UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

ESCUELA DE GRADUADOS

ANALISIS DE LA EXPRESION DE TRANSPORTADORES DE HEXOSAS

EN CANCER, CON ESPECIAL ENFASIS EN NEOPLASIAS DE LA MAMA.

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER EN

CIENCIAS BIOLOGICAS CON MENCION EN FISIOLOGIA

ALEJANDRO SAMUEL GODOY SANCHEZ

2000

UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
ESCUELA DE GRADUADOS

Esta tesis ha sido realizada en el Departamento de Histologa y Embriologa de la Facultad

de Ciencias Biolgicas.

Profesor Gua: Dr. Francisco Javier Nualart Santander

por la siguiente Comisin Evaluadora.

Ha sido

1.- Dr. Carlos Figueroa

(U

2.- Dr. Jorge Roa

(U

3.- Dr. Francisco Nualart

(U

Jefe de programa: Dr. Clemente Gonzlez.

AGRADECIMIENTOS
Concluida esta etapa, no puedo dejar de agradecer, a quienes de una u otra manera,
colaboraron para hacer posible, este, mi primer gran sueo:
- A mi tutor, el Dr. Francisco Nualart, cuya experiencia cientfica ha sido el alero bajo el cual
me he formado durante todos estos aos.
- A la Prof. Karin Reinicke, por su constante apoyo, crtica cientfica y organizacin del
laboratorio.
- A los miembros del Departamento de Histologa y Embriologa, por permitir el desarrollo
de mi trabajo en un ambiente cmodo y agradable.
- A CONICYT, por confiar en m y brindarme apoyo econmico.
- Al Dr. Juan Carlos Vera, por su apoyo y sabios consejos.
- A la Sra. Mara de la Luz, por compartir su gran experiencia tcnica conmigo.
- A mi amigo Emilio, con quien compart gratos momentos de mi vida.
- A mis compaeras de laboratorio: Mnica, Esther, Carolina, Sofia, Mara de los Angeles y
Maite, quienes con su sincera amistad, hicieron ms grata mi estada en esta ciudad.
- Al Dr. David Golde, por el apoyo brindado fruto de la colaboracin entre ambos
laboratorios.
- A Viviana y Rosita, por su apoyo incondicional.
- A mi amigo Juan Carlos Tapia, por su chispeante y grata amistad.
A todos quienes me apoyaron, escucharon y soportaron durante todo este tiempo.

A todos ellos...

Muchas Gracias.

Esta Tesis de Grado ha sido financiada por los Proyectos de la Direccin de Investigacin de
la Universidad de Concepcin DIUC 96035001-1 y 98035001. En forma adicional,
parcialmente financiada por el Proyecto FONDECYT 1980130.

A mis padres, Samuel y Nidia

A mis hermanos, Karina, David y Germn
A mi amiga y compaera, Vivi

AlrmaPezoC.
Q.E.P.D.

INDICE GENERAL
Pginas
Indicegeneral. . ...................................................................... ... .........

Indicede figuras ................................................... . .............................

Indicede tablas ................... . ... . ..........................................................

VIII

Abreviaturas............................................................. . ..... . ..... . ...... . ...

IX

RESUMEN.................. ... ................................................. .. ...............

SUMMARY............... . ................. . .............................................. .....

XII

1.

INTRODUCCION ......... ... ...................... ...................................

1

1.1

Aspectos generales. ............................................................... . ..

1.2

Sistemas transportadores de glucosa...............................................3

1.2.1

Co-transportadores Na/glucosa ....................................................

1.2.2

Transportadores facilitativos: estructura molecular..............................3

1.2.3

Transportadores facilitativos: distribucin y propiedades .............. . ......

1.2.3.1

GLUTI/isoforma del eritrocito.....................................................6

1.2.3.2

GLUT2/isoforma heptica ...................... . ...................................

1.2.3.3

GLUT3/isoforma cerebral.. . ......... . ...............................................

1.2.3.4

GLUT4/isoforma adiposo-muscular ................ . ...............................

1.2.3.5

GLUT5/isoforma del intestino delgado ........... . ............................... ..

1.3

Generalidades sobre neoplasia......................................................

1.3.1

Cambios proliferativos ........................... . ........... .. ...... . ...............

10

1.3.2

Alteraciones de la apoptosis ... . .................................. . ..................

11

1.3.3

Alteraciones metablicas ............. . ....... . ... . .............. . ....................

13

1.4

Aspectos generales sobre el cncer de mama ... . ...................................

15

1.5

Expresin de GLUTs en cncer de mama..... ................. . .................. ..

17

1.6

Hiptesis de trabajo

19

1.7

Objetivos ..... . ...... . ................... . ............. . ............. . ........... . .......

20

2.

MATERIALES Y METODOS ........................... ... .... . ..................

21

2.1

Materiales biolgicos ......................................... . .................. ....

21

2.1.1

Anticuerpos ............ . ................................................ . .... ... ......

21

2.1.2

Tumores de archivo y tejidos normales .... . ..... . .......................... . ......

21

2.1.3

Clulas en cultivo ............................... . .......... . ..........................

21

2.1.4

Aislamiento de membranas de eritrocitos ..................... ... ..................

21

2.2

Mtodos .................................... ........... . ......................... . .....

23

2.2.1

Procesamiento de muestras ............................. . ............................

23

2.2.1.1

Fijacin ............................ . ........................ . ...........................

23

2.2.1.2

Deshidratacin y aclaramiento ... . ................................... .. ... . .........

23

2.2.1.3

Inclusin...............................................................................

23

2.2.1.4 Obtencin y montaje de los cortes. ............ . ...................................

23

2.2.2

Pretratamiento de las muestras ..... . ............ ....................................

24

2.2.2.1

Desparafinacin y rehidratacin de los cortes....................................

24

2.2.2.2

Inhibicin de peroxidasa endgena..................................................

24

2.2.2.3

Exposicin a microondas .............................................................

24

2.2.2.4 Digestin con proteinasa K..........................................................

24

2.2.3

Mtodos morfolgicos ...... . ...................................... ..................

24

2.2.3.1

Inmunolocalizacin ........... . ... . ........... . ............................. . ..........

24

2.2.3.1.1 Mtodos PAP ................. . ........................................................

25

2.2.3.1.2 Mtodos de segundo anticuerpo marcado ........................... . .... ....... ...

25

2.2.3.1.3 Mtodo de avidina-biotina .................................................... ........

25

2.2.3.2

Inmunolocal izacin ultraestructural ........ . . ...................... ... ..............

26

2.2.4

Mtodos de biologa molecular. . .................................. . ..................

26

II

2.2.4.1 Marcaje de sondas

26

2.2.4.2 Obtencin de sondas de RNA por transcripcin in vitro ................... . ....

26

Hibridacin insitu ................................. ... ... ... ...........................

27

2.2.4.4 RT-PCR in situ ........ . .......................................................... . .....

28

2.2.4.3

2.2.4.5 Inmunodeteccin de protenas inmobilizadas en

membranas de nitrocelulosa despus de la electroforesis........................28
2.2.4.5.1 Electroforesis ..................... .. ...................................................

29

2.2.4.5.2 Electrotransferencia ................................... . ... ... .... . ....................

29

2.2.4.5.3 Inmunodeteccin de protenas.......................................................29

2.2.4.6 Determinacin de apoptosis mediante la tcnica de TUNEL ................. ..

30

3.

RESULTADOS .... . ............. . ........................ . .... . .......... . ...........

31

3.1

1 PARTE: estandarizacin y anlisis de expresin de GLUTs

en tumores humanos .................................... ... ...........................

31

3.1.1

Anlisis de la especificidad de los anticuerpos hechos contra GLUTs.........31

3.1.2

Estandarizacin de diferentes mtodos inmunocitoqumicos

y clasificacin de su reactividad....................................................34

3.1.3

Expresin de GLUT 1 en diferentes tumores humanos...........................38

3.1.4

Anlisis de otras isoformas de GLUT (GLUT2-GLUT5) en

diferentes tumores humanos ................................................... ......41

3.2

II PARTE: anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en

cncerde mama........................................................................44

3.2.1

Anlisis de expresin del RNA mensajero para GLUT1 y GLUT5

en mama normal y tumoral .................................... . ...... . ...............

3.2.2

47

Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de las isoformas

GLUT1 y GLUT5 a nivel de microscopia ptica y electrnica................50

ifi

3.2.3

Anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en clulas de cncer

de mama en cultivo (MDA-468 y MCF-7) ....................................... ..58

3.3

III PARTE: Anlisis preliminares de la correlacin entre la

expresin de GLUTI, grado de diferenciacin del tumor,
proliferacin celular y apoptosis ................................................. . .............. . ...

3.3.1

62

Correlacin de la expresin de GLUT1 con el grado de diferenciacin

del tumor y marcadores de proliferacin celular en carcinoma
demama.. ........ ......................................................................................

3.3.2

62

Correlacin de la expresin de GLUT1 con el ndice de muerte

celular programada en carcinoma de mama ..................................... . .... 64

3.3.3

Correlacin de la expresin de GLUT1 con el ndice de muerte celular

programada en tumores inducidos en ratones "nude"..

..

....

...

..................

4.

DISCUSION ......... ... ........................................... . ......................

4.1

1 PARTE: estandarizacin y anlisis de expresin de GLUTs

..........................................................
en tumores humanos............

4.2

73

73

II PARTE: anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en

cncer de mama... ........................................................................

4.3

65

77

III PARTE: Anlisis preliminares de la correlacin entre la

expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular y apoptosis........82

5.

CONCLUSIONES ...................................................... ... ..............

87

6.

BIBLIOGRAFIA... ....................................................... . ........... ...

89

My

INDICE DE FIGURAS
Pgina
Figura 1. Modelo propuesto para la orientacin del transportador
facilitativo de glucosa (GLUT1) en la membrana plasmtica.................................

Figura 2. Control de la especificidad de anticuerpos que reconocen

transportadores de glucosa ............................................. . ...... . ....... . ..........

33

Figura 3. Mtodos inmunocitoqumicos para la deteccin del

transportador de glucosa GLUT1 ...............................................................36

Figura 4. Criterios de clasificacin de la reaccin inmunocitoqumica.....................37

Figura S. Tumores malignos con elevada expresin de GLUT1... ......................... 40

Figura 6. Tumores malignos con dbil o moderada expresin de GLUTI...............43

Figura 7. Anlisis de la localizacin de GLUT2, GLUT3 y GLUT5 en tumores

malignos.............................. ... ........................................... ... .............

46

Figura 8. Anlisis de la especificidad de los partidores, mediante RT-PCR

iii

vitro.... ...................... ............................................. . .... . ................

49

Figura 9. Anlisis de RT-PCR in situ para la deteccin del mensajero

de GLUT1 en tejido mamario normal y tumoral.. ................................... . ... . ...

51

Figura 10. Anlisis de RT-PCR in sita para la deteccin del mensajero

de GLUT5 en tejido mamario normal y tumoral ...... . ......................................

kTA

52

Figura 11. Deteccin inmunocitoqumica de GLUT 1 en tejido mamario

normaly tumoral .......... . ................................... ...................................

55

Figura 12. Anlisis de expresin a nivel ultraestructural de GLUT1 en cncer

demama................ ...................................................... . .....................

57

Figura 13. Deteccin inmunocitoqumica de GLUT5 en tejido mamario

normaly tumoral ... ... ...................... ........................................ . .... .......... 59

Figura 14. Anlisis de expresin a nivel ultraestructural de GLUT5 en cncer

demama............................ . .............. . .......................... . ........ .............. 60
Figura 15. Expresin de GLUTs en la lnea celular de cncer de mama
MDA-468 .......... . .......................................................... .. ... . ................ 61

Figura 16. Expresin de GLUTI y PCNA en cncer de mama con diferentes

grados de diferenciacin ...... ... .................................................................. 67

Figura 17. Anlisis comparativo del ndice de muerte celular programada

en tumores de mama con diferentes grados de diferenciacin histopatolgica.............68

Figura 18. Anlisis ultraestructural de tumores inducidos en ratones "nude .............. 69

Figura 19. Anlisis de muerte celular programada y expresin de p53

Entumores "nude ............................... . ... . .......................................... . ...

70

Figura 20. Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de GLUTI,

GLUT2 y GLUT5 en tumor inducido en ratones "nude ............... . .......... . ........... 72

Figura 21. Esquema integrativo de la relacin entre carcinomas mamarios

de diferentes grados de diferenciacin con el grado de apoptosis, proliferacin

y expresin del transportador de glucosa 1..........................................................86

VII

INDICE DE TABLAS

Pgina

Tabla 1. Comparacin entre los tipos de muerte celular, apoptosis

y necrosis, desde el punto de vista morfolgico y bioqumico.... . ...........................

12

Tabla 2. Panormica de los tipos histolgicos tumorales segun

la clasificacin de la organizacin mundial de la salud...........................................16

Tabla 3. Anticuerpos y complejos enzirnticos utilizados en los

mtodos de inmunodeteccin in situ e in vitro ..................... ................................ 22

Tabla 4. Expresin de GLUT1 en tejidos normales y tumorales

(j)rimera parte) ...... ... ............................................. . ................................. 39

Tabla 5. Expresin de GLUT1 en tejidos normales y tumorales

(segunda parte) ............... ............ . ............. . .......................... . ................... 42

Tabla 6. Expresin de GLUT2-GLUT5 en tejidos normales y tumorales.................... 45

Tabla 7. Niveles de expresin de GLUTI en Carcinoma Ductal

Invasor con diferentes grados de diferenciacin..... ......... . ................... . ................. 63

Tabla 8. Niveles de expresin de PCNA e ndice de apoptosis en

Carcinoma Ductal Invasor con diferentes grados de diferenciacin..............................66

Vm

ABREVIATURAS

ABC
AEC
AP
ATP
BC IP
BSA
CDI
DAB
DEPC
DTT
dUTP
EDTA
FITC
GLUT
IgG
Km
NBT
PA P
PBS
PCNA
PEG
POD
SBR
SDS
SGLT
SSC
TdT
TEMED
TUNEL

complejo avidina-biotina-peroxidasa
3-amino-9-etilcarbasole
fosfatasa alcalina
trifosfato de adenosina
bromo-cloro-indol ii-fosfato
albmina de suero de bovino
carcinoma ductal invasor de mama
3,3-diaminobencidina
dietilpirocarbonato
ditiotreitol
trifosfato de deoxiuridina
etilendiamintetraacetato
isotiocianato de fluoresceina
transportador facilitativo de glucosa
inmunogiobulina G
constante de M ichael is-Menten
azul de nitrotetrasolio
complejo peroxidasa anti-peroxidasa
tampn fosfato salino
antgeno nuclear de proliferacin celular
polietilen glicol
peroxidasa
clasificacin Scar-Blom-Richardsoon
dodecil sulfato de sodio
transportador de Na7glucosa
tampn citrato de sodio standart
transferasa deoxinucleotidil terminal
N,N,Nt,N'-tetrametiletilendiamina
terminal; dUTP; nick; end; labeling

RESUMEN
La glucosa es incorporada a las clulas por medio de los transportadores facilitativos
de hexosas (GLUT), de los cuales se han descrito 5 isoformas (GLUT1-5). Las clulas
tumorales poseen un metabolismo de glucosa incrementado, lo que ha sido asociado a una
elevada expresin de GLUT1, y en algunos casos, de otras isoformas de GLUTs. Hasta el
momento, no se ha establecido claramente qu isoformas de GLUTs se encuentran presentes
en los distintos tipos tumorales, y menos an, si la sobre-expresin de GLUT1 y/o de otras
isoformas constituye una propiedad general de los tumores o se relaciona especialmente con
neoplasias de mayor agresividad. En este trabajo llevamos a cabo un anlisis detallado de la
expresin de diferentes isoformas de transportadores de glucosa en diversos tumores de
origen humano. Como una primera etapa, estandarizamos diferentes protocolos de
inmunocitoqumica para el anlisis de muestras frescas y de archivo, adems de las
condiciones de uso de los anticuerpos policlonales preparados contra cada isoforma de
GLUT. Posteriormente, analizamos mediante inmunocitoqumica, la expresin de GLUTs en
una serie de 110 muestras de tumores humanos, incluyendo 31 muestras de tumores de
mama. En este tipo tumoral, estudiamos la expresin de GLUT1 y GLUT5 a nivel de
microscopa ptica y electrnica, as como tambin a nivel de ARN mensajero, mediante RTPCR iii situ. Adems, intentamos correlacionar la expresin de GLUT1 con parmetros
biolgicos determinantes de agresividad tumoral, como la expresin de marcadores de
proliferacin celular (PCNA y Ki-67) y los ndices de apoptosis. Por ltimo, analizamos la
expresin de GLUT1 y GLUT5 en la lnea celular MDA-468 la que ha sido ampliamente
utilizada para modelar el comportamiento de clulas de cncer mamario in vitro, y en un
modelo biolgico de cncer de mama inducido en ratones "nude". Se encontr una relacin
directa entre la sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias y la expresin de otras
isoformas de transportadores de glucosa (GLUT2-GLUT5); los tumores que no expresan
GLUT1 tampoco sobre-expresan otras isoformas. En cncer de mama, los anlisis de RTPCR in situ mostraron una sobre-expresin del mensajero para GLUTI y GLUT5 con
respecto al tejido normal. GLUT1 se estudi realizando inmunocitoqumica a nivel ptico y
electrnico, observandose una localizacin preferencial en membranas plasmticas que
forman estructuras semejantes a "canaliculos intercelulares". Esta adaptacin indicara que la
clula tumoral realiza un "sorting" diferencial de GLUTI a regiones particulares de la
membrana de la clula tumoral. GLUT5 en cambio se localiz a nivel citoplasmtico y
especificamente en estructuras de tipo vesicular. Los estudios en clulas MDA-468 en
cultivo confirmaron los resultados obtenidos in vivo, observndose en este caso un "sorting"
diferencial de GLUT1 a regiones de membrana que contactan clulas adyacentes. La

expresin de GLUTI no se relacion directamente con el grado de diferenciacin de los

tumores de mama, siendo los tumores de indiferenciacin intermedia los que mostraron la
mayor expresin. Tampoco se observ una relacin directa con el grado de proliferacin ni
con el ndice de apoptosis. Tumores inducidos en ratones "nude" mostraron caractersticas de
indiferenciacin intermedia y el anlisis de expresin de GLUT1 revel un comportamiento
similar al de los tumores in situ. La sobre-expresin de los transportadores GLUT1 y
GLUT5 en las clulas tumorales de mama permitira que estas clulas puedan metabolizar
glucosa y fructosa. La sobre-expresin y el "sorting" diferencial de GLUT1 no parecen ser
una propiedad general de los tumores de mama sino que corespondera a una caracterstica
que se observa fundamentalmente en tumores de grado de indiferenciacin intermedia con la
formacin de brotes slidos. De esta forma la alta expresin de GLUT1 en cncer de mama
estara asociado al tipo de crecimiento e invasin de las clulas tumorales y no directamente
relacionado con el grado de indiferenciacin de las clulas.

xl

SUMMARY
Facilitative glucose transporters are a family of transmembrane proteins that mediate the
transport of glucose across cellular membranes and include five isoforms,
GLUT 1 /erythrocyte, GLUT2/liver, GLUT3/brain, GLUT4/muscle-fat, and GLUT5/sma!1
intestine. Tumor celis show increased uptake of glucose compared to normal celis, due to
enhanced metabolic needs and aerobic glycolysis. Although it has been established that the
increased uptake of glucose in sorne human malignant tumors is related to the overexpression of glucose transporters, no detailed study of the simultaneous expression of
distinct transporter isoforms in different tumors has been presented. Moreover, no
ultrastructural analysis of glucose transporter expression in tumors is available. In this
work, we standarized a number of imrnunocytochemical methods to study the expression of
glucose transporters in human samples. We analyzed the expression of different GLUTs
isoforms in 110 human tumor samples and additionally performed a detailed analysis of
GLUT1 and GLUT5 expression in malignan breast tumors at the optical and ultrastructural
levels. The expression of GLUT1 and GLUT5 mRNAs was confirmed by iii situ reverse
transcription coupled to a polymerase chain reaction (in situ RT-PCR). We also studied the
presence of different GLUTs in breast cancer ccli unes MDA-468 and MCF-7. GLUT1
expression was correlated with markers of cellular proliferation (PCNA) and apoptosis in
breast tumors during several stages of differentiation. The analysis of human breast tumors
was compared with tumors xenografted in nude mice injected with MDA-468 cells.
Immunocytochemical analysis revealed low to undetectable !eve!s of GLUTI
immunoreactivity in normal cells, with a clear increase in immunoreactivity in the tumor
cells. Wc observed a positive correlation between GLUT1 expression and the presence of
other GLUTs isoforms in the same tumors. Thus, the tumors that showed a low level of
GLUT1 expression did not show expression of glucose transporter isoforms. In breast
tumors, GLUTI immunoreactivity was localized in the celi periphery in 22% of the tumors.
GLUT 1 was preferentially localized in lateral membrane domains involved in ccli to ccli
contact between adjacent tumor cells, and was less evident in membranes in contact with
connective tissue. A similar GLUTI subcellular localization was observed in MCF-7 and
MDA-468 ce!ls grown in vitro, suggesting that it represents an intrinsic property of the
tumor ce!is that is maintained in the tumor celi unes. Ultrastructural analysis revealed the
presence of GLUT1 in specia!ized ceil membrane areas of adjacent ce!ls maintained in close
opposition by junctiona! complexes. We observed increased GLUT5 immunoreactivity iii
breast tumor cells as compared to normal tissue, and the expression of GLUT5 mRNA was
confirmed by in situ RT-PCR. Ultrastructural analysis revealed GLUT5 immunoreactive
MI

material associated to intracellular vesicle-like structures, but no immunoreaction was

associated to the plasma membranes. The increased expression and membrane localization
of GLUT 1 are consistent with the idea that this transporter is important in the uptake of
glucose by breast tumor celis. Thus, the preferential subcellular distribution of GLUT 1 at
lateral membrane domains may represent a physiological specialization of breast tumor celis
linked to their enhanced glucose metabolism suggesting that GLUT1 is subjected to a
differential sorting in these celis. On the other hand, the cytoplasmic localization of GLUT5
suggests that it may be involved not only in the uptake of extracellular fructose, but may
also participate in subcellular transport. Finally, we did not find a relationship between
GLUT1 expression and the differentiation grade of the breast tumor. The increased
expression of GLUT 1 and the differential sorting of the molecule to cellular membranes
involved in the formation of "canalicular-Iike" structures were especially evident in tumors
with solid celi masses where the celis do not have direct contact with the connective tissue.
Therefore, elevated expression of GLUTI in breast tumors is mainly associated to the
growth rate and malignancy of tumor celis within the connective tissue, and not directily
with the differentiation grade of the tumor.

