Práct 1 Material de Laboratorio

DETERMINACIN
DE ACTIVIDAD
INSTITUTO
POLITCNICOENZIMTICA
Y EFECTO DE LA
CONCENTRACIN
DE
Instituto
Politcnico Nacional
NACIONAL
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa
UNIDAD
PROFESIONAL
ENZIMA, PH,
TEMPERATURA
Y FUERZA
Laboratorio
de Bioconversiones
INICA EN LAINTERDISCIPLINARIA
ACTIVIDAD ENZIMTICA (DE BIOTECNOLOGA
AMILASA).
PROFESORES:
Dra. Mara del Carmen Oliver S.
Dr. Luis Fernndez Linares
IBT. Jocelyn Snchez Arellano
GRUPO: 5BM1
EQUIPO: 6
ALUMNOS:
Betancourt Acosta Jazmn

Hernndez Borja Karen Susana
Loreto Reza Marco Eli
Montoya Daz Jos Antonio
Salinas Martnez Carla Karen
2 de Octubre del 2014
Instituto Politcnico Nacional

Laboratorio de Bioconversiones
NDICE
Contenido
1.1. Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio..................4
1.1.1 Introduccin...................................................................................................4
1.1.2 Objetivos.......................................................................................................4
1.1.3 Metodologa..................................................................................................4
1.1.4 Resultados....................................................................................................7
1.1.5. Discusin......................................................................................................7
1.1.6. Conclusiones................................................................................................8
1.1.7 Referencias...................................................................................................8
1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas.........................9
1.2.1 Introduccin...................................................................................................9
1.2.2 Objetivos......................................................................................................11
1.2.3 Metodologa.................................................................................................11
1.2.4 Resultados..................................................................................................14
1.2.5 Discusin.....................................................................................................15
1.2.6 Conclusiones...............................................................................................15
1.2.7 Bibliografa..................................................................................................15
1.3
Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de Bioconversiones.16
1.3.1 Introduccin.................................................................................................16
1.3.2 Objetivos.....................................................................................................16
1.3.3Metodologa.................................................................................................17
1.3.4Discusin......................................................................................................19
1.3.5 Conclusiones...............................................................................................19
1.3.6Bibliografa...................................................................................................19
1.4 Determinacin de crecimiento celular por turbidimetra o Densidad ptica
(D.O), peso seco y cuenta directa en cmara de Neubauer...................................20
1.4.1 Introduccin.................................................................................................20
1.4.2. Objetivos....................................................................................................21
1.4.3Materiales y reactivos..................................................................................21
1.4.4. Metodologa...............................................................................................22
1.4.5. Resultados.................................................................................................22
1

1.4.6 Discusin.....................................................................................................24
1.4.7 Conclusiones...............................................................................................24
1.5 Determinacion de azucares reductores............................................................22
1.5.1Introduccin..................................................................................................22
1.5.2 Objetivos.....................................................................................................23
1.5.3 Metodologa................................................................................................23
1.5.4 Resultados..................................................................................................24
1.5.5 Discusin.....................................................................................................25
1.5.6 Conclusiones...............................................................................................27
1.5.7 Referencias.................................................................................................27
1.6. Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas elegidas.......28
1.6.1 Introduccin.................................................................................................28
1.6.2 Objetivos.....................................................................................................29
1.6.3 Metodologa................................................................................................29
1.6.4 Resultados..................................................................................................30
1.6.5 Discusin.....................................................................................................32
1.6.6 Conclusiones...............................................................................................33
1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas: amilasas.................................34
1.7.1 Introduccin.................................................................................................34
1.7.1Materiales y mtodo.....................................................................................34
1.7.2 Objetivos.....................................................................................................35
1.7.3 Metodologa................................................................................................35
1.7.4 Resultados..................................................................................................35
1.7.5 Discusin.....................................................................................................36
1.7.6Conclusiones................................................................................................37
1.8 Efecto de la Concentracin de la enzima en la actividad enzimtica de una
Amilasa....................................................................................................................39
1.8.1 Introduccin.................................................................................................39
1.8.2 Objetivos.....................................................................................................39
1.8.3 Desarrollo Experimental..............................................................................40
1.8.4 Resultados..................................................................................................41
1.8.5 Discusin.....................................................................................................44
1.8.6 Conclusiones...............................................................................................45
2

1.8.7 Memoria de clculo.....................................................................................45
1.8.8 Bibliografa..................................................................................................45
1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica................................46
1.9.1 Introduccin.................................................................................................46
1.9.2 Metodologa................................................................................................47
1.9.3 Resultados :................................................................................................48
1.9.4 Discusin.....................................................................................................50
1.9.5 Conclusiones...............................................................................................51
1.9.6 Bibliografa..................................................................................................52

1.1. Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo

de laboratorio
1.1.1 Introduccin
Las micropipetas se utilizan en varios campos de la ciencia como el rea de la
salud, qumica, biologa, farmacutica y gentica, para realizar medidas
volumtricas con precisin y exactitud . Para ello los laboratorios deben
asegurar la obtencin de buenos resultados utilizando instrumentos de
maneara adecuada dems se calibrados (Batista et. al, 2006).
Los rangos de microlitros que utilizan las micropipetas se utilizan con
frecuencia en la mayora de los campos de la qumica analtica y gentica,
especialmente cuando se trata de pruebas altamente sensibles donde un error
pequeo puede conllevar a unos resultados errneos.
Paras tener una buena determinacin se requiere calibrar las micropipetas en
las condiciones en las que se va a trabajar en el laboratorio para de esta
manera estar seguros de los resultados obtenidos, uno de los mtodos ms
sencillos para calibrar consiste en comparar el volumen entregado por el
instrumento es comparado con el peso del lquido (frecuentemente agua)a
este mtodo se llama mtodo gravimtrico.
Es indispensable para realizar este mtodo conocer el manejo adecuado de las
micropipetas as como su modo de dispensacin del lquido
Una punta desechable, por lo general de polipropileno, se adjunta a la pipeta
del mbolo, posteriormente con el pistn en el primer lmite de aspiracin la
punta se sumerge en el lquido, despus se libera el embolo para la aspiracin
del lquido.
Para expulsar el lquido del pistn, se desliza completamente el pistn, hasta
llegar al segundo limite. El peso del volumen entregado es determinado
utilizando una balanza analtica.
Hemos de mencionar que existe una norma para la calibracin y manejo de
micropipetas, esta norma es la ISO 8655 para aparatos volumtricos operados
por pistn. Los premisas principales de dicha norma se centran en 3 puntos
fundamentales: las condiciones ambientales, utilizar una balanza adecuada y
minimizar el efecto de la evaporacin en volmenes inferiores
1.1.2 Objetivos
Conocer el protocolo para el manejo de micropipetas en el laboratorio.
Conocer los tipos y los rangos de volumen de micropipetas.
Entender el manejo de micropipetas para el uso de lquidos voltiles y

viscosos.

1.1.3 Metodologa
Materiales y reactivos.
Micropipeta 1L - 10L
Puntas para micropipetas
Balanza analtica
Tubos eppendorf
Agua destilada
Glicerol
Diclorometano
Manejo y uso de micropipetas.

Se emplearon micropipetas de 4 distintos rangos de volumen. Se identificaron
las puntas adecuadas para cada tipo de micropipeta
Con una de las micropipetas se sigui el siguiente protocolo para la operacin
del instrumento, utilizando agua destilada como liquido de experimentacin.
1.
2.
3.
4.
5.
Se ajust el pistn al volumen deseado.

Se oprimi el pistn en el primer lmite.
Se sumergi la punta en el lquido, con el pistn oprimido.
Despus se liber el embolo para la aspiracin del lquido.
Para expulsar el lquido del pistn, se deslizo completamente el pistn,
hasta llegar al segundo limite.
Manejo y uso de micropipetas para lquidos viscosos.
Durante el manejo y uso de micropipetas para lquidos viscosos se utiliz como
liquido de experimentacin glicerol (densidad = 1.26 g/ cm 3), se sigui el
mismo protocolo de manejo, pero modificando el paso 4, para este etapa el
embolo debe de ser liberado lentamente para permitir que el lquido entre y no
se formen burbujas o se introduzca aire dentro de la punta.

Manejo y uso de micropipetas para

voltiles.
Durante el manejo y uso de micropipetas
para lquidos voltiles se utiliz como
liquido
de
experimentacin
Diclorometano, se sigui el mismo
protocolo de manejo, pero modificando
nuevamente, en este caso se repiti el
paso 2, 3 y 4 para saturar la punta de la
micropipeta este procedimiento se llev a
cabo en una campana de extraccin para
evitar aspirar los vapores producidos por
el.
Ilustracin 1 Procedimiento correcto

para calibrar una micropipeta
Calibracin de micropipetas
Se ajust una micropipeta de 100L - 1000L a un el volumen de 600L ,se
tomaron 5 alcuotas de agua destilada como se muestra en la ilustracin 1 y
se pesaron en balanza analtica, utilizando un tubo eppendorf como contenedor
Calculo del error sistemtico y aleatorio de micropipetas.
Con los obtenidos se calcul el error sistemtico que proporciona la Exactitud
(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio, que nos
expresar la Precisin (grado de reproducibilidad de las medidas) de la pipeta.
Para el clculo del error sistemtico, se consider previamente el factor de
correccin del agua, considerando la presin atmosfrica de la ciudad de
Mxico de 80kPa y una temperatura de 23.5 C. Los factores de correccin se
muestran en la Tabla 1.
Tabla 1Factor Z (g/L) EN ISO 8655 para agua
destilada en funcin de la temperatura y presin
atmosfricas

Valor medio del volumen
dosificado
x =
valores medidos
n nmero de valores medidosZ
(1)
El error de medicin sistemtico porcentual se calcula con la siguiente

ecuacin
e s=100
x xnominal
( 2 )
x nominal
Donde Xnominal indica el volumen aparente dosificado, es decir el volumen que se

desea tomar por la micropipeta.
El error aleatorio (desviacin estndar) se calcula de la siguiente forma.
xix 2
(3)
N
i=1
=
Es necesario calcular la desviacin estndar como un valor porcentual
(coeficiente de variacin).

