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CAPTULO VIII
PURIFICACIN DE ENZIMAS
CONTENIDO
Precauciones que se deben tomar al trabajar con enzimas
Etapas generales de un proceso de purificacin
Preparacin del extracto de purificacin
Tcnicas de purificacin por precipitacin
Tcnicas cromatogrficas
Mtodos auxiliares de purificacin
8.1.
INTRODUCCIN
La purificacin de una enzima es un proceso complejo debido a la
alta inestabilidad que muestran estas molculas y resulta ser un reto para
el Enzimlogo pues durante el mismo debe aplicar una serie de
estrategias, seleccionando de muchos mtodos aquellos que hagan al
procedimiento ms rentable.
La purificacin enzimtica desarroll enormemente gracias a la aparicin
de nuevas tcnicas bioqumicas all por los aos 50s y 60s del siglo
pasado y esto ha permitido tambin el avance de la Enzimologa pues
recin con una enzima pura se pudo determinar los mecanismos
catalticos, las propiedades qumicas, la masa molecular, los residuos
aminoacdicos que forman parte del centro activo, etc. de la misma.
Antes de considerar los aspectos prcticos de una purificacin es
necesario definir cual es el propsito u objeto de uso de la enzima
purificada; si se quiere por ejemplo hacer una caracterizacin molecular
de la misma, esta debe estar con un alto grado de pureza y en grandes
cantidades; pero si el objetivo es utilizarla para estudios cinticos, se
requerir en pequeas cantidades y no totalmente pura. Una vez
establecido el propsito de la enzima, se debe definir el nmero de
requerimientos mnimos para el producto final en trminos de calidad,
cantidad y eficiencia de la purificacin, o que se traduce en trminos de
pureza, rendimiento y economa.
Enzimologa
Enzimologa
8.3. ETAPAS
GENERALES
DE
UN
PROCESO
DE
PURIFICACIN
La seleccin y secuencia de los mtodos de purificacin a
emplearse deben hacerse con cierto criterio lo cual implica tomar en
cuenta los siguientes aspectos:
8.3.1. Conocimiento de la enzima:
Se debe estar al tanto de todo lo conocido hasta el momento, antes
de iniciar la purificacin: caractersticas moleculares como PM, PI;
conocer sus sustratos y productos, cofactores y coenzimas si los hay,
participacin de moduladores positivos o negativos; propiedades
fisicoqumicas de la enzima como pH y temperatura ptimas.
Se debe saber tambin sobre el medio natural de la enzima, si es
intracelular o extracelular; si esta unida a membrana celular u otra
estructura subcelular. Si existen impurezas en la fuente de extraccin que
pueden inhibir a la enzima, o la presencia de proteasas en la misma, etc.
Es importante hacer una revisin amplia sobre lo informado en la
literatura acerca de la enzima a purificar.
8.3.2. Seleccin de un mtodo que permita la identificacin y
cuantificacin de la enzima a purificar y de la protena total
Durante toda la purificacin es necesario detectar la presencia de la
enzima en forma activa; pero como la enzima est adems acompaada
de una gran variedad de molculas proteicas, se hace imprescindible la
22evaluacin de protena en cada etapa.
Existen varios mtodos para determinar la protena total (Lowry, Biuret,
microbiuret, Bradford, etc.), la seleccin de uno de ellos depende de las
caractersticas del extracto de partida, dado que la diferencias de los
mismos es su sensibilidad.
La evaluacin de la enzima se hace a travs de la medida de su actividad,
utilizando un mtodo que debe ser lo ms especfico y sencillo posible.
Estos dos ensayos permiten evaluar la eficiencia de una etapa de
purificacin, mediante los parmetros de control de la misma: actividad
especfica, rendimiento y pureza.
La actividad especfica es la actividad de la enzima por miligramo de
protena presente en cada etapa y se calcula de la siguiente forma:
Enzimologa
_______________________________________________
Enzimologa
una bacteria la cual por su corto tiempo de generacin, fcil cultivo y por
tener un nmero menor de contaminantes que una clula eucaritica, nos
va a proporcionar un mejor rendimiento.