1. INTRODUCCION
1.1 Aspectos generales.
Los carbohidratos estn ampliamente distribuidos en vegetales y animales, donde
desempean funciones estructurales y metablicas muy vanadas. Glucosa, el carbohidrato
ms abundante, corresponde a una molcula altamente hidrofilica, y es considerada como el
principal combustible metablico requerido por las clulas para la produccin oxidativa y no
oxidativa de ATP (Lienhard y cols,, 1992; Mueckler, 1994; Mueckler, 1995).
En los mamferos, la absorcin de glucosa y otros monosacridos, se realiza en el
intestino delgado (Ferraris y Diamond, 1989), siendo la glucosa almacenada principalmente
en el hgado, msculos y tejido adiposo. Su concentracin a nivel sanguneo est regulada en
todo momento, por factores como la ingestin diaria y el balance homeosttico realizado por
hormonas secretadas en las clulas A y B del pncreas, entre otras.
La gliclisis es la principal va metablica para la utilizacin de glucosa, y se lleva a
cabo en todas las clulas en algn momento de su desarrollo. Es una va nica, ya que puede
utilizar oxgeno si est disponible (aerbica) o puede proseguir sin l (anaerbica). En
condiciones anaerbicas, la gliclisis prosigue hasta la formacin y acumulacin de lactato,
con produccin de 2 moles de ATP por molcula de glucosa hidrolizada. Sin embargo,
cuando se introduce el oxgeno, no hay acumulacin de lactato y el piruvato se convierte en
el principal producto final. Este ltimo no se acumula, debido a que prosigue a travs de la
va de la piruvato dehidrogenasa, hasta el ciclo de los cidos tricarboxlicos, en donde se lleva
a cabo el catabolismo de los residuos acetilos, en forma de acetil-coA, producidos a partir
del piruvato. En este proceso se liberan equivalentes de hidrgeno, los que al ser
introducidos a la fosforilacin oxidativa, permiten aumentar considerablemente la
produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (36 moles de ATP/mol de glucosa).
De este modo, la presencia y utilizacin de oxgeno por la clula, permite optimizar en gran
medida la produccin de energa a partir de la metabolizacin de esta hexosa.
Gliclisis no slo es la va principal para el metabolismo de glucosa, si no que
tambin, proporciona una ruta importante para metabolizar fructosa y galactosa
procedentes de los alimentos. Sin embargo, poco se conoce sobre los procesos que median la
incorporacin y metabolismo de estos monosacridos, los cuales son utilizados por un
reducido nmero de tejidos en el organismo humano.

Todos los procesos relacionados, tanto con la regulacin de la concentracin

sangunea de glucosa, as como su metabolismo celular, presentan como requisito principal,
que esta molcula sea incorporada a las clulas, para lo cual, debe atravesar la membrana
plasmtica. No obstante, la glucosa es una molcula altamente hidrofilica, por lo que no tiene
la capacidad de atravesar la membrana plasmtica por si sola, lo que hace necesario la
presencia de sistemas especiales que puedan hacer factible este proceso.
La capacidad para transportar glucosa a travs de la membrana plasmtica es un
rasgo comn en todas las clulas, desde las bacterias, hasta clulas de mamferos altamente
especializadas como las neuronas. Pese a ser ste, un fenmeno generalizado en los diversos
tipos celulares, requiere de mecanismos especficos que aseguren un grado de selectividad y
eficiencia adecuados para permitir la vida de la clula.
Se sabe que determinadas sustancias entran o salen de la clula a travs de portadores
o canales especficos que son protenas intrnsecas de la membrana plasmtica. El transporte
a travs de tales portadores o canales recibe el nombre de transporte mediado. Entre los
sistemas de transporte mediado se cuentan los procesos de transporte activo y transporte
facilitado, que tienen varias propiedades en comn, dentro de las cuales, una de las ms
importantes es acelerar notablemente el transporte de molculas, que por su tamao y
liposolubilidad, les sera muy dificil o prcticamente imposible sortear la barrera que impone
la membrana plasmtica. La principal distincin entre estos dos procesos es que el
transporte activo es capaz de bombear una sustancia en contra de un gradiente
electroqumico, esto requiere de energa, por lo que los procesos de transporte activo han de
estar conectados de algn modo con el metabolismo energtico. El transporte facilitado, en
cambio, tiende a equilibrar las sustancias a ambos lados de la membrana, por movimientos a
favor de sus gradientes electroqumicos, por lo tanto, no es dependiente del metabolismo
energtico.
Los sistemas de transporte activo pueden emplear ATP directamente (transporte
activo primario), o estar conectados de manera indirecta al metabolismo, generalmente
impulsados por el gradiente de otra especie molecular (transporte activo secundario), por
ejemplo, el acoplamiento a cationes monovalentes como el sodio (Na) e hidrgeno (H4T).

1.2 Sistemas transportadores de glucosa.

La glucosa se transporta a la clula utilizando sistemas activos y equilibrativos,
segn sea el tipo de protena transportadora que medie el proceso. Hasta el momento se
conocen dos grandes sistemas para el transporte de glucosa en clulas de mamferos: Los cotransportadores Na/Glucosa (SGLTs), expresados principalmente en la membrana apical de
las clulas epiteliales del intestino delgado y rin (tbulo contorneado proximal), y la
familia de transportadores facilitativos de hexosas (GLUTs) expresados en la gran mayora
de los tejidos.
1.2.1 Co-transportadores Na+/Glucosa.
Los co-transportadores Na+/Glucosa, tienen la particularidad de transportar esta
hexosa en contra de un gradiente de concentracin, aprovechando la gradiente del sodio. Este
tipo de proceso se denomina transporte activo secundario o ligado al sodio. Hediger y cols
en 1987, public sus estudios de donacin del transportador Na/glucosa intestinal de
conejo (SGLTI), a lo cual prosiguieron estudios de caracterizacin ms detallados, como la
determinacin de la topologa del transportador y anlisis funcionales mediante estudios
electrofisiolgicos de SGLT1 expresado en oocitos de Xenopus laevis (Hediger y cols.,
1989; Ikeda y cols., 1989; Birnir y cols., 1991; Parent y cols., 1992). Estudios realizados en
vesculas de membranas apicales aisladas de clulas epiteliales de absorcin del rion
1982a; Turner y Moran,
humano y de conejo (Turner y Silverman, 1977; Turner y Moran,
y en tbulos renales de rata perfundidos in vitro (Barfuss y Schafer, 1981),
revelaron la presencia de, al menos, dos isoformas diferentes para el co-transporte de
Na7glucosa, SGLT1 y SGLT2. Estudios realizados por Mackenzie y cols. en 1994,
identificaron otra isoforma de co-transportador Na/glucosa en rin de porcino, la cual
denominaron inicialmente, SAAT-pSGLT2. Posteriormente, You y cols. en 1995,
basndose en el patrn de distribucin tisular, sugiri que SAAT-pSGLT2 podra ser una
nueva isoforma que es expresada, principalmente, en tejidos no renales, la cual denomin
SGLT3.
1.2.2 Transportadores facil itativos: estructura molecular.
Los estudios sobre el transportador de glucosa se remontan a la dcada de los 70,
especficamente a los trabajos realizados por Kasahara y Hinkle (1977) y Sogin y Hinkle
(1978), los que desarrollaron tcnicas de aislamiento del transportador de D-glucosa desde

membranas de eritrocitos y realizaron estudios de unin de citocalasina 13, determinando la

accin de molculas tales como floretina, maltosa y D-glucosa sobre la unin. En estos
estudios se pudo determinar que la glucosa inhibe competitivamente la unin de citocalasina
B al transportador en eritrocitos, al igual que maltosa y floretina. Estos trabajos, permitieron
postular adems, que est molcula transportadora alternara su accin entre dos estados de
conformacin, el primero, con el sitio de unin al sustrato orientado hacia el exterior y el
segundo, con el sitio de unin al sustrato orientado hacia el interior de la clula.
Posteriormente, Sogin y Hinkle en el ao 1980, lograron purificar un anticuerpo policlonal
hecho contra una fraccin purificada del transportador de glucosa, el cual fue utilizado para
determinar la migracin de esta molcula en geles de poliacrilamida-SDS, establecindose una
masa molecular de aproximadamente 55 kDa.
En el ao 1985, Mueckler y cols., a partir del carrier purificado desde la lnea celular
de hepatoma (HepG 2 ), lograron determinar la secuencia aminoacdica del transportador y
proponen un modelo para la estructura bidimensional del mismo, sugiriendo que esta
molcula est inmersa en la membrana a travs de 12 dominios. Pessin & Bell en 1992, a
travs de perfiles hidropticos y determinaciones de estructura secundaria, aport nuevas
evidencias para reafirmar que estos transportadores son altamente hidrofbicos, sugiriendo
que ms del 50% de los aminocidos estn inmersos en la membrana. En el modelo
propuesto por Mueckler para estos transportadores, la protena atraviesa 12 veces la
membrana y sus extremos amino y carboxilo terminal se encuentran orientados hacia el
interior celular. En este ltimo, se presentan secuencias consenso para fosforilacin por
protenas quinasas serinaltreonina, que podran regular la funcin del transportador (Begum
y cols., 1993; Reusch y cols., 1993). Una extensa asa extracelular conecta los segmentos
transmembrana M 1 y M2 y es donde se encuentra un sitio de glicosilacin que se cree es
necesario para el adecuado procesamiento de la protena y podra relacionarse con la afinidad
de esta molcula por su sustrato (Kitagawa y col., 1995; Noto y col., 1997). Otra asa
estructural de gran tamao y orientado hacia el medio intracelular, est presente entre los
segmentos M6 y M7. Los restantes segmentos transmembrana estn conectados por
pequeas secuencias de 7 a 14 aminocidos. A pesar de la similitud estructural, estos
transportadores entre si presentan una gran variabilidad con solo un 39-65% de identidad
aminoacdica. En general, las regiones de mayor diversidad entre las diferentes isoformas se
presentan en los extremos amino y carboxilo terminal y el segmento extracelular entre Ml y
M2. (Ver fig. 1).

O1igosacrido

Fig 1. Modelo propuesto para la orientacin del transportador facilitativo de glucosa

(GLUT1) en la membrana plasmtica. En este modelo, las regiones de trans-membrana son
numeradas (Ml-M12) y mostradas como rectngulos. Los dominios amino y carboxilo
terminal se encuentran orientados hacia el citoplasma celular y se postula la presencia de dos
asas de gran tamafio, una orientada hacia el extracelular, entre Ml y M2, en donde se
encuentra un potencial sitio de glicosilacin del transportador y la otra orientado hacia el
intracelular, entre M6 y M7.

1 .2.3 Transportadores facilitativos: distribucin y propiedades.

La familia de transportadores facilitativos de glucosa (Simpson y Cushman, 1986;
Carruthers, 1990; Mueckler, 1994), est compuesta de al menos 6 miembros (GLUT1GLUT5 y GLUT7), producto de genes distintos. Hasta el momento no existe evidencia que
seale la creacin de variantes adicionales de isoformas producto de "splicing" alternativo
(Pessin & Bell, 1992). Todas las isoformas tienen un patrn de expresin caracterstico,
tanto de localizacin tisular como de nivel de expresin, lo que permite diferenciar a una
isoforma de otra (Mueckler, 1985; Brot-Laroche y cols., 1988; Silverman, 1991; Klip y
cols., 1994). Cada una de estas isoformas ha sido expresada en sistemas heterlogos
(bacterias, oocitos de xenopus y clulas de mamferos cultivadas), lo que ha permitido
examinar independientemente las propiedades bioqumicas de cada una de ellas (Pessin &
BelI, 1992).
1.2.3.1 GLUT1/isoforma del eritrocito: Esta isoforma se encuentra en todos los tejidos y es
muy abundante en eritrocitos, tejidos fetales, clulas endoteliales y en los plexos corodeos.
Tambin fueron encontrados altos niveles de expresin en las clulas endoteliales del
cerebro, sealando que esta molcula es un componente importante de la barrera hematoenceflica (Pardridge y cols., 1990). Durante el desarrollo del cerebro fetal humano se ha
localizado GLUT 1 en clulas endoteliales involucradas en barrera en estadios previos a las
10 semanas de desarrollo (Nualart y cois., 1999). Se postula que esta isoforma sera
responsable de la captacin basal de glucosa por parte de la gran mayora de las clulas del
organismo (Mueckler y cois., 1985; Birbaum y cols., 1986; Thorens, 1988). Estudios de las
propiedades cinticas de GLUT 1 de rata y humano, expresados en oocitos de xenopus
laevis, han mostrado una K m de 6.9 mM para 2-deoxy-D-glucosa y 20.1 mM para 3-0metilgiucosa en GLUTI de rata, y una K m de 17.2 mM para 3-0- metilglucosa en humanos
(Kayano y cois., 1988; Gould y Lienhard, 1989; Gould y cols., 1991).
1.2.3.2 GLUT2/isoforma heptica: Esta isoforma posee una expresin ms restringida que la
de GLUT 1, encontrndose mayoritariamente en hgado, membranas basolaterales del
epitelio de absorcin del intestino delgado y rin y en clulas 3 del pncreas (Flier y col.,
1987; Thorens y col., 1988). A nivel cerebral se ha localizado en algunos grupos de
astrocitos, neuroblastos del cerebro, clulas de Mller de la retina y en epndimo del
hipotlamo (Vannucci y col, 1997; Nualart y col, 1999, Garca y col, 1999). La distribucin
tisular de GLUT2 sugiere que esta isoforma media la captacin y liberacin de glucosa por
los hepatocitos y que participa en el transporte transepitelial de la glucosa absorbida y

reabsorbida por el intestino delgado y rion, respectivamente. La expresin de GLUT2 en

los islotes pancreticos, puede ser muy importante en la mantencin de los niveles de
glucosa sangunea, actuando conjuntamente con la enzima glucoquinasa para regular el
control de la secrecin de insulina por las clulas B (Heimberg y cols., 1996). Se ha
demostrado que esta isoforma posee un 55% de identidad con la secuencia de GLUT1
humano.
Estudios de expresin in vitro de GLUT2 han demostrado que esta isoforma posee
una K m de 13.2 mM para 2-deoxy-D-glucosa, y de 42.3 mM para 3-0- metilglucosa, las
cuales son significativamente ms altas que las presentadas por las otras isoformas (Gould y
cols., 1991).
1.2.3.3 GLUT3/isoforma cerebral: Kayano y cois. en 1988, usando la estrategia de
hibridacin a baja especificidad con una sonda de cDNA para GLUT1, logr aislar un cDNA
desde una librera de msculo fetal humano, el cual codificaba para una protena de 496
aminocidos, la que tena un 64% y 52% de identidad con GLUTI y GLUT2
respectivamente. A esta protena la denominaron GLUT3. El ARN mensajero para este
transportador est presente en todos los tejidos, pero es expresado mayoritariamente en
rin, placenta y cerebro, considerndose incluso, el transportador de glucosa neuronal
(Kayano y cols., 1988; Nagamatsu y cols., 1993; Haber y cols., 1993). Es considerado
adems, un transportador de elevada afinidad, con un K m de 1.8 y 10.6 mM para 2-deoxyD-glucosa y 3-O-metilglucosa, respectivamente (Gould y cols., 1991).
1.2.3.4 GLUT4/isoforma adiposo-muscular: Esta isoforma fue aislada casi simultneamente
por 4 grupos de investigadores, los que trabajando en modelos humanos, de rata y ratn
(Birbaum, 1989; Charron y cols., 1989; Fukomoto y cols., 1989; James y cols., 1989),
lograron aislar un cDNA que codifica para un transportador de glucosa sensible a insulina, al
cual denominaron GLUT4. GLUT4 humano tiene un 65, 54 y 58% de identidad con
GLUT1, GLUT2, y GLUT3 humano, respectivamente. Altos niveles de ARN mensajero
para GLUT4 han sido detectados en tejido adiposo, msculo cardiaco y esqueltico.
(Birnbaum, 1989; Fukomoto y cols., 1989; Kaestner y cols., 1989). Estudios cinticos han
demostrado que su Km para 2-deoxy-D-glucosa es de 4.6 mM.
1.2.3.5 GLUT55soforma del intestino delgado: Uno de los ms recientes miembros de la
familia de genes de transportadores facilitativos de glucosa en ser identificado es GLUT5
(Kayano y col, 1990). GLUT5 humano muestra un 42, 40, 39 y 42% de identidad con

GLUT 1-4, respectivamente. Es expresado predominantemente en intestino delgado,

eritrocito, prstata y espermatozoides (Burant y cols., 1992; Davidson y cois., 1992;
Hundal y cols., 1992; Mahraoui y cois., 1992; Rand y cols., 1993; Concha y cois., 1997).
La distribucin subcelular de esta isoforma es an desconocida. De particular inters, es el
hecho de que esta isoforma no transporta glucosa y solo se relaciona con el transporte de
fructosa, que es una molcula utilizada por muy pocos tejidos en el organismo humano y de
la cual se conoce poco sobre su captacin y metabolismo. Estudios cinticos y de
inmunodeteccin, han determinado la expresin de este transportador (GLUT5) en lneas
clulares de cncer de mama (MCF-7 y MDA-468) y en tejidos mamarios tumorales, pero
no en tejidos normales de glndula mamaria, lo que sugiere que el proceso de transformacin
neoplsica de la clula mamaria, podra activar otras rutas metablicas, con el objetivo de
incorporar nuevos sustratos a la clula (Zamora-Len y cols., 1996). No obstante, la
explicacin para la incorporacin de fructosa por la clula neoplsica, se maneja an en un
mbito especulativo.
Otras Isoformas de GLUTs han sido postuladas hasta el momento, es el caso de
GLUT7 el que se encuentra restringido a sistemas de endomembranas (Waddell y cols.,
1992) y se cree, facilitara el transporte de glucosa a travs de los distintos organelos
citoplasmticos, como retculo endoplsmico y aparato de Golgi. GLUT6, se ha
determinado que corresponde a un pseudo-gen (Kayano y cols., 1990).
En relacin a la especificidad de los transportadores, GLUT1, GLUT3 y GLUT4,
son transportadores de glucosa (Gould y Holman, 1993) y de la forma oxidada de la
vitamina C, el cido deshidroascrbico (Vera y cols., 1993; Vera y cols., 1994). GLUT2,
adems de glucosa transporta fructosa y galactosa, pero con baja afinidad (Gould y Holman,
1993), mientras que GLUT5 es un transportador de fructosa de alta afinidad y no
transporta glucosa (Burant y cols., 1992; Gould y Holman, 1993).
Farmacolgicamente, estos transportadores no pueden ser distinguidos por agonistas
y antagonistas especficos, sin embargo, es posible clasificarlos de acuerdo a sus parmetros
cinticos para diferentes sustratos; es as como GLUT3 es de mayor afinidad que GLUTI,
GLUT2 y GLUT4 usando 2-deoxi-D-glucosa y 3-O-metilglucosa como sustrato.

1.3 Generalidades sobre neoplasia.

Una neoplasia es una proliferacin incontrolada de clulas que expresan diversos
grados de fidelidad a sus precursores y cuyo crecimiento excesivo contina an despus de
cesar el estmulo que origin el cambio (Robbins y cols., 1995). Las neoplasias pueden
clasificarse primariamente en dos grandes grupos: neoplasias benignas y malignas. Los
criterios para establecer esta clasificacin, estn basados en variados aspectos de su
comportamiento biolgico, tales como: diferenciacin y anaplasia, tasa de crecimiento,
invasin local e invasin a distancia o metstasis.
Aunque no existe claridad absoluta en cuanto a la etiologa de las neoplasias, existe
consenso en sugerir que una gran parte de ellas, corresponde a una enfermedad de tipo
gentica, dada principalmente por lesiones (mutaciones) de diversa naturaleza, en genes que
regulan los procesos normales de crecimiento, diferenciacin y muerte celular,
transformndose estos, en genes que inducen un aumento descontrolado en el nmero de
clulas, y que han sido denominados comnmente, como oncogenes celulares (c-oncs). No
obstante, existen evidencias para sugerir que algunas neoplasias pudiesen tener un origen
viral, ya que se ha demostrado que ciertos retrovirus introducen, en su clula husped, genes
que promueven la proliferacin celular descontrolada, estos genes alterados han sido
denominados comnmente como oncogenes virales (v-oncs).
La clula normal mantiene un absoluto control de su proliferacin, mediante la accin
conjunta de dos grandes grupos de genes, estos son: los proto-oncogenes y los genes
supresores de tumores. Los proto-oncogenes promueven el crecimiento celular actuando en
variados puntos de las vas de transduccin de seales, estimulando la proliferacin de una
manera regulada. Por otra parte, la clula controla negativamente su crecimiento, mediante la
accin de los genes supresores de tumores, cuyos productos regulan la proliferacin celular
y aseguran la estabilidad del genoma. Hasta el momento, se han identificado un gran nmero
de proto-oncogenes y genes supresores de tumores, y se ha encontrado que muchos de ellos
son blancos de mutaciones involucradas en los eventos de transformacin neoplsica.
Se debe tener presente, que la carcinognesis es un proceso en mltiples pasos tanto
a nivel fenotpico como gentico, es as como el crecimiento excesivo, la invasin local y la
capacidad de formar metstasis, se adquieren paso a paso, un fenmeno denominado
progresin tumoral. A nivel molecular, la progresin tumoral resulta de la acumulacin de

mutaciones genticas en una misma clula. De esta forma, la clula neoplsica expenmenta
diversas alteraciones con respecto a su equivalente normal, como son: a) cambios
proliferativos, b) alteracin en su sobrevida y c) cambios metablicos (Rubin y Farber,
1990; Robbins y cols., 1995).
1 .3.1 Cambios proliferativos: Los tejidos normales controlan su nmero celular, regulando
por un lado, la proliferacin, y por otro, la tasa de recambio. Estos procesos, como se
mencion anteriormente, estn bajo el control de los proto-oncogenes, genes supresores de
tumores y genes que inducen y regulan la muerte celular (apoptosis). Las alteraciones que
pueden experimentar los proto-oncogenes son numerosas y a distintos niveles en las vas de
transduccin de seales, resultando generalmente, en la sobre-estimulacin de la actividad de
estas molculas y por ende en una proliferacin descontrolada y anormal. Por otro lado,
mutaciones en los genes supresores de tumores se traducen por una parte, en una falla de la
inhibicin del ciclo celular en los puntos de restriccin especficos, con lo cual el ciclo
prosigue sin control, aumentando el nmero celular, y por otra, en una falla en el control de
la estabilidad del ADN, con lo cual, las posibles mutaciones no pueden ser reparadas y la
clula aumenta sus probabilidades de una futura transformacin maligna. Uno de los genes
supresores de tumores ms estudiados hasta el momento, ha sido el gen P53, cuyo producto
de expresin tiene como funcin, supervisar la integridad del genoma sirviendo como un
punto de control a nivel de G1IS. Si p53 detecta alguna alteracin en el material gentico,
activa la maquinaria de reparacin del ADN y la secuencia del material gentico es
restaurada. Sin embargo, cuando las alteraciones son demasiado extensas y no pueden ser
reparadas, p53 activa la cascada de proteasas especficas (caspasas) las que conducen a la
muerte de la clula daada, asegurando de esta forma, que estas mutaciones no se transmitan
a las futuras generaciones celulares (Shostak y cois., 1999). Ahora bien, cualquier mutacin
en el gen P53 se traducir en la produccin de una protena alterada, incapaz de cumplir su
funcin adecuadamente, por lo que las probabilidades de desarrollar una neoplasia aumentan
considerablemente, ms an, se ha documentado alta expresin de la protena p53 mutada en
neoplasias malignas de mama y colon (Soong y cols., 1997).
Est bien establecido que el aumento en la proliferacin es un evento comn en la
gran mayora de las neoplasias, siendo considerado adems, como un factor pronstico en
algunos tipos tumorales. La determinacin del estado proliferativo de un tumor, es un
anlisis de rutina en patologa, y se realiza mediante la determinacin inmunohistoqumica de
ciertos marcadores o indicadores de proliferacin, los cuales corresponden a protenas
nucleares, que tienen la particularidad de ser expresadas en clulas que estn en cualquier

10

etapa del ciclo celular, pero que no se expresan en aquellas clulas que estn en estado Go.
Dentro de estos indicadores, los ms conocidos son Ki-67 y el antgeno nuclear de
proliferacin celular (PCNA) (Takasaki y cols., 1981; Veronese y cols., 1993). La deteccin
inmunocitoqumica de estos marcadores permite establecer con bastante claridad el nivel de
proliferacin in situ, que presenta un determinado tumor en un momento dado y de esta
manera poder evaluar su comportamiento y desarrollar terapias adecuadas, considerando el
estado proliferativo real del tumor (Veronese y cols., 1993).
1.3.2 Alteraciones de la apoptosis: La regulacin del nmero celular en los tejidos, se realiza
en parte, por un proceso fisiolgico denominado muerte celular programada o apoptosis.
Este proceso se caracteriza por la expresin de un conjunto de genes activados por diversos
estmulos, los que se traducen en cambios morfolgicos y bioqumicos de la clula. Estos
cambios le dan a la clula apopttica una caracterstica morfolgica muy particular (ver tabla
1). Como se dijo anteriormente, apoptosis es un evento fisiolgico, lo que implica que existe
una homeostasis constante en los tejidos en los cuales se est desarrollando este proceso, a
diferencia de la necrosis, que es un tipo de muerte celular inducida por un proceso de injuria
tisular.
Se ha determinado que la apoptosis se produce por la accin concertada de un
conjunto de proteasas que han sido denominadas caspasas, y cuya activacin desencadena
variados eventos en la clula. Un evento temprano y caracterstico en apoptosis, es la
fragmentacin internucleosomal del ADN celular, lo que ha servido para el desarrollo de
metodologas destinadas a identificar las clulas apoptticas in situ, mediante el uso de una
enzima (TdT), que aade nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del ADN fragmentado,
pudiendo estos nucleotidos ser detectados por mtodos inmunolgicos.
Se ha establecido adems, que el proceso de apoptosis est regulado negativamente
por un conjunto de genes, de los cuales Bcl-2 ha sido uno de los ms analizados hasta el
momento, y cuyo producto de expresin ha sido relacionado con la inhibicin de muerte
celular en modelos biolgicos in vivo e in vitro (Larsen, 1994).
Teniendo en cuenta los antecedentes presentados anteriormente, se puede deducir
que cualquier mutacin en los genes que promueven la apoptosis o en los inhibidores de los
genes represores, produce el bloqueo de los eventos de apoptosis, con el consecuente
aumento en la sobrevida de las clulas del tejido sometido a este tipo de alteracin, lo que

Tabla 1. Comparacin entre los tipos de muerte celular, apoptosis y necrosis, desde el
punto de vista morfolgico y bioqumico.