S% =
*100 (4)
1.1.4 Resultados
Las Tablas 2 muestran los resultados de las mediciones de la masa de los
volmenes tomados con la micropipeta
Volumen
500L
Tabla 2. Pesos de volmenes micropipeta 100L -1000L

0.4890g
0.4858g
0.5141g
0.5066g
0.4870g
La tabla 3. Resume el error en los volmenes medidos en cada una de las

micropipetas.
Tabla 3. Error sistemtico porcentual de las

mediciones con micropipetas
Volum
X
Rango de
en
es (%)
S
corregi
pipeta
medid
(%)
do con
o (L)
factor
Z (mL)
100L
600
0.4946
1.08
2.37
-1000L
56
1.1.5. Discusin
La norma EN ISO 8655 establece los lmites permisibles de error en las
micropipetas, la Tabla 4 muestra tales datos. Al realizar la comparacin entre el
error obtenido con las micropipeta del laboratorio de bioconversiones y los
establecidos en la norma, se observan diferencias significativas, esto hace
suponer que el equipo est mal calibrado.

Tabla4 Lmites de error permisibles en micropipetas
El valor de S(%) o coeficiente de
desviacin se puede deber a
que
el error aleatorio era
significativo esto debido a que
experimentalmente los valores
obtenidos fueron tomados por
diferentes personas del equipo lo
que conlleva a un error mayor
en cuanto a la toma de datos.
Lo cual pudo influir en el valor
de error sistemtico es de igual
manera , sin embargo
aun
considerando
estos
errores
experimentales los resultados
obtenido
se
encuentran
sumamente
fuera del rango
esperado por la norma.
1.1.6. Conclusiones
Para el manejo de soluciones densas como el glicerol o para lquidos voltiles,
es necesario seguir el protocolo de operacin para asegurar tomar el volumen
adecuado.
El uso adecuado y la calibracin de una micropipeta es un punto clave para
asegurar la exactitud y precisin durante la toma de la muestra.
1.1.7 Referencias
E. Batista., L. Pinto,, E. Filipe,, &, (2006). Calibration of micropipettes:

Test methods and uncertainty analysis. In Measurement (Vol. 40, pp.
338-342). doi:www.elsevier.com/locate/measurement
Eppendorf AG, SOP. (2013). Instrucciones del trabajo estndar para

micropipetas. Retrieved from www.eppendorf.com/myeppendorf
Sica, A. , Constantino, P., Heijo, G., Fabretti, J. A G.antino, P., & Santo, C.
G.antino, P, (2009). Evaluacin del error debido a la evaporacin en el
mtodo gravimtrico de calibracin de micro pipetas. Revista del
laboratorio tecnolgico del Uruguay , 4, 15-18.

1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas.

1.2.1 Introduccin
Espectrofotmetros
Espectrofotometra se refiere a la medida de cantidades relativas de luz
absorbida por una muestra, en funcin de la longitud de onda.
Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz
caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de
absorcin de luz de una muestra vs soluciones estndar, es posible determinar
la identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra
(solucin incgnita).
Las ventajas de la espectrofotometra sobre otros mtodos analticos de
laboratorio son varias: es rpida, precisa, verstil, fcil de usar y eficiente en
costo.
La espectrofotometra se usa para diversas aplicaciones, como: anlisis
cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas, estandarizacin de
colores de diversos materiales, deteccin de niveles de contaminacin en aire y
agua, y determinacin de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos.
Un espectrofotmetro tpico posee cuatro componentes bsicos: una fuente de
radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que
cubre (usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para
ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que
separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la
dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide
cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.
En general, los espectrofotmetros miden en % de transmitancia (T) y
absorbancia (A). El porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de
radiacin que pasa a travs de la muestra y alcanza el detector. Una solucin
lmpida, no absorbente (0 de absorbancia), mostrara una lectura de 100% de
transmitancia en un espectrofotmetro calibrado.
Las determinaciones analticas, basadas en el uso de un espectrofotmetro
tienen como fundamento la ley de Lanbert-Beer. La ley tambin se conoce
como ley de Beer-Lambert-Bouguer y fue descubierta de formas diferentes e
independientes. Se puede decir que esta ley se trata de un medio o mtodo
10

matemtico, el cual es utilizado para expresar de qu modo la materia
absorbe la luz.
Esta ley se puede expresar en trminos de potencia de luz o de intensidad de
luz, asumiendo luz monocromtica, como:
It / I0 = 10
- bc
Donde It es la intensidad de luz transmitida por la muestra, I0 la intensidad de

luz que incide sobre la muestra y que proviene de la fuente, el coeficiente de
absortividad molar en unidades de M -1cm-1, b es la longitud de la trayectoria del
haz de luz a travs de la muestra o el espesor de la celda en centmetros o lo
que se conoce como paso ptico.
La relacin It / I0 se conoce como transmitancia, T,
Porcentaje de transmitancia: % T = 100.It / I0
La luz absorbida sera I0 - It es decir la diferencia entre la intensidad de la luz
incidente y la intensidad transmitida despus de pasar a travs de la muestra.
A veces se expresa en forma porcentual en funcin de la transmitancia medida
como :
Porcentaje de absorcin = (Tblanco - Tmuestra. ) x 100 o absortancia.
Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relacin It / I0 , entonces:
-log It / I0 = - log T o igual que log I0 /It = log I0 log It
relacin que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra.
La relacin -log It / I0 = - log T recibe el nombre de Absorbancia y se designa
por A.
Centrfugas
La centrifugacin es un proceso de separacin que utiliza la accin de la fuerza
centrfuga para promover la aceleracin de partculas en una mezcla de slidolquido. Dos fases claramente distintas se forman en el recipiente durante la
centrifugacin:
El sedimento; generalmente no tiene una estructura uniforme.
El centrifugado o el concentrado que es el lquido flotante; a menudo claro,
algunas veces nublado, debido a la presencia de las partculas coloidales muy
finas que no se depositan fcilmente. Sin embargo puede tambin contener
varias fases si el lquido intersticial de las mezclas contiene el elemento con
11

diversas densidades, tales como aceites por ejemplo.
En un recipiente cilndrico que rota a una velocidad angular w (rad/s) o N (rpm)
y contiene un anillo de liquido de un radio significativo R (m), la aceleracin
centrifuga Fc (m/s) a la que estn sometidas las partculas son:
Fc = w2R = 0.011 N2R
La fuerza aplicable a cada partcula por unidad de peso viene expresada como:
Fc = 0.011 N2R (rs rL) x 1/g = G (rs rl),
con G = w2R / g = 0.11 N2R / 9.81 = 11.2 x 10-4 N2R
Donde rs : densidad de la partcula
rl : densidad del liquido intersticial
Los centrifugadores, o centrfugas, se encargan de la separacin de las
partculas mediante fuerza de aceleracin gravitacional que se logra gracias a
una rotacin rpida. Este proceso puede provocar la sedimentacin o
suspensin de las partculas o puede conseguir la fuerza necesaria para la
filtracin a travs de algn tipo de filtro.
El mtodo de separacin es similar a la separacin por gravedad. La fuerza
motriz es mayor al ser resultado de la rotacin del liquido: en el caso de la
sedimentacin, donde la fuerza motriz es el resultado entre las diferencias en
densidad de las partculas slidas y liquidas, la separacin se logra con una
fuerza del orden de 1000 a 20000 veces mayor que la gravedad.
Los centrifugadores de sedimentos fueron inventados para la separacin entre
lquidos y slidas y para los slidos no manejables. Pronto se llego a la
conclusin de que este tipo de sistemas tiene una gran cantidad de
aplicaciones adicionales desde la separacin de slidos e impurezas, hasta la
separacin de slidos en lquidos.
1.2.2 Objetivos
Capacitar al alumno para el uso de equipos de laboratorio como lo son

espectrofotmetros y centrfugas.
12

Medir absorbancia de diferentes concentraciones de muestra para realizar

una curva de calibracin.
1.2.3 Metodologa
Materiales, reactivos y equipos.
Micropipetas (varios volmenes)

Puntas para micropipetas.
Tubos eppendorf
Celdas para espectrofotmetro
Espectrofotmetro de luz visible y UV
Centrfuga
Colorante azul de tripano
Agua destilada
Tubos falcon de 50 mL
Gradilla para celdas
Espectrofotmetros
Se mostr de forma terica el protocolo de operacin del espectrofotmetro. Se
indic la fuente de luz utilizada para los rangos de luz visible y ultravioleta.
Pasos:
1. Prender el espectrofotmetro y esperar a que se caliente entre 10 y
minutos.
2. Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual
introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien
transmitancia y a cero de absorbancia.
3. Posteriormente, se introdujo una celda con la muestra y se ley
absorbancia a = 597 nm
15
se
de
la
La lmpara de deuterio es usada para medidas con longitud de onda dentro del
rango visible, por otro lado las lmparas de tungsteno son usadas para
mediciones en el rango de UV.
Consideraciones que hay que tener en el manejo:
Se debe llevar el equipo a cero despus de cada muestra o si se cambia la

longitud de onda.
Dar al espectrofotmetro tiempo suficiente para que se caliente.
13

Limpiar las celdas con papel liso y asegurarse de que las celdas no posean
partculas, manchas o huellas dactilares.
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.

Centrfugas: Diagrama de flujo de los pasos (Centrfuga BECKMAN J2-MC)
Para abrir mueva el interruptor a la posicin
ON y accione la palanca de apertura.
Para programar prima ROTOR e introduzca el
nmero del tipo de rotor a usar.
Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm),
verificando las velocidades mximas para
cada rotor.
Oprima TIME y teclee el tiempo (h:min).
Oprima TEMP y teclee la temperatura (C).
Al terminar la seleccin, oprima ENTER.
Para operar coloque cada par de tubos ya
equilibrados en posiciones contrarias
(encontradas).
Coloque la tapa del rotor y cierre la
centrfuga.
Permita que el equipo enfre a la temperatura
indicada antes de comenzar el programa.
Oprima el botn START para iniciar el
programa (se puede abortar oprimiendo el
botn STOP).
Consideraciones que hay que tener en el manejo y limpieza:
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.

Asegrese de equilibrar los tubos de centrfuga (en peso) con la muestra u
otra sustancia en una balanza.
Se tiene que limpiar las paredes internas de la centrfuga despus de su uso
para evitar contaminaciones.
14

Se deben limpiar los rotores despus de su uso para evitar que exista
desequilibrio al momento de usar la centrfuga nuevamente.
Diagrama de flujo de los pasos (Centrfuga HERMLE 2300)

Oprima el botn de apertura.
Para programar hay que mantener oprimido el botn

preset.
Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla.
Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla.

Para operar coloque cada par de tubos equilibrados en
peso en posiciones encontrada.
Coloque la tapa del rotor (si ste posee una) y cierre la
centrfuga.
Oprima el botn start para iniciar el programa (puede
parar oprimiendo el botn stop).
Consideraciones que hay que tener en el manejo y limpieza:
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta u hoja de control del equipo.