8.3.4. Extraccin de la enzima
La localizacin de la enzima es un elemento importante para
hacer la seleccin del mtodo a emplear. Si la enzima se segrega al
medio, el procedimiento se simplifica, primero porque en la purificacin
hay menos contaminantes y segundo, por ser una protena que se va a
enfrentar a un medio distinto al de su sntesis, con seguridad que esta
dotada de una alta capacidad de resistencia a los cambios del medio (alto
nmero de puentes disulfuro, tamao pequeo, protena monomrica,
etc.).
Si la enzima es endocelular, el procedimiento de extraccin es ms
complejo; si esta est soluble en el citosol, es ms fcil de extraer que si
se encuentra en algn organoide, pues solo basta una ruptura de la
membrana plasmtica. Si purificamos una enzima de una clula
eucaritica que est localizada dentro de una organela, la ruptura de las
membranas intracelulares requiere de un tratamiento ms vigoroso; en
este caso es ms recomendable hacer previamente un fraccionamiento
por centrifugacin (centrifugacin diferencial) para obtener primero el
organoide y luego recin hacer la extraccin.
Las enzimas unidas a la membrana plasmtica o a membranas
intracelulares no se pueden extraer si no se utilizan medios apropiados
que permitan la ruptura de la interaccin protena-lpido que se presenta
en estos casos (empleo de detergentes).
8.3.5. Estructuracin de un plan de purificacin
La separacin de una enzima implica el aislamiento de la misma
de una mezcla compleja de protenas por lo que se hace necesario utilizar
una combinacin adecuada de tcnicas de separacin, cuyos fundamentos
sean diferentes (separacin por diferente PM, PI, polaridad, solubilidad,
etc.).
La estructuracin de un plan de purificacin se hace indispensable, el
mismo que combina adecuadamente diferentes tcnicas y en el orden
adecuado, en base a las propiedades especficas de la enzima a purificar y
de las molculas contaminantes. Existen incontables tcnicas de
separacin, pero las podemos agrupar en dos grandes grupos: tcnicas de
baja y alta resolucin.
Enzimologa
8.3.5.1.
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Tipo de clula o
Tejido
Principio
Suaves
Lisis celular
Eritrocitos
Digestin enzimtica
Bacterias
Homogenizador
Potter-Evehjem
Oocitos
Solubilizacin qumica
con tolueno y autlisis
Levadura
Hgado
Desgarramiento
celular
de
Tejidos vegetales
y animales
Trituracin
con
abrasivos: arena o
almina
Tejidos vegetales
y bacterias
Prensa francesa
Bacterias
y
clulas vegetales
Ultrasonicacin
Suspensiones
celulares
Molino de bolas
Suspensiones
celulares
Homogenizador
Mantn Gaulin
Suspensiones
celulares
Moderados
Homogenizacin
manual
(homogenizador
vidrio)
Homogenizador
cuchillas de acero
de
la
membrana
de
Vigorosos
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
ZONAS HIDROFBICAS
como
membranas mitocondriales, cloroplastos, retculo endoplsmico,
GRUPO POLAR SIN CARGA
etc.,+ -GRUPO
hay que
solubilizar este material usando detergentes los cuales
POLAR
enlazan a la protena y ocupan el lugar de los componentes lipdicos de
las membranas; el inconveniente es que al eliminar el detergente, la
protena puede desnaturalizarse o al menos agregarse y precipitar.
Un mtodo clsico empleado en estos casos es la extraccin del material
lipdico con acetona para obtener los denominados polvos cetnicos; el
mtodo consiste en una deshidratacin gradual con acetona hasta que esta
disuelva a los componentes grasos de las membranas, se liberan las
protenas y luego se evapora el solvente orgnico. El residuo slido
obtenido es luego dispersado en un buffer acuoso donde se recupera a la
enzima.
8.5. TCNICAS DE PURIFICACIN POR PRECIPITACIN
El principio bsico de esta tcnica es provocar una alteracin de
alguna propiedad del solvente original, que promueva la precipitacin de
sustancias; estas sustancias precipitadas pueden ser separadas mejor por
centrifugacin a velocidades relativamente bajas. Estas tcnicas son
aplicadas al inicio de un proceso de purificacin y pueden tener el fin de
eliminar contaminantes o concentrar el extracto.
