Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

DETECCIN DEL MARCADOR

Y-STR DE USO FORENSE
DYS393 EN HECES HUMANAS
FUENTES B. Susy, CONDORI T. Gualberto, LUNA B Ruddy,
Centro de Investigacin Gentica, DNPTC-Polica Nacional, Bolivia. Correspondencia: rlunab@gmail.com

RESUMEN
Mediante la amplificacin por PCR del marcador molecular
de uso forense DYS393, se ha evaluado cualitativamente
el sistema comercial Fecal DNA Purification Kit de la
compaa MoBio, para la purificacin de ADN total a
partir de muestras de heces de origen humano,
conservadas a -20 C por 6, 13 y 90 das, sometidas a
degradacin ambiental por 24 horas, y colectadas en va
pblica. Los resultados demostraron que el sistema es
eficiente en todos los casos, tanto para remover los
inhibidores de PCR como para obtener cantidad suficiente
del disminuido material gentico humano remanente en
los restos fecales, y as permitir la deteccin y estudio
forense del marcador de identidad gentica. Un siguiente
estudio cuantitativo es requerido.

ABSTRACT
Using the genetic identity marker DYS393 of forensic
use, by means of PCR it has been evaluated the
commercial system Fecal DNA Purification Kit from
MoBio company for the purification of total DNA, starting
from samples of recent grounds, subjected to
environmental degradation along 24 hours, preserved at
-20C, and sampled from thoroughfare. Results showed
that the system is efficient in all cases, so much to remove
the inhibitors of PCR like to obtain enough quantity of the
diminished and remnant human genetic material in the
fecal samples, reaching the goal of detecting this genetic
identity molecular marker in prospective forensic
applications. A quantitative analysis is required.
Palabras clave: Heces, evidencia, forense, purificacin,
perfil gentico, DYS393.

INTRODUCCIN
En las pasadas tres dcadas, el progreso cientfico en
el desarrollo de tcnicas de anlisis gentico molecular
ha sido vertiginoso. Para las ciencias forenses, la
incorporacin del perfil de identidad gentica como
herramienta en la identificacin de personas representa
uno de los avances ms tiles y significativos desde la
creacin de las bases de datos con huellas dactilares.

Diversos marcadores moleculares del tipo STR (Single

Tandem Repeats) son empleados actualmente para
obtener perfiles de identidad gentica; uno de ellos, el
marcador DYS393, que se halla nicamente en el
cromosoma Y, es principalmente utilizado para discriminar,
en uso conjunto a otros marcadores similares, el perfil
gentico del ADN autosmico de una vctima de sexo
femenino, del perfil haplotpico de un agresor varn, en
un caso tpico de agresin sexual que contiene evidencia
de indicios biolgicos mezclados.
Sin embargo, en un escenario criminal puede encontrarse
una amplia gama de indicios biolgicos durante una
investigacin policial forense, entre los que se incluyen
restos titulares, manchas hemticas, muestras pilosas,
fluidos diversos, y, rara vez, restos fecales. Este tipo
ltimo de indicio, por su naturaleza, es difcil de procesar
en el laboratorio, especialmente si la descomposicin
orgnica ha sido acelerada por condiciones de temperatura
y humedad del entorno, y si el tiempo transcurrido ha
sido excesivo. Cul entonces la razn de evaluar
mtodos analticos para estudiar esta rara evidencia
biolgica? Pues como ejemplo y motivo principal est el
atraco a la casa de cambios SUDAMER en La Paz en
2006, donde se obtuvo como nico rastro biolgico este
singular pero escaso tipo de evidencia (com.pers. Tcnl.
Gualberto Condori T., Sub-Jefe Dpto. Nal. Polica Tcnica
Cientfica).
Existen tres razones principales por las que la obtencin
de ADN til a partir de heces es compleja: a) la cantidad
de material gentico humano es escasa; b) existe una
gran cantidad de material gentico microbiano
contaminante; y c) las heces poseen una variedad de
compuestos inhibidores del PCR como las bilirrubinas,
polisacridos complejos, sales biliares y otros (Deuter et
al., 1995; Monteiro et al., 1997).
La facultad para obtener perfiles de identidad gentica
a partir de muestras de heces, resulta ventajosa bajo
circunstancias en las que una investigacin policial forense
dispone nicamente de este material biolgico como
evidencia; un mtodo rpido y verstil de purificacin
resulta, por tanto, muy necesario (Vigilant, 2002). La
actividad inhibitoria de los contaminantes propios del
material fecal ha sido previamente documentada (Surace,
23
N 2 Vol 1 Ao 2007

Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

1999; Monteiro et al., 1977). Esta inhibicin obstaculiza

principalmente la actividad de la enzima polimerasa
durante la amplificacin por PCR de los marcadores STR,
por lo que su remocin o inactivacin es imperativa.
(Deuter et al., 1995). Los factores metodolgicos ms
importantes ha tomar en cuenta son: la etapa de
purificacin durante la obtencin del material gentico
total, la inactivacin de inhibidores durante la lisis celular
y la purificacin durante la recuperacin de la cromatina
nuclear de alto peso molecular que contiene el genoma
del cromosoma Y.
La aplicacin de varios protocolos de purificacin de ADN
de rutina han mostrado en nuestro medio poca o ninguna
eficiencia con este tipo especfico de evidencia biolgica
(com.pers. Tcnl. Condori), por lo que se hace necesario
evaluar nuevos y mejor elaborados sistemas, basados
en mecanismos de purificacin ms selectiva y eficiente
tal como ha sido demostrado por el trabajo de Vandenberg
y van Oorschot (2002) con un mtodo de purificacin de
la compaa QIAGEN.
La sola deteccin del marcador DYS393 en heces fecales
humanas mediante PCR es un indicador cualitativo de
la eficiencia del mtodo de purificacin propuesto, as
como tambin de la sensibilidad del sistema de
amplificacin (considerando la disminuida cantidad de
ADN del donante y el efecto degradativo de sustancias
y microorganismos propios de las heces), y,
adicionalmente, es un indicador directo del sexo del
donante de la muestra biolgica fecal.
El presente trabajo evalu el sistema comercial Fecal
DNA Purification Kit de lisis alcalina y filtrado selectivo
por columnas de precipitacin de la compaa MoBio
(diseado originalmente para estudiar el genoma total
bacteriano), en bsqueda de la posibilidad de extender
su aplicabilidad en el campo forense, determinando si
posee la sensibilidad suficiente para detectar el casi
imperceptible ADN humano presente en restos fecales,
a travs de la amplificacin y deteccin del microsatlite
DYS393.

MATERIALES Y MTODOS
Colecta de muestras
Dos tipos de muestras fecales fueron obtenidas para el
estudio. La primera constituida por heces fecales humanas
de donante varn, colectadas en frascos plsticos
inmediatamente a su deposicin. La segunda de heces

24
N 2 Vol 1 Ao 2007

humanas de donante desconocido colectadas en va

pblica.
Para estimar cualitativamente la eficiencia del mtodo
aplicado, se previ la purificacin de ADN a partir de la
una muestra principal colectada y procesada fresca
etiquetada A. De sta, tres sub-muestras fueron
conservadas a -20 C y procesadas al trmino de 6 das
(A1), de 13 das (A2) y de 90 das (A3) de
conservacin respectivamente. Una cuarta sub-muestra
de A, etiquetada B (por tanto rplica de A), fue sometida
a condicin ambiente por 24 horas, obteniendo fragmentos
de la misma cada 2 horas (B1, B2, B3, B4 Y B5). La
muestra obtenida en va pblica fue etiquetada C.
El control negativo de donante femenino fue etiquetado
F y el control positivo V.
Los extractos fueron primeramente sometidos a un PCR
buscando detectar un marcador propio y exclusivo de
microorganismos bacterianos (el gen de la sub-unidad
16S del ribosoma, 1500 pb aprox.) con objeto de evaluar
la pureza e idoneidad del extracto para futuras
amplificacin a partir del ADN total obtenido.
Posteriormente se procedi a la deteccin del marcador
DYS393 del genoma humano (130 pb aprox.).
La especificidad de los cebadores se confirm utilizando
ADN control negativo de un donante femenino (F), y
ADN de un donante varn como control positivo (V),
obtenidos a partir de sangre colectada por puncin y
goteo (50 ul aprox.).