Para cambiar rotor utilice la llave del equipo.
En caso de que, por alguna falla en el suministro elctrico, la pantalla se
muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y
conctelo nuevamente. Proceda con la programacin.
Precaucin al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla
lentamente.
Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es
imprescindible que los tubos encontrados tengan el mismo peso.
Se tiene que limpiar las paredes internas de la centrfuga despus de su uso
para evitar contaminaciones.
15

Se deben limpiar los rotores despus de su uso para evitar que exista
desequilibrio al momento de usar la centrfuga nuevamente.
1.2.4 Resultados
Se midi la absorbancia de soluciones con diferentes concentraciones del
colorante azul de tripano, los resultados se muestran en la tabla x.
Tabla x. Absorbancias a 597nm
las diluciones del colorante azul
de tripano
Diluci
Abs (597 nm)
n
1:10
0.386
1:20
0.252
1:30
0.170
Grfica x. Absorbancias a 597nm de las diluciones del colorante azul de tripano
1.2.5 Discusin
En el anlisis espectrofotomtrico ordinario se lee la absorbancia, pues sta es
directamente proporcional a la concentracin, si se cumple la ley de LambertBeer (Walton et. al, 1983).
En la Tabla 1 se observa una disminucin en la medida de la absorbancia de las
diluciones realizadas, conforme disminuye la concentracin del colorante azul
de tripano. Lo anterior concuerda con la ley de Lambert-Beer.
1.2.6 Conclusiones
La disminucin de las lecturas de absorbancia es directamente proporcional a
la concentracin del colorante azul de tripano.
1.2.7 Bibliografa
Duymovich, C., Acheme, R., Sesini, S., & Mazziotta, D. (2005).
Espectrofotmetros y fotocolormetros gua prctica de actualizacin.
Acta bioqum. cln. latinoam. v.39 n.4
Walton, H. F., & Reyes. (1983). Anlisis qumico e instrumental moderno.

Espaa: Reverte.
16

Daz N, Brcela J. A., Fernndez E., et al.(2008). Cap. 8. Espectrofometra:

Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas.
Espaa: Campus Universitario de Rabanales: Departamento de
Bioqumica
y
Biologa
Molecular.
Recuperado
de
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
1.3
Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de
Bioconversiones
1.3.1 Introduccin.
Todos los reactivos y soluciones que se usan en el anlisis biotecnologo para
realizar las pruebas descriptas en las practicas, tanto de principios activos
como de productos formulados deben ser preparados a partir de material de
calidad o grado analitico.
Los reactivos son sustancias empleadas como tales o como elementos
constitutivos de soluciones y se emplean para la realizacin de las pruebas y
valoraciones, los reactivos especiales son los que se utilizan en una prueba en
particular y su preparacin se encuentra descripta junto con dicha prueba.
Por otro lado los Indicadores son reactivos empleados para determinar el punto
final de una reaccinn quimica, para medir la concentracinn de ion hidrogeno
(pH) o para indicar un cambio de pH. Se enumeran junto con los indicadores.
Las soluciones reguladoras son soluciones reguladoras de pH, soluciones
Colorimtricas- Son soluciones empleadas en la preparacin de estndares
colorimtricos para comparacin, se abrevian (SC).
Las Soluciones de Reactivos son soluciones de reactivos en solventes y
concentraciones definidos, apropiados para los fines especificados, se abrevian
(SR).
Las soluciones volumtricas son soluciones de reactivos de concentracin
conocida, empleadas principalmente en determinaciones volumtricas. Las
concentraciones se expresan generalmente en funcin de la normalidad, se
abrevian (SV).
17

1.3.2 Objetivos.
Conocer la importancia del reactivo a preparar, identificando el tipo de

reaccin que genera cuando se homogeniza con otras sustancias, as
como sus aplicaciones a nivel laboratorio.
fomentar las condiciones de operacin para cada reactivo, tomando en
cuenta, las tcnicas bsicas tericas hasta la ltima referencia escrita
sobre l.
Saber realizar los clculos de preparacin, y conocer las tcnicas
adecuadas de preparacin y almacenamiento de los reactivos.
1.3.3Metodologa
Reactivo de Bradford
Se disolvieron 100 mg de azl brillante de Coomasie G-250 en 50mL de etanol
al 95%. A esta solucin se le aadieron 100mL de cido fosfrico al 85%(w/v).
La solucin resultante se diluy a un volumen final de 1L. Una vez terminado el
reactivo se verifico que su color fuera caf. Las concentraciones finales en el
reactivo fueron 0.01%(w/v) de azl brillante de Coomasie G-250, 4.7% de
etanol y 8.5%(w/v) de cido fosfrico.
Reactivo DNS
Se disolvieron 30g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada has obtener
un volumen final de 50mL. Se agregaron 1.6g de NaOH previamente disueltos
en 10mL de agua destilda, a continuacin se aadi 1g de DNS previamente
disuelto en 20mL de agua destilada. Se afor la solucin a 100mL y se guard
en obscuridad en frasco mbar.
Solucin de almidn 1%(p/v)
Se suspendi 1g de almidn en 100mL de regulador de fosfatos 0.1M con pH
7.0, posteriormente se desnaturaliz calentando en bao de agua a 60 C
durante 15 min.
Solucin de acetatos 0.05M
Se disolvieron 5.103g de acetato de sodio en 750mL de agua destilada y 1.5mL
de cido actico en 500 mL de agua destilada. Se aadi cuanto fue necesario
hasta alcanzar un pH 5 de la solucin de cido actico a la solucin de acetato
de sodio.
18

Solucin de fosfatos 0.01M
Se disolvieron 20.106g de fosfato dibsico de sodio en 750mL de agua
destilada y 6.9g de bifosfato de sodio en 500 mL de agua destilada. Se aadi
cuanto fue necesario hasta alcanzar un pH 7 de la solucin de bifosfato de
sodio a la solucin de fosfato dibsico de sodio.
Descripcin del reactivo.

Reactivo de Bradford.
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva
Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una
azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el
colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.
Reactivo del cido 3,5-Dinitrosaliclico (DNS)
Qumicamente se trata de un anillo bencnico tetrasubstituido por dos grupos
nitro, un hidroxilo y un carboxilo, Se utiliza en laboratorios de anlisis clnicos
como reactivo de identificacin de azcares reductores.
Solucin de almidn.
El almidn se utiliza a menudo en la qumica como un indicador para
valoraciones redox triyoduro donde est presente. El almidn forma un
complejo azul-negro muy oscuro con triyoduro que puede hacerse por el yodo
con yoduro de mezcla.
Solucin de alfa-amilasa.
La alfa-amilasa degrada
el
almidn
en
una
mezcla
de disacridos: maltosa, maltotriosa trisacrido (la cual contiene dos (1-4)residuos de glucosa) y oligosacridos conocidos como dextrinas, que contienen
la (1-6)- ramas de glucosa.
Solucin de antrona.
Es una solucin reguladora, con aplicaciones variadas, ya sea actuando sola o
con mltiples componentes en homogenizacin, as
como los reactivos
mencionados.
19

Memoria de clculo.
Para la realizacin de solucin de antrona.
Disolver 0.2 antrona en 5mL de etanol y aforar a 100mL con H 2SO4 al 75%
Clculos de acetatos.
Preparacin de reactivos.
136.08gr--------1M1L
60.05mL------1L---1M
6.804gr--------0.05M750mL
30.025mL-----1L---0.5M
X=5.103gr de acetato de sodio en 750mL

en 500mL
X1=1.5mL de acido actico
Se prepara tanto el acetato como el cido actico luego se llev el acetato a PH

7, utilizando el cido ac.
1.3.4Discusin
Un mtodo rpido y exacto para la estimacin de la concentracin de
protenas es esencial en muchos campos de estudios como la caracterizacin y
purificacin de protenas y enzimas, estudio de la expresin de una protena y
diagnstico clnico.
Bradford se ha vuelto el mtodo preferido en los laboratorios debido a su
mayor rapidez y sensibilidad, la buena tcnica en la preparacin de reactivos,
mostr resultados viables en las siguientes prcticas.
Segn el mtodo Miller, los azcares reductores pueden reducir el cido 3,5dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el cido 3,5dinitrosaliclico es reducido en presencia de calor, por los azcares reductores
que entran en contacto, con l se desarrolla un cambio de color parecido al
caf. El cambio de coloracin puede entonces determinarse por lecturas de
densidad ptica, ledas por espectrofotometra a una determinada longitud de
onda que se realizaron en las prcticas siguientes.
1.3.5 Conclusiones
Se realizarn los clculos correspondientes para la elaboracin de los reactivos
descriptos.
En el laboratorio de bioconversiones se usa el reactivo de Bradford para la
cuantificacin de protenas.
En el laboratorio de bioconversiones se usa el reactivo DNS para la
cuantificacin de azcares reductores.
1.3.6Bibliografa
Bailey (1998) Applied Microbiology and Biotechnology Volumen 29 VTT,
Biotechnical Laboratory, Tietotie 2, SF-02150, Espoo, Finland
20

Kruger (1994) Basic Protein and Peptide Protocols Methods in Molecular
Biology Volumen 32, University of Hertfordshire.
1.4 Determinacin de crecimiento celular por

turbidimetra o Densidad ptica (D.O), peso seco y
cuenta directa en cmara de Neubauer.
1.4.1 Introduccin
Existen diversas tcnicas para medir la cantidad de clulas de un cultivo, cada
una de las cuales presenta una serie de ventajas y desventajas con respecto a
los dems, pero por lo general todas reportan datos que se aproximan a la
realidad (con mayor o menor exactitud.
La biomasa es un parmetro crtico y difcil de medir en distintos procesos. Es
importante debido a que es una variable clave para optimizar un proceso
especfico, o para llegar a una eficiencia mxima para obtener un cierto
producto (un antibitico). Hay diversos mtodos para la cuantificacin de
biomasa. Estos mtodos deben ser rpidos, y si es posible, en tiempo real
Mtodos directos de determinacin de biomasa
El peso seco es el mtodo ms ampliamente aplicado para la estimacin de
biomasa. Tambin se utiliza como un mtodo de referencia. La densidad celular
se puede cuantificar en gramos de peso seco, o como nmero de clulas
21

viables / clulas muertas por mL. Las clulas en una muestra pueden ser
separadas del caldo bien por centrifugacin o bien por filtracin y pesadas
mientras estn completamente secas.
La medicin de peso seco por lo general da un resultado muy consistente. El
mtodo es simple pero laborioso y tardado. A pesar de ser un mtodo
ampliamente usado puede ser errneo si el caldo contiene otro material
insoluble como se encuentra comnmente en un fermentador. Adems, estos
mtodos no pueden distinguir de las clulas viables de las clulas muertas.
El Peso hmedo Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es
pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es
una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja
es que el diluyente queda atrapado en el espacio intracelular y contribuye al
peso total de la masa.
Cuenta directa en cmara.
El recuento se realiza en una cuadrcula central de la cmara
que se multiplica por la profundidad, obtenindose un
nmero de microorganismos por unidad de volumen. La
cmara de Neubauer es una cmara adaptada al
microscopio, se trata de un portaobjetos con una depresin
en el centro en donde se encuentra grabada una retcula
cuadrada.
La retcula mide 3mm x 3mm de lado, subdividida a su
Ilustracin 2Detalle de una
vez en 9 cuadrados de 1mm de lado cada uno.
rejilla de una cmara de
Neubauer.
El recuento en cmara no es completamente exacto por

las irregularidades en la distribucin de la muestra. Por otra parte, pueden
confundirse las clulas con otras formas
contenidas en el medio; adems no
permite
distinguir entre clulas vivas de clulas muertas
Mtodos indirectos de determinacin de biomasa
Dispersin de la luz
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin,
parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es
transmitida.
Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para
monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero
pueden llevar a resultados errneos.
Densidad ptica.
La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz
dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. La densidad ptica
o turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos
unicelulares puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz.
Las muestras a determinar son generalmente traslcidas cuando no presentan
crecimiento microbiano
22

