdons 481 e 509 (Nash et al., 1997). Estas
mutaes no gene rpoB tem grande importncia por fazer surgir bacilos
multirresistentes.

3

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estas trs regies.

Figura 1: Representao esquemtica das partes de um dendrmero

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Figura 2: Representao esquemtica da estrutura do dendrmero.

especializadas como, por exemplo, os dendrmeros do tipo PAMAM pela empresa

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Figura 4: Dendrmero de Gerao 1. Fonte: (Prabal, 2005).

O crescimento do dendrmero PAMAM limitado pelo congestionamento

Figura 5: Representao de um dendrmero PAMAM de gerao 10.

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Tabela 1: Tabela representativa das propriedades do dendrmero PAMAM.

1) Nmero de grupos na superfcie

3) Nmero de aminas Tercirias

o nmero de tomos do ncleo,

que partem de cada brao, G a gerao.

nmero de aminas tercirias no ncleo.

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duplicao da funcionalidade como mostra a Figura 6.

Figura 6: Reaes sucessivas da formao do dendrmero PAMAM.

As geraes de nmero inteiro crescentes, G0, G1, G2, etc, so terminadas

O nmero de grupamentos amina na superfcie dobra a cada nova gerao

menor reatividade dos demais grupamentos funcionais presentes no seu interior,

Figura 7: Dendrimero PAMAM de gerao 4, Adaptado de (Kono et al., 2005).

Outro importante estudo avaliou a citotoxicidade de dendrmeros PAMAM

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um frmaco para tratamento de tumores no crebro, tem sua toxicidade reduzida

Figura 8: Propriedades estruturais dos dendrmeros PAMAM.

Estas caractersticas estruturais, alm da razovel biocompatibilidade e

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lquidos intersticiais e intracelulares. A excreo ocorre eliminando os frmacos

Proteger o medicamento no trnsito do organismo at este atingir o alvo

Os dendrmeros PAMAM possuem caractersticas que os tornam

bioeliminao ou biodegradabilidade aceitveis. Possuem adeso celular

que o nmero mximo de molculas acopladas ao dendrmero nunca excedia o

Este fato mostrou que as interaes se davam

preferencialmente na superfcie principalmente atravs da formao de pares

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complexo ou conjugado e da droga livre(Cheng et al., 2008).

Tabela 2: Drogas complexadas ou conjugadas com o dendrmero PAMAM.

diminuir a toxicidade. Outro fator para a reduo da toxicidade reduzir a

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muito maior quando comparada droga livre.

Um estudo realizado com clulas de fgado de ces (Madin-Darby) (Irvine

G0 > G3 >G2. Este estudo concluiu que a transposio dos dendrmeros

atravs destas membranas dependente do tamanho e dos grupamentos da

dendrmero em atravessar o endotlio. Geometrias e cargas de drogas acopladas

catinicos como o PAMAM tm sido estudados quanto a sua entrada na clula

Jevprasesphant et.al, 2004).

Para que o dendrmero possa ser usado como um nanotransportador deve

Sobre a estrutura do dendrmero foram realizadas dinmicas moleculares

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epidemia de AIDS e emergncia de bacilos multirresistentes considerada

principalmente as classes menos favorecidas.

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Figura 9:Bacilo de Koch. Fonte: (Piedade, 2010).

de alesterol na membrana celular tem grande influncia na ligao do

fagossoma atravs de receptores CR1, CR3, e CR4 e pelo receptor de

1) Uma parte dos bacilos destruda;

2) Outra parte entra em estado latente podendo causar a doena no