APOPTOSIS

NECROSIS

CRITERIOS MORFOLGICOS
Delecin de clulas nicas

Muerte de grupos celulares

No hay respuesta inflamatoria

Existe respuesta inflamatoria

La membrana no pierde integridad

Prdida de integridad de la membrana

Lisosomas intactos

Ruptura de lisosomas

Formacin de cuerpos apoptticos

Lisis completa de la clula

CRITERIOS BIOQUIMICOS
Inducida por estmulos fisiolgicos

No fisiolgica

Requiere de energa

No requiere de energa

Transcripcin de nuevos genes

No se transcriben nuevos genes

Requiere sintesis de macromolculas

Precisa de sintesis de macromolculas

12

sumado a un elevado ndice proliferativo, favorecera notoriamente el desarrollo y

crecimiento tumoral.

1.3.3 Alteraciones metablicas: Entre los cambios metablicos destacan, bsicamente, las
modificaciones en el metabolismo glicoltico, el cual se hace principalmente anaerbico, lo
que conlieva a una menor produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (Robbins
y cols., 1995; Younes y cols., 1996a). Este cambio en la actividad glicoltica celular, persiste
an en presencia de oxgeno; siendo el consumo de oxgeno, notoriamente reducido en estas
clulas. Anlisis tumorales in vitro e in vivo, han demostrado que la captacin y consumo de
glucosa por parte de clulas neoplsicas aumenta en un 300%, con respecto a sus
equivalentes normales, mientras que el consumo de oxigeno disminuye dramticamente.
Estudios de medicin de la actividad de las enzimas del ciclo de Krebs y la fosforilacin
oxidativa han evidenciado una dramtica disminucin, sugiriendo incluso, que algunas de
estas enzimas dejan de funcionar, lo que resulta en una excesiva acumulacin de piruvato y
un aumento notable de la concentracin de lactato en la clula. Ms an, tanto las enzimas
del ciclo de Krebs, como las de la fosforilacin oxidativa estn localizadas en las
mitocondrias, organelos que se encuentran muy disminuidos en la clula tumoral con
respecto a la normal. No obstante, an no se tiene una explicacin satisfactoria del por qu
de esta modificacin en las rutas metablicas de la clula neoplsica. Sin embargo, se postula
que uno de los mecanismos de sobrevivencia de los tumores anaplsicos, es la utilizacin de
rutas metablicas menos complejas, de manera de simplificar al mximo su metabolismo
para poder obtener ventajas comparativas sobre su tejido huesped.

En estas condiciones anaerbicas, la actividad metablica de la clula neoplsica

depende, mayormente, de la captacin de glucosa que del consumo de oxgeno, por lo tanto,
la clula tumoral debe incorporar mayor cantidad de glucosa que las clulas normales para
suplir sus elevadas necesidades metablicas, producto de su intenso y descontrolado estado
proliferativo (Loike y cols., 1992; Robbins y cols., 1995; Younes y cols., 1996).
Considerando lo sealado anteriormente, se ha determinado que algunas neoplasias, al igual
que la mayora de las clulas tumorales en cultivo sobre-expresan transportadores
facilitativos de glucosa (Silverman, 1991; Mueckler, 1994; Younes y cols., 1996a; Haber y
cols., 1998). Esta propiedad de la clula tumoral ha sido utilizada para el desarrollo de
mtodos de diagnstico no invasivos como la tomografia de emisin de positrones (PET), en
la que se utiliza un anlogo de glucosa fluorado (1 8-fluoro-2-deoxy-D-glucosa) que tiene una

13

tasa de incorporacin mayor en las clulas tumorales que en el tejido normal (Nieweg y
cois., 1993), pudindose detectar con bastante certeza, la localizacin y magnitud de una
determinada masa tumoral. Este mtodo se ha utilizado principalmente para el diagnstico y
evaluacin del curso clnico experimentado por los pacientes con neoplasias de esta
naturaleza (Nieweg y cols., 1993b)

Anlisis de expresin realizados por Younes y cols., (1996) y resultados obtenidos

por nuestro grupo de investigacin (Godoy y cols., 1996, Godoy y cols., 1997) permiten
sugerir que GLUT 1 es una isoforma sobre-expresada en diferentes tipos de neoplasias, sin
embargo, no existen anlisis detallados de la expresin de todas las isoformas de GLUTs en
distintos tipos tumorales y, menos an, estudios tendientes a establecer la correlacin entre
expresin de GLUT1, estadios de desarrollo tumoral y aspectos proliferativos y de muerte
celular programada. Con respecto a las otras isoformas de GLUTs, se ha encontrado que
algunas de ellas tienen una expresin restringida a ciertos tipos tumorales (Zamora-Len y
cols., 1996; Younes y cois., 1997a). Yamamoto y cols. (1990), detect altos niveles de
RNAs mensajeros para GLUT3 en cncer de colon, sin embargo, hasta el momento no se ha
podido detectar la expresin de la protena en este tipo tumoral. No obstante, se ha
determinado la expresin de GLUT3 en tumores gstricos, testiculares y de ovario (Younes
1997b) Tzukamoto y cols. (1997), trabajando en lneas celulares de retinoblastomas
y cois.,
(WERI-Rbl e Y79), ha detectado la expresin de GLUT1 en ambas lneas celulares y
expresin de GLUT4 en la lnea celular Y79, sugiriendo que ests clulas tumorales en
cultivo poseen diferentes mecanismos para la incorporacin de glucosa.
Si bien, se ha obtenido un marco importante de informacin en relacin a la biologa
de la clula neoplsica, an no existen patrones que permitan predecir con certeza el
comportamiento biolgico que adoptar una determinada neoplasia durante las diferentes
etapas de su evolucin. No obstante, es un hecho que para comprender de mejor manera el
comportamiento de la clula neoplsica, se debe abordar el conocimiento de la biologa
tumoral de una manera ms integral, es decir, considerando variados aspectos que influyen
en su evolucin, como son: aspectos proliferativos, actividad metablica e ndice de muerte
celular programada.

14

1.4 Aspectos generales sobre cncer de mama.

El tumor mamario es una de las causas ms frecuentes de muerte en la mujer a nivel
mundial (Rubin y Farber, 1990; Arraztoa, 1993; Robbins y cols., 1995), con una tasa que
flucta entre 5.8 en pases como Japn y 28.4 en pases como Inglaterra (tasa por 100.000
mujeres). En Chile, no estamos ausentes de estas estadsticas, siendo el cncer de mama, una
de las tres primeras causas de muerte en la mujer.
El cncer de mama, es una enfermedad muy heterognea, tanto desde el punto de
vista clnico, como patolgico. Estudios estadsticos han evidenciado la presencia de
numerosos factores predisponentes para este tipo de enfermedad, sin embargo, anlisis
realizados en tumores mamarios in vitro e inducidos en animales de experimentacin
apuntan a 3 series de influencias que puediesen contribuir mayoritariamente a la gnesis del
cncer de mama, estos son: a) factores genticos, b) desequilibrios hormonales y c) factores
ambientales. No obstante, el mayor nmero de evidencias se ha obtenido en relacin a la
contribucin que realizan los oncogenes y genes supresores de tumores a la gnesis del
cncer de mama, como es el caso del gen supresor de tumores P53, el que se ha establecido
que se encuentra mutado en ms de un 50% de los tumores mamarios, y en un porcentaje no
menos considerable en otros tumores, como por ejemplo, en cncer de colon,
establecindose incluso, como un marcador de malignidad en neoplasias mamarias (Tsuda y
col, 1994; kawazaki y cols., 1997). Sin embargo, ninguno de estos criterios es vlido, por si
solo, para explicar la gnesis de todos los tipos de carcinoma de mama existentes.
Los carcinomas mamarios han sido clasificados, por la Organizacin mundial de la
salud, en dos grandes grupos: No invasores e infiltrantes (ver tabla 2).
En nuestro estudio nos hemos avocado principalmente, al anlisis del carcinoma
ductal invasor (CDI), dado que, de los tumores mamarios malignos, el CDI corresponde al
grupo ms importante, constituyendo un 65 a 80% de todos los carcinomas mamarios
(Robbins y cols., 1995; Rossen, 1996).
El carcinoma ductal invasor forma, invariablemente, un tumor slido. A simple vista,
este carcinoma puede presentar necrosis acompaada usualmente de hemorragia. L.a
apariencia histolgica del carcinoma ductal es muy heterognea, consiste bsicamente de
clulas malignas de revestimiento de los conductos dispuestas en cordones, nidos slidos de
clulas, tbulos, glndulas, masas anastomosadas y mezclas de todos ellos. En muchos

15

Tabla 2. . Panormica de los tipos histolgicos tumorales segn la clasificacin de la

Organizacin Mundial de la Salud (OMS)

Carcinomas no invasoresa
la. Carcinoma intraductal.
lb. Carcinoma intraductal con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lubulillar ,z situ.

Carcinomas In vasoresa
la. Carcinoma ductal, sin otra especificidad.
lb. Carcinoma ductal infiltrante con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lobulillar infiltrante.
3.- Carcinoma medular.
4.- Carcinoma coloide (mucinoso).
5.- Carcinoma tubular.
6.- Carcinoma adenoide qustico.
7.- Carcinoma apocrino,
8.- Carcinoma papilar infiltrante.

aRbbflS

S (1995) Patologa estructural y funcional. Cap 24, P1215.

16

casos pueden verse tambin componentes intraductales. Las clulas malignas invaden el
estroma de tejido conectivo, siendo, frecuentemente fcil, observar invasin de espacios
perivasculares y perineurales, as como de vasos sanguneos y linfticos, lo que sin duda
pone de manifiesto la presencia de clones metastsicos en estas neoplsias.
La graduacin de estos tumores obedece a una estimacin de su diferenciacin, la que
est limitada a la porcin invasiva del tumor. Hasta el momento, esta clasificacin se realiza
segn dos criterios ampliamente establecidos. El primero de ellos evala el grado de atipia
nuclear y el segundo, la diferenciacin histolgica (tabla 2).
La primera clasificacin (atipia nuclear), considera la citologa de los ncleos
tumorales en comparacin con los ncleos de las clulas epiteliales normales, reportndolos
en trminos de tres categoras: Bien diferenciados (grado III), intermedio (grado II) y
pobremente diferenciado (grado 1). La graduacin nuclear no proporciona informacin sobre
el patrn de crecimiento del tumor, por lo tanto, esta clasificacin puede ser aplicada,
indistintamente, a los carcinomas ductales invasores, como a cualquier otro subtipo de
carcinoma mamario (Rossen, 1996). El segundo tipo de clasificacin (histolgica), describe el
patrn de crecimiento microscpico de los CDI, as como tambin, los rasgos citolgicos de
diferenciacin. El grado histolgico es, usualmente, expresado en tres categoras: Bien
diferenciado (grado 1), moderadamente diferenciado (grado II) y pobremente diferenciado
(grado III). Con respecto a este tipo de clasificacin, existen muchas variantes, dentro de las
cuales, una de las ms utilizadas es la propuesta por Scar-Bloom-Richardsoon (SBR). Esta
clasificacin es ampliamente utilizada en los servicios de patologa y es la que se ha
considerado para la evaluacin de las muestras tumorales proporcionadas para nuestro
estudio.
1.5 Expresin de GLUTs en cncer de mama.
El cncer de mama, al igual que la gran mayora de las neoplasias, tiene la
caracterstica de poseer una actividad metablica y de captacin de glucosa elevada (Brown
y Wahl, 1993). Diferentes estudios (Brown y Wahl, 1993; Younes y cols., 1996a; ZamoraLen y cols., 1996) y resultados obtenidos en nuestro laboratorio (Godoy y cols., 1996;
Castro y Nualart, 1997; Godoy y cols., 1997), evidencian una sobre-expresin de la
isoforma GLUT1 en este tipo tumoral. Referente a la expresin de las otras isoformas,
Brow y Wahl (1993) detectaron GLUT2, GLUT3 y GLUT4 en adenocarcinoma de mama,
no observando expresin de GLUT5. Anlisis posteriores (Zamora-Len y cols., 1996) han

17

propuesto que la clula tumoral de mama tambin expresa GLUT5, y por lo tanto, posee la
capacidad de metabolizar fructosa. Este hecho, como se mencion anteriormente, tiene
particular importancia puesto que se tiene muy poca informacin sobre el metabolismo de
esta hexosa en el organismo humano y adems, se sabe muy poco sobre el metabolismo de
hexosas, diferentes de glucosa, por la clula mamaria tumoral. La expresin de GLUT5 en
cncer de mama sugiere, por tanto, que esta neoplasia tiene la capacidad potencial de
incorporar fructosa, la cual podra ser utilizada como una fuente alternativa para la
obtencin de energa metablica por parte de estas clulas. Este hecho, abre nuevas
posibilidades para una mejor comprensin de las adaptaciones metablicas que pudiesen
realizar las clulas neoplsicas mamarias.
Si bien se han realizado diferentes estudios tendientes a determinar la expresin de
GLUTs en cncer de mama, no existen anlisis detallados de la expresin y distribucin de
GLUTs en cncer de mama a nivel celular y subcelular, como tampoco, estudios que
permitan correlacionar estos hallazgos con parmetros de progresin tumoral, proliferacin
celular y muerte celular programada. Es fundamental realizar estudios que permitan dilucidar
estas interrogantes y que ayuden a comprender en parte, la biologa de la clula tumoral de
una manera ms completa y globalizada, considerando todos los aspectos que determinan el
comportamiento ms o menos agresivo de una determinada neoplasia, para as poder abordar
su tratamiento clnico de manera ms integral. Estos estudios permitirn, adems, avanzar en
la bsqueda de nuevos criterios para la clasificacin de estas neoplasias, basndose no solo
en las caractersticas morfolgicas de la clula, sino que tambin en aspectos moleculares,
propios de la neoplasia. Junto con esto, se abren perspectivas para la aplicacin de nuevas
tcnicas de diagnstico precoz y tratamiento del cncer.

lo

1 .6 Hiptesis de trabajo.
Existe un conjunto de estudios tendientes a establecer la expresin de
transportadores de hexosas en diferentes tipos de neoplasias. Estos anlisis han permitido
observar que algunos tumores expresan altas concentraciones de GLUT 1, sin embargo, no se
han considerado importantes preguntas relacionadas con la localizacin de la expresin de
GLUT1 en estos tumores y su relacin con malignidad tumoral. Anlisis iniciales realizados
en cncer de colon, permiten sugerir que a medida que avanza el tumor y aumenta su
malignidad existe una mayor expresin de GLUT1, sugiriendo que la expresin de esta
isoforma puede ser utilizada como un marcador de malignidad tumoral (Younes y cols.,
1996b) Si bien existen algunos estudios relacionados con la expresin de GLUTI, poco se
conoce sobre la expresin y funcin de otras isoformas de GLUTs en cncer, as como
tambin de la relacin que pudiese existir entre la expresin de las diferentes isoformas de
GLUTs y marcadores de proliferacin celular y apoptosis.
En nuestro estudio, nos hemos propuesto la siguiente hiptesis de trabajo: " La
sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias humanas est directamente relacionada
con el grado de agresividad tumoral. La expresin de otras isoformas de GLUTs es una
propiedad particular de cada tumor, permitiendo a estas neoplasias metabolizar hexosas
diferentes de glucosa, que presentan vas metablicas menos reguladas".

19

1.7 Obtjetivos.
Los objetivos planteados en nuestro estudio, son los siguientes:
Estandarizar diferentes mtodos inmunohistoqumicos y de hibridacin in situ para la
deteccin de GLUTs a nivel de protena y RNA, respectivamente.
2.- Analizar la expresin de transportadores de hexosas GLUTI-5 en diversas neoplasias
humanas y establecer su correlacin con el tejido normal.
3.- Determinar la expresin, a nivel celular, de GLUT1 y GLUT5 en neoplasias de mama
con diferentes grados de desarrollo tumoral.
4.- Determinar la expresin de GLUT1 y GLUT5 en cncer de mama a nivel subcelular
utilizando microscopa electrnica.
5.- Analizar y correlacionar la expresin de marcadores de proliferacin celular Ki-67 y
PCNA con la expresin de GLUT1, en cncer de mama.
6.- Correlacionar el nivel de expresin de indicadores de muerte celular programada con
expresin de GLUT1, en cncer de mama.

2. MATERIALES Y METODOS
2.1- Materiales biolgicos.
2.1.1 Anticuerpos: Nuestro laboratorio dispone de una completa batera de anticuerpos
primarios para la deteccin de las diferentes isoformas de GLUTs, as como tambin, para
diferentes tipos de marcadores celulares. Poseemos adems, un conjunto de anticuerpos
secundarios conjugados a diferentes enzimas, fluorocromos y partculas de oro, adems de
complejos multienzimticos (PAP) para la deteccin de los anticuerpos secundarios
respectivos (ver tabla 3).
2.1.2 Tumores de archivo y tejidos normales: Para el estudio de neoplasias de diversos
orgenes, se analiz un conjunto de muestras de archivo provenientes de 20 tumores
diferentes. Estas muestras fueron facilitadas por los Servicios de Anatoma Patolgica del
Hospital Regional de Valdivia, Departamento de Patologa de la Universidad de Concepcin
y el Programa de Farmacologa Molecular del Memorial Sloan-Kettenng Cancer Center
(MSKCC), Nueva York, USA. En el caso del cncer de mama, se analizaron 33 muestras de
carcinoma ductal invasor, con diferentes grados de diferenciacin histopatolgica (2
muestras SBR 1, 17 de grado SBR II y 11 de grado SBR III). La totalidad de las muestras de
carcinoma ductal invasor de mama, fueron facilitados por el servicio de Patologa de la
Universidad de Concepcin. Las muestras de 5 tumores de mania inducidas en ratones
"nude" fueron donadas por el MSKCC. Paralelamente, se analizaron tejidos controles,
provenientes de 17 muestras de mama humana normal, donadas por el MSKCC.
2.1.3 Clulas en cultivo: Para los anlisis de expresin in vitro, se utilizaron las lneas
celulares de cncer de mama MDA-468 y MCF-7 (American Type Culture Collection), las
que fueron donadas por el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York. USA. Las
clulas se hicieron crecer en una mezcla de medio Eagle modificado por Dulbecco, el cual
contiene glucosa 17.5 mM y medio F- 12 (1:1 vollvol), suplementado adems con suero
bovino fetal 10% y penicilinalestreptomicina 1%.
2.1.4 Aislamiento de membranas de eritrocitos: Se obtuvo sangre fresca por puncin venosa
y se centrifug a 3000 rpm por 10 min para separar los eritrocitos del resto de los
componentes sanguneos. El sobrenadante se elimin por aspiracin y el "pellet" de