1.4.2. Objetivos
Conocer y diferenciar las tcnicas ms utilizadas para la cuantificacin de

biomasa microbiana.
Determinar el contenido de biomasa presente en una muestra de levadura
por mtodos directos e indirectos
Determinar la biomasa en peso seco y mediante tcnica de turbidimetra
correlacionando los datos
1.4.3Materiales y reactivos.
Centrfuga
Balanza analtica
Espectrofotmetro
Microscpico
Cmara de Neubauer
Charolas de aluminio
Tubos eppendorf
Agua destilada
23
1
.4.4. Metodologa
Densidad ptica (D.O.)
Se emple una muestra de levadura de panadera, a partir de la cual se realizaron diluciones
para obtener un intervalo de lectura de densidad ptica menor a 1.
6. Se realizaron diluciones: 1:100, 1:200, 1:400 1:500 con muestra cultivo de levadura.
7. Se prepar el espectrofotmetro para leer muestras a 600 nm.
8. Se utiliz como blanco una muestra de aproximadamente 1 mL. de medio sin inoculo.
9. Despus se obtuvo la densidad ptica de cada muestra (1mL de cada dilucin) a 600 nm.
10.Para realizar la curva de calibracin (D.O. vs dilucin) se tomaron muestras con lecturas de
absorbancia menores a 1.
Camara de Neubauer
Para la cuenta directa en cmara de Neubauer, se tom un volumen de muestra celular,
posteriormente se realiz una dilucin, se coloc 0.1 mL de la muestra de ultima dilucin entre la
cmara y el cubreobjetos, que por efecto de capilaridad, toda la cmara se cubri de muestra.
Se observ la cmara con muestra al microscopio, el cual, para localizar las divisiones de sta,
fue necesario utilizar el objetivo de 10x y posteriormente, para observar el nmero de clulas, se
cambi el objetivo a 40x; donde seguidamente se procedi a realzar un conteo de clulas
individuales vistas por cuadrante. Se realiz el clculo necesario y se report el resultado en
Cel. /mL.
Peso seco.
1. Se etiquetaron las charolas de aluminio y se pesaron en la balanza analtica.
2. Se coloc sobre las charolas el volumen a diluir de levadura directo correspondiente a las
diluciones: 1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250.
3. Se dejaron en una estufa a 100 0C, lo que quemo la pastilla, se enfri en el desecador, y se
peso.
4. El peso seco se obtuvo de la diferencia entre el peso inicial y final de cada charola.
A 600nm
1.5
1
Absorbancia
A 600nm
0.5
0
0
Dilucin
1.4.5. Resultados
Densidad ptica (D.O.)
D.O.
A 600nm
1:100
1.114
1:200
0.529
24
1:400
0.232
1:500
0.185
Peso seco.
F
Figura 1 . Densidad ptica vs dilucin se eliminaron los

datos donde la absorbancia resulto >1.
Peso
Charol
Peso
inicial
a (g)
final (g)
(g)
13.42
0,174
1:02
14.84
4
5
13.24
0,104
1:04
14.285
0
1
13.19
0,049
1.8
13.675
5
95
13.28
0,017
1:16
13.382
4
95
13.59
0,008
1:50
13.690
5
9
13.20
0,003
1:100
13.243
2
75
13.25
0,002
1:150
13.274
2
13.25
0,001
1:200
13.265
2
15
13.27
0,000
1:250
13.288
7
75
Tabla 3. Clculo de
peso seco
Peso seco
Dilucin
mg/mL
1:2
17,45
1:4
10,41
1.8
4,995
1:16
1,795
1:50
0,89
1:100
0,375
1.150
0,2
1:200
0,115
1:250
0,075
Dilucin
Se realiz el clculo de pesos seco considerando que se realizaron diluciones para

un volumen final de 10 ml. La Tabla 3 muestra los resultados:
En soluciones diluidas es posible hacer una correlacin entre un mtodo directo y uno
indirecto (peso seco y densidad ptica) graficando D.O a 600 nm vs peso seco.
25
D.O vs Peso Seco

15
10
Densidad Optica
D.O vs Peso Seco

Linear (D.O vs Peso Seco)
5
0
0 1 f(x)
2 =3 4 5 6 7 8 9 10
R = 0
Peso seco
Figura 2 . Correlacin entre un mtodo directo y un meto

indirecto.
Camara de Neubauer
El resultado de la cmara de neubauer es de 1 x108 Cel. /mL.
1.4.6 Discusin
Se obtuvieron estimaciones que no pueden ser del todo correctas, ya que se cometieron
errores en el procedimiento, al dejar a temperaturas de 100 0C las charolas con muestra,
(siendo lo recomendable 650C-48 h 800C-24h), provocando que las muestras se algunas
muestras se quemaran, razn que puede causar variacin en los resultados. Tabla 4.
El peso seco obtenido a partir de una muestra (mg/mL), es una tcnica til para
volmenes grandes de muestra ya que diferencias en orden de miligramos representan un
gran nmero de clulas.
Esta relacin directa entre absorbancia y peso seco slo aplica para soluciones diluidas
que no pueden tener una absorbancia mayor a 1, ya que valores mayores producen
desviaciones y comportamientos no lineales que no se podran evaluar de esta manera.
26
Por otro lado el usar diluciones muy pequeas puede involucrar ms errores, debido a
problemas de manejo de equipo como en el pipeteo, y menor sensibilidad en el
espectrofotmetro por el bajo nivel de absorcin.
Los componentes voltiles de las clulas pueden perderse en el secado
La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado
1.4.7 Conclusiones
La tcnica de peso seco es un mtodo simple, pero si se realiza de manera correcta

consume bastante tiempo y es poco reproducible.
La principal desventaja peso seco es que durante su determinacin no solo se incluyen

microorganismos activos, sino tambin, clulas muertas, material inerte y materia
orgnica absorbida esto genera que la determinacin de masa microbiana no sea exacta.
Componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir

degradacin.
La turbidimetra (Densidad ptica) no es un mtodo til para medir la biomasa de

suspensiones para un nmero relativamente pequeo de bacterias y o levaduras, esto por
que segn Rodrguez, et al (2005), seala que para que sean visibles trazas de turbidez es
necesario ms de un milln de clulas por mililitro para ser medida por un
espectrofotmetro.
La relacin directa entre absorbancia y peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas
con una absorbancia<1.
1.4.7 Referencias
Arniz C., I. (2003). Determinacin de biomasa en procesos biolgicos. Escuela

superior de agricultura de Barcelona.
Barer, M. R., and Harwood, C. R. 1999. Bacterial viability and culturability. Adv.
Microb. Physiol.(Vol 41, pp 93137).
Bratbak, G. 1985. Bacterial biovolume and biomass estimations. Appl.Environ.

Microbiol. (Vol 49, pp 14881493).
C. l., Felice. (2005). Microbial biomass estimation. Critical Reviews in
Biotechnology,(Vol 112,pp 25-95).
Rodrguez, E. (2005). Principios y prcticas de laboratorio.Bacteriologa General,
doi: Universisdad de Costa Rica.
Sica, A. , Constantino, P., Heijo, G., Fabretti, J. A G.antino, P., & Santo, C. G.antino,
P, (2009). Evaluacin del error debido a la evaporacin en el mtodo. Revista del
laboratorio tecnolgico del Uruguay , 4, 15-18.
27
1.5 Determinacion de azucares reductores

1.5.1Introduccin
Los azucares con aldehdos libres o un grupo cetnico como glucosa, fructosa y lactosa los
cuales presentan un carbono libre en una estructura y pueden reducir en determinadas
condiciones a las sales cpricas a esos azcares se les conoce como azucares reductor
(Martnez, 2000). Los azucares reductores se transforman fcilmente en enedioles (reductonas)
al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan
fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en
solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag +, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los
azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos. Gracias a esto este tipo de azucares
se pueden determinar cuantitativa o cualitativamente . (Ting, 1956)
El mtodo DNS, tambin llamado tcnica de Miller es una tcnica colorimtrica que emplea cido
3,5 dinitrosaliclico para la hidrolisis de polisacridos presentes en una muestra, bsicamente lo
que sucede es que el cido 3,5 dinitrosaliclico es reducido a acido 3 amino 5 nitrosaliclico
mientras que los grupos aldehdo aparecen para oxidar los grupos carboxilo (Miller, 1959)
El reactivo cido dinitrosaliclico descubierto por Summer y colaboradores para la determinacin
de azcares reductores est compuesto por cido dinitrosaliclico, sal de Rochelle (tartrato sdico
potsico), fenol, bisulfato de sodio e hidrxido de sodio. De acuerdo a los autores, la sal de
Rochelle es adicionada para evitar la disolucin de oxgeno en el reactivo, el fenol incrementa la
cantidad de color producido y el bisulfato estabiliza la calidad del color obtenido, as mismo, se
requiere el lcali para la accin reductora de la glucosa en el cido dinitrosaliclico. El mayor
defecto de la prueba DNS recae en la perdida de una parte del azcar reductor analizado.
(Miller, 1959)
Es importante recalcar que, para poder disolver el cido dinitrosaliclico, el hidrxido de sodio
deber estar completamente disuelto. Una vez preparado el reactivo deber almacenarse en un
recipiente color mbar, a temperatura ambiente. Dura aproximadamente un mes. (Martnez,
2000)
Por otro lado, es importante mencionar que si se utiliza un mtodo espectrofotomtrico para
cuantificar la concentracin de analito presente en una muestra problema, es necesario
relacionar la concentracin de dicho analito con la cantidad de luz que absorbe el haz que le
incide. Sabiendo que sta es una relacin aproximadamente lineal, lo ms recomendable es
preparar una solucin estndar, con una concentracin conocida de analito y hacer diversas
diluciones de la misma, para poder obtener dicha relacin y expresarla matemticamente con la
ayuda de la ecuacin de la recta y=mx +b. En este caso, m, ser la pendiente de esta recta, b
la ordenada al origen, x la concentracin de analito y y la absorbancia observada para cada
concentracin. La tcnica de DNS cuantifica, como mximo una concentracin de azcar de un
mg/ml. Por lo tanto, la solucin estndar deber tener esa concentracin. (Martnez, 2000)
Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentacin
o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica (Martnez, 2000).
1.5.2 Objetivos
Conocer la metodologa para realizar el mtodo de Miller (DNS) para cuantificar azucares
reductores.
23
Verificar la sensibilidad del mtodo para cuantificacin de azcares reductores.