Protocolo de purificacin de ADN a partir de

heces:
Se mantuvo el esquema general recomendado por el
fabricante aplicando algunas modificaciones: 400 a 500
mg de heces fueron agregados a un tubo MoBio de
miniesferas de slica, adicionando 700 ul de la solucin
para mini esferas ms 250 ul de la solucin removedora
de contaminantes (Inhibitor Removal Solution, IRS). La
mezcla se someti a vrtex por 10 minutos. Luego los
tubos fueron centrifugados a 10000G por 1 minuto y se
colect el sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo,
adicionando 250 ul de la solucin de lisis, dejando en
reposo a 4 C por 10 minutos luego de mezclarlos por
inversin. Posteriormente se colectaron 600 ul de la
mezcla en un tubo filtro spin, centrifugando el mismo por
1 minuto a 10000G y desechandose el precipitado. El
remanente de la mezcla fue sometido al mismo
procedimiento, desechando el precipitado y se agregando

Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

al filtro spin 600 ul de una solucin de etanol al 90%. El

filtro spin con etanol fue centrifugado a 10000G por 1
minuto, desechado el precipitado y se centrifugando una
vez ms por 1 minuto a 10000G. Finalmente, el filtro spin
fue colocado en un tubo eppendorf nuevo y se agregaron
50 ul de una solucin Tris 10 mM, precipitando y
recuperando el ADN total (> 50 kDa) por centrifugacin
de 1 minuto a 10000 G.

Protocolo de purificacin de ADN de sangre:

Se utiliz el mismo sistema pero eliminado la etapa inicial
de disgregacin por miniesferas, ms la de remocin de
contaminantes con la solucin IRS: 50 ul de sangre fresca
fueron colocados en un tubo eppendorf de 1.5 ml y se
agregaron 800 ul de la solucin de lisis alcalina, dejando
reposar durante 20 minutos a 4 C luego de mezclar por
inversin. Se colectaron 600 ul de la mezcla en un tubo
filtro spin que fue centrifugado por 1 minuto a 10000G,
desechando el precipitado. El remanente de la mezcla
fue sometido al mismo procedimiento. Desechando el
filtrado, se agregaron 600 ul de la solucin de etanol al
90% y se centrifug a 10000G por 1 minuto, el precipitado
fue desechado y se centrifug una vez ms por 1 minuto
a 10000G. El filtro spin fue colocado en un tubo nuevo
y se agreg cuidadosamente 50 ul de Tris 10 mM, liberando el ADN del filtro finalmente por centrifugacin de
1 minuto a 10000 G.