21

Tabla 3. Anticuerpos y complejos enzimticos utilizados en los mtodos de

inmunodeteccin in situ e in vitro.
Especie

Dilucin

GLUTI

conejo

1:1000

GLUT2

1:1000

GLUT3

conejo
conejo

GLUT4

conejo

1:1000
1:1000

GLUT5
Antgeno Nuclear de

conejo

1:1000

Proliferacin Celular

ratn

1:100

DAKO

Antgeno Ki-67 humano

conejo/ratn

1:500

DAKO

Protena p53 humana

ratn

Inmunoglobulina de conejo

cerdo

1:200
1:100

DAKO
DAKO

Inmunoglobulina de ratn

conejo
conejo

1:100
1:100

DAKO
DAKO

ratn

1:50

DAKO

Digoxigenina-POD

oveja

1:500

B. Mannheim

Digoxigenina-AP

oveja
oveja

1:500
1:50

B. Mannheim

biotinilada
Inmunoglobulina de ratn
biotinilada
Inmunoglobulina de conejo-

cerdo

1:400

DAKO

conejo

1:200

DAKO

FITC
Inmunoglobulina de conejo-

cerdo

1:30

DAKO

AP

cabra

1:500

SIGMA

Nombre
-

-PAP conejo
PAP ratn

FITC-AP
Inmunoglobulina de conejo

B. Mannheim

DAKO

Sistema ABC
Inmunoglobulina de conejoPartculas de oro

Marca

1:50

cabra

22

BBlnternational

eritrocitos se lav 3 veces en PBS 150 mM (pH 7.4) para eliminar el resto de plasma.
Luego, los eritrocitos fueron usados en fosfato de sodio 5 mM (pH 7.4) y se centrifug la
muestra a 10.500 rpm por 30 mm. Posteriormente, el "pellet" se lav en fosfato de sodio 10
mM (pH 7.4) 4 a 5 veces y luego se alicuot y almacen a 70C hasta su uso como control
positivo en la metodologa de "immunoblotting".
2.2 Mtodos.
Los mtodos que comprenden, el procesamiento previo y posterior anlisis de las
muestras, son los siguientes:
2.2.1. Procesamiento de las muestras.
2.2.1.1 Fijacin: Las muestras se fijaron por inmersin en formalina acuosa al 10%, durante
un perodo de 24 a 48 hrs, luego de lo cual, se lavaron en agua corriente por 1 hr
aproximadamente. Algunas de las muestras se fijaron por inmersin en solucin Bouin,
durante un perodo de 72 hrs.
2.2.1.2 Deshidratacin y aclaramiento: Previo a la inclusin en parafina, las muestras se
sometieron, indistintamente, a los procesos de deshidratacin y aclaramiento:
- Deshidratacin: Las muestras fueron pasadas por una batera de etanoles a concentraciones
crecientes (etanol 70%, etanol 95%, etanol 100% 1-1V) por 15-20 min cada vez.
- Aclaramiento: Las muestras se pasaron por benzoato de metilo (1411), por 30 min cada
vez, luego de lo cual, se incluyeron en benzol (141) por 5 mm.
2.2.1.3 Inclusin: Una vez sometidas al proceso de aclaracin, las muestras fueron incluidas
en parafina o paraplast a 60C y luego enfriadas rpidamente en agua, para solidificar el
paraplast.
2.2.1.4 Obtencin y montaje de los cortes: De cada muestra, incluida en bloque de paraplast,
se obtuvieron cortes de 7 ptm de espesor con un micrtomo Reichert jung 2040, luego, los
cortes se montaron en porta-objetos cubiertos en poli-L-lisina al 0.1% (Sigma) o gelatina al
1% (BDH), para favorecer la adhesin de la muestra al vidrio, en un bao termorregulado

23

(Lab Line) a 45C. Posteriormente, las muestras se almacenaron en una estufa

termorregulada (ORSA 500) a 37C por 24 hrs y finalmente, se guardaron a temperatura
ambiente.
2.2.2 Pretratamiento de las muestras.
2.2.2.1 Desparafinacin y rehidratacin de los cortes: Las muestras se sometieron a 3
lavados en xilol por 5 min cada uno, luego de lo cual, se rehidrataron en etanol a
concentraciones decrecientes (100%, 96%, 85%, 70% y 50%) por 5 min cada vez.
Posteriormente, se pasaron por agua destilada, y luego se equilibraron en el tampn
apropiado, de acuerdo a la tcnica a utilizar.
2.2.2.2 Inhibicin de peroxidasa endgena: Luego de la deshidratacin en alcohol 50%, se
incubaron las muestras en una solucin de perxido de hidrgeno al 3% en metanol absoluto
(MERCK), por un perodo de 15 min a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron en
agua destilada y posteriormente se equilibraron en tampn Tris-fosfato lO mM pH 7.8.
2.2.2.3 Exposicin a microondas: Para favorecer la inmunodeteccin de los marcadores
nucleares p53 y Ki-67, algunas muestras fueron tratadas en un horno de microonda (600 W)
durante 5 a 7 mm, sumergidas en tampn citrato 0.1 M (pH 6.4).
2.2.2.4 Digestin con proteinasa K: Algunas muestras se incubaron en una solucin de
proteinasa K (DAKO) 1 p.g/ml en PBS 150 mM, por un perodo de 5 min a 37C en estufa
termorregulada. La reaccin se detuvo por dilucin de la enzima en agua destilada estril o
con una solucin de glicina 0,1 M en PBS 150 mM.
2.2.3 Mtodos morfolgicos.
2.2.3.1 Inmunolocalizacin: Se estandarizaron 7 sistemas diferentes para la deteccin de las
distintas isoformas de GLUTs, los cuales pueden subdividirse a su vez, en 3 grandes
grupos: mtodos peroxidasa anti-peroxidas (PAP) (mtodo de PAP revelado con 3,3
diaminobencidina DAB, mtodo PAP amplificado con iones de cobalto, mtodo PAP
revelado con 3-amino-9-etilcarbasol AEC), mtodos de segundo anticuerpo marcado
(mtodo del segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina, mtodo del segundo
anticuerpo conjugado con partculas de oro y mtodo del segundo anticuerpo conjugado con
fluoresceina) y por ltimo, el mtodo de avidina-biotina (ABC). En todos los sistemas

24

utilizados, las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes (tabla
3), durante toda la noche en cmara hmeda a temperatura ambiente.
2.2.3.1.1 Mtodos PAP: Posterior a la incubacin con el anticuerpo primario, las muestras
analizadas por el mtodo de PAP, se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM (pH
7.8) por 10 min cada vez, luego de lo cual, se incubaron con el segundo anticuerpo anti IgG
de ratn o conejo, segn correspondi, durante un periodo de 2 a 4 hrs a temperatura
ambiente. Posteriormente, las muestras se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM
(pH 7.8) por 10 min cada vez y se incubaron con PAP de ratn o conejo, durante 30
minutos a temperatura ambiente. Por ltimo, la reaccin enzimtica fue revelada utilizando
diferentes sustratos:
a) 3,3 diaminobenzidina y perxido de hidrgeno, por 15 minutos (Nualart y Rodrguez,
1996).
b) Complejo "DAB/METAL concentrate" (Pierce) diluido 1: 10 en "buffer sustrato stable
peroxide" (Pierce), durante 3 a 5 mm.
e) PAP-AEC en cambio, se revel con una solucin tampn acetato 0.1 M (pH 5.2), en
presencia de 3-amino-9-etilcarbasol y perxido de hidrgeno al 3%, por 15-20 mm.
2.2.3.1.2 Mtodos de segundo anticuerpo marcado: Posterior a la incubacin del anticuerpo
primario, las muestras fueron incubadas utilizando:
a) Un segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina (tabla 3), por 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. La actividad enzimtica fue revelada con bromo-cloroindolil-fosfato (BCIP) y "nitro-blue-tetrazolium" (NBT) en presencia de tampn Tris-HC1
0.1 M (pH 9.5) NaC1 0.1 M, MgC1 2 0.05 M.
b) Un segundo anticuerpo conjugado con partculas de oro (tabla 3), durante 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. Este sistema fue revelado con una solucin de nitrato de
plata (Silver enhancer, SIGMA).
c) Un segundo anticuerpo conjugado a fluorescena (tabla 3) por 3 hrs, protegido de la luz
directa. La imagen fluorescente fue procesada utilizando un sistema de digitalizacin "Axon
Imagin Worbench 2.1" acoplado al microscpio de epifluorescencia.
2.2.3.1.3 Mtodo de avidina-biotina (ABC): El mtodo de deteccin ABC, incorpora el uso
del complejo avidina-biotina (DAKO), un sistema de alta sensibilidad para deteccin de
antgenos. Se utiliz un anticuerpo secundario biotinilado (DAKO) el cual fue incubado por
30 min en cmara hmeda a temperatura ambiente. Luego de lavar las muestras en tampn
Tris-fosfato 10 mM (pH 7.8), se incub con el complejo ABC [A: avidina en PBS (pH 7.2)

25

B: Peroxidasa biotinilada en PBS (pH 7.2) C: Tampn Tris-HC1 0.05 M (pH 7.6)] por 30
min en cmara hmeda. La actividad enzimtica fue revelada como el mtodo de peroxidasa
convencional (revelado DAB normal).
2.2.3.2 Inmunolocalizacin ultraestructural: Cada muestra fue fijada en Karnovsky [tampn
fosfato 0,1 M (pH 7.4), p-formaldehido 4%, glutaraldehido 2.5%], post-fijadas con
tetrxido de osmio al 1% por 1 h a 4 C, e incluida en epon-araldita. Los cortes ultrafinos
fueron contrastados, para su observacin, con acetato de uranilo y citrato de plomo al 1%.
Para inmunocitoqumica, previo a la incubacin con el primer anticuerpo, los cortes
ultrafinos se trataron con perxido de hidrgeno 3% y/y por 5 minutos para eliminar el
osmio. El suero anti-GLUT1 fue diluido 1:500 en Tris-HC1 10 mM (pH 7.4), conteniendo
BSA 1% e incubado por 16 h a 4C. Como segundo antisuero se utiliz anti-IgG de conejooro (jartculas de 10 nm) diluida 1:25 en tampn-Tris-HC1 10 mM sin BSA. La incubacin
se realiz por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, los cortes fueron contrastados con
uranilo y plomo al 1%, cubiertos con una membrana de carbn y observados al microscopio
electrnico.
2.2.4. Mtodos de biologa molecular.
2.2.4.1 Marcaje de sondas: Las sondas oligonucleotdicas utilizadas en la tcnica de
hibridacin in situ con "oligo-probe" fueron diluidas a una concentracin de 2 pg/ml en
tampn Tris-EDTA 10 mM (pH 8.0). Luego, se marcaron con biotina-14-dUTP, utilizando
la enzima TdT (Gibco) por 2 h a 37C (Sambrook y cols., 1989). Esta enzima aade
nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del DNA. Las sondas oligonucleotdicas para
cada transportador corresponden a los ltimos 40 nucletidos de la regin 3' de los RNA
mensajeros respectivos.
GLUT 1: 5 'CACTTGGGAGTCAGCCCCCAGAGGGTGGAAGAGCTCCTA3'
GLUT5: 5 'CTGTTCCGAAGTGACAGGTGGAAGCTCTTTCAGTTCCTCC3'
2.2.4.2 Obtencin de sondas de RNA por transcripcin iii vitro: El proceso de transcripcin
in vitro se realiz a partir del cDNA para GLUT1 y GLUT5 donado en un vector de
expresin plasmidial (pcDNA3). El inserto para GLUTI y GLUT5 se localiz entre los
sitios de restriccin para Kpn y Xho 1 del plasmidio (pcDNA3). El vector de expresin
contiene dos sitios promotores para RNA polimerasas virales SP6 y T7, ubicados a cada

lado del inserto. Para la obtencin de la ribosonda "antisense", el plasmidio pcDNA3 se

lineariz con la enzima de restriccin Kpn 1 y se utiliz la RNA polimerasa SP6 2 U/pi en
presencia de dNTP 1 mM, dUTP-digoxigenina 0.35 mM, tampn lx, inhibidor de RNasa 2
U/pi (kit Boehringer Mannheim). En el caso de la sonda "sense", el plasmidio se lineariz
con Xho y se utiliz la RNA polimerasa T7 2 U/pi, bajo las mismas condiciones de
reaccin. La obtencin de las ribosondas se realiz por el sistema "t-un off', durante 2 hrs a
3 7C, luego de lo cual, se digiri el DNA plasmidial con DNasa 1 libre de RNasa 1 U/tl por
15 min a 37C. Finalmente, la actividad de la DNasa 1 se detuvo con EDTA 0.2 M y las
sondas fueron congeladas a -20C hasta su uso. Para la hibridacin in situ, se utilizaron 2 p.g
de sonda aproximadamente.
2.2.4.3 Hibridacin in situ: Se realiz hibridacin in situ utilizando dos tipos de sondas
diferentes. En primer lugar, se utilizaron sondas oligonucleotdicas de 17 mer, las cuales
fueron marcadas con nucleotidos conjugados a biotina (ver marcaje de sondas), y en segundo
lugar, se utilizaron ribosondas de 2 kb, obtenidas por transcripcin in vitro a partir del
cDNA donado en un vector de expresin plasmidial (ver obtencin de ribosondas).
Las muestras se trataron con proteinasa K por 5 min a 37C, luego de lo cual, se postfijaron en p-formaldehido al 4% por 5 min a 4C, y posteriormente, se incubaron en una
solucin de trietano!aminalanhidrido actico 0.1 M (pH 8.0) por 10 min a temperatura
ambiente. Luego, las muestras se incubaron en solucin de prehibridacin del kit Novagen
[Tris-HCI 10 mM (pH 7.5), formamida 50%, NaCI 0.6 M, EDTA 1 mM, heparina 50
.tg/ml, DTT 10 mM, PEG 8000 10%, Solucin Denhardt lx] por 30 min a 37C.
Posteriormente, se incubaron en solucin de hibridacin del kit Novagen [Tris-HC1 10 mM
(pH 7.5), formamida 50%, NaC] 0.6 M, EDTA 1 mM, heparina 50 tg/ml, DTT 10 mM,
ADN carrier 0.5 mg/mI, tRNA 0.5 mg/mI, PEG 8000 10%, solucin Denhardt 1X],
conteniendo las sondas respectivas (ver sondas), por toda la noche a 3 7C. Luego de esto,
las muestras se lavaron en tampn citrato salino (SSC) a concentracin decreciente (2x SSC,
lx SSC, 0.5x SSC, y 0.16x SSC) durante 10 min cada vez, para disminuir la unin
inespecifica de las sondas. La deteccin, en el caso de sondas oligonucleotdicas, se realiz
con anti-biotina conjugado con fosfatasa alcalina, el cual se incub por 2 horas a temperatura
ambiente y se revel con bromo-cloro-indolil-fosfato (BCIP) y "nitro-blue-tetrazolium"
(NBT) en tampn Tris-HC1 0.1 M (iH 9.5), NaC1 0.1 M, MgCl2 0.05 M (Sambrook y col,
1989). Cuando se utilizaron ribosondas marcadas con digoxigenina, las muestras se
incubaron con anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina por 2 horas a temperatura
ambiente en cmara hmeda y revelado de la misma forma que el mtodo anterior.

27

No se consider la utilizacin de hibridacin isotpica, debido al costo del mtodo y la

dificultad en la manipulacin de las muestras e interpretacin de resultados al tratar de
correlacionar la expresin de GLUTs con los parmetros histopatolgicos.
2.2.4.4 RT-PCR in situ: Cortes de 7 pim montados en portaobjetos cubiertos con
aminoalkilsilano (Perkin Elmer), fueron digeridos con proteinasa K (DAKO) 1 jig'ml por 5
min a 37C, lavados en agua-DEPC estril y en etanol absoluto por 1 min cada vez y luego
secados al aire. Posteriormente, las muestras se post-fijaron en p-formaldehido al 4% en
PBS 150 mM por 5 min a 4C, se lavaron dos veces en agua-DEPC estril y una vez en
etanol absoluto por 1 min cada vez, y luego se secaron al aire. Posteriormente, las muestras
se trataron con trietanolaminalanhdrido actico 0.1 M (pH 8.0), por 10 min a temperatura
ambiente, luego de lo cual, se incubaron en DNasa 1 1 U/tl (Boehringer Mannheim), por 3
hr a 37C en cmara hmeda, y posteriormente, se lavaron 3 veces en agua-DEPC estril por
10 min cada vez y se re-incubaron en DNasa 1 1 U/tl por toda la noche a 37C en cmara
hmeda. Las muestras se incubaron nuevamente en trietanolamina/anhdrido actico, bajo las
mismas condiciones anteriores, y posteriormente, fueron sometidas al proceso de
transcripcin reversa iii situ siguiendo las indicaciones del kit CLONTECH (H 20-DEPC,
oligo dT 20 pmol, IX tampn de reaccin, dNTP 0.5 mM, inhibidor de RNasa 1 U/pJ,
transcriptasa reversa Mu1V 200 U/ng RNA). Las muestras se lavaron en agua-DEPC y
etanol absoluto por 2 min cada vez y luego se amplific el DNA complementario de
GLUTI y GLUT5 mediante la reaccin de PCR in situ siguiendo las indicaciones del kit
Perkin-Elmer (H 20-DEPC, MgC1 2 4.5 mM, Tampn II lx, dNTP 200 .tM, dUTPdigoxigenina 10 p.M, partidores 0.5 p.M, ampli-taq DNA polimerasa 10 U/.tl), utilizando
partidores especficos para la secuencia del transportador (ver fig. 8). Por ltimo, las
muestras se incubaron con anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Boebringer
Mannheim) y la deteccin se realiz con NBT y BCIP en presencia de tampn Tris-HC1
0.1 M (pH 9.5), NaCl 0.1 M, MgCl2 0.05 M.
2.2.4.5 Inmunodeteccin de protenas inmovilizadas en membranas de nitrocelulosa despus

de la electroforesis: Para el anlisis de la especificidad de los anticuerpos anti-GLUT1 y

anti-GLUT5 se realiz la deteccin de estas protenas en membranas aisladas de eritrocitos
humanos (ver aislamiento de membranas), en donde se ha demostrado previamente su
presencia (Concha y cols., 1997). Para esto, las protenas de los extractos de membrana
fueron separadas y analizadas realizando gel de poliacrilamida-SDS al 10
eletrotransferencia de protenas e inmunodeteccin en membranas de nitrocelulosa.

2.2.4.5.1 Electroforesis: Se prepar un gel separador constituido por la mezcla de

acrilamida-bisacrilamida al 10%, N,N,N',N'- tetrametiletilendiamina (TEMED) al 0.1%,
persulfato de amonio al 0.03% y SDS al 0.4%, en tampn Tris-HCI 0.8 M (pH 8.8). Como
gel espaciador se us la mezcla acrilamida-bisacnlamida al 5%, TEMED al 0.25%
persulfato de amonio al 0. 1 % y SDS al 0.2%. en una solucin tampn Tris-HCI 0.1 M (pH
6.8). El gel se ubic en una cmara de electroforesis (SIGMA), sumergido en tampn de
corrida Tris-glicina [Tris 6.25 mM (pH 8.3), glicina 48 mM, SDS 0.1%]. Las muestras
fueron diluidas 1:1 en tampn de carga 2x (Tris-HC1 0,25 M, SDS 4%, 13-mercaptoetanol
4%, Glicerol 20%) y sembradas en el gel espaciador. Posteriormente, se aplic una corriente
de 20 voltios durante 8 horas para permitir la migracin de las protenas a travs del gel
separador. Para marcar el frente de corrida se utiliz azul de bromofenol al 0.2% en tampn
de carga 2x. Como marcadores de peso molecular se utilizaron: 3-ga1actosidasa (116 kDa),
fosforilasa-b (97 kDa), albmina bovino (66 kDa), albmina EGO (45 kDa) y anhidrasa
carbnica (29 kDa).
2.2.4.5.2 Electrotransferencia: La electrotransferencia de las protenas a membrana de
nitrocelulosa se realiz en una cmara de transferencia (SIGMA) en la que se ubic el gel en
contacto con la membrana de nitrocelulosa dentro de un sistema de material poroso y se
sumergi en un tampn de transferencia [Tris-HC1 125 mM (pH 8.9), glicina 200 mM,
metanol 20%, SDS 0.067%]. El proceso de transferencia se realiz a 50 voltios durante 2 h.
2.2.4.5.3 Inmunodeteccin de protenas: Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon en
leche descremada al 5% en PBS 150 mM (pH 7.4) y se incubaron por 18 h con el anticuerpo
policlonal correspondiente (anti-GLUT1 o anti-GLUT5) en dilucin 1:1500 en leche
descremada al 5% en PBS 150 mM (pH 7.4). La incubacin se realiz a temperatura
ambiente en cmara hmeda. Posteriormente, las membranas se lavaron 3 veces en PBS 150
mM (pH 7.4), durante 10 min cada vez. Como segundo anticuerpo se utiliz anti-IgG de
conejo (DAKO) diluido en leche descremada al 5% en PBS 150 mM (pH 7.4) el que se
incub durante 2 horas a temperatura ambiente en cmara hmeda. Luego, se lavaron las
membranas en las mismas condiciones anteriores. Por ltimo, se incub la membrana con un
complejo peroxidasa anti-peroxidasa diluido en leche descremada al 5% en PBS 150 mM
(pH 7.4), por 45 minutos a temperatura ambiente en cmara hmeda. La actividad
enzimtica de la peroxidasa se revel con una solucin de 4-cloro-a naftol al 0.2% en
presencia de perhidrol.

29

2.2.4.6 Determinacin de apoptosis mediante la tcnica de TUNEL: Para realizar la tcnica

de TUNEL (T: terminal; U: dUTP; N: nick; E: end; L: labeling) se utiliz el kit ApopTag
(Oncor). Cortes de 7 ptm montados sobre portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina, fueron
tratados con proteinasa K 1 tg/m1 por 5 min a 37C y posteriormente, se incubaron con la
enzima TdT por 1 h a 37C . Esta enzima cataliza la adicin de nucleotidos marcados con
digoxigenina a los extremos 3 'OH del DNA fragmentado. Posteriormente, cada muestra fue
incubada con un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con fluorescena diluido 1:50 por 30
minutos a temperatura ambiente, luego de lo cual, las muestras se incubaron por 1 hr, con
anti-fluorescena conjugado con fosfatasa alcalina. La actividad enzimtica fue revelada con
tampn de reaccin, en presencia de los sustratos NBT y BCIP. Las muestras se montaron
en glicerol-PBS y la reaccin fue visualizada en un microscopio ptico. Se observ un total
de 10 campos en cada muestra y se contaron los cuerpos apoptticos, versus ncleos
totales del epitelio neoplsico.

30

3. RESULTADOS

3.1 PARTE: ESTANDARIZACION Y ANALISIS DE EXPRESION DE GLUTS EN

TUMORES HUMANOS.

3.1.1 Anlisis de la especificidad de los anticuerpos hechos contra GLUTs.

En una primera etapa de este trabajo de tesis, nos propusimos estandarizar las
condiciones para el desarrollo de la metodologa de inmunocitoqumica, comenzando por
analizar la especificidad de los anticuerpos policlonales, hechos contra las diferentes
isoformas de GLUTs (GLUT1-GLUT5). Para esto, estudiamos la expresin de cada
isoforma en tejidos controles, teniendo en cuenta que cada una de ellas posee un patrn de
expresin caracterstico. La expresin de GLUT1 se analiz en tejido cerebral, en donde se
observ una fuerte reaccin en membranas de clulas endoteliales de los micro-capilares que
forman la barrera hemato-enceflica (Fig. 2, A, flecha). GLUT2 fue analizado en tejido
heptico, donde se observ inmunoreactividad en las membranas plasmticas de los
hepatocitos (Fig. 2, B, flecha). GLUT3 se estudi en testculo humano, detectndose
expresin en membranas celulares de espermtidas (Fig. 2, C, flecha). La expresin de
GLUT4 se comprob en tejidos insulino-sensibles como es el caso del tejido adiposo. En
este tejido, se observ expresin de GLUT4 en la membrana plasmtica de los adipocitos
(Fig. 2, D, flecha). La expresin de GLUT5 se confirm en eritrocitos humanos (Fig. 2, E,
flecha). No se observ reactividad cuando el anticuerpo primario fue omitido o incubado
previamente con el pptido inductor correspondiente (Fig. 2, F). Adicionalmente, se analiz
la especificidad de GLUT1 y GLUT5 mediante la tcnica de inmunodeteccin de protenas
inmobilizadas en papeles de nitrocelulosa despus de la electroforesis. Se observ que antiGLUT1 reconoce una banda de un tamao molecular entre 45 y 66 kDa (Fig. 2, A, surco 1).
Anti-GLUT5 en cambio, reconoce una banda de 66 kDa aproximadamente (Fig 2, A, surco
3). En ambos casos se observ que la reactividad no se present cuando el anticuerpo
primario fue incubado previamente con el pptido inductor correspondiente (Fig. 2, B,
surcos 2 y 4). Ambos resultados estn de acuerdo con lo descrito previamente en la
literatura (Concha y cols., 1997; Zamora-len y cois., 1995).