La distribucin de los residuos hidrofilicos e hidrofbicos en la superficie
de las protenas, es el factor que determina la solubilidad en diferentes
solventes; aquellas protenas muy solubles en agua presentan una baja
hidrofobicidad en la superficie de la molcula, mientras las menos
solubles presentan un mayor nmero de grupos hidrofbicos
superficiales. Aunque la tendencia de los grupos hidrofbicos es
concentrarse en el interior de la molcula de protena, pueden existir
cierto nmero de estos residuos en la superficie, en contacto con el
solvente. Ver figura 8.1.
Enzimologa
Enzimologa
solubilidad en solvente acuosos.
ATRACCIN
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Log S = k
Donde:
S = solubilidad de la protena
= logaritmo de la solubilidad de la protena a fuerza
inica de cero, (depende da la naturaleza de la
protena, del pH y la temperatura)
'
s
= fuerza inica
Es 0la figura 8.5 se puede observar el comportamiento de algunas
protenas al incrementar la concentracin de sulfato de amonio.
-0,5 que a pequeos cambios en la fuerza inica se producen
Obsrvese
cambios drsticos en la solubilidad de una protena.
-1,0
Log. Solubilidad
2
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
SOLVENTE
ORGNICO
ZONAS HIDROFBICAS
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
100
75
80
50
Enzimologa
Nmero de Molculas
Enzimologa
64 128128 19248
16
6464
14436
3232
1089
11
252
00
60
00
6464
4824
6464
7221
77
6010
00
301
00
3232
1220
2121
6015
22
465
00
17
10
3535
3214
66
4210
00
30
3535
1112
1515
3512
00
36
2121
26
2424
1412
11
36
77
13
2828
810
66
31
11
2424
47
1212
19
1515
24
1818
11
66
2222
22
2222
11
1818
1212
666
22
11
13
20
Nmero de Transferencias
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Almina
Gel de slice
Esteroles, aminocidos
Enzimologa
Carbn activado
Gel de fosfato de calcio
Hidroxiapatita
Protenas, polinucletidos
cidos nucleicos
Enzimologa
Enzimologa
VENTAJAS DE
MOLECULAR
EXCLUSIN
Dextrano
Sephadex G1O
Sephadex G25
Sephadex G75
Sephadex G200
700
1000 5000
3000 70000
5000 800000
Potiacrilamida
Bio-gel P2
Bio-gel P6
Bto-gel P150
Bio-gel P300
200 2000
1000 6000
15000 150000
80000 400000
Agarosa
Sepharosa 2B
Sepharosa 4B
Bio-gel A-0,5 M
Bio-gel A-15 M
Bio-gel A-150 M
2 x 106 - 25 x 108
3 x 105 - 3 x 106
30000 500000
30000 - 15 x 106
5 x 106 - 150 x 106
Enzimologa
.
Otros grupos que se usan corrientemente son el carboxilo y el hidroxilo
fenlico. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo, un grupo amino
cuaternario) es un intercambiador de aniones o amnico.
La matriz puede estar hecha de diferentes materiales; los de ms uso son
el dextrano, la celulosa y los copolmeros de estireno y divinil
benceno. La tabla 8.3 muestra los intercambiadores inicos de ms uso.
Tabla 8.3
PROPIEDADES DE ALGUNOS
INTERCAMBIADORES INICOS
Matriz
Intercambiador
Grupo Funcional
Nombre Comercial
Enzimologa
Dextrano
Celulosa
Acrilico
Feniica
Epoxiamina
Sulfopropilo
Cartoximetito
DietIl-(2 hidroxipropil)
aminoetilo
Dietilaminoetilo
SP-Sephadex
CM-Sephadex
QAE-Sephadex
DEAE-Sephadex
C
C
A
A
A
Carboximetilo
Fosfo
Dietilaminoetilo
Polietilenimina
p-aminobenzilo
CM-celulosa
P-cel
DEAE-celulosa
PEl-celulosa
PAB-celulosa
DC
FC
DA
Carboxlico
cido sultnico
amino terciario
Bio Rex-70
Bio Rex-40
AG-3
Enzimologa
Enzimologa
purificacin parcial.