Realizar una curva de calibracin de absorbancia vs concentracin de azcares reductores.
1.5.3 Metodologa
Materiales y reactivos
Agua destilada
Reactivo DNS
Solucin de maltosa de 2g/L
Micropipeta de 20 - 200 L
Micopipeta de 200-1000 L
Espectrofotmetro
Parrilla
Recipiente para calentar agua
Flotador
Tubos Eppendorf
Agua corriente
Hielo
Un contenedor
Determinacin de azcares reductores a 540nm

1. Se realiz por triplicado una curva patrn de maltosa de 0 a 1.8 g/L tal como de muestra
en la tabla 1
2. Por cada muestra se adicion 0.1mL de reactivo DNS a tubos Eppendorf por triplicado.
3. Se agreg 0.1 mL de muestra problema a cada tubo por duplicado.
4. Se cerraron los tubos Eppendorf y se sometieron a bao mara por 5 minutos.
5. Los tubos fueron colocados en un bao de hielo hasta enfriar.
6. Fue sumado 1mL de agua destilada a cada tubo.
7. Se homogenizaron las muestras.
24
8. Con el blanco (agua destilada +DNS) el espectrofotmetro se ajust a 540nm y se

procedi a leer las muestras a sta longitud de onda.
Tabla 2 Diluciones para la curva patrn de maltosa
Tubo
1
(blan
co)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Concent
racin
de
maltosa
en la
muestra
(g/L)
Vol.
de la
soluci
n de
malto
sa
de
2g/L
(mL)
0.0
0.00
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
No
de
mu
est
ra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Volum
en de
agua
destila
da
(mL)
Se realiz una curva patrn en la que se observ el

comportamiento de la absorbancia en funcin de la
concentracin. Obtenindose una ecuacin que
describiera el comportamiento lineal de dicha grfica
1.00
0.9
0.8
0.7
0.6
1.5.4 Resultados
0.5
Ajustando la longitud de onda a 540nm cada una de
0.4
las muestras para realizar la curva tipo fue leda,
0.3
obtenindose los resultados que se muestran en la
0.2
tabla 2.
0.1
Concen Absor Absor Absor
Pro
tracin bancia bancia bancia medi
de
1
2
3
o
maltos
a [g/L]
0
-0.08 -0.022 -0.002
0.035
0.2
0.027
0.031
0.013 0.024
0.4
0.092
0.09
0.096 0.093
0.6
0.228
0.192
0.198 0.206
0.8
0.148
0.162
0.101 0.137
1
0.273
0.294
0.278 0.282
1.2
0.398
0.394
0.334 0.375
1.4
0.483
0.355
0.407 0.415
1.6
0.491
0.457
0.574 0.507
1.8
0.477
0.529
0.572 0.526
Haciendo uso de la absorbancia y siendo conocidas las concentraciones de cada muestra se

realiz una grfica para verificar el comportamiento de la absorbancia en funcin de la
concertacin, para obtener una mejor tendencia no se tomaron en cuenta las muestras 3 y 5
25
pues se comportaban de la manera esperada y poder as realizar una curva patrn adecuada
que ser necesaria para la cuantificacin de azucares reductores para prcticas futuras.
Curva de calibracin DNS

0.6
0.5
0.4
Absorbancia a 540nm
f(x) = 0.32x - 0.02

R = 0.99
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Concentracin de maltosa(g/L)
Figura 1 Curva de calibracin de DNS, en sta grfica se muestra el comportamiento

de la absorbancia en funcin de la concentracin de la muestra.
De acuerdo con la ecuacin que se obtuvo al realizar la regresin lineal de los datos obtenidos
experimentalmente de absorbancia vs las concentraciones propuestas para la determinacin de
azcares reductores se tiene:
||0.3196 x 0.024
Dnde
Abs= Absorbancia
x= concentracin de maltosa en la muestra
Entonces, con el promedio de las absorbancias obtenido gracias a las lecturas realizadas por
duplicado de cada muestra, se puede conocer la concentracin de azucares reductores en cada
muestra realizando un simple despeje de la ecuacin anterior
x=
|+0.024|
0.3196
1.5.5 Discusin
La Espectrofotometra es una de las tcnicas analticas ms utilizadas ya que se puede
determinar la cantidad de azucares en una muestra de estudio ,comparndola despus con la
radiacin absorbida por un blanco .En este caso, es de gran utilidad para poder determinar la
cantidad de azucares reductores disueltos en una muestra, midiendo la cantidad de radiacin
absorbida por la misma.
La base en la determinacin de azucares reductoras por este mtodo es la reaccin de esos
carbohidratos con reactivos como el DNS que forman un complejo coloreado que puede ser
detectado y cuantificado en un espectrofotmetro.
26
La formacin de cido 3-amino-5-nitrosaliclico resulta en un cambio en la cantidad de luz

absorbida, a longitud de onda 540 nm. La absorbancia medida es entonces, directamente
proporcional a la cantidad de azcar reductor, lo cual se puede observar en la figura 2. Segn la
bibliografa consultada la tcnica DNS cuantifica como mximo una concentracin de 1mg/mL de
azcares reductores sin embargo, en nuestro caso las lecturas de absorbancia fueron menores a
uno hasta la concentracin de maltosa correspondiente a 2g/L, por lo que no fue necesario
hacer diluciones, ya que esto no concuerda con los datos bibliogrficos se cree que el problema
de las lecturas fue debido al espectrofotmetro que se emple durante la prctica.
Para la realizacin de la grfica mostrada en la figura 2 se grafic la absorbancia I vs la
concentracin de cada muestra problema, debido a que como se muestra en la tabla 2 los
puntos 3 y 5 varan significativamente al comportamiento de los dems datos obtenidos se opt
por retirarlos de la grfica para de esta manera obtener una mejor R 2; Esta variacin en las
muestras 3 y 5 la atribuimos a un error de tipo sistemtico ,ya que el triplicado no fue realizado
por la misma persona, adems de que la homogenizacin de la muestra pudo no ser la
adecuada y por tanto dar fallas en las mediciones
Es conveniente mencionar que sta grfica fue elegida debido a que se realizaron regresiones
lineales de las grficas en que fue graficado el promedio de absorbancias vs concentracin y tres
ms con las absorbancias vs la concentracin, sin embargo estas grficas fueron descartadas
debido ya que an eliminando los puntos 3 y 5 no se pudo alcanzar un coeficiente de
correlacin mejor al que se presenta en la grfica de la figura el cual fue de 0.989.
Segn Vinagre en cualquier mtodo analtico si la pendiente es empinada en una curva patrn, el
mtodo posee alta sensibilidad y si la pendiente es poco empinada, el mtodo posee una baja
sensibilidad, comparando la pendiente obtenida (figura 2) con la figura 3 se puede observar la
alta sensibilidad del mtodo para determinar azcares reductores mediante DNS debido a que la
pendiente que se obtuvo es empinada. (Vinagre, 2002).
Figura 2 Respuesta en funcin de la concentracin del analito: Atributos de los

mtodos (Vinagre, 2002)
1.5.6 Conclusiones
El mtodo de determinacin de azucares reductores usando DNS es una tcnica sencilla y rpida,
que permite la cuantificacin de stos compuestos con facilidad.
27
La realizacin de un triplicado en cualquier mtodo analtico es de suma importancia, pues esto

ayuda a verificar la reproducibilidad del ensayo, sin embargo, cuando los resultados que se
obtienen no son los esperados, es importante identificar las posibles causas del error, as como
tomar decisiones en base a los resultados que se obtienen.
La importancia de una curva de calibracin recae en el hecho de que al conocer alguna de las
variables implicadas en dicha curva, se puede determinar con suma facilidad la variable que se
desconoce.
El uso adecuado del equipo, as como el correcto funcionamiento del mismo determina en gran
medida los resultados que se obtienen al desarrollar un experimento.
1.5.7 Referencias
Martnez, A. (2000). DNS: Una tcnica de cuantificacin de azcares reductores.

TECNOCULTURA,
7-9.
Mxico
[En
lnea]
disponible
en:
http://es.scribd.com/doc/14424586/DNS-una-tecnica-para-la-cuantificacion-de-azucaresreductores
Miller, G. L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Redicing Sugar. Analitich Chemistry , 426-428. USA [En lnea] disponible en:
http://46.38.63.192/mail/lg.php?
doi=10.1021/ac60147a030&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMy8xMC4xMDIxL
2FjNjAxNDdhMDMwLnBkZg%3D%3D
Ting, S. (1956). Rapid Colorimetric Methods for Simultaneus Determination of

Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices . USA: Food Chem.
Vinagre, J. (2002). Calidad de Mtodos Analticos. FAO, 137-145. [En lnea] disponible
en: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ah833s/AH833S07.pdf
28
1.6. Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas

elegidas.
1.6.1 Introduccin
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina
bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere
conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de
enfermedades, as como para otros muchos propsitos.
El mtodo que se emple durante estas prcticas se basa en un principio diferente: se emplea
un colorante hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un
color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena, origina
un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende, de la interaccin
relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es
relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y
lquidos orgnicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta ms rpido y fcil de
emplear que otros mtodos alternativos, y ms sensible que la medida de absorbancia a 280 nm.
Para determinar la concentracin de protena total presente en una muestra se requiere la
preparacin de una curva de calibrado empleando una protena patrn, que generalmente suele
ser la seroalbmina bovino (BSA).
La determinacin de las cantidades de microgramos de protena en el ensayo de azul brillante de
Coomassie Blue G-250 Bradford se lleva a cabo por medicin de la absorbancia a 595 nm. Este
ensayo es sensible (1-15 g), permite la cuantificacin de protenas rpida y sencilla en los
lisados celulares, fracciones celulares, o muestras de protenas recombinantes, con el propsito
de la normalizacin de las mediciones bioqumicas. Sin embargo, una no linealidad intrnseca
compromete la sensibilidad y la precisin de este mtodo (Bradford MM, 1976).
1.6.2 Objetivos
Determinar la concentracin de protena de una solucin enzimtica a travs del mtodo

colorimtrico de Bradford.
Estandarizar el mtodo de Bradford a partir de la elaboracin de una curva estndar de
Albmina de suero bovino (BSA).
1.6.3 Metodologa
Materiales, reactivos y equipos
29