31

Fig 2. Control de la especificidad de anticuerpos que reconocen transportadores de

glucosa. Panel superior: La reaccin para cada transportador se observ en las membranas
celulares (flechas). (A) Tejido cerebral de ratn analizado con anti-GLUT1. (B) Tejido
heptico de ratn analizado con anti-GLUT2. (C) Testculo humano analizado con antiGLUT3. (D) Tejido adiposo analizado con anti-GLUT4. (E) Eritrocitos humanos analizados
con anti-GLUT5. (F) Control negativo de testculo humano. Panel inferior: Expresin de
GLUT1 y GLUT5 en membranas de eritrocitos obtenidas por choque osmtico. Las
muestras fueron corridas en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%, y posteriormente, las
protenas fueron electrotransferidas a papeles de nitrocelulosa. (A) Inmunodeteccin de
GLUT1 y GLUT5 (surcos 1 y 3). Controles (surcos 2 y 4). Panel superior, aumento de
figuras A-F: x 420.

32

f..

GLUT1

GLUT3

GLUT

GLUT5

GLUT1 GLUT5
97 66

. I

45 -*

29 -

23 4

33

Control

3.1.2 Estandarizacin de diferentes mtodos inmunocitoqumicos y clasificacin de su

reactividad.
El siguiente paso en nuestro estudio, consisti en estandarizar diferentes mtodos
inmunocitoqumicos con el fin de seleccionar el ms adecuado para el anlisis de la expresin
de GLUTs en muestras de archivo provenientes de tejidos normales y tumorales. Para esto,
se probaron siete metodologas diferentes (Fig. 3), analizando la sensibilidad y resolucin de
cada tcnica. Este anlisis nos permiti determinar que el mtodo de mayor resolucin, pero
con sensibilidad intermedia, fue el mtodo PAP (Fig. 3, A-F). Los mtodos que mostraron
mejor sensibilidad y resolucin fueron los mtodos revelados con DAB y DAB-cobalto
(Fig. 3, A-D). El mtodo revelado con dietilcarbasole fue el menos sensible y el de menor
resolucin de los mtodos que utilizaron el sistema PAP (Fig. 3, E-F). Los mtodos de
mayor sensibilidad fueron los sistemas ABC y el uso de un segundo anticuerpo conjugado
con partculas de oro, cuya deteccin fue revelada con nitrato de plata. Sin embargo, los
mtodos de alta sensibilidad incorporaron un porcentaje importante de fondo (Fig. 3, I-L),
que se present como tincin no especfica en el tejido conectivo. El mtodo de menor
sensibilidad y resolucin correspondi al segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa
alcalina y revelado con los sustratos NBT y BCIP (Fig. 3, G-H). Con este sistema, se
observ tincin de fondo asociada principalmente a reas necrticas del tejido tumoral, lo
que correspondera a fosfatasa alcalina endgena. El mtodo fluorescente present una baja
sensibilidad, pero una excelente resolucin. Esta metodologa fue utilizada para digitalizar las
imgenes fluorescentes, proceso que aument considerablemente la sensibilidad, permitiendo
adems, hacer anlisis semicuantitativos del nivel de expresin de GLUT1 en tumores
mamarios (Fig. 11, E-H). Con todos los mtodos de anlisis utilizados se detect una tincin
intensa en las membranas celulares (Fig. 3, B, D, F, H, J, L, flechas).
La expresin de GLUTs en muestras normales y tumorales fue analizada y
clasificada en base a la intensidad de la reaccin, asignndole una, dos o tres cruces (+, ++,
+++), de acuerdo a su nivel creciente de reactividad (Fig. 4). La tincin dbil y moderada fue
preferentemente citoplasmtica, sin embargo, en la reaccin intensa se destacaron muy
claramente las membranas celulares (Fig. 4). Las muestras que no presentaron reaccin
fueron clasificadas como negativas (Fig. 4). Este criterio de anlisis fue adaptado de Nagase
y col. (1995).

34

Fig 3. Mtodos inmunocitoqumicos para la deteccin del transportador de glucosa

GLUT1 en tumor de mama. Las figuras en el borde izquierdo representan un esquema de
los diferentes mtodos inmunocitoquimicos utilizados. (A-F) Mtodo de peroxidasa
antiperoxidasa, revelado con diaminobencidina (A y B), diaminobencidinalamplificado con
iones de cobalto (C y D) y dietilcarbasole (E y F). (G y H) Mtodo del segundo anticuerpo
conjugado con fosfatasa alcalina. (1 y J) Mtodo del segundo anticuerpo conjugado con
partculas de oro. (K y L) Mtodo del complejo avidina-biotina. Todos los sistemas
analizados fueron capaces de detectar la presencia del transportador GLUT1 en las
membranas plasmticas de las clulas tumorales, pero con diferente sensibilidad y resolucin.
Aumento de figuras A, C, E, G, 1, K: x 35. Aumento de figuras B, D, F, H, J, L: x 350.

35

+DRB

i'

4k

PAP DAB

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:-

4+ DII E
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4k
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PAP-DAB - Co

E
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ABC

36

4 .

Tincin

negativa

dbil

moderada

intensa

++

+++

citoplasma

citoplasma

Smbolos

Localizacin

negativa

dbil. +

-'

i-

moderada +4-

.;fl:..

membrana celular
y citoplasma

tenp

4++

Fig 4. Criterios de clasificacin de la reaccin inmunocitoqumica. En el panel superior

se indican los criterios empleados para clasificar la intensidad de la reaccin
inmunocitoqumica. En el panel inferior se muestran ejemplos de cada nivel de reaccin.
Aumento de figuras x250.

37

3.1.3 Expresin de GLUT1 en diferentes tumores humanos.

Teniendo en cuenta resultados previos que sugeran una sobre-expresin de
transportadores facilitativos en tumores gastrointestinales y mamarios (Yamamoto y col.,
1990; Brown y Wahl, 1993), decidimos analizar, mediante inmunocitoqumica, la expresin
de las isoformas GLUT1-GLUT5 en un amplio conjunto de tumores humanos, que
correspondieron a una casustica de ms de 120 muestras tumorales provenientes de 22
tipos de neoplasias diferentes. Paralelamente, analizamos y comparamos la expresin de
estas isoformas de GLUTs en 78 muestras normales, correspondientes a cada tejido
tumoral.
Nuestros resultados demuestran que, de todas las isoformas analizadas, GLUT1 fue
la ms ampliamente expresada en los tumores, encontrndose reactividad variable para esta
molcula (+,++,+++)en aproximadamente un 70% de las muestras tumorales (Tabla 4). Sin
embargo, la sobre-expresin (+++) de GLUTI, se encontr solo en un reducido grupo de
tumores que no sobrepas el 40% del total de las muestras (Tabla 4). La expresin de
GLUTI en tejidos normales solo se present en un 29% del total de muestras normales
analizadas (Tabla 4 y 5), siendo siempre de menor intensidad que la reactividad observada
en tejidos tumorales (datos no mostrados).
El anlisis de inmunocitoqumica a nivel ptico mostr que la expresin de GLUTI
en los diferentes tipos tumorales es muy heterognea, encontrndose elevada expresin
(+++) en un grupo de tumores considerados de comportamiento altamente agresivo, que
adems poseen una tasa de proliferacin elevada (Tabla 4). Este resultado se observ
preferentemente en carcinoma de pulmn, adenocarcinoma de colon, melanoma, carcinoma
ductal invasor de mama, carcinoma de ovario y carcinoma embrionario testicular. En estos
tejidos, la expresin de GLUTI se localiz con mucho mayor intensidad a nivel de las
membranas plasmticas que en el citoplasma de las clulas tumorales (Fig. 5). En el
parnquima neoplsico de tumores de colon, mama, pulmn y ovario, la reaccin fue
generalmente ms intensa hacia el centro de los nidos de clulas tumorales, especficamente,
en las clulas que bordean las reas de necrosis, sin embargo, no se apreci reaccin positiva
para GLUTI en la zona de necrosis propiamente tal (Fig. 5, A, D, G, K). A nivel celular, la
inmunoreactividad para GLUT1 se localiz con mayor intensidad, en aquellas regiones de la
membrana plasmtica que estn en contacto con clulas neoplsicas vecinas. Esta
observacin fue muy evidente en carcinoma de ovario, de mama y colon (Fig. 5, H e 1
flecha, K), mostrando una ms baja reactividad en aquellas regiones de la membrana

Tabla 4. Expresion de GLUT1 en tejidos normales y tumorales (primera parte)

Tejidos con alta expresin.
Tejido

Diagnstico

Clon

Normal
Adenocarcinoma
Normal
Carcinoma invasor
Normal
Rhadomiosarcoma
Normal
Carcinoma
Normal
Melanoma
Basocelular
Normal
Carcinoma
Normal
Carcinoma
Carcinoma indiferenciado
Mesotelioma (pleura)
Normal (ceis. germinales)
Seminoma
Carcinoma embrionario

G. Mamaria
M.Esquelt.
Ovario
Piel

Prstata
Pulmn

Testculo

Total
*
Solo en clulas basales.
** Reaccin focal en reas cercanas a necrosis
ND: No determinado.

Positivos/total
013

Intensidad
-

818
0/12

28133

Nl)

112

015

313

3/3
212
1/1
10/15 *
5122**
0/5
212
4/4
2/2
3/3

315
212
16146 61/86

+
+/+++
+++
+++

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40

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OW

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4.

CARCINMA DE COLON

Control

Fig 5. Tumores malignos con elevada expresin de GLUT1. (A y C) Carcinoma de mama,

(B) mesotelioma, (E y F) carcinoma de pulmn, (D, H e 1) carcinoma de ovario, (J y L)
melanoma, (G y K) carcinoma de colon. La reactividad se localiz mayoritariamente, en las
membranas plasmticas de las clulas tumorales (A, D, G, K, flechas), en reas cercanas a
regiones de elevada necrosis (D, flechas). (C, F, 1, L) Mayor aumento de regiones tumorales,
en donde se muestra claramente la localizacin del transportador a nivel de membranas
plasmticas (flechas). En cncer de mama, ovario y colon se observa una polaridad de la
inmunoreaccin hacia regiones de la membrana plasmtica que contactan clulas vecinas (C,
flecha y cabeza de flecha; 1, flechas). Cn: conectivo. Imgenes con aumento menor: x 300.
Imgenes con aumento mayor: x 900.

40

plasmtica que estn en contacto con el tejido conectivo (Fig. 5, C, cabeza de flecha). Junto
con la elevada reaccin a nivel de membrana plasmtica, tambin se observ
inmunoreactividad para GLUTI en el citoplasma de las clulas tumorales, no obstante, esta
reactividad fue siempre de menor intensidad que la observada en la membrana plasmtica
(Fig. 5, C, 1, L).
El anlisis de inmunocitoqumica permiti determinar que existe un grupo de tumores
que poseen bajos niveles de expresin de GLUT1. Dentro de este grupo de tumores se
clasificaron adenocarcinoma de pncreas, astrocitomas, carcinoma de rion, hgado,
estmago, y leiomioma de tero (Tabla 5). La deteccin de GLUT1 en estas neoplasias, se
observ preferencialmente a nivel citoplasmtico (Fig. 6, A-H), adems, se determin que la
gran mayora de las clulas de una misma muestra presentaron similares niveles de
reactividad para GLUT1 (Fig. 6, E-H, flechas). La reactividad celular contrast con la
reaccin negativa del parnquima tumoral (Fig. 6, G). Slo el linfoma de Hodgkin y el
carcinoma papilar de ovario no presentaron reaccin positiva para GLUT 1, an cuando, se
analiz un nmero bastante significativo de muestras.
3.1.4 Anlisis de otras isoformas de GLUT (GLUT2-GLUT5) en diferentes tumores
humanos.
Anlisis previos de expresin de GLUTs en tipos particulares de neoplasias, como
por ejemplo, el cncer de pulmn (Younes y cols., 1997a) sugieren que estos tumores
pudiesen estar expresando otras isoformas de GLUTs (en este caso particular, la isoforma
GLUT3), conjuntamente con la expresin de la isoforma GLUT1. Para determinar si la
expresin de otras isoformas de GLUTs es un evento generalizado en los tejidos tumorales
y, si las otras isoformas de GLUTs muestran un patrn de expresin complementario a
GLUT1, en neoplasias donde se detect esta isoforma, se procedi a analizar y correlacionar
la expresin de GLUT1 con la expresin de las isoformas GLUT2, GLUT3, GLUT4 y
GLUT5, en un amplio rango de tumores humanos.
La expresin de estas isoformas en tejidos normales fue ms restringida an, ya que
solo algunos tejidos mostraron expresin de algunas de ellas. Es el caso del tejido prosttico,
el cual present expresin de GLUT5 especficamente en las clulas columnares del epitelio
glandular pseudoestratificado (Tabla 6). Por otro lado, en muestras de testculo, se observ
expresin de GLUT3 y GLUT5 asociada principalmente a clulas germinales
(espermtidas).

Il

Tabla S. Expresin de GLUT1 en tejidos normales y tumorales

(segunda parte).

Tejidos con baja expresin

Tejido

Diagnstico

Cerebro

Normal (excluyendo vasos)

Astrocitoma
Papiloma de plexos
Normal
Carcinoma
Normal
Carcinoma
Linfoma
Linfoma de Hodgkin
Normal
Adenocarcinoma
Tumor neuroendocrino
(tumor carcinoide)
Normal
Carcinoma
Normal
Carcinoma papilar
Normal
Leiomioma

Estmago
Hgado
Linfoide
Pncreas

Rin
Tiroides
Utero

Positivos/total
515

515
2/2
011
213

015
212
3/3
1112

0/5
212
3/3

+
+
+
+
-

++
+

212

015

016

015

42

++

315

8/32

Intensidad

212
24/41

%
-
0

' ARCUMA RENAL

IIEIOMIOMA DE WERO
Cn
'.
*
'

'

1,

CARCINOM.t GASTRICO

'.-

..

1INFOM4 DE HODGKIN
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Fig 6. Tumores malignos con dbil o moderada expresin de GLUT1. (A) Leiomioma de
tero, (B) carcinoma renal, (C) carcinoma gstrico, (D) linfoma de Hodgkin. La reactividad se
localiz, principalmente, a nivel citoplasmtico. Con mayores aumentos (E, F, G y H), se
aprecia una distribucin homognea de la reactividad para GLUT 1 en el citoplasma de la
clulas tumorales (flechas). En todos los tumores se observaron glbulos rojos con intensa
tincin en la membrana celular (D, cabeza de flecha). Cn: conectivo. Imgenes con menor
aumento: x 150. Imgenes con mayor aumento: x 420.

43

Nuestro anlisis mostr que la expresin de las isoformas GLUT2-GLUT5 no fue

tan generalizada como la de GLUT1, si no que estuvo ms bien restringida a ciertos tipos
tumorales (Tabla 6). Algunas neoplasias, como el carcinoma de colon y de mama, expresaron
GLUT2, GLUT3, GLUT4 y GLUT5 (Tabla 6, Fig. 7), en tanto que otras neoplasias solo
mostraron expresin de una o dos de estas isoformas (Tabla 6). Es as como el mesotelioma
de pleura solo mostr expresin de GLUT3 y GLUT5, el carcinoma de ovario por el
contrario, mostr expresin de GLUT2 y GLUT5, en tanto que el carcinoma indiferenciado
de pulmn y el melanoma solo mostraron expresin de las isoformas GLUT3 y GLUT4
respectivamente (Tabla 6, Fig. 7). Adems, algunas neoplasias como el carcinoma de pulmn
y de prstata, no expresaron ninguna de las isoformas mencionadas anteriormente.
La reaccin para GLUT2 fue preferentemente localizada a nivel citoplasmtico,
tincin que se puede observar claramente en el carcinoma de colon y mama (Fig. 7, B y C;
flecha), sin embargo, en el carcinoma hepatocelular se detect una intensa tincin a nivel de
la membrana celular (Fig. 7, A; flechas). En el mesotelioma de pulmn, se detect
inmunoreactividad heterognea para GLUT3, siendo mayor la inmunoreactividad hacia el
centro de los brotes de clulas tumorales, generalmente asociados con zonas de mayor
necrosis (fig. 7, D). En cuanto a la reactividad citoplasmtica, esta fue casi siempre difusa y
distribuida de manera homognea en todo el citoplasma de la clula tumoral, sin embargo, en
las reas de mayor tincin se detect una clara presencia del transportador en las membranas
celulares (Fig. 7, D; flecha). Resultados similares se obtuvieron con anti-GLUT3 en
carcinoma de colon y seminoma (Fig. 7, E y F; flechas). En el cncer de mama, se observ
que la reactividad para la isoforma GLUT5, mostr una distribucin de tipo granular, la cual
se distribuy por todo el citoplasma celular (ver ms adelante), an cuando tambin se
observ reaccin en la membrana celular (fig. 7, G; flecha). La reaccin para GLUT5 en los
otros tumores positivos fue preferentemente citoplasmtica (Fig 7, H e 1; flechas).

3.211 PARTE: ANALISIS DE LA EXPRESION DE GLUT1 Y GLUT5 EN CANCER DE

MAMA.
El anlisis de la expresin de GLUTs en todo el conjunto de muestras tumorales nos
permiti identificar un grupo particular de neoplasias malignas que se caracterizaron por
presentar elevados niveles del transportador facililitativo de glucosa, GLUT1. Dentro de

44

Tabla 6. Expresion de GLUT2-5 en tejidos normales y tumorales.

Tejido

Diagnstico

Cerebro

Normal

Colon

Estmago

GLUT2
-

GLUT4

012

GLUTS
-

(++)

515
(+/+++)

0/5
315
(+/++)

1/2
(+++)
0/5
7/7
(+/+++)

2/2

0/2

012

0/2

Astrocitoma

Normal
Adenocarcinoma

0/5
5/5

Normal
Carcinoma

GLUT3

015

(~)
G. Mamaria

Normal
Carcinoma invasor

30/33

3/33

2133

28133

112
(+)
213
(+)
0/12
012
012

(+/++)

(+/++)

Normal
Carcinoma

112

0/2

0/2

Linfoide

Linfoma

013

013

013

M. esquel.
Ovario

Linfoma de Hodgkin
Rhadomiosarcoma
Carcinoma

0112
012
112

0112
012
012

0112
0/2
0/2

Hgado

(+++)

(+)
Pncreas

Normal
Adenocarcinoma

112

0/2

012

(+)

(+)
Piel
Prstata

Pulmn

Rin
Testculo

Tiroides
Utero

112

Normal
Melanoma
Normal

0/4

014

015

015

0/4
0/5

014
9/10*

Carcinoma
Carcinoma
Carcinoma indiferenciado

015
012
013

015
012
113

015
012
013

(+++)
0/5
012
013

Mesotelioma (pleura)

212

012

2/2

Carcinoma
Normal (ceis. germinales)

(+)
012
013

Seminoma

Carcinoma embrionario
Carcinoma papilar
Leiomioma

012
0/2
2/2

* Membrana apical de las clulas columnares

ND: No determinado.
+/-i--i-/+++: Intensidad de la reaccin.

(++)
212
(+/+++)
0/2
313

012
0/3

3/5

NL)
0/2
012

ND
012
012

(++)
012
3/3
(+++)
115
(+++)
ND
012
212

"

GLUT2

'.- -

GLUT2

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'GJUT2

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Fig 7. Anlisis de la localizacin de GLUT2, GLUT3 y GLUT5 en tumores malignos.

La tincin se localiz preferentemente en la membrana celular de las clulas tumorales
(flechas). (A, B, C) Expresin de GLUT2 en carcinoma hepatocelular (A), de colon (B) y de
mama (C). (D, E, F) Expresin de GLUT3 en mesotelioma de pulmn (D), carcinoma de
colon (E) y seminoma testicular (F). (G, H, 1) Expresin de GLUT5 en carcinoma de mama
(G), colon (H) y astrocitoma (1). Aumento de figuras x250.