8.7. MTODOS AUXILIARES DE PURIFICACIN
Durante una purificacin es posible que la enzima que se est
purificando no est en condiciones apropiadas para aplicar el siguiente
paso de purificacin, por ejemplo puede estar en baja concentracin o en
una solucin con un alto contenido de sales; para solucionar estos
problemas se aplican mtodos especficos que por sus caractersticas y el
objetivo para los que son utilizados no constituyen, con algunas
excepciones, verdaderos mtodos de purificacin pero que, sin embargo,
son muy tiles y a veces imprescindibles.
8.7.1. CONCENTRACIN
Existen varias formas de concentrar la muestra enzimtica en
purificacin, una de ellas es la concentracin por precipitacin por la
adicin de sulfato de amonio, aunque tambin puede hacerse agregando
acetona. La desventaja de este mtodo es que el precipitado redisuelto
contiene el agente precipitante, que muchas veces se debe eliminar. Estos
mtodos de precipitacin son adecuados solamente cuando el contenido
proteico del extracto est por encima de 1 mg por ml.
Otra forma de concentrar es por adsorcin, por ejemplo en un
intercambiador inico, en este caso, solo se requiere que la enzima se
adsorba totalmente sin que importe el resto de protenas. Aunque los
mtodos ms importantes son aquellos en los que se produce eliminacin
de agua conjuntamente con solutos de bajo peso molecular; esto puede
lograrse con una gran variedad de procedimientos utilizando membranas
semipermeables (dilisis) o el principio de cromatografa en gel. Las
partculas secas de un Sephadex G-25 por ejemplo, cuando se hinchan
absorben agua ms no protenas, pues el tamao de sus poros es pequeo;
si tratamos 100 mi de solucin de purificacin con 20 gramos secos del
Sephadex en mencin, se obtiene un volumen final de 30 mi que
contienen un 80% de la protena original.
En la utilizacin del principio de dilisis, la muestra se coloca en una
bolsa de dilisis que se rodea de un polvo que atrae el agua. Las
sustancias ms utilizadas pare este fin son el polietilenglicol (PM 20000)
y carboximetil celulosa; el inconveniente son las impurezas de bajo peso
molecular que pueden estar presentes en estos materiales.
El sistema ms usado para eliminar agua es la ultrafiltracin; en este
Enzimologa
Agitador Magntico
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
CAPITULO IX
CONTENIDO
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimas inducibles
La mayor parte de las enzimas comerciales son inducibles, es decir,
requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como
inductor. De acuerdo con el modelo de Jacob y Monod (1961), el
inductor permite la sntesis de la enzima al unirse con el represor que
bloquea al gen operador impidiendo su transcripcin. Cuando el inductor
es de alto peso molecular y no puede atravesar la pared celular de la
bacteria, por ejemplo celulosa, el dmero celobiosa puede actuar como
inductor. En la tabla 9.2 se muestran algunos ejemplos de enzimas
inducibles.
TABLA 9.2
EJEMPLOS DE ENZIMAS INDUCIBLES
ENZIMA
Dextransacarasa
Dextranasa
Alfa amilasa
Naringinasa
Pululanasa
Invertasa
Glucosa isomerasa
Tirosinasa
MICROORGANISMO
Leuconostoc mesenteroides
Penicillium funiculosum
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Klebsiella pneumonidae
Pullularia pullulans
Bacillus coagulans
Neurospora crassa
INDUCTOR
Sacarosa
Dextranas
Almidn
Naringina
Maltosa
Monopalmitato de sacarosa
Xilosa
Tirosina D o L
Mecanismos de represin
Es la inhibicin en la sntesis de una enzima generalmente inducible, por
intermediarios producidos en el rpido catabolismo de la fuente de
carbono. Un ejemplo es la represin de lactasa por glucosa en E. coli. El
cAMP juega un rol clave en el mecanismo de represin, ya que su
concentracin intracelular se ve disminuida hasta 1000 veces cuando el
microorganismo crece en glucosa y la represin puede ser revertida
mediante su reposicin al medio. En la tabla 9.3 se muestran algunos
ejemplos de enzimas sujetas a este tipo de represin conocida como
represin catablica.