Espectrofotmetro
Tubos Eppendorf con rosca
Agua destilada
BSA
Solucin de Bradford
Celdas para espectrofotmetro
Gradilla para celdas
Tubo falcon de 15 mL forrado con papel aluminio
Mtodo de Bradford
1. Se prepararon diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 g/ml como se muestra en la
tabla X.
Tabla X. Concentraciones de BSA para lecturas a 595 nm
(BSA) 200 g/mL
(mL)
Agua destilada
(mL)
Concentracin de
BSA (g/mL)
0
0.2
5
0
0.02
5
0.22
5
20
0.0
5
0.2
0
40
0.07
5
0.17
5
60
0.1
0
0.1
5
80
0.12
5
0.12
5
100
0.1
5
0.1
0
120
0.17
5
0.07
5
140
0.2
0
0.0
5
160
0.22
5
0.02
5
180
0.2
5
0.0
200
2. Se adicion a cada tubo eppendorf los volmenes estandarizados en la Tabla X, obteniendo

un volumen final de 0.25 mL en cada tubo. Cada dilucin se realiz por triplicado.
3. Se adicion 0.75 mL del reactivo Bradford a cada tubo para obtener un volumen final de 1 mL
en cada tubo.
4. Posteriormente se dej reposar la solucin por 5 minutos .
5. Se ley la absorbancia a 595 nm.
1.6.4 Resultados
Mtodo de Bradford
Se realizaron lecturas por triplicado a distintas muestras de concentracin conocida, tomando
como blanco para calibrar la curva estndar: 0.25 mL de agua destilada y 0.75 mL de reactivo de
Bradford. Se obtuvieron los datos de la Tabla X, los cuales se usaron para elaborar la curva
estndar que sirve para determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Bradford.
Tabla X. Lecturas de absorbancia a 595 nm
30
Concentracin
de BSA (g/mL)
Lectura
1
0
0.260
0.428
0.674
0.738
0.773
0.810
0.838
0.817
0.849
0.839
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Absorbancia (A)
Lectura Lectura
2
3
0
0
0.182
0.190
0.340
0.550
0.632
0.666
0.759
0.760
0.810
0.972
0.888
0.835
0.886
0.777
0.899
0.834
0.827
0.910
0.856
0.846
Promedio
0
0.210
0.439
0.657
0.752
0.851
0.844
0.833
0.850
0.862
0.847
Obteniendo la ecuacin de la regresin lineal:

1
0.9
f(x) = 0x + 0.26
R = 0.73
0.8
0.7
0.6
Absorbancia (A)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
50
100
150
200
250
Concentracin de BSA (g/mL)
Se eliminaron algunos datos debido a que en la grafica de la regresin lineal original se percibe
que las ultimas concentraciones tienen una absorbancia muy similar. Quedando de la siguiente
manera:
31
0.9
f(x) = 0.01x + 0.05

R = 0.97
0.8
0.7
0.6
0.5
Absorbancia (A) 0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
20
40
60
80
100
120
Concentarcin de BSA (g/mL)
Figura X. Curva estndar de BSA para determinacin de protenas por el mtodo de Bradford.
y = 0.008x + 0.049
Donde: y= absorbancia, x= concentracin de BSA
1.6.5 Discusin
El rango de sensibilidad de U.V. con respecto al mtodo de Bradford para determinar la
concentracin de protena se usaron concentraciones de 0 200 g/mL para la curva estndar
del ensayo.
Sin embargo, una no linealidad intrnseca compromete la sensibilidad y la precisin del mtodo
de Bradford, es decir, hay un grado de curvatura en un amplio intervalo de concentraciones de
protena en la curva estndar de BSA a una =595. Por lo tanto, solo es posible utilizar una
estrecha gama de concentraciones relativamente altas de protena (2-10 mg/mL de BSA); a estas
concentraciones se garantiza un ajuste de regresin lineal mejor (Ernst O., 2010).
La no linealidad representa un inconveniente cuando las cantidades de microgramos de protena
no estn disponibles en la curva estndar, y que a menudo requiere mltiples diluciones de las
muestras desconocidas.
La fuente de la no linealidad est en el propio reactivo, ya que hay un solapamiento en el
espectro de las dos formas diferentes de la coloracin del colorante (Bradford, 1976).
Existen tres formas del azul brillante de Coomassie que est en equilibrio cido-base con el pH
cido habitual del ensayo. Las formas de color rojo, azul, y verde tienen mximos de absorbancia
a 470, 590, y 650 nm, respectivamente. El azul es la forma que se une la protena, formando un
complejo que absorbe intensamente la luz a 595 nm.
El mtodo de Bradford de cuantificacin de protenas est basado en el cambio de color del
colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas.
32
Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos.

Esta unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del
colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena (Bradford, 1976).
Estructura qumica del azul de Comassie.

Algunas ventajas y/o desventajas del mtodo de Bradford son:
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo permanece
estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso
muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la
automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como potasio y
carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los
agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de buffers).
1.6.6 Conclusiones
El mtodo colorimtrico de Bradford, es un ensayo sencillo y de relativa sensibilidad debido al
inconveniente de la presencia de detergentes o sales que interfieren con la interaccin del
complejo protena-colorante.
Existe una curvatura grande en la grfica original de la regresin lineal, por lo tanto se
eliminaron estos ltimos datos que la ocasionan. La segunda grfica, que fue una modificacin
de la primera, se muestra con una ecuacin mucho mejor.
Referencias
Bradford MM (1976). Un mtodo rpido y sensible para la cuantificacin de cantidades de

microgramos de protena utilizando el principio de la protena de unin de colorante. Anal
Biochem. 72, 248-254.
Ernst, O., Zor, T (2010). Linealizacin del ensayo de protenas Bradford. J. Vis. Exp. (38),
e1918.
33
Zor T, Selinger Z (1996). Linealizacin del ensayo de protenas de Bradford aumenta su

sensibilidad: estudios tericos y experimentales. Anal Biochem. 236, 302-308.
1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas:

amilasas
1.7.1 Introduccin
Las amilasas (E.C. 3.2.1.1) se encuentran entre las enzimas ms importantes y de gran
significado para la industria biotecnolgica, constituyendo toda una clase de enzimas
industriales teniendo entre el 20-30% del mercado mundial de enzimas (Azad et al. 2009;
Rajagopalan & Krishnan 2008).
El trmino amilasa fue usado originalmente para designar a una enzima extracelular capaz de
hidrolizar enlaces -1,4-glucosidicos en polisacridos contenedores de 3 o ms unidades de
glucosa 1,4- ligadas como se describe en la ilustracin 1. La enzima acta en almidn,
glicgeno y polisacridos de manera aleatoria liberando grupos reductores.
La enzima acta en almidn, glicgeno y polisacridos

de manera aleatoria liberando grupos reductores.
Estas enzimas se encuentran tanto en organismos
eucariontes como procariontes. Son de gran valor en
distintas aplicaciones biotecnolgicas desde alimentos,
fermentaciones, textiles e industria papelera (Deb,
Talukdar, Mohsina, Sarker, & Sayem, 2013)
Ilustracin 1. Reaccin catalizada por alfa-amilasa.
1.7.1Materiales y mtodo
Balanza analtica
Tubos eppendorf
Espectrofotmetro
Celdas para espectrofotmetro (uv y visible)
Solucin de almidn 1% p/v
Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M
Reactivo de DNS
-amilasa
Reactivo de Bradford
34
1.7.2 Objetivos
Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa
Calcular las unidades de actividad enzimtica.
1.7.3 Metodologa
En un tubo epperndorf de 1.5 mL se agregaron 950 L de solucin de almidn al 1% p/v a

temperatura ambiente (23C) posteriormente se adicionaron 500 L de solucin de
amilasa exceptuando al testigo.
Se agreg solucin de almidn al 1% p/v inmediatamente se tomaron 100 L de la mezcla
de reaccin para colocarse en otro tubo eppendorf con 100 L de reactivo DNS para
detener la reaccin
Este procedimiento se realiz por triplicado en intervalos de 30 segundos entre tubos de
reaccin y en intervalos de 3 y 6 minutos entre tubos con DNS para detener reaccin.
Todos los tubos se pusieron en bao Mara a ebullicin durante 5 minutos. Transcurrido
ese tiempo se sacaron para colocarse en una cuba con hielo, se homogeniz la solucin
en cada tubo, agregando 1 mL de agua destilada para su posterior lectura en
espectrofotmetro UV-2100 a 540 nm.
Para determinar la cantidad de protena en la solucin de -amilasa se coloc dicha

solucin en una celda UV con su respectivo Buffer de fosfatos pH 7 como blanco y se
midi en espectrofotmetro a 280 nm.
Se coloc en una celda de plstico 250 L de enzima y 750 L de solucin de Bradford y

despus de 5 minutos se ley a 595 nm utilizando buffer de fosfatos pH 7 en el blanco en
lugar de enzima
1.7.4 Resultados
El grupo realizo el mtodo de Bradford para determinar de manera directa la cantidad de
protenas presentes en la muestra los cuales se encuentran en la tabla que se muestra a
continuacin
Tabla 1 Absorbancias obtenidas en el metdo de Bradford de el grupo
Equipo
01:10
01:20
1
0.345
0.364
0.194
0.191
2
0.17
0.163
0.098
0.173
3
0.126
0.472
0.241
0.349
4
0
0.275
0.15
0
5
0.527
0.542
0.464
0.843
6
0.146
0.165
0.063
0.105
7
0.817
0.871
0.389
0.421
As mismo se realizaron pruebas de DNS de las muestra a diferentes tiempos para observar de
esta manera la actividad de la amilasa al medir
Tabla 2Resultados de absorbancia para medir actividad enzimtica a 0,3,6 min
Absorbancia DNS
(540nm)
35
0min 3min
6min
0.215
0.119
0.256
0.212
0.235
0.168
promedio
0.221
0.143
0.256
x=( y+0.0093)/0.
4047
1.7.5 Discusin.
Utilizando el promedio de las mediciones de absorbancia se calcul la actividad enzimtica
correspondiente a los tiempos de 6 y 3 minutos utilizando las siguientes ecuaciones:
U=
[ Producto ] t 1[ Producto ] t 0
U esp=
[ Producto ] t 1[ Producto ] t 0
t [ Protena ]
Los resultados de U se muestran en la siguiente tabla
Tabla 3 Resultados de actividad enzimtica con respecto a la glucosa liberada vs tiempo
tiempo
Act enz
mol/ml
3 0.22066
667
6
0.1435
0.7
f(x) = - 0.04x + 0.67
0.6 R = 0.96
0.5
0.4
Glucosa[mol/ml]
0.3
0.2
0.1
0
0
Tiempo[min]
Grfica 1. Concentracin de maltosa liberada con respecto al tiempo, la pendiente