46

este grupo particular de tumores, seleccionamos el cncer de mama, para realizar un anlisis
detallado de la expresin de GLUT1 y GLUT5. La expresin de la isoforma GLUT5 en
estas neoplasias es de particular importancia ya que esta molcula solo transporta fructosa,
un sustrato metablico que es utilizado por muy pocos tejidos en el organismo humano y
sobre el cual se conoce muy poco acerca de su metabolismo, ms an, se conoce muy poco
acerca de la posible captacin y metabolismo de fructosa por parte de las clulas tumorales.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, se analiz la expresin de las isoformas
GLUT1 y GLUT5 en muestras de archivo de carcinoma ductal invasor de mama y clulas
tumorales de mama en cultivo (MDA-468 y MCF-7), mediante las metodologas de RTPCR in situ e inmunocitoqumica a nivel ptico y electrnico.
3.2.1 Anlisis de expresin del RNA mensajero para GLUT1 y GLUT5 en mama normal y
tumoral.
En una primera etapa, se comenz por detectar la presencia del mensajero para
GLUT1 y GLUT5 en tejidos normales y tumorales. Con este propsito, nosotros
empleamos en nuestro estudio, tres metodologas diferentes, estas son: Hibridacin in situ
con oligo-sondas, hibridacin in situ con ribosondas y RT-PCR iii situ.
La utilizacin de oligo-sondas y ribosondas no lograron detectar de manera eficiente
el mRNA para GLUTI y GLUT5 en tejidos mamarios (datos no mostrados). La deteccin
de los mensajeros para estos transportadores, utilizando los mtodos no isotpicos
mencionados anteriormente, ha sido un objetivo complejo de resolver, posiblemente debido
a la baja sensibilidad de los mtodos empleados.
Considerando los problemas con los mtodos convencionales para realizar
hibridacin in situ, estandarizamos el mtodo de RT-PCR in situ, el cual nos permiti
amplificar la seal para su posterior deteccin en estas muestras. Si bien, el mtodo de RTPCR in situ es de compleja estandarizacin, tiene la ventaja de que permite detectar
secuencias de mRNA con una sensibilidad muy superior a los mtodos convencionales de
hibridacin in situ, presentando una sensibilidad aproximada de dos copias de mRNA por
clula.
El anlisis de RT-PCR in situ requiere de variados controles que aseguren la
especificidad de la reaccin, uno de los ms importantes es comprobar la especificidad de los

47

partidores que se utilizaron para amplificar el cDNA de cada transportador. Esto se realiz
mediante la tcnica de RT-PCR iii vitro en tejidos controles en los cuales la expresin de
GLUTI y GLUT5 est ampliamente confirmada. Para esto, se realiz PCR ti vitro a los
cDNAs obtenidos por transcripcin reversa a partir del RNA aislado de cerebro, placenta e
hgado, con el propsito de detectar el producto correspondiente a GLUT1 (Fig. 8, A).
Tambin se utiliz RNA aislado de testculo para la deteccin de los productos de PCR
correspondientes a GLUT5 (Fig. 8, B). En el caso de GLUT1, se amplific un producto de
aproximadamente 400 pb, solo en placenta y cerebro, que son tejidos en los cuales se ha
demostrado que expresan el transportador GLUT1, por el contrario, no se detect el
mensajero en muestras aisladas de hgado, las que expresan mayoritariamente GLUT2 (Fig.
8, A). Estos productos de PCR para GLUT1 se corresponden con el tamao esperado. En el
caso de GLUT5 se amplific el cDNA para este transportador, que se obtuvo a partir de
una muestra de RNA total aislado de testculo y se amplific un producto de aprox. 400 pb,
que tambin se corresponde con el tamao esperado (Fig. 8, B). Este anlisis nos permiti
confirmar que los partidores son especficos para reconocer el cDNA de las isoformas
GLUTI y GLUT5.
En el anlisis de RT-PCR ti situ, tanto para GLUT1 como para GLUT5, es
necesario hacer notar que no todas las muestras analizadas presentaron reactividad positiva
para el mensajero de ambos transportadores, lo que se atribuy preferentemente a la falta de
control en el proceso previo de fijacin e inclusin de la muestra, proceso que por supuesto,
no fue controlado por nosotros, dado que la totalidad de las muestras correspondieron a
especmenes de archivo ya procesados en los servicios de patologa.
El anlisis de RT-PCR in situ para GLUTI en tejido de mama tumoral, mostr una
reaccin intensa, localizada mayoritariamente en las clulas del parnquima neoplsico, y
especficamente, en el citoplasma de dichas clulas tumorales (Fig. 9, A y B). En todos los
casos analizados, la reactividad para el mRNA de GLUT1 se caracteriz por ser heterognea,
presentndose reas con mayor reactividad que otras, dentro del mismo tumor (Fig. 9, A
flechas). La gran mayora de las reas analizadas que presentaron una elevada marca por RTPCR, se correlacionaron espacialmente con las reas que mostraron elevada expresin de la
protena para dicho mensajero, lo que se comprob realizando inmunohistoqumica y RTPCR in situ en cortes vecinos (datos no mostrados). Se observ adems, que las clulas
estromales presentaron un bajo grado de tincin (Fig. 9, A y B). En mama normal se pudo
evidenciar diferentes niveles de reaccin dentro de una misma muestra, observndose
glndulas con mayor reactividad que otras, ms an, dentro de una

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Fig 8. Anlisis de la especificidad de los partidores, mediante RT-PCR iii vitro. (A)
Deteccin del cDNA de GLUTI, amplificado a partir de RNA aislado de hgado (1), cerebro
(2) y placenta (3). Cuando el procedimiento de RT fue omitido, la reaccin de PCR no
mostr producto amplificado en todas las muestras analizadas (4). (B) Deteccin del cDNA
de GLUT5, amplificado a partir de RNA aislado de testculo (2). No se detect el producto
de amplificacin cuando no se realiz el procedimiento de RT (1). Las flechas indican la
migracin del producto amplificado. Se seala la migracin de un marcador de tamao de 600
pb.

49

misma glndula, la reactividad fue variable en cada una de las clulas (Fig. 9, D flecha). La
tincin se localiz en el citoplasma de las clulas del epitelio glandular, tambin se observ
reactividad en el componente mioepitelial y en algunas clulas del estroma, aunque en estas
ltimas, la reactividad fue de menor intensidad. Se realizaron controles negativos adicionales
como fueron la omisin del procedimiento de transcripcin reversa (Fig. 9, E), para controlar
que la reaccin correspondiese especficamente al cDNA obtenido en este paso. Otro
control negativo fue la omisin de los partidores en la mezcla de reaccin de PCR (Fig. 9, F),
lo que permiti controlar la actividad reparadora de la polimerasa. Adems de los controles
mencionados anteriormente, se probaron una serie de otros controles tendientes a verificar
otras etapas de la reaccin, estos son: la omisin de la DNA polimerasa, el tratamiento con
RNasa, la digestin previa de las muestras con DNasa 1, lo que permiti eliminar la reaccin
asociada al gen que codifica para los transportadores y que est presente en todas las
clulas, y el estudio de la actividad de digoxigenina endgena y especificidad del anticuerpo.
Todos los controles resultaron segn lo esperado, sugiriendo una elevada especificidad de la
reaccin (datos no mostrados).
Los anlisis de GLUT5 en tejido tumoral, al igual que para GLUT1, mostraron una
elevada reactividad asociada mayoritariamente al epitelio neoplsico, observndose tambin,
reaccin de menor intensidad en las clulas del estroma (Fig. 10, A y B). La reactividad se
localiz especficamente en el citoplasma de las clulas tumorales (Fig. 10, A y B, flechas).
La reaccin fue de tipo heterognea, con zonas tumorales que presentaron elevada tincin,
en tanto que otras zonas presentaron menor reactividad e incluso algunas fueron negativas
(datos no mostrados). En mama normal la reactividad se localiz preferentemente en el
citoplasma de las clulas mioepiteliales, las que se observaron intensamente teidas en la
periferia de las glndulas (Fig. 10, D, flecha M). Muy pocas clulas epiteliales de las
glndulas normales mostraron reactividad para el mRNA de GLUT5 (Fig. 10, C-E; flecha),
ms an, la mayora de las glndulas no evidenciaron reaccin para el mRNA de GLUT5
(Fig. 10, C; flechas). Las clulas del conectivo mostraron muy baja reactividad (Fig. 10, CF). Las clulas endoteliales de los vasos sanguneos fueron negativos (Fig. 10, E; flecha y).

3.2.2 Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de las isoformas GLUT1 y GLUT5 a

nivel de microscopa ptica y electrnica.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos por RT-PCR

in situ,

nos

propusimos analizar, con mayor detalle, la expresin y localizacin de las protenas GLUT1

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Fig 9. Anlisis de RT-PCR in silu para la deteccin del mensajero de GLUT1 en tejido
mamario normal y tumoral. (A, B) Tejido mamario tumoral. Las clulas tumorales
muestran una intensa reaccin localizada en el rea citoplasmtica (flechas). En las clulas del
tejido conectivo, se observa una reactividad menor. (C, D) Tejido mamario normal. Las
clulas normales presentan diferentes niveles de reactividad citoplasmtica (flechas). (E-F)
Tejido mamario tumoral. Controles negativos sin procedimiento de RT (E) y. realizando la
reaccin de RT sin partidores (F). Imgenes A, B: x 420. Imgenes C-F: x 350.

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Fig 10. Anlisis de RT-PCR iii situ para la deteccin del mensajero de GLUT5 en
tejido mamario normal y tumoral. (A, B) tejido mamario tumoral. Las clulas tumorales
muestran una intensa reaccin localizada en el rea citoplasmtica (flechas). En las clulas del
tejido conectivo, se observa una reaccin de menor intensidad. (C-F) Tejido mamario normal.
Las clulas epiteliales presentan diferentes niveles de reactividad (C, D, E, flechas marcadas
con E), sin embargo, la mayor reactividad se observ en las clulas mioepiteliales (D, E,
flechas marcadas con M). Las clulas endoteliales de los vasos sanguneos no mostraron
reacin positiva (E, flechas marcadas con y). Imgenes A, B: x 420. Imgenes C-F: x 350.

52

y GLUT5, tanto en tejido normal como tumoral, con el fin de establecer si la expresin del
mensajero se correlaciona con una elevada expresin de la protena en estos tumores. Para
esto desarrollamos inmunocitoqumica a nivel ptico, inmunofluorescencia con digitalizacin
de imgenes e inmunocitoqumica a nivel de microscopa electrnica.
La reactividad para la isoforma GLUT1 en tejidos tumorales fue muy heterognea
entre una muestra y otra, as como tambin, en diferentes reas de una misma muestra
tumoral, presentndose regiones del parnquima neoplsico con elevada inmunotincin y
regiones en que la reactividad fue menor e incluso negativa (Fig. 11, C). La mayor reactividad
se present generalmente en grupos de clulas que rodean las zonas de elevada necrosis, por
lo general, hacia el centro de los nidos de clulas tumorales en crecimiento, en donde la
densidad celular es mayor que en el resto del tumor (Fig, 11, D). Estos anlisis mostraron
tambin que, a nivel celular, la inmunotincin se localiz con mayor intensidad en la
membrana plasmtica de las clulas tumorales (Fig. 11, D flecha), sin embargo, tambin se
observ reaccin citoplasmtica, la que se distribuy de manera homognea en las clulas
tumorales (Fig. 11, D). Las clulas del tejido conectivo presentaron una baja expresin de la
protena GLUT1 (Fig. 11,C).
Los anlisis de inmunofluorescencia acoplados a digitalizacin de imgenes en tejidos
tumorales de mama, permitieron obtener una apreciacin semicuantitativa del nivel de
reactividad para GLUT 1 dentro de una muestra tumoral, comprobndose primero, que la
reactividad es heterognea entre las distintas reas del epitelio neoplsico en activa
proliferacin (Fig. 11, E y G). Este anlisis evidenci adems, que el mayor nivel de
inmunotincin se localiz preferencialmente en regiones de membrana plasmtica que
contactan clulas vecinas (Fig. 11, D, F, H flechas), en cambio, las regiones de la membrana
plasmtica que estn en contacto con el tejido conectivo, presentaron muy bajos niveles de
reactividad para este transportador, como se pudo observar en las reas apicales de la
membrana plasmtica de estas clulas tumorales (Fig. 11, F y H, cabezas de flechas). Al
igual que con el mtodo de peroxidasa, la reactividad se focaliz principalmente en el
parnquima neoplsico, no detectndose tincin asociada al tejido conectivo (Fig. 11, G).
Uno de los aspectos ms sorprendentes observados con esta tcnica, fue la localizacin
del transportador preferentemente en las membranas plasmticas que contactan clulas
vecinas (Fig. 11, D, F, H; flechas). Sin embargo, la expresin a nivel de las membranas
citoplasmticas que contactan el tejido conectivo fue muy baja (Fig. 11, F y H, cabezas de
flecha) Si bien, la reaccin en membranas celulares laterales se observ de un

53

Fig 11. Detecccin inmunocitoqumica de GLUT1 en tejido mamario normal y

tumoral. Muestras de tejido mamario normal y tumoral fueron incubados con anti-GLUT1
y. la inmunoreactividad fue revelada usando el metodo PAP (A-D) o el mtodo de
inmunofluorescencia acoplado a digitalizacin de imagen (E-H). (A, B) Tejidos normales de
mama. Las clulas epiteliales de las glndulas normales no mostraron inmunoreactividad (A).
En B se observa con mayor aumento el recuadro sealado en A. Las clulas epiteliales se
indican con flechas. (C-I-I) Se observan 3 tumores de mama diferentes (C, E y G). Un
aumento de las regiones enmarcadas se observan en D, F y H. La inmunoreactividad para
GLUT1 en los tejidos tumorales fue intensa y localizada preferentemente en la membrana
plasmtica de las clulas. A mayor aumento, se observa que la reactividad se asocia
fundamentalmente a regiones de la membrana plasmtica que contactan clulas vecinas (D, F,
H, flechas). Regiones de la membrana plasmtica que contactan el tejido conectivo mostraron
niveles de reactividad muy bajos (F, H, cabeza de flechas). Imgenes A, C y E: x 160.
Imgenes B, D y G: x 250. Imgenes F y H: x 900.

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55

espesor demasiado grande para ser producto del contacto de las membranas de dos clulas,
es factible que en estas reas se desarrollen interdigitaciones de membranas con gran cantidad
de transportador. Sin embargo, un anlisis ptico mostr pequeos espacios en el centro de
estas reas de tincin. Para tener mayores evidencias de estas posibles adaptaciones
presentes en clulas tumorales de mama, se realiz un estudio ultraestructural.
El anlisis ultraestructural permiti confirmar las evidencias previas obtenidas por
microscopa ptica y digitalizacin de imgenes fluorescentes, las que sugeran una
localizacin preferencial del transportador GLUT1 en regiones de la membrana plasmtica
que estn en relacin con clulas vecinas (Fig. 12, A). Sin embargo, estos anlisis
permitieron determinar que GLUTI se localiza selectivamente en zonas de la membrana
plasmtica que estn involucradas en la formacin de estructuras semejantes a "canalculos
intercelulares" (Fig. 12, B y C), ms an, no se observ marca en aquellas regiones de la
membrana que contactan clulas vecinas pero que no forman este tipo de estructuras
canaliculares (Fig. 12, B, M). La regin apical de la membrana plasmtica que esta en
contacto con el tejido conectivo, prcticamente no evidenci marca para GLUTI o present
una marca de mucho menor intensidad que la observada en las membranas de los canalculos
(Fig. 12, D; flecha, M), lo que concuerda con los anlisis de inmunoperoxidasa e
inmunofluorescencia. Se observaron adems, complejos de unin entre las clulas tumorales
en la periferia de estas estructuras canaliculares, estos complejos de unin fueron del tipo
"desmosomas" (Fig. 12, D).
Los anlisis en tejido mamario normal mostraron que solo el 50% de las muestras
analizadas present inmunoreactividad para GLUT5, siendo esta, de menor intensidad
comparada con la inmunotincin del tejido tumoral (Fig. 13, A-D). En el tejido mamario
normal, la reactividad se localiz mayoritariamente en el citoplasma de las clulas
mioepiteliales (Fig. 13, A y B, flechas M). La expresin de la protena GLUT5 se
corresponde con la expresin del mensajero en las clulas mioepiteliales, determinado por
RT-PCR in situ. En las clulas del epitelio mamario normal, la reaccin para GLUT5 se
present solo en algunas glndulas (fig. 13, C, E). Las clulas del tejido conectivo no
mostraron reactividad para esta isoforma.
Los anlisis inmunocitoqumicos para GLUT5 en cncer de mama, mostraron que la
expresin de esta molcula es ms generalizada que la expresin de GLUT1 en este tipo
tumoral, observndose reactividad positiva en un 95% de las muestras analizadas. Sin

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Fig 12. Anlisis de la expresin a nivel ultraestructural de GLUT1 en cncer de

mama. La imagen muestra la regin de contacto de cuatro clulas tumorales de mama. La
marca para GLUTI se localiz en zonas especficas de la membrana celular, circunscrita
solamente a membranas que contactaron estructuras canaliculares (B, C; M+). Las
membranas que contactan el tej ido conectivo, y que no forman canalculos con las clulas
vecinas, no presentaron una marca significativa (B y D; M-). Mv: microvellosidades. Imagen
A: x 4000. Imgenes B-D: x 14000.

57

embargo, a diferencia de la expresin de GLUT1, los anlisis de microscopa ptica

demostraron que GLUT5 se expresa preferentemente a nivel del citoplasma de las clulas
neoplsicas, siendo esta reaccin de tipo granular y homognea (Fig. 13, E-G), an cuando,
se observ una tendencia de las clulas tumorales a presentar una mayor intensidad de
reaccin hacia las regiones del citoplasma cercanas a la membrana nuclear. No se encontr
una correlacin entre el nivel de expresin y el grado de diferenciacin histopatolgica del
tumor. La reactividad fue inhibida completamente al preincubar el anticuerpo con el pptido
inductor correspondiente (fig. 13, H).
Estos hallazgos a nivel de microscopa ptica, nos motivaron a determinar, mediante
anlisis ultraestructural, la localizacin exacta del transportador en el citoplasma de las
clulas tumorales. El anlisis ultraestructural nos permiti confirmar la localizacin
citoplasmtica de la isoforma GLUT5 (Fig. 14, A) en estructuras membranosas de aspecto
vesicular (Fig. 14, B, C y D flechas). Algunos anlisis permitieron observar que la marca
para la isoforma GLUT5 se localiza tambin a nivel de la membrana de vesculas (Fig. 14, D;
flecha). Se observ, un porcentaje de marca inespecfica no asociada a estructuras vesiculares
que se distribuy de manera homognea por toda la muestra.
3.2.3 Anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en clulas de cncer de mama en cultivo
(MDA-468 y MCF-7).
Se analizaron inmunocitoqumicamente todas las isoformas de GLUTs en la lnea
celular MDA-468, con el fin de establecer una comparacin en la expresin de GLUTs entre
muestras de tejidos tumorales in vivo con clulas cultivadas in vitro. Nuestro anlisis mostr
que, al igual que en las muestras in vivo, las isoformas GLUTI y GLUT5 fueron las ms
ampliamente expresadas en clulas tumorales en cultivo (Fig. 15, A y E). En cuanto a la
expresin de la isoforma GLUT 1, esta se localiz preferentemente en la membrana que est
en contacto con clulas vecinas (Fig. 15, A flechas y recuadro). Este resultado se corresponde
con lo observado en muestras de tejidos tumorales de mama (Fig. 11, D, F y H). La expresin
de la isoforma GLUT5 se localiz preferencialmente en el citoplasma de las clulas
neoplsicas, aun cuando tambin se pudo apreciar reaccin a nivel de las membranas
plasmticas de estas clulas (Fig. 15, E; flechas y recuadro). La isoforma GLUT4 present
una dbil expresin citoplasmtica, en tanto que las isoformas GLUT2 y GLUT3 no fueron
inmunocitoqumicamente detectables (Fig. 15, D, B y C respectivamente). La reaccin fue
negativa cuando se suprimi la incubacin con el anticuerpo primario (Fig. 15, F control).

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Fiz 13. Deteccin inmunocitoqumica de CLI LJT5 en tejido mamario normal y tumoral.
(A-C) Tejido mamario normal. (D-H) Tejido mamario tumoral. En el tejido normal, se
observaron clulas epiteliales glandulares con reacin positiva citoplasmtica (C; E+) y con
reaccin negativa (A, B; E-). Las clulas mioepiteliales tambin mostraron reactividad
citoplasmtica para GLUT5 (A y B; M). Las clulas tumorales evidenciaron una mayor
intensidad de inmunotincin, fundamentalmente asociada al citoplasma (E, F, G, flechas). (H)
Control negativo con anticuerpo pre-adsorbido con el pptido inductor del suero. Asterisco
en imagen E: vaso sanguneo. Imgenes A-E: x 160. Imgenes F, H: x 200. Imagen G: x 250.

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Fig 14. Anlisis de la expresin a nivel ultraestructural de GLUT5 en cncer de

mama. (A) Se observan dos clulas glandulares neoplsicas de mama. La reactividad para
GLUT5 se localiza en el citoplasma. (B y C) Mayores aumentos de las reas encuadradas en
A. La marca se localiza preferencialmente en estructuras de tipo vesicular (flechas). (D)
imagen de otra clula tumoral, en la que se observa la marca a nivel de la membrana vesicular
cercana a la regin externa de la clula (flecha). Imagen A: x 6000. Imgenes B-D: x 15000.

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GLUT2

GLUT1

GLUT3

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CONTROL

Fig 15. Expresin de GLUTs en la lnea celular de cncer de mama MDA-468. Anlisis
inmunocitoqumico para GLUT1 (A), GLUT2 (B), GLUT3 (C), GLUT4 (D) y GLUT5 (E).
Los estudios de localizacin in vitro solo mostraron expresin de las isoformas GLUT1 (A)
y GLUT5 (E). La expresin de GLUTI se localiz, preferentemente, en zonas de la
membrana plasmtica que contactan clulas vecinas (A, flechas). La expresin de GLUT5 en
cambio, se localiz en el citoplasma celular, an cuando, se observ tambin reaccin a nivel
de la membrana plasmtica (E, flecha). GLUT4 se expres dbilmente en el citoplasma de las
clulas (D), en tanto que GLUT2 y GLUT3 fueron inmunocitoqumicamente no detectables
(B y C). (F) Control negativo. Imgenes A-F: x 450.