Un mecanismo menos frecuente de inhibicin lo constituye la
retrorrepresin, en el cual la sntesis de la enzima se ve reprimida por la
presencia de productos finales de biosntesis. Un ejemplo lo constituye el
efecto de ciertos aminocidos del medio de cultivo en la sntesis de
protenas.
TABLA 9.3
Enzimologa
MICROORGANISMO
Neurospora crassa
Escherichia coli
Leuconostoc mesenteroides
Trichoderma viride
Bacillus subtilis
Rhodotorula mucilaginosa
Bacillus estearthermophilus
REPRESO
Glucosa-fruc
Glucosa
Sacarosa
Celobiosa
Glucosa
Glucosa
Fructosa
Mejoramiento gentico
Una vez conocidos los mecanismos regulatorios de la produccin de una
enzima, se podr mejorar la productividad a travs de procesos de
mutacin y seleccin o bien mediante un adecuado manejo del medio
ambiente. En la tabla 9.4 se presentan algunas estrategias para la
obtencin de mutantes.
TABLA 9.4
ESTRATEGIAS EN LA SOBREPRODUCCIN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
ENZIMAS INDUCIBLES
Obtencin de mutantes con necesidades reducidas o nulas de inductor (cuando el
es caro)
ENZIMAS SUJETAS A RETRORREPRESIN
Evitar la presencia de productos finales en el medio de cultivo
Evitar la acumulacin de productos finales mediante la adicin de algn inhibid
ruta metablica
Limitar la disponibilidad de un factor de crecimiento a un mutante auxtrofo
Eliminacin de los productos finales (dilisis, ultrafiltracin)
Obtencin de mutantes no sujetos a represin por productos finales
ENZIMAS SUJETAS A REPRESIN CATABLICA
Evitar el uso de la fuente de carbono que ocasiona la represin, sustituyndola por
mas lenta asimilacin
Limitar el crecimiento del microorganismo ya sea cultivo en quemostato o ferme
retroalimentada
Obtencin de mutantes resistentes a la represin catablica
Medida de la actividad enzimtica durante la produccin
Enzimologa
Alfa
amilasas
Pectinasas
Celulasas
METODOLOGA
Solubilizacin de papel
Enzimologa
Enzimologa
MICROORGANISMO
Rhizopus sp.
Aspergillus oryzae
Aspergillus niger
Trichoderma viride
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Aspergillus soyae
SUSTRATO
Salvado de trigo
Salvado de trigo
Arroz
Salvado de trigo
Salvado de trigo
Salvado de trigo
Figura 9.1.- Produccin de celulasas utilizando el mtodo de Koji. A.cultivo sumergido para inoculacin de Trichoderma
viride, B.compresor de aire, C.- filtro de aire, D.- Inoculacin, E.- aire de salida,
F.- colector de muestra, G.- bomba de centrfuga, H.- cultivo de T. viride
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
FUENTE DE
CARBONO
Almidn
Celulosa
Dextrana
Almidn
Sacarosa
Naringina
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
MICROORGANISM
Bacillus subtilis
Trichoderma viride
Penicillium funiculosu
Aspergillus niger
Leuconostoc mesenteroi
Aspergillus niger
Kluyveromyces lactis
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Enzimologa
Salvado de trigo
Salvado de arroz
Agua de cocimiento de maz
Diversos hidrolizados
Malta (cebada)
FUENTES
PROTEICAS
MICROBIANAS
Extracto de levaduras
Vinazas
Hidrolizado de pescado
Hidrolizado de carne
MICROORGANISMO
Celulasa
Invertasa
Dextranasa
Alternansacarasa
Trichoderma viride
Pullularia pullulans
Penicillum
funiculosum
Leuconostoc
mesenteroides
Aerobacter aerogenes
Pululanasa
Relacin de produccin
MEDIO + TENSIOACTIVO
MEDIO SOLO
20
16
2
2
1,5
Enzimologa
Enzimologa
EXTRACCIN:
Si la enzima est ligada a la pared celular o a alguna membrana celular,
se usa solventes como el isobutanol, alcohol isoamlico y tolueno. Para
Enzimologa
Enzimologa
SEPARACIN DE SLIDOS:
La eliminacin de clulas al final de la fermentacin, la eliminacin de
residuos celulares despus de la ruptura y la recuperacin o eliminacin
de precipitados (protenas y cidos nuclicos), se efecta por
centrifugacin o por filtracin. La seleccin del equipo mas adecuado
depende de varios factores dentro de los que podemos destacar, tamao
de partcula, diferencia de densidades entre las fases a separar, viscocidad
del medio, la aglomeracin y caractersticas pegajosas del precipitado. En
todos los procesos prcticamente es necesario el agregado de floculantes
(hidrocoloides o polielectrolitos) con el fin de aglomerar las partculas y
facilitar su separacin.