representa la actividad enzimtica U.
36
Dichos resultados se expresan en funcin de la concentracin de maltosa puesto que la curva de

calibracin por el mtodo de DNS est en funcin de maltosa.
En tabla 3 se muestran los resultados de actividad enzimtica calculados en los minutos 3 y 6 del
experimento. Se observa que la actividad enzimtica es menor a los 6 minutos, tanto la actividad
especfica como no especfica y que la pendiente de la grfica 1 corresponde al resultado de
actividad enzimtica (U) al minuto 6
Sin embargo este comportamiento se repite en la actividad enzimtica especfica.
Tabla4. Resultados de actividad enzimtica con respecto a los moles de maltosa liberados.
tiempo
Act enz
Act esp
3 0.220666
0.0733
67
6
0.1435
0.0239
1.7.6Conclusiones
Tanto en la tabla 3 como en la 4 se puede observar que el resultado de actividad

enzimtica es menor a los 6 minutos, dicho resultado es el esperado, puesto que la
velocidad enzimtica es mayor cuando existe mayor disponibilidad de sustrato, es decir al
inicio de la reaccin
Factores como la temperatura o condiciones del ensayo pudieron haber afectado este
resultado. Pero estos no fueron considerables,
1.7.7 Referencias
Deb, P., Talukdar, S. A., Mohsina, K., Sarker, P. K., & Sayem, S. A. (2013). Production and partial
characterization of extracellular amylase enzyme from Bacillus amyloliquefaciens P-001.
SpringerPlus, 2.
Azad MA, Bae JH, Kim JS, Lim JK, Song KS, Shin BS, Kim HR. Isolation and characterization
of a novel thermostable alpha-amylase from Korean pine seeds. N Biotechnol.
2009; 26:143149. doi: 10.1016/j.nbt.2009.09.006. [PubMed] [Cross Ref]
Rajagopalan G, Krishnan C. Alpha-amylase production from catabolite derepressed
Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresour
Technol. 2008; 99(8):30443050. doi: 10.1016/j.biortech.2007.06.001. [PubMed]
[Cross Ref]
37
1.8 EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA EN LA

ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UNA AMILASA.
1.8.1 Introduccin
La actividad enzimtica se refiere a la capacidad de catlisis en condiciones ptimas, es decir,
cuando una enzima acta en su velocidad mxima, lo que se consigue estandarizando las
condiciones del medio y utilizando concentracin saturada del sustrato; en estas condiciones la
velocidad de catlisis es mxima.
Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzimas no pueden medirse
directamente. Por consiguiente la actividad de una enzima se mide generalmente siguiendo la
desaparicin de sustrato, aparicin de un producto o la modificacin de cofactores de
una reaccin. Diversos factores modifican la actividad enzimtica, tales como:
Influencia de temperatura
pH
Concentracin de la enzima
Concentracin del sustrato
efecto de los inhibidores y activadores.
La -amilasa (1,4, -glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza los enlaces 1-4
glicsidicos de polisacridos, tales como el almidn, glicgeno o productos de degradacin de los
mismos (1). Tiene una actividad enzimtica que oscila entre 53-129 U/L, su peso molecular va de
los 40 000 a 50 000 Da, su actividad requiere de la presencia de iones cloruro (2). Esta enzima
38
tiene importancia en la industria alimentaria como en cervecera, dulcera, cereales y panadera,

y especficamente en la sacarificacin maltognica (1), sin embargo, su produccin es limitada y
es un producto de exportacin. La -amilasa que es producida de manera natural por Aspergillus
oryzae tiene un peso molecular de 52 x 310 (2). Las enzimas de origen microbiano presentan
ventajas tcnico-econmicas: poseen tiempos de generacin menores, tienen requerimientos de
espacio menor por unidad de enzima producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la
disponibilidad de nuevas enzimas (3). Los preparados industriales de enzimas, se caracterizan
por la actividad particular de la enzima deseada, por el efecto del pH, temperatura, tiempo de
reaccin, concentraciones de la enzima y del sustrato, as como el efecto de los inhibidores o
activadores, que pueden presentarse en las aplicaciones industriales. La produccin de una
enzima, incluye dos etapas principales: la fermentacin, en la que se multiplica el
microorganismo productor de la enzima, y la de recuperacin y purificacin en la que se asla la
enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. En la industria se utilizan ms los
preparados enzimticos, pues la purificacin de la enzima podra representar costos adicionales
en la produccin de alimentos. La calidad de la enzima est en funcin de la fermentacin, pues
esta influye directamente en la coloracin, olor y estabilidad de la enzima.
1.8.2 Objetivos
Determinar el efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica
Determinar la concentracin de la enzima mediante la tcnica de Bradford
1.8.3 Desarrollo Experimental
Solucin de almidn al 1%
Pesar 1g de
almidn
Suspender en
100 ml de
regulador de
fosfatos 0.1M pH
7.0
Desnaturalizar en
agua a 60 C por
15 min.
Determinacin de la concentracin de protena en la solucin enzimtica por Bradford
39
Preparar un
blanco con 0.25
ml del regulador
de fosfatos y
0.75ml de
Bradford
Determinar la
concentracin
Tomar 0.25 ml
de cada
concentracin y
adicionar 0.75
ml de Bradford
Leer
absorbancia a
595nm
Realizar por
duplicado para
cada
concentracin
de amilasa
Esperar 5 min.
Efecto de la concentracin de enzima en la velocidad de reaccin enzimtica
Prepara tubos
eppendorf como
lo indica la tabla
Tomar 0.1ml de
la reaccion y
adicionarlo a un
tubo con 0.1ml
de DNS
Adicionar por
triplicado 0.95ml
de la solucin a
diferentes
concentraciones
Incubar por 5
min en un bao a
25C
Adicionar 0.05ml
de solucion de
amilasa, excepto
al testigo
Utilizar un
intervalo entre
cada tubo, de
30s.
Tratar por tcnica

DNS visto en la
seccin 1.5 y 1.7
TABLA 8.1. Soluciones para determinar el efecto de la concentracin de la enzima en la actividad

enzimtica.
TUBO
Sol. De amilasa
(mg/ml)
Vol. De la solucin de
Testigo
--
3P1
1
3P2
2
3P3
3
3P4
4
3P5
5
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
40
Sustrato
(ml)
Vol. De la solucin de
Enzima en PO4
(ml)
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
1.8.4 Resultados
Efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica de una amilasa
Tabla 8.2 Lecturas de absorbancias a 540 nm a distintas concentraciones de enzima.
Tubos
a
distintas P1
concentraciones de enzima
4mg/m
L
Promedio de absorbancias (nm)
0.293
P2
3mg/m
L
0.337
P3
2mg/m
L
0.262
P4
1mg/m
L
0.262
P5
0.5mg/
mL
0.166
Curva de calibracin DNS

0.6
f(x) = 0.32x - 0.02
R = 0.99
0.5
0.4
0.3
Absorbancia a 540nm
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8
-0.1
Concentracin de maltosa(g/L)
fig. 1 Curva de
calibracin de DNS, en sta grfica se muestra el comportamiento de la absorbancia en funcin
de la concentracin de la muestra
41
Para determinar la concentracin, despejamos x de la ecuacin de la recta de la grfica
x=
y+ 0.024
0.3196
Tabla 8.3 Concentraciones de producto para diferentes concentraciones de amilasa
ncentracin de amilasa
sorbancias (nm)
ncentracin de
ductores
4mg/mL
0.293
azcares 0.9918
g/L
3 mg/mL 2mg/mL
1mg/mL
0.337
1.1295
g/L
0.262
0.8948
g/L
0.262
0.8948
g/L
0.5mg/
mL
0.166
0.5944
g/L
1.2
1
0.8
concentracion azucares reductores (g/L) 0.6

0.4
0.2
0
concentracion de - amilasa (mg/mL)
Fig. 2 Relacin entre la conc. de enzima y de azcar reductor
Tabla 8.4 valores de actividad enzimtica con respecto a su concentracin.
Fig 3
Concentracin de
amilasa (mg/ml)
0.5
1
2
3
4
actividad enzimtica(g/L
*min)
0.0990
0.0500
0
0.0391
-0.0229
comportamiento
42
de la actividad enzimtica de la amilasa vs conc. enzima
1.8.5 Discusin
En la tabla 8.2 observamos la absorbancia a diferentes concentraciones de enzima en mg/ml,
mediante la grfica 8.2 se determina la concentracin de enzima como lo vemos en la tabla 8.3,
dichos resultados no son satisfactorios, debido a que desde la lectura de la absorbancia se
present irregularidad a lo esperado bibliogrficamente, sin embargo se observa que la
concentracin va aumentando desde [0.5] a [3] manteniendo una relacin ascendente.
Por otro lado se observa que la actividad enzimtica respecto a la concentracin de enzima, no
concuerda con la actividad normal con respecto a la concentracin, ya que entre ms
concentracin de enzima, mayor actividad debera de mostar.
Sin embargo se observa que la mayor actividad enzimtica se encuentra a una concentracin de
0.5 mg/ml (ya que como valor de producto 0, se toma al cero como tal.) y un pH de 7 (pH ptimo
de la amilasa) y a 24C de temperatura. Y la menor actividad, se encuentra entre
concentraciones de 4mg/ml, causando completa controversia al encontrar la menor actividad en
la mayor concentracin de enzima.
En la tabla 8.4 se puede observar los resultados de la actividad enzimtica, los cuales muestran
un comportamiento no esperado bibliogrficamente, debido al mal manejo que se llev a la hora
de preparar las muestras provocando una lectura errnea en el espectrofotmetro.
Con respecto a la velocidad, para sacar los valores de la velocidad se debe linealizar la grfica, y
la pendiente es equivalente a la velocidad.
Por otro lado, analizando las posibles causas de los errores, se puede decir que la tcnica de DNS
necesita concentracin y un buen manejo de los espacios y el material, ya que puede existir
error al momento de agregar la soluciones o incluso en el tiempo en el que acta el DNS e
incluso en la temperatura optima a la que se debe trabajar.
La actividad enzimtica es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de la
actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones
1.8.6 Conclusiones
Con el fin de obtener respuesta a la actividad enzimtica en funcin de la concentracin, se
realiz la metodologa mostrada anteriormente, mediante la tcnica de DNS se determin dicha
actividad enzimtica.
La cuantificacin de la actividad enzimtica siempre est en funcin de ciertas condiciones que
si se modifican afectan el ensayo enzimtico. Dichas condiciones las comenzamos a ver con la
variacin de concentracin de enzima.
1.8.7 Memoria de clculo