Condiciones de PCR:
La amplificacin del 16S DNA ribosomal para detectar
genoma bacteriano presente en las heces se realiz
segn el protocolo estandarizado para el estudio de
bacterias sulfato reductoras en sedimentos amaznicos
por Luna R. (2004).
Las condiciones de los reactivos BioLabs, cuyo Buffer
contiene MgCl2 para la amplificacin del marcador humano
DYS393, fueron: Buffer Taq 1X, dNTPs 0.2mM, Cebadores 0.2uM, Taq Polimerasa 0.035 U/ul y de 3 a 5 ng
del ADN purificado. El programa de amplificacin empleado fue: un ciclo de 95 C por 1 minuto; 30 ciclos de
95 C por 30 segundos, 55 C por 30 segundos y 72 C
por 30 segundos; 1 ciclo final de 72 C por 5 minutos
(Lisbeth Borjas, Universidad del Zulia, Venezuela. com.
pers.).
Los purificados del ADN total obtenido y el amplificado
del 16S DNAr bacteriano fueron revelados mediante
electroforesis horizontal en agarosa estndar al 2%, 50V
y 45 minutos. El producto DYS393 fue revelado por
electroforesis horizontal en agarosa LMP al 2.5%, 50V
y 30 minutos. Las fotografas digitales fueron analizadas
empleando el programa informtico de distribucin libre
LabImage 7.1.

MUESTRA

TIPO

ORIGEN

Reciente

Heces Donante Varn

A1

Conservada -20 C 6 das

HDV

A2

Conservada -20 C 13 das

HDV

A3

Conservada -20 C 90 das

HDV

Reciente

HDV

B1

Cond. Ambiente 2 horas

HDV

B2

Cond. Ambiente 4 horas

HDV

B3

Cond. Ambiente 6 horas

HDV

B4

Cond. Ambiente 8 horas

HDV

B5

Cond. Ambiente 24 horas

HDV

En Va Pblica

Heces Donante No Identificado

Control Negativo (-)

Sangre Donante Mujer

Control Positivo (+)

Sangre Donante Varn

Tabla 1. Condiciones de las muestras de heces analizadas.

25
N 2 Vol 1 Ao 2007

Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

A1

A2

A3

B1

16S 18S

B1

B2

B3

B4

B5

B6

B7

Figura 1: Fotografa digital invertida y seccionada en columnas (mediante el software LabImage 7.1) de la electroforesis horizontal
en agarosa LMP de los productos de PCR obtenidos (16S DNAr y DYS393). Ver referencia en Tabla 1.

RESULTADOS
La purificacin de ADN en los grupos de muestras A y
B permiti obtener de 15 a 20 ug/ml de material gentico.
La muestra C proporcion 3 a 7 ug/ml y present una
degradacin aparente entre 82 y 93%, evaluada por
comparacin del esmirro y la longitud total de la corrida
electrofortica mediante el programa LabImage. En todos
los casos se obtuvo el producto esperado de 1500 pb
correspondiente al 16S DNAr bacteriano (no mostrado),
y en todos, excepto en el control negativo F, se obtuvo
el amplificado esperado de 130 pb del DYS393
(Figura 1).
Tabla 1: Condiciones de las muestras de heces
analizadas:
Figura 1: Fotografa digital invertida y seccionada en
columnas (mediante el software LabImage 7.1) de la
electroforesis horizontal en agarosa LMP de los productos
de PCR obtenidos (16S DNAr y DYS393). Ver referencia
en Tabla 1.

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
La obtencin de perfiles de ADN a partir de heces se ha
vuelto mucho ms efectiva y prctica con los sistemas
de extraccin automatizados (Norris y Bock, 2000; Roy,
2003), pero son mucho ms costosos que los manuales,
y mucho ms (hasta 20 veces) que los protocolos
tradicionales. La compaa MoBio ofrece un kit manual
especfico para aplicaciones forenses pero con un costo
5 veces mayor al del kit evaluado en el presente trabajo.
Convenientemente, los resultados experimentales
obtenidos en el presente trabajo han demostrado eficiencia
suficiente para proseguir con una estandarizacin.
Un sistema de lisis nicamente alcalino es levemente
selectivo ya que al no contener SDS limita la lisis celular