La operacin de separacin mas empleada en la recuperacin de enzimas
es la centrifugacin; el tiempo y la velocidad deben ser cuidadosamente
seleccionadas en cada etapa en que se requiera. Otra operacin
importante es la ultrafiltracin; con el conocimiento del PM de la enzima
a procesar, se selecciona la membrana o la fibra con el tamao de poro
adecuado para su retencin, permitiendo al sistema concentrar la muestra
Enzimologa
PRECIPITACIN, EXTRACCIN
CROMATOGRAFAS:
LQUIDO-LQUIDO
SECUENCIA DE OPERACIONES:
Existe poca informacin disponible sobre que operaciones seleccionar y
en qu secuencia, al disear un proceso de purificacin de enzimas
microbianas. De un anlisis de 8 revistas peridicas efectuado en 1984,
en 100 publicaciones sobre purificacin de enzimas, se encontr que la
operacin mas usada es la cromatografa de intercambio inico (75% de
los
Enzimologa
Enzimologa
COSTOS:
Se debe optimizar el proceso en cuanto a costos, sacrificando etapas de
purificacin por su alto costo de reactivos o por su menor rendimiento en
relacin a otras etapas. Un valor promedio de costos es, 200 dlares por
litro de capacidad del fermentador.
Enzimologa
CAPITULO X
CONTENIDO
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
La biotecnologa en los ltimos aos ha experimentado grandes avances
as como sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos
qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica. Los procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya
que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biolgicos: Presentan una gran actividad cataltica;
muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad
y regioespecificidad); son muy activos a temperatura ambiente y presin
atmosfrica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha
generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la
mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo, por
otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y
productos es difcil y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la
inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea
econmicamente rentable.
GENERALIDADES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o
localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser
Enzimologa
Tanque agitado
Tanque agitado de
Alimentacin contnua
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Figura 10.4.
Mtodo de microencapsulacin de enzimas por
polimerizacin interfacial
Enzimologa
Figura 10.6.
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
1. Su preparacin sencilla.
2. Su bajo costo.
3. No hay cambios de especificidad enzimtica.
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.
Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:
1. La optimizacin rigurosa de las variables que controlan la adsorcin.
2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecnico.
3. La unin al soporte es dbil.
Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear
resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y
contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan
cambios en la matriz insoluble.
10.3.2. Unin covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de
inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos
qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas
(ver tabla 10.1)
De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura
de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el
soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina,
y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido
asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter
hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo
presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada
su estructura terciaria.
Enzimologa
Enzimologa
10.4. Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica
que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas
enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas
de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos,
diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si
estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura.
El co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica
debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las
enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de
lisina (por ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de
inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la enzima por
adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico
(con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente
aadir el reactivo bifuncional.
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
RT
RTxzFV
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
Inclusin en
Atrapamiento
Reticulado
Adsorcin
Unin
Membranas
qumica
covalente
Preparacin
Intermedia
Difcil
Intermedia
Sencilla
Difcil Fuerza de
unin
Dbil
Media
Dbil-Media
Media
Fuerte
Actividad enzimtica Media-Alta
Baja
Baja
Media
Alta
Regeneracin soporte Posible
Imposible
Imposible
Posible
Difcil
Coste proceso
Medio-Alto
Medio
Medio
Bajo
Alto
Estabilidad
Media
Alta
Alta
Baja
Alta
Validez
General
General
Limitada
General
Limitada
Resistencia microbiana S
S
S
No
No
Enzimologa
Enzimologa
Enzimologa
BIBLIOGRAFA
Enzimologa
fundamentals
and