61

3.3 ifi PARTE: ANALISIS PRELIMINARES DE LA CORRELACION ENTRE LA

EXPRESION DE GLUT1, GRADO DE DIFERENCIACION DEL TUMOR,
PROLIFERACION CELULAR Y APOPTOSIS.
Como un objetivo orientado hacia el diagnstico clnico, nos propusimos realizar un
estudio preliminar de correlacin de la expresin del transportador facilitativo de glucosa
GLUTI con parmetros biolgicos considerados por los clnicos como factores
determinantes de la agresividad de un tumor, estos son: grado de diferenciacin del tumor,
proliferacin celular e ndice de muerte celular programada (apoptosis). Para esto, se analiz
la relacin existente entre los diferentes grados de diferenciacin del tumor de mama (SRB 1,
SR132 y SR133) con la expresin inmunocitoqumica de GLUT1 y la expresin de
marcadores de proliferacin celular (PCNA). Posteriormente, se estableci una correlacin
entre la expresin inmunocitoqumica de GLUT1 y el ndice de apoptosis analizada por el
mtodo de TUNEL. Finalmente, se estudiaron los mismos parmetros en tumores inducidos
en ratones "nude", para establecer un posible modelo de anlisis a futuro.
3.3.1 Correlacin de la expresin de GLUT1 con el grado de diferenciacin del tumor y
marcadores de proliferacin celular en carcinoma de mama.
Los anlisis inmunocitoqumicos para GLUT1 revelaron que de un total de 31
tumores analizados, solamente una muestra (3.2%) no mostr reactividad para GLUT1
(Tabla 7). Un 22.5% de los tumores analizados present una reaccin intensa a nivel de las
membranas celulares (Tabla 7). Adicionalmente, GLUT1 se observ con reaccin
citoplasmtico leve y moderada, en un 74.1% de los tumores (Tabla 7). De esta forma, un
96.6% de las muestras de carcinoma mamario presentaron inmunotincin para GLUT1
(Tabla 7).
En este estudio se analizaron dos tumores de tipo SRB1 debido a que este carcinoma
no es detectado clnicamente y su frecuencia de diagnstico es muy baja. La expresin de
GLUT 1 en las muestras SBR 1 analizadas fue bajo (Tabla 7, Fig. 16). La mayor reactividad
se observ en tumores de tipo SBR2 y SBR3 (Tabla 7, Fig. 16). Sin embargo, el grado ms
indiferenciado no mostr un mayor nivel de expresin. En el tipo SR132 se observ un
66.5% de los tumores con reaccin moderada e intensa (Tabla 7, Fig. 16), en cambio, slo el
36.3% de los tumores de tipo SR133, mostraron la misma reaccin (Tabla 7, Fig. 16). Este
anlisis indica que no existe una relacin entre indiferenciacin del tumor y un aumento

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Tabla 7. Niveles de expresin de GLUT1 en Carcinoma Ductal Invasor con diferentes

grados de diferenciacin.
Reactividad para GLUT1
Grados

Moderada
(++)

Leve
(+)

Negativa
(-)

Intensa
(+++)

Total
Positivos
n

SBR1

100

100

SBR2

18

33.3

38.8

27.7

18

100

SBR3

11

54.4

18.1

18.1

10

90.7

Total

31

3.2

14

45.1

29

22.5

30

96.6

63

en el nivel de expresin de GLUT 1, debido a que el mayor nmero de tumores positivos,

present un nivel intermedio de indiferenciacin.
En una siguiente etapa se intent analizar silos tumores ms proliferativos podan
corresponder a los metablicamente ms activos. De esta forma, se correlacion el grado de
diferenciacin histopatolgica y el nivel de expresin inmunocitoqumica de PCNA (Tabla
8). La inmunoreactividad para PCNA, se observ como una tincin nuclear, que se clasific
de acuerdo al porcentaje de ncleos con tincin positiva con respecto al total de ncleos
tumorales contados en 10 campos de una muestra. (baja proliferacin= menos del 10%;
proliferecin intermedia = 10-50% y alta proliferacin= sobre el 50%). El anlisis para ki-67
solo se realiz en algunas muestras seleccionadas, para corroborar los resultados obtenidos
con PCNA (no mostrado).
Del total de tumores anlizados el 96.7% present reaccin positiva para PCNA. Un
indice de proliferacin bajo se encontr en un 45.1% de los tumores. Sin embargo, una
proliferacin moderada y alta se observ en un 51.4%. Se determin un aumento leve en la
proliferacin en los tumores de tipo SRB3 al compararlos con los tumores SRB2. Los
tumores SRB2 presentaron un 49.9% de los tumores en estados moderados y altos de
proliferacin, en cambio, los tumores SRB3 mostraron un indice de 54.4%. Aun cuando los
datos cuantitativos no lo sefalan, la mayor intensidad de marca se encontr en los tumores
de grado SRB2 (Fig. 17).
3.3.2 Correlacin de la expresin de GLUTI con el ndice de apoptosis en carcinoma de
mama.
Se determin el ndice de apoptosis en muestras de carcinoma ductal invasor con
diferentes grados de diferenciacin histopatolgica, mediante la tcnica de TUNEL, y se
correlacion con la expresin de la isoforma GLUT1. El ndice de apoptsis se determin
mediante una estimacin del porcentaje de los cuerpos apoptticos presentes en el tumor,
con respecto al nmero total de ncleos de clulas tumorales contabilizados en 10 campos
de una muestra. Nuestro anlisis determin que el ndice de apoptosis se relacion de
manera indirecta con el
grado de diferenciacin histopatolgica, es decir, los tumores de grado SBR 1 mostraron los
ms altos ndices de muerte celular programada (Tabla 8), observndose cuerpos
apoptticos distribuidos por todo el epitelio neoplsico y mayoritariamente en aquellas
zonas cercanas a las reas de necrosis, especialmente en el grupo de clulas que rodea la zona

central de necrosis, y en la primera porcin de la zona de necrosis (Fig. 18, A). En

microscopa de campo claro, estos cuerpos apoptticos fueron observados como fragmentos
de cromatina nuclear muy picnticos y rodeados de un pequeo remanente de citoplasma
celular (Fig. 18, B recuadro). En los tumores SBR2 el porcentaje de cuerpos apoptticos fue
menor que en el grado SBR1, pero mayor que en el grado SBR3 (Tabla 8). Se observ
adems, que en este tipo tumoral los cuerpos apoptticos tendieron a agruparse en regiones
especficas del epitelio tumoral, a diferencia de los tumores SBR 1 en los cuales los cuerpos
apoptticos se distribuyeron de manera aleatoria por todo el epitelio neoplsico. En los
tumores SBR3, el porcentaje de cuerpos apoptticos fue notoriamente inferior a los otros
dos grados tumorales (Tabla 8), presentndose solo cuerpos apoptticos aislados en la
muestra. Estos resultados demuestran que existe una relacin contrapuesta entre el ndice
apopttico y el grado de anaplasia.
3.3.3 Anlisis de tumores inducidos en ratones 'tnude".
Paralelo a los estudios realizados en tumores humanos, se estudio la expresin de las
distintas isoformas de GLUTs en un modelo biolgico de cncer de mama inducido por
inyeccin de clulas tumorales en ratones "nude", con el fin de: a) determinar si el patrn de
expresin caracterstico para las isoformas GLUT1 y GLUT5 se mantena al inyectar las
clulas humanas en un animal de experimentacin; b) observar si un tumor con alto grado
proliferativo y de diferenciacin intermedia tipo SRB2 muestra las adaptaciones observadas
en tumores humanos; c) obtener un adecuado modelo de estudio para la expresin de estos
transportadores en tejidos tumorales de mama.
En una primera etapa los tumores inducidos en ratones "nude" se analizaron
ultraestructuralmente para definir aproximadamente el grado y tipo de tumor inducido (Fig.
18). Los anlisis indicaron la presencia de un tumor con brotes proliferativos muy activos
con centros necrticos. Las clulas presentaron un gran tamao con nucleos de cromatina
condensada. Se observ la presencia de canalculos intracelulares e interdigitaciones de las
clulas como complejos de unin (Fig. 18, A-D). Todas estas caractersticas nos sealaron la
presencia de un tumor con caractersticas de tipo SRB2. Adicionalmente, esta clasificacin
fue confirmada al observar una gran reaccin para PCNA (resultados no mostrados) y la
presencia de cuerpos apoptticos en la regin cercana a la necrosis (Fig. 19, A,B). El nivel
de apoptosis fue adems confirmado al observar una gran expresin de p53 (Fig. 19, C, D).

IRI

Tabla 8. Niveles de expresin de PCNA e ndice de apoptosis en Carcinoma Ductal Invasor con diferentes
grados de diferenciacin.
Indice
Grados

No
detectado
n
%

Indice de
apoptosis

Proliferacin

de

Bajo
(1-20%)
n
%

Moderado
(20-50%)
n
%

Alto
(sobre 50%)
n
%

Total
Positivos
n
%

100

4.6

27.7

18

100

2.1

27.2

10

90.9

0.8

25.7

30

96.7

SBR 1

50

50

SBR2

18

50

22.2

SBR3

11

36.3

27.2

Total

31

3.2

14

45.1

25,7

GLUT1

PCNA
W0

'.

j i

Vy

SBR1

.1

SBR1

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0.

'

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1)

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w.

..:

SBR3

Ad

'

Fig 16. Expresin de GLUT1 y PCNA en cncer de mama con diferentes grados de
diferenciacin. (A, C y E) Expresin de GLUT 1 en muestras con grados de diferenciacin
histopatolgica SBR1, 2 y 3, respectivamente. (B, C y E) Expresin de PCNA en regiones
adyacentes a las analizadas con GLUTI. En el caso de GLUTI, la reaccin se localiz
preferentemente en las membranas plasmticas (C, flecha), en tanto que la expresin de
PCNA fue eminentemente nuclear (D, flecha). N: necrosis. E: estroma. Tu: tejido tumoral.
Aumento imagenes: A,B x250. C, B x300. E, F x350.

67

'

t3

:.

fW?

'-1

SBR1

'
SBR2

.'

_s.

pL
:-'

'

4 .,

SBR3

o
:

Fig 17. Anlisis comparativo del ndice de apoptosis en tumores de mama con
diferentes grados de diferenciacin histopatolgica. Las imgenes se muestran en
fluorescencia (A, C y E) y campo claro (B, D y G). (A y B) Tumores de clasificacin SBR
1. (C y D) tumores de clasificacin SBR 2. (E y F) Tumores de clasificacin SBR 3. Los
cuerpos apoptticos se localizaron principalmente, en las reas de necrosis o zonas del
epitelio neoplsico cercanas a ellas (A y B, flechas). A microscopia de campo claro, los
cuerpos apoptticos se observaron como fragmentos nucleares muy picnticos (D, flechas).

LB

:4
4

MV"
's

..

,/ t-

.4

lit

Fig. 18. Anlisis ultraestructural de tumores inducidos en ratones "nude". (A) Clulas
del tumor mostrando caractersticas ultraestructurales tpicas de un tumor de mama. Se
observan los ncleos voluminosos y condensaciones de la cromatina (flechas). (B, C)
Canalculos intracelulares. Secrecin de aspecto flocular se observa en el centro de cada
canalculo (flechas). (C) Uniones intercelulares de las clulas tumorales (flechas). Aumento en
imagen A: x4000. B-C: x14.000.

anti-P53

II

ahti53
fria

'1

Fig. 19. Anlisis de muerte celular programada y expresin de p53 en tumores

"nude". (A-B) Anlisis de dos tumores nude, detectandose la presencia de cuerpos
apoptticos en la regin de necrosis del tumor (N). El inserto en A, muestra un detalle de un
cuerpo apopttico. (C-D) Anlisis de la expresin de p53. Los ncleos de las clulas
tumorales presentaron una alta expresin de la protena (D). Tu: tumor.

,I]

Nuestros anlisis determinaron una elevada expresin de la isoforma GLUT 1

preferentemente en las membranas de las clulas tumorales (Fig. 20, B mayor aumento). La
reaccin fue heterognea dentro de la misma muestra, localizndose slo en puntos focales
del parnquima tumoral, principalmente en clulas muy cercanas a las zonas de necrosis
celular (Fig. 20, A y B). En este modelo biolgico tambin se observ que la expresin de
GLUT1 no se circunscribi preferencialmente hacia regiones de la membrana plasmtica que
contactan clulas vecinas (Fig. 16, B flechas). Sin embargo, a diferencia de lo observado en
tejidos iii vivo y en clulas cultivadas in vitro, no se observ expresin de ninguna de las
otras isoformas de GLUTs en este modelo biolgico (Fig. 20, C y D).

71

E i

a'

GLUT1

GLUT1.

GLUT2

GLUT5

Fig 20. Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de GLUT1, GLUT2 y GLUTS en

tumor inducido en ratones "nude". (A) En el tejido tumoral, se muestra una fuerte
expresin de GLUT1 que se distribuy de manera heterognea dentro del parnquima
neoplsico. (B) Mayor aumento del rea encuadrada en A. La inmunotincin se localiza
preferencialmente en las membranas citoplasmticas de las clulas tumorales. (C y D) La
expresin de las isoformas GLUT2 y GLUT5 fue inmunocitoqumicamente no detectable.
Aumento imagen A: x 35. Imgenes B-D: x 350,

72

4. DISCUSION
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de
transportadores de hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras
normales y tumores. Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y
ultraestructural, de la expresin de las isoformas GLUT 1 y GLUT5 en carcinoma ductal
invasor de mama, que corresponde al tipo tumoral de mayor frecuencia dentro de estas
neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis preliminar de correlacin entre la expresin de
GLUTI y marcadores de proliferacin celular (PCNA) y apoptosis.

4.1 1 PARTE: ESTANDARIZACION Y ANALISIS DE EXPRESION DE GLUTs EN

TUMORES HUMANOS.
Nuestros resultados de anlisis de la especificidad de los anticuerpos policlonales,
nos permiten determinar que estos presentan un alto grado de especificidad, ya que cada uno
de ellos fue especfico para reconocer la isoforma correspondiente en los tejidos controles,
mostrando una reactividad localizada en la membrana celular. Los controles en los cuales se
hizo competir el anticuerpo con el pptido inductor, demuestran que estos antisueros
reconocen especficamente la secuencia de aminocidos contra los cuales estn diseados.
Los controles en los cuales se omiti el anticuerpo primario permitieron comprobar la
especificidad del anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, descartando una posible reaccin
cruzada con IgG humana.
El anlisis de immunoblotting" nos permiti determinar que el antisuero antiGLUTI, reconoce una protena cuyo peso molecular flucta entre los 45 y 66 kDa. Si
consideramos que esta protena sin glicosilar tiene un tamano molecular aproximado de 45
kDa, entonces esta variabilidad en el tamao molecular podra estar asociada a niveles
crecientes de glicosilacin de la protena. Anti-GLUT5 en cambio, solo reconoci una banda
de 66 kDa, lo que sugiere que esta isoforma no presenta tanta variabilidad en la glicosilacin
como se observa con GLUT1 en membranas de eritrocitos humanos. Todos estos resultados
concuerdan con lo descrito en la literatura por Mueckler y col. (1985) y Kayano y col.
(1990).
El estudio de estandarizacin de los diferentes mtodos inmunocitoqumicos para la
deteccin de GLUT1 en tejidos controles, mostr que todas las metodologas analizadas
73

presentan diferentes niveles de sensibilidad y resolucin, no obstante, todas demostraron ser

especficas en detectar la protena transportadora GLUT1 en los tejidos controles. Dentro
de los mtodos analizados por nosotros, los sistemas PAP demostraron ser los ms
eficientes en cuanto a sensibilidad y resolucin, y dentro de estos, el mtodo PAP revelado
con diaminobencidina, sin intensificacin, result ser el mejor de los sistemas, considerando
los parmetros mencionados anteriormente, y adems, su fcil manejo.
Estudios de "northern blot", realizados por Yamamoto y cols. (1990), permitieron
analizar la expresin del mRNA para GLUTI-GLUT5 en un conjunto de neoplasias
gastrointestinales. En este estudio, se observ que los tejidos tumorales muestran una mayor
expresin del mensajero para GLUT1 que los tejidos normales, concluyendo que la sobreexpresin de la isoforma GLUTI, corresponde a una caracterstica general en las distintas
neoplasias humanas. Teniendo en cuenta que los estudios de Yamamoto y cols. (1990),
fueron realizados solamente en neoplasias gastrointestinales y considerando adems, que no
siempre una alta expresin del mensajero se correlaciona directamente con una alta expresin
de la protena, nosotros decidimos analizar, mediante inmunocitoqumica, la expresin de la
protena GLUTI en un amplio rango de tumores humanos, provenientes de 22 tipos de
tejidos diferentes, para determinar si la sobre-expresin de GLUT1 corresponde realmente a
una condicin propia del proceso de transformacin neoplsica.
Nuestros resultados evidenciaron que, contrario a lo propuesto por el grupo de
Yamamoto y cols. (1990), la sobre-expresin de la protena GLUT 1 estuvo restringida a un
cierto grupo particular de tumores, en tanto que otro grupo considerable de neoplasias
present niveles ms bajos de reactividad e incluso no detectables. Estos hallazgos sugieren
que la sobre-expresin de GLUT1 podra no ser un evento generalizado en cncer, como lo
sugieren estos autores, si no que ms bien, podra estar asociado a una caracterstica
particular de un determinado grupo de neoplasias. Con respecto a esto, se ha especulado
mucho acerca del rol funcional que pudiese estar jugando la sobre-expresin de la isoforma
GLUT 1 en estos tumores, lo que ha llevado a formular variadas teoras que tienden a
explicar el porque de esta sobre-expresin.
El anlisis de la expresin de GLUT1 en los tumores que presentaron elevada
inmunotincin, evidenci que la reactividad es variable dentro de una misma muestra, y que
la mayor expresin de este transportador se observa en regiones del tumor en las cuales la
densidad celular es mucho mayor, generalmente asociadas con zonas de elevada necrosis.
Esto podra indicar que una mayor proliferacin y densidad celular genera directamente una

74

baja en la disponibilidad de glucosa, debido a lo cual, la clula tumoral sobreexpresara

GLUT 1, aumentando la captacin de la hexosa. Este mecanismo sera eficiente considerando
que las clulas tumorales utilizan solo la va anaerbica para metabolizar esta hexosa,
generando una baja cantidad de ATP por mol de glucosa.
Considerando que las neoplsias poseen un metabolismo glicoltico incrementado con
respecto a los tejidos normales, debido a su activa proliferacin, y, que el mecanismo por el
cual las clulas tumorales incrementan su captacin de glucosa, es mediante una sobreexpresin de los transportadores de hexosas, se podra deducir que una mayor expresin del
transportador de hexosas GLUT1, en un cierto grupo de tumores, podra estar directamente
relacionado con una mayor actividad proliferativa de estos, y por ende, con una mayor
capacidad de invasin. Estudios realizados por Younes y cols. (1998), trabajando en lneas
celulares de cncer de mama (MCF-7, MDA-MB-435 y MDA-MB-23 1), sugieren una
posible relacin positiva entre la sobre-expresin de GLUT1 y una mayor capacidad
invasiva de las clulas in vitro, sin embargo, hasta el momento, no existen estudios que
sugieran los mecanismos moleculares que podran explicar dicho fenmeno. Otros estudios
han relacionado la expresin de la isoforma GLUTI con la capacidad de los tumores de
desarrollar metstasis (Younes y cols., 1996), sugiriendo una posible correlacin entre la
elevada expresin de la protena GLUT1 y la presencia de clones metastsicos.
Por otra parte, teniendo en consideracin que estos transportadores tienen la
caracaterstica de ser multifuncionales, es decir, que pueden transportar otros sustratos
metablicos adems de glucosa, como por ejemplo, la forma oxidada de la vitamina C, el
cido dehidroascrbico, se abren otras posibilidades para poder explicar el rol funcional que
pudiese tener la sobre-expresin de GLUTI en este grupo particular de neoplasias. Es un
hecho conocido que la forma oxidada de la vitamina C se transporta a travs de algunas de
las isoformas de GLUTs (Levine y cois., 1997), especficamente a travs de las isoformas
GLUT1, GLUT3 y GLUT4 (Vera y cols., 1993).
Existen estudios recientes in vitro e in vivo demostrando que los GLUT estn
involucrados en la captacin de vitamina C en tumores donde no se expresa el
cotransportador de vitamina C reducida y sodio. De esta forma el mecanismo involucrara un
proceso de oxidacin de vitamina C producto de la gnesis de cantidades muy bajas de
superxidos, de esta forma, el cido dehidroascrbico generado localmente sera captado por
las clulas tumorales a travs de GLUT y reducido intracelularmente a cido ascrbico. Este
mecanismo se ha postulado como un proceso central en el reciclamiento de vitamina C en

75

clulas normales y como un mecanismo nico para la incorporacin de esta vitamina en

clulas tumorales (Nualart y cols., 1999; Agus y cols., 1999; Nualart y cols., 2000).
An cuando el anlisis realizado anteriormente parece lgico para tumores con
elevada expresin de GLUTI no es absolutamente aplicable a tumores con baja expresin o
sin expresin de GLUT1. Younes y cols. (1996), analiz la expresin de GLUT1 en un
amplio conjunto de tumores humanos, evidenciando, al igual que nosotros, que un
porcentaje considerable de las neoplasias analizadas expresaban niveles bajos o nulos de esta
isoforma. Los autores sugirieron que esta condicin de la clula neoplsica podra estar
siendo compensada por la sobre-expresin de alguna de las otras isoformas de GLUTs en
estos tumores, de manera tal que el estado metablico y la captacin de glucosa se mantenga
elevado. Teniendo en cuenta estos antecedentes, sumados al hecho de que no existen
estudios tendientes a analizar la expresin de todas las isoformas de GLUTs en un amplio
conjunto de tumores humanos, nos propusimos analizar y correlacionar la expresin de
GLUT1 con la expresin de las isoformas GLUT2, GLUT3, GLUT4 y GLUT5 en un
conjunto de muestras normales y tumores, con el fin de establecer algn tipo de relacin
entre expresin de GLUTI y las otras isoformas de GLUTs en estos tumores.
Contrariamente a lo sugerido por Younes y cols. (1996), nuestros resultados
demostraron que los tumores que sobre-expresan la isoforma GLUT1 tienden a sobreexpresar otras isoformas de GLUTs, en tanto que los tumores que muestran menor
expresin de GLUT1, tienden tambin a mostrar una ms baja expresin de las otras
isoformas de GLUTs. Sin embargo, la expresin de GLUT2, GLUT3, GLUT4 y GLUT5
fue mucho ms selectiva que la expresin de GLUT1. El cncer de mama, adems de la
isoforma GLUT1, sobre-expres las isoformas GLUT2 y GLUT5, sin embargo, el
carcinoma de colon sobre-expres todas las isoformas de GLUTs. Estos resultados sugieren
que la expresin de las isoformas diferentes a GLUTI pudiese ser un evento altamente
regulado, y que por lo tanto, est restringido solamente a determinados tipos de neoplasias.
De esta forma, un tumor con tasa metablica muy elevada expresar diferentes
transportadores para suplir sus necesidades de glucosa. Sin embargo, la expresin de
GLUT5 es una adaptacin muy importante, por ejemplo el cncer de colon y de mama,
debido a que esta isoforma es un transportador exclusivo de fructosa. Probablemente la
incorporacin de fructosa le permite a la clula tumoral ocupar un metabolito cuya va
metablica es mucho menos regulada que la va metablica de la glucosa.