26
N 2 Vol 1 Ao 2007

en su mayor parte a membranas, dejando paredes

celulares pobremente afectadas. Esto es apropiado en
muestras de heces ya que la mayor parte de los cidos
nuclecos presentes pertenecen a bacterias de la flora
intestinal y otros contaminantes biolgicos parasticos.
El mtodo empleado de MoBio contiene SDS como
detergente lsico y, pese a esto, la potencial interferencia
del genoma bacteriano en el PCR ha sido evadida por
la especificidad del marcador STR elegido. No se
obtuvieron productos adicionales al esperado a excepcin
de la banda extrema inferior de aproximadamente 70 pb,
presente en todos amplificados y asociada a la naturaleza
del DYS393 y su probable afinidad a regiones del
cromosoma X (Neil et al., 2004) que no afectan sueficiencia
para detectar el producto esperado en el cromosoma Y
de 130pb.
La cantidad de ADN humano presente en las muestras
analizadas no puede ser apropiadamente evaluada con
los mtodos empleados, pero, a travs de los resultados
obtenidos, ha demostrado ser de calidad y cantidad
suficientes para realizar la amplificacin del marcador
forense DYS393 a partir de muestras fecales en distintos
estados de conservacin (A, B y C). Mientras mayor el
tiempo de reposo de restos fecales a condiciones
ambientales, mayor el estado degradativo de sus
componentes biolgicos. Los restos del epitelio intestinal
arrastrados durante la formacin y expulsin de las heces
son mnimos y generalmente degradados por la actividad
microbiana, pese a esto la cantidad detectada por el
sistema empleado ha sido suficiente, lo cual invita a
continuar la investigacin utilizando mtodos cuantitativos.
La presencia del producto 16S DNAr es evidencia de la
ptima calidad del material gentico para el PCR (1500
pb). La gran cantidad de bacterias presentes en heces
probablemente facilita su deteccin, pero la presencia
de contaminantes orgnicos e inhibidores dificultaran la

Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

misma al emplearse mtodos convencionales de

extraccin de ADN (Wilson, 1997). El protocolo empleado
no solo ha permitido la amplificacin de un marcador
taxonmico bacteriano, sino tambin de uno humano y
de extenso uso forense.

AGRADECIMIENTOS

La ausencia de producto DYS393 en el carril 3 (muestra

congelada por 13 das) no implica un efecto negativo del
tiempo de conservacin sobre la integridad del ADN, ya
que en una prueba posterior la rplica de esta muestra
evidenci un resultado positivo (datos no mostrados).

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

Deuter R, Pietsch S, Hertel S, Muller O. A method for

preparation of fecal DNA suitable for PCR. Nucleic Acids
Research 1995. 23(18):3800-1.

Sin embargo, el ensayo realizado con la muestra B

(condicin ambiente durante 24 horas) deja ver una
gradual disminucin de intensidad de las bandas en la
electroforesis, lo cual puede asociarse al probable efecto
degradativo del entorno sobre el ADN humano remanente
en las heces. No obstante, al tratarse de un PCR no
cuantitativo no es posible llegar a una clara conclusin.
Para apoyar este punto de vista ntese la similitud de
intensidad y tamao entre las bandas del control positivo
V (carril 15) y de la muestra colectada en va pblica
(carril 5).

2.

Johnson D, Martil L. y Roberts K. STR-typing of human

DNA from human fecal matter using the QIAGEN
QIAamp stool mini kit. Journal of Forensic Sciences
2005. 50:4.

3.

Monteiro L, Bonnemaison D, Vekris A, Petry KG, Bonnet

J. 1997. Complex polysaccharides as PCR inhibitors
feces. Journal of Clinical Microbiology. 1997:995-998.

4.

Nicholas Vandenberg y Roland A. H. van Oorschot.

Extraction of Human Nuclear DNA from Feces Samples
Using the QIAamp DNA Stool Mini Kit. Journal of
Forensic Sciences 2002, 47(5):1-3.

5.

Leat Neil, Liezle Ehrenreich, Mongi Benjeddou y Sean

Davison. Developments in the use of Y- chromosome
markers in forensic genetics. African Journal of
Biotechnology 2004 . 3 (12): 637-642.