76

Otro aspecto interesante de destacar es que la expresin de las isoformas GLUT2 y

GLUT5, se observ tanto en membrana plasmtica como en el citoplasma celular. En
algunas neoplasias, como el mesotelioma de pulmn, se observ una fuerte reactividad a
nivel de la membrana plasmtica, sin embargo, en la gran mayora de las neoplsias
analizadas, la reactividad para GLUT2 y GLUT5 se localiz, preferentemente, a nivel
citoplasmtico. La expresin a nivel citoplasmtico es de mucha importancia, ya que sugiere
que otras isoformas, distintas de GLUT4, pudiesen estar siendo almacenadas en reservorios
intracelulares. Evidencias en plaquetas humanas (Sorbaba y cois., 1997) sugerieren un
posible almacenamiento citoplasmtico y posterior translocacin de la isoforma GLUT3, sin
embargo, hasta el momento no existen evidencias concretas que sugieran un almacenamiento
de otras isofornias de GLUTs en el citoplasma de clulas tumorales. No obstante, esta
expresin citoplasmtica de algunas de las isoformas de GLUTs en tumores humanos, ya ha
sido sefialada por otros autores (Brown y Wahl, 1993), sin embargo, no se han realizado
anlisis ms detallados tendientes a determinar con mayor exactitud la localizacin
ultraestructural de estas isoformas en el citoplasma de las clulas tumorales. GLUT3 es un
transportador de glucosa de alta afinidad que ha sido asociado directamente con el sistema
nervioso central. Su expresin en el cncer de colon, pulmn y seminoma indica una posible
relacin con tumores de crecimiento rpido y de naturaleza agresiva. Los anlisis de
progresin tumoral y sobrevida realizados en pacientes con expresin de GLUT3 en cncer
de pulmn, confirman nuestra proposicin (Younes y col, 1997a)
4.2 II PARTE: ANALISIS DE EXPRESION DE GLUT1 Y GLUT5 EN CANCER DE
MAMA.
Con el objetivo de profundizar nuestro anlisis de expresin de GLUTs en tumores
humanos, se analiz particularmente el carcinoma ductal invasor de mama, una neoplasia de
gran incidencia, tanto en nuestro pas como en el extranjero. Para esto, nosotros realizamos
estudios detallados de la expresin de las isoformas GLUT1 y GLUT5, a nivel de mensajero
y protena, haciendo un anlisis comparativo entre el tejido normal y tumoral. Adems,
estudiamos la expresin de estas isoformas en clulas cultivadas in vitro.
En una primera etapa se realiz la estandarizacin de la metodologa de RT-PCR iii
situ en nuestro laboratorio, siendo este, un objetivo bastante complejo de resolver en lo que
a tcnica se refiere, debido a la enorme cantidad de variables que afectaron las distintas
etapas de esta reaccin, sin embargo, se debe considerar que esta metodologa, una vez
estandarizada, ofrece proyecciones incalculables para el estudio de la expresin de

77

mensajeros, ya que permite analizar in vivo la expresin espacio-temporal de un

determinado gen. Todo esto, sumado al hecho de que permite detectar, eficientemente,
secuencias virales insertadas en el ADN celular, hacen del RT-PCR in situ, una metodologa
con gran proyeccin haca el rea clnica y de diagnstico patolgico.
La deteccin del mensajero en tejidos normales de mama revel expresin tanto para
la isoforma GLUTI como para la isoforma GLUT5, sin embargo, en ambos casos la
reactividad fue mucho menor que en los tejidos tumorales. En el caso de GLUT1, como era
de esperar, se observ diferentes niveles de reaccin para el mensajero en el epitelio normal,
debido a que la actividad metablica y de proliferacin est fuertemente influenciada por las
hormonas que regulan el ciclo menstrual (estrgeno y progesterona). La reactividad en las
clulas estromales fue baja, y no se observ presencia del mensajero para GLUTI en las
clulas mioepiteliales. El anlisis de GLUT5 en cambio, mostr que la expresin del
mensajero se localiz preferentemente y con mayor intensidad en las clulas mioepiteliales.
La expresin en el epitelio normal fue variable y solo se present en un reducido porcentaje
de las muestras, sugiriendo con esto que, en tejido mamario normal, las clulas mioepiteliales
seran las ms activas en incorporar fructosa.
Nuestros hallazgos sobre la deteccin del mensajero en cncer de mama, mediante
RT-PCR in situ, muestran que la expresin de las isoformas GLUT1 y GLUT5, est
notablemente incrementada en tumores de mama con respecto al tejido normal. Este
fenmeno de sobre-expresin del mensajero, especficamente del mensajero para GLUT1, ya
haba sido comunicado anteriormente para tumores gastrointestinales en un estudio in vitro
realizado por Yamamoto y col. (1990). No obstante, ellos realizaron su estudio en un tipo
de neoplasia diferente y en una casustica de tumores muy por debajo de la nuestra. Se debe
agregar adems, que hasta el momento no existen estudios de RT-PCR in situ para la
deteccin de mensajeros de GLUTs en ningn tipo celular.
La reactividad para el mensajero de GLUT1 y GLUT5 en tumores, se observ
siempre a nivel citoplasmtico, y preferente, en el epitelio neoplsico. La expresin en
clulas del tejido conectivo fue de menor intensidad comparada con el tejido tumoral. La
variabilidad en la reactividad, observada entre una regin y otra de un mismo tumor, nos
sugiere que las clulas tumorales tendran dintintos niveles de expresin del mensajero, y que
por lo tanto, no todas las clulas se encontraran en una misma condicin metablica,
asumiendo con esto, un fenmeno de independencia celular. En nuestro anlisis se observ
adems, que un porcentaje considerable de muestras tumorales no mostr reaccin positiva.

Este resultado podra sugerir una posible regulacin transcripcional de la expresin del
mensajero. Sin embargo, se debe considerar que las muestras utilizadas para el anlisis de
RT-PCR in situ, provenan de tejidos de archivo procesados para patologa rutinaria, por lo
tanto, en ninguna de estas se pudo controlar las condiciones de manejo y fijacin de la
muestra, por lo que una reactividad negativa, bien podra estar asociada a un proceso de
degradacin del mensajero, producto de las malas condiciones de manejo, y no a una
expresin disminuida del mensajero per se en el tumor.
Luego de este anlisis, quisimos determinar si la mayor expresin del mensajero para
GLUT1 y GLUT5, se correlaciona con una mayor expresin de la protena en estos tejidos.
Estudios previos de expresin de GLUTs en cncer de mama, realizados por el grupo de
Brown y cols. (1993), evidenciaron mayoritariamente la expresin de las isoformas GLUTI,
GLUT2 y GLUT4 en este tipo tumoral, no evidenciando expresin de la isoforma GLUT3
y GLUT5. En nuestro estudio, contrario a lo obtenido por Brown y cols. (1993),
detectamos expresin de todas las isoformas de GLUTs, pero mayoritariamente de las
isoformas GLUT1 y GLUT5. Se debe hacer notar que nuestro estudio fue desarrollado con
una casustica mucho mayor que la de Brown y cols. (1993).
Nuestros estudios confirmaron la sobre-expresin de GLUT1 en el tejido tumoral,
con respecto al tejido normal. Sin embargo, los datos inmunocitoqumicos a nivel ptico y
ultraestructural confirman una sorprendente polarizacin de la localizacin de GLUT1 en la
membrana plasmtica de las clulas tumorales, involucrada en la formacin de "estructuras
canaliculares", limitadas por complejos de unin. Este resultado aporta evidencias para
sugerir un posible "sorting" diferencial de la isoforma GLUT1 en clulas tumorales de
mama. El "sorting" diferencial tendra que estar determinado por algn dominio presente en
la secuencia aminoacdica de la protena transportadora.
En un estudio realizado por Verhey y cols. (1993), se desarrollaron protenas
quimricas para GLUT1 y GLUT4, intercambiando las regiones carboxilo y amino terminal
entre estos transportadores. Estos estudios revelaron que el dominio carboxilo terminal
podra tener un rol protagnico en el "sorting" de estas protenas. Sin embargo, otro estudio
desarrollado por Nakazaki y cols. (1997), postula que sera el asa intracelular M6-M7, y no
el extremo carboxilo terminal, el que contendra las seales de "sorting" para estas protenas.
No obstante estos resultados, an no se tienen antecedentes acabados para determinar que
dominio de la protena podra dar cuenta de este fenmeno y como es regulado en clulas
tumorales.

vil

Sobre la capacidad de la clula tumoral de formar o desarrollar este tipo de

adaptaciones, no se sabe nada an, sin embargo, en un estudio publicado por Maniotis y
cois. (1999), se determin que melanomas altamente agresivos tienen la capacidad de formar
canales huecos sin presencia de endotelio y delimitados por la pared de las clulas
tumorales, por los cuales pueden circular eritrocitos. Se postula que estos canales podran
facilitar la perfusin del tumor independiente de la angiognesis. Adems, se ha evidenciado
que estas estructuras se forman solo en tumores malignos, y no en neoplasias benignas del
mismo tejido. No obstante, estos canales parecen ser macroestructuras, y por lo tanto, no
son similares a las estructuras canaliculares evidenciadas en nuestro estudio en tumores de
mama, ya que su tamaiio pareciera ser mucho mayor. Sin embargo, lo observado en este
estudio podra corresponder a una importante adaptacin morfo-funcional de las clulas de
cncer de mama.
Estas adaptaciones, al igual que las observadas por Maniotis y col. (1999), podran
relacionarse con una elevada indiferenciacin de la clula tumoral y por lo tanto, con un
comportamiento ms agresivo de la neoplasia. Adems, estos hallazgos abren nuevas
posibilidades terapeuticas para el tratamiento del cncer, ya que hasta el momento, las
terapias para evitar el crecimiento tumoral, estn orientadas principalmente a impedir la
angiognesis tumoral.
La expresin inmunocitoqumica de GLUT5 en tejido mamario normal, se observ
solo en algunas glndulas normales, en el citoplasma de las clulas glandulares, sin embargo,
la mayor expresin se localiz en el citoplasma de las clulas mioepiteliales. Este resultado
demuestra que la expresin del mensajero se correlaciona directamente con la expresin de la
protena en estos tejidos. En cuanto a la expresin de GLUT5 en tejidos tumorales, nosotros
observamos una sobre-expresin, la cual se localiz preferentemente en el citoplasma de
estas clulas, sugiriendo un posible reclutamiento intracelular de esta isoforrna. El anlisis
ultraestructural confirm lo observado a nivel ptico, determinando que GLUT5 se expresa
mayoritariamente en estructuras de tipo vesicular localizadas en el citoplasma celular. Este
fenmeno es de particular importancia ya que hasta el momento no ha sido documentado
que la isoforma GLUT5 este localizada en vesiculas citoplasmticas en clulas tumorales. Si
bien es cierto, algunos autores han documentado expresin de otras isoformas de GLUTs
distintas de GLUT1 en el citoplasma de las clulas tumorales (Brown y col., 1993), ninguno
de ellos ha desarrollado estudios de localizacin ms detallados que permitan determinar con
exactitud en que estructuras del citoplasma celular se est expresando esta molcula.

Nuestros resultados son concluyentes en determinar que GLUT5 se localiza en estructuras

vesiculares citoplasmticas, sugiriendo que esta isoforma podra estar almacenada en
reservorios intracelulares, similar a lo que ocurre con la isoforma GLUT4. Adems, este
hallazgo sugiere que la isoforma GLUT5 puede tener la capacidad potencial de ser
translocado hacia la membrana plasmtica por accin de algn estmulo externo, hecho que
ha sido descrito, hasta el momento, solo para la isoforma GLUT4. Con esto, se abren
nuevas perspectivas para el estudio y regulacin de la expresin de GLUT5 en cncer de
mama, con el objetivo de determinar el posible estmulo que pudiese gatillar la translocacin
de esta isoforma. Estos resultados, corroboran los hallazgos de Zamora-Len y col. (1996),
y por lo tanto, aportan nuevas evidencias para sugerir que la clula tumoral de mama tiene la
capacidad de transportar fructosa, como lo sugieren los estudios in vitro realizados por
estos autores. Sin embargo, en el estudio realizado por Zamora-Len, no se detect
expresin de la isoforma GLUT5 en epitelio normal ni en clulas mioepiteliales, hecho que si
fue observado en nuestro anlisis.
La expresin de la isoforma GLUT5 en cncer de mama es de particular importancia
ya que sugiere que este tipo tumoral podra tener la capacidad potencial de transportar
fructosa, el cual es un sustrato metablico que es utilizado por muy pocos tejidos en el
organismo humano, y sobre el que se conoce muy poco acerca de su metabolismo a nivel
celular. Nuestros resultados sugieren adems, que el proceso de transformacin neoplsica
de la glndula mamaria podra potenciar la sobre-expresin de la isoforma GLUT5, y por lo
tanto, incrementar la utilizacin de fructosa como un sustrato metablico alternativo a la
utilizacin de glucosa, posiblemente, para compensar el elevado estado metablico de la
neoplasia. La elevada proporcin con que se expresa esta isoforma en los tumores de mama
(95%) podra tener importantes aplicaciones terapeuticas, adems de ser utilizada como un
posible marcador biolgico en cncer de mama.
Con el fin de establecer si la expresin y localizacin de GLUT1 y GLUT5
observada en cncer de mama in vivo, era conservado en clulas cultivadas in vitro, se
analiz la expresin de todas las isoformas de GLUTs en la lnea celular de cncer de mama
MDA-468. Nuestros resultados detectaron expresin de las isoformas GLUTI y GLUT5,
y al igual que lo observado en los tejidos tumorales, la reactividad para GLUT1 se localiz
intensamente en regiones de la membrana plasmtica que parecen contactar clulas vecinas.
GLUT5 se localiz mayoritariamente en el citoplasma de estas clulas. Este hallazgo
corrobora los resultados obtenidos por nosotros, sugiriendo y reafirmando la localizacin
diferencial de las isoformas GLUTI y GLUT5 en cncer de mama y valida el cultivo de

E;"

clulas tumorales como un futuro modelo para estudiar ms en detalle los procesos que
regulan este mecanismo de "sorting" diferencial.
4.3 ifi PARTE. ANALISIS PRELIMINARES DE LA CORRELACION ENTRE LA
EXPRESION DE GLUT1, GRADO DE DIFERENCIACION DEL TUMOR,
PROLIFERACION CELULAR Y APOPTOSIS.

Nuestro ltimo objetivo fue correlacionar el grado de diferenciacin de los carcinomas

de mama con la expresin de GLUT 1 y marcadores de proliferacin celular y apoptosis.
Con el fin de tratar de establecer si una sobre-expresin de esta isoforma se relacionara con
un comportamiento ms agresivo de la neoplasia, el cual est determinado por un estado
proliferativo elevado y un menor ndice de muerte celular programada. Este estudio se
compar con tumores inducidos en ratones "nude" para establecer un posible modelo de
estudio comparativo.
En nuestro anlisis, se demostr que los tumores con una diferenciacin intermedia
(SRB2) presentaron la mayor expresin de GLUT 1. Adems, estos tumores presentaron
una alto grado de proliferacin. Sin embargo, las formas mas indiferenciadas de estos
tumores (SRB3) no mostraron una alta expresin del transportador, aun cuando, se
determin un alto grado de proliferacin. Por lo tanto, el grado de proliferacin no se
correlaciona directamente con la sobre-expresin de GLUT1.
Younes y cols. (1996), correlacionaron la expresin del transportador de glucosa
GLUT 1, con la expresin de las protenas ki-67, encontrando una relacin directa entre
ambos parmetros. Estos autores no clasificaron los tumores considerando su grado de
diferenciacin. Si en nuestro estudio analizaramos slo el grupo de SBR2, podriamos
concluir de la misma forma que Younes y cois. (1996), sin embargo, nosotros identificamos
un grupo de tumores indiferenciados y altamente proliferativos que no sobre-expresa
GLUT1.
Nuestro estudio seala, que independiente del grado de proliferacin, los tumores
que sobre-expresan GLUT1 son aquellos que presentan clulas con un nivel intermedio de
diferenciacin (SR132) (Fig. 21, B). Es interesante destacar que este tipo de tumores posee
un crecimiento particular, caracterizado por presentar masas tumorales solidas.
Fundamentalmente en estas reas se encontr la mayor cantidad de clulas que realizan el

M
.

"sorting" diferencial de GLUT1 a estructuras "canaliculares". Las adaptaciones encontradas

en nuestro estudio pueden explicar cmo una clula neoplsica particular, altamente
proliferativa, se adapta para incorporar glucosa que difunde desde reas relativamente
lejanas (Fig. 21, B).
Los tumores con clulas diferenciadas (SRB1), an cuando no son muy
proliferativos, muestran una gran masa necrtica y un alto nivel de apoptosis (Fig. 21, A).
Esta observacin podra ser explicada al considerar que las clulas presentes en este tipo
tumoral no se adaptan metablicamente expresando altos niveles de GLUTI. Debido a lo
cual, una vez que la clula tumoral prolifera hacia el interior del brote neoplsico pierde
rpidamente la capacidad de incorporar glucosa y muere por necrosis o apoptosis. La
situacin sera diferente en un tumor indiferenciado (SBR3), cuyas clulas estn en un
contacto permanente con el tejido conectivo, por lo tanto, no dependen de la difusin de
glucosa desde vasos sanguneos que se encuentran a grandes distancias (Fig. 21, C). De esta
forma las clulas no requieren sobre-expresar GLUT1 para sobrevivir realizando una activa
proliferacin. La falta de necrosis y la casi nula apoptosis se relaciona directamente con lo
discutido.
De esta forma, la alta expresin de GLUT1 est directamente relacionada con la
forma de crecimiento e invasin local que realizan las clulas neoplsicas y creemos que no
se relaciona directamente con mayor o menor agresividad tumoral. Este ltimo concepto
sera apoyado considerando que tumores de mama con clulas con alto grado de anaplasia
(SRB3) poseen baja expresin de GLUT1 pero el mayor potencial metastsico.
El anlisis de expresin realizado en tumores inducidos en ratones "nude", demostr
expresin solamente de la isoforma GLUT1. GLUT5 en cambio, fue inmunocitoqumicamente no detectable en este modelo. El patrn de crecimiento tumoral fue similar a lo
observado con tumores de tipo SBR2. Las clulas presentaron un nivel intermedio de
indiferenciacin, alta proliferacin celular y alta expresin de GLUT 1. Sin embargo este
tumor present masas necrticas con alto grado de apoptosis (7,1%), probablemente debido
a un sobre crecimiento del tumor en el ratn "nude". Aun as, lo observado en este modelo
es muy similar a lo detectado en los carcinomas humanos de grado SRB2. Debido a lo cual
esta metodologa podra ser de gran importancia en los anlisis futuros de esta problemtica.
Los estudios realizados en esta tesis, abren nuevas oportunidades para desarrollar
anlisis tendientes a determinar, por un lado, el rol funcional de la expresin de GLUT 1 en

estos tumores, y por otro, incorporar criterios que permitan una mejor evaluacin del tumor
desde una perspectiva ms generalizada, considerando todos los aspectos que determinan el
comportamiento de una determinada neoplasia.

Fig. 21. Esquema integrativo de la relacin entre carcinomas mamarios de diferentes

grados de diferenciacin con el grado de apoptosis, proliferacin y expresin del
transportador de glucosa. Lado izquierdo: Esquema de diferentes tipos de tumores de
mama con grados decrecientes de diferenciacin (A, con diferenciacin alta (SBR1); B, con
diferenciacin intermedia (SBR2); C, indiferenciado (SBR3)) y su relacin con el tejido
conectivo (lneas de color rojo). Lado derecho: Se indica la diferenciacin, proliferacin,
necrosis, apoptosis, expresin de GLUT1 y localizacin diferencial de GLUT1 para cada
tipo de tumor. Flechas en direccin ascendente: grado alto. Flechas en direccin descendente:
grado leve . Flechas en ambos sentidos: grado intermedio. +: Presencia. - : Ausencia.

o
l

GLUCOSA
Diferenciado
Proliferacion +
Necrosis

SBR 1

Apoptosis
GLUCOSA
-

Tejido
conectivo

Expresin de GLUTI
Localizacin diferencial (-)

GLUCOSA

Diferenciado + +
Proliferacin
Necrosis

SBR2

Apoptosis
GLU

Expresin de GLUT1
Localizacin diferencial (+)

(iliJi' 1+

GLUCOSA
SA

Diferenciado
Proliferacin
Necrosis
Apoptosis
Expresin de GLUT1

GLUCOSA

+
+
+
+

Localizacin diferencial (-)

5. CONCLUSIONES
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de transportadores de
hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras normales y tumores.
Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y ultraestructural, de la expresin de las
isoformas GLUT1 y GLUT5 en carcinoma ductal invasor de mama, que corresponde al tipo
tumoral de mayor frecuencia dentro de estas neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis
preliminar de correlacin entre la expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular
(PCNA) y apoptosis. Con este anlisis de concluye que:
- Los anticuerpos utilizados en este estudio son de alta especificidad y localizaron selectivamente
a cada isoforma de los transportadores de glucosa.
- La sobre-expresin de GLUT1 en cncer humano no es un fenmeno general, estando
restringido a un conjunto de neoplasias, que en la mayora de los casos son altamente agresivas.
Sin embargo, este estudio no pudo concluir una relacin directa entre agresividad y expresin de
GLUT1.
- Las neoplasias que no sobre-expresan GLUT1 tampoco sobre-expresan otra isoforma de
transportador de glucosa. En cambio, la mayor parte de los tumores que presentaron altos niveles
de GLUT1, sobre-expresaron otra isoforma de GLUTs.
- La expresin de GLUT5 sugiere que algunas neoplasias se adaptan metablicamente para
incorporar y utilizar fructosa como fuente de energa.
- En cncer de mama, la sobre-expresin de GLUT1 en tumores SBR2, seala una adaptacin
particular de este tipo tumoral, que junto a la gnesis de estructuras tipo "canalculos" y el
"sorting" diferencial de GLUT1 a membranas canaliculares, muestran que la expresin y
localizacin celular de GLUT 1 est directamente relacionada con el tipo de crecimiento de los
brotes tumorales y su relacin con el tejido conectivo. Este tipo de tumores posee una gran
capacidad de captacin de glucosa que impide la induccin de muerte celular. De esta forma se
observa un tumor con baja necrosis y apoptosis, aun cuando las clulas tumorales se alejan
considerablemte del estroma.
- En tumores de mama de tipo SBR3, no sera necesario la sobre-expresin de GLUT1 y su
localizacin diferencial, debido a que las clulas proliferan en un ntimo contacto con el estroma,
teniendo un acceso directo a la glucosa sangunea.

- Los fenmenos que regular la expresin de GLUT1 en cncer de mama no parecen estar
relacionados con el grado de proliferacin o apoptosis.
- La expresin de transportadores de fructosa en cncer de mama, indica que estas clulas
neoplsicas poseen la capacidad de metabolizar fructosa, que presentan una va metablica menos
regulada que la va de la glucosa.
- La localizacin intracelular de GLUT5 en cancer de mama, sugiere que este transportador
estara involucrado en transporte subcelular de esta hexosa.

5. CONCLUSIONES
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de transportadores de
hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras normales y tumores.
Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y ultraestructural, de la expresin de las
isoformas GLUT1 y GLUT5 en carcinoma ductal invasor de mama, que corresponde al tipo
tumoral de mayor frecuencia dentro de estas neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis
preliminar de correlacin entre la expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular
(PCNA) y apoptosis. Con este anlisis de concluye que:
- Los anticuerpos utilizados en este estudio son de alta especificidad y localizaron selectivamente
a cada isoforma de los transportadores de glucosa.
- La sobre-expresin de GLUT1 en cncer humano no es un fenmeno general, estando
restringido a un conjunto de neoplasias, que en la mayora de los casos son altamente agresivas.
Sin embargo, este estudio no pudo concluir una relacin directa entre agresividad y expresin de
GLUT1.
- Las neoplasias que no sobre-expresan GLUT1 tampoco sobre-expresan otra isoforma de
transportador de glucosa. En cambio, la mayor parte de los tumores que presentaron altos niveles
de GLUT1, sobre-expresaron otra isoforma de GLUTs.
- La expresin de GLUT5 sugiere que algunas neoplasias se adaptan metablicamente para
incorporar y utilizar fructosa como fuente de energa.
- En cncer de mama, la sobre-expresin de GLUT1 en tumores SBR2, seala una adaptacin
particular de este tipo tumoral, que junto a la gnesis de estructuras tipo "canalculos" y el
"sorting" diferencial de GLUT1 a membranas canaliculares, muestran que la expresin y
localizacin celular de GLUT1 est directamente relacionada con el tipo de crecimiento de los
brotes tumorales y su relacin con el tejido conectivo. Este tipo de tumores posee una gran
capacidad de captacin de glucosa que impide la induccin de muerte celular. De esta forma se
observa un tumor con baja necrosis y apoptosis, aun cuando las clulas tumorales se alejan
considerablemte del estroma.
- En tumores de mama de tipo SBR3, no sera necesario la sobre-expresin de GLUTI y su
localizacin diferencial, debido a que las clulas proliferan en un ntimo contacto con el estroma,
teniendo un acceso directo a la glucosa sangunea.

mo

- Los fenmenos que regular la expresin de GLUT1 en cncer de mama no parecen estar
relacionados con el grado de proliferacin o apoptosis.
- La expresin de transportadores de fructosa en cncer de mama, indica que estas clulas
neoplsicas poseen la capacidad de metabolizar fructosa, que presentan una va metablica menos
regulada que la va de la glucosa.
- La localizacin intracelular de GLUT5 en cancer de mama, sugiere que este transportador
estara involucrado en transporte subcelular de esta hexosa.

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