6.

Luna R. Perfil preliminar de bacterias sulfato reductoras

en sedimentos de laguna La Granja (Beni - Bolivia).
Tesis de Licenciatura. Carrera de Biologa, FCPN, UMSA,
La Paz, Bolivia 2004.Norris D. y Bock J. Use of fecal
material to associate a suspect with a crime scene: report
of two cases.Journal of Forensic Sciencies 2000. 45:1.

7.

Surace D. Retrieval of nuclear DNA from human feces:

Implications and techniques in forensic science [hons.
thesis]. La Trobe University 1999.

8.

Taberlet Pierre, Sally Griffin, Benot Goossens, Sophie

Questiau, Valrie Manceau, Nathalie Escaravage, Lisette
P. Waits and Jean Bouvet. Reliable genotyping
of samples with very low DNA quantities using PCR.
Nucleic Acids Research1996. 24(16):3189-3194.

9.

Linda Vigilant. Technical Challenges in the Microsatellite

Genotyping of a Wild Chimpanzee Population Using
Feces. Evolutionary Anthropology, Suppl 2002. 1:16216.

10.

Ian G. Wilson, Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid

Amplification. Applied and Environmental Microbiology
1997. 63(10):3741-3751.

Un resultado adicional deducido a partir de la presencia

de DYS393 en la muestra C (carril 5) es la posibilidad
de afirmar que se trat de heces procedentes de un
donante varn. Lo cual evidencia la potencial aplicacin
de los marcadores del cromosoma-Y en este tipo de
evidencia biolgica para, inicialmente, identificar el gnero
del donante, adems de evidenciar claramente la
importante posibilidad de estudiar el genoma humano
presente en una muestra tan maltratada.
El principio de remocin de inhibidores de PCR ha sido
previamente demostrado en aplicaciones forenses (Norris
y Bock, 2000; Johnson et al., 2005).
La eficiencia demostrada por el mtodo aplicado tiene
directa relacin con los principios fsico-qumicos del
sistema comercial utilizado (MoBio). Por un lado, una
optimizacin metodolgica en la aplicacin de la solucin
removedora de contaminantes IRS, y por otro, la
purificacin final del ADN obtenido a travs del filtro spin
son, al punto de vista de los autores, los factores
preponderantes para lograr resultados positivos con este
tipo de muestra biolgica compleja, considerada como
potencial evidencia biolgica durante una investigacin
forense, que por su naturaleza se ve sometida a
descomposicin por condiciones ambientales extremas
y por la actividad bacteriana destructiva inherente.

A Susana Revollo PhD, responsable del laboratorio de

Biologa Molecular del SELADIS en La Paz por el soporte
tcnico prestado.

27
N 2 Vol 1 Ao 2007

Deteccin del Marcador Y-STR de uso Forense DYS393 en Heces Humanas

11.

12.

De La Barra Zeballos Susan, Identificacin de anticuerpos

anticlulas de los islotes del pncreas (ICAs) en
pacientes con diabetes Mellitus tipo 1 y en familiares de
primer grado de los mismos por inmunofluorescencia
indirecta con sustrato de pncreas de rata, Tesina para
optar al ttulo de Licenciatura. UMSA - FCFB. La Paz
Bolivia. 2000.
Daz Horta O, Cabrera Rode E, Daz Daz O. Estrategias

28
N 2 Vol 1 Ao 2007

a seguir en la prevencin primaria de Diabetes Mellitus

Insulinodependiente. Revista Cubana Endocrinologa,
1996;7(1) 12-25.
13.

Snchez-Garca L, Salinas MT. Un modelo de aplicacin

de la medicina preventiva: Diabetes Mellitus Insulino
Dependiente. SELADIS - FCFB y Hospital Obrero CNS
- Medicina Interna y Endocrinologa. La Paz - Bolivia.
1997.