Se determin la concentracin a partir de la curva tipo de maltosa
y=0.3196 X - 0.024
Despejando a X
X=
y +0.024
0.3196
Se sustituye cada absorbancia en el valor de y y se obtiene la concentracin.
X ( 0.5 )=
0.166+ 0.024
=0.5944
0.3196
43
X ( 1 )=
0.262+0.024
=0.8948 g /L
0.3196
X ( 2 )=
0.262+0.024
=0.8948 g /L
0.3196
X ( 3 )=
0.337+ 0.024
=0.1295 g/ L
0.3196
X ( 4 )=
0.293+0.024
=0.9918 g / L
0.3196
Posteriormente se determina la actividad enzimtica, Al sustituir en (1) las concentraciones en
g
L del producto.
U 0.5=
U 1=
=0.0990 g / Lmin
[ 0.8948 ]t 1[ 0.5944 ]t 0
U 1=
U 1=
[ 0.5944 ]t 1 [ 0 ] t 0
=0.0500 g /L min
[ 0.8948 ]t 1[ 0.8948 ] t 0
6
[ 0.9918 ]t 1[ 0.8948 ] t 0
6
=0 g/ L min
=0.0229 g / Lmin
1.8.8 Bibliografa
Guadarrama, A.(2002, Mayo). Obtencin de -amilasa a partir de Aspergillus oryzae [en

lnea]. Disponible en: http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-24.pdf [08/09/2013]
1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica

1.9.1 Introduccin
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de
incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen
esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a
desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se
llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la
reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida
a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse
44
Figura 1.
sobre la actividad enzimtica
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables
(carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol,
las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el
medio, estos grupos pueden tener carga elctrica
negativa o neutra. Como la conformacin de las
depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr
el cual la conformacin ser la ms adecuada para
actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo.
Efecto de la temperatura
etc.) en
pH del
positiva,
protenas
un pH en
la
La mayora de las enzimas son muy sensibles a los

cambios
de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar
drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a
pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la
desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos
complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.
DISOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Mantener el pH constante es vital para el
desarrollo de las reacciones qumicas y
que tienen lugar tanto en los seres vivos
nivel experimental, en el laboratorio. Los
amortiguadores (tambin llamados
disoluciones amortiguadoras, sistemas
buffers) son aquellas disoluciones cuya
concentracin de protones apenas vara al
cidos o bases fuertes
correcto
bioqumicas
como, a
Los amortiguadores ms sencillos estn

por mezclas binarias:
formados
tampn o
aadir
45
un cido dbil y una sal del mismo cido con una base fuerte (por ejemplo, cido actico y
acetato sdico)
una base dbil y la sal de esta base con un cido fuerte (por ejemplo, amonaco y cloruro
amnico)
1.9.2 Metodologa
Metodologa para la preparacin de buffer de fosfatos a pH 7
Para realizar la preparacin de la solucin de buffer a pH 7, se pesaron 4.3544 g de fosfato
dibsico de potasio (K2HPO4) equivalentes a 0.1 M para 250 mL de buffer. Se transfirieron estos a
un matraz aforado de 250 mL y se afor con agua destilada. Despus, se llev a pH 7 con una
solucin de fosfato monobsico de potasio (KH 2PO4) 0.1 M.
Metodologa para la preparacin de solucin de almidn a pH 7
Para preparar solucin de almidn a pH 7, se mezclaron 0.1 gramos de almidn por cada 10 mL
de buffer a pH 7, y se agit hasta que se disolvi completamente el almidn. Posteriormente se
llev a un horno para que el almidn se disolviera completamente y el volumen de muestra
evaporado fue compensado al adicionarle agua destilada.
Efecto del pH en la actividad enzimtica alfa- amilasa
En el desarrollo de la prctica se prepararon soluciones buffer de pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0, para
determinar la actividad enzimtica a estos valores. Con la ayuda de esto se llev a preparar seis
muestra madre en la cual se agreg 0.95 mL de solucin de almidn al 1% y 0.05 mL de enzima
alfa- amilasa, con intervalos de 30 segundos. Esto se realiz por duplicado en tiempos de 3 y 6
minutos.
Primeramente se coloc a cada tubo de reaccin 0.95 mL de solucin de almidn al 1% y a los
tubos para anlisis de actividad enzimtica 0.1 mL re reactivo DNS. Una vez teniendo todo esto
listo se prosigui a iniciar la experimentacin. En tiempo cero se agreg al primer tubo 0.05 mL
de mezcla de reaccin, se dej pasar 30 segundos para poder agregar al otro tubo 0.05 mL de
mezcla de reaccin y as sucesivamente hasta llegar a los 6 diferentes tipos de buffer.
Exactamente en el minuto 3 se agreg 0.1 mL de la nueva mezcla al tubo que se le haba
colocado previamente 0.1 mL de DNS. Y de nuevo se prosigui sucesivamente de esta manera
hasta los 8.3 min, colocando cada muestra madre con sus respectivos tubos como se muestra en
la siguiente tabla. Todo esto se realiz por duplicado de cada regulador de pH.
Una vez que se tuvieron todos los tubos preparados se llevaron a bao mara durante 5 minutos,
transcurrido este tiempo se pasaron inmediatamente a bao de agua fra. Ya que se tuvieron
fros los tubos se coloc 1 mL de agua destilada y se llevaron a leer en el espectrofotmetro a
540 nm.
Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima alfa- amilasa
Para la determinacin del efecto de la temperatura se utiliz una muestra de la enzima a un
pH=7. Las temperaturas a determinar fueron 24, 35, 45, 55 y 65C.
46
Se prepararon 4 tubos de reaccin con 0.95mL de solucin de almidn a pH= 7en una gradilla
para tubos de 1.5 mL. En la misma gradilla para cada tubo de reaccin se prepararon 4 tubos
con 0.1mL de reactivo DNS y un tubo sin enzima como blanco.
Al inicio del proceso los tubos de reaccin con 0.95mL de solucin de almidn y el blanco
correspondiente se colocaron previamente dentro de un bao por 5 minutos para que alcanzaran
la temperatura de determinacin.
Se comenz en un tiempo cero adicionando 0.05mL de solucin de enzima al cada tubo de
reaccin en las temperaturas antes mencionadas.
Pasados 3 minutos, se adicion 0.1mL de la mezcla de reaccin del tubo a los tubos con DNS.
Pasados 6 minutos desde el tiempo cero, se adicion 0.1mL de la mezcla de reaccin de los
tubos a los que contienen DNS.
Se vaciaron los tubos de reaccin con DNS en celdas espectrofotomtricas y se procedi a leer la
absorbancia a 540nm como lo indica el mtodo de determinacin con DNS.
1.9.3 Resultados :
Se analiz la actividad enzimtica de la enzima -amilasa a diferentes temperaturas y distintos
pH para conocer su comportamiento de acuerdo a las condiciones fisicoqumicas presentes,
obteniendo una diferencia de actividad notable y velocidades variables (Tabla 1 y 2), observando
que las condiciones si afectan la funcin de la enzima.
Tabla 1. Determinacin de actividad enzimtica de -amilasa a diferente pH.
Ph
5
6
7
8
9
Velocidad Promedio
(g de Glucosa/L * min)
0.2544
0.2636
0.1675
0.0000
0.0000
U
1.4133
1.4647
0.9304
0.0000
0.0000
Concentracin
Proteica Muestra (mg)
0.1000
0.1000
0.1000
0.1000
0.1000
U/mg de
protena
14.1330
14.6469
9.3042
0.0000
0.0000
47
16
14
12
10
U/mg de proteina (mol/min*mg)
8
6
4
2
0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
pH
Figura 2. Comparacin de actividad enzimtica especifica de -amilasa a diferente pH a 24.1 C.
Tabla 2. Determinacin de actividad enzimtica de -amilasa a distintas temperaturas.
Temperatura
C
24.1
35
55
65
Velocidad Promedio
(g de Glucosa/L *
min)
0.1675
0.0728
0.2193
0.1417
0.9304
0.4047
1.2184
0.7870
Concentracin
Proteica Muestra
(mg)
0.1000
0.1000
0.1000
0.1000
U/mg de
proten
a
9.3042
4.0472
12.1844
7.8695
14
12
10
8
U/mg de proteina (mol/min*mg)
6
4
2
0
2025303540455055606570
Temperatura (C)
Figura 3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica especfica. pH de 7 a una

concentracin enzimtica de 2 mg/Ml
48
1.9.4 Discusin
Todas las enzimas tienen un pH ptimo en donde tienen mayor actividad, y a medida que se
alejan de ese pH (ya sea alcalino o cido) disminuye su actividad. Esto se debe a que unos restos
aminoacdicos de las enzimas tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la
estructura tridimensional de la protena como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio
puede modificar las cargas de estos aminocidos y de este modo desnaturalizar a la enzima.
En la figura 2 puede verse que el pH ptimo donde la enzima alfa- amilasa alcanza una actividad
enzimtica ptima y por ende una velocidad cataltica alta es en un pH cercano a 6. Si el medio
es cido, la actividad enzimtica no tiene una repercusin tan fuerte en comparacin con medios
alcalinos.
Por tanto, se puede decir que a pH extremos, la alfa- amilasa deja de funcionar o al menos
disminuye notablemente su actividad enzimtica.
En la figura 3, existe cierta incongruencia en los datos, ya que segn la grfica la temperatura
ptima de la enzima alfa- amilasa es de 55C. Pero el comportamiento de la grfica es sigmoidal,
indicando en un principio que a una temperatura baja (en comparacin a su ptima) hay buena
actividad enzimtica, quiz no la mejor, pero si funciona bien en la conversin de sustrato
producto, luego la temperatura aumente y la actividad enzimtica vuelve a verse afectada.
El pH ptimo y la temperatura ptima son de 5-6 y de 60C respectivamente. Ambos casos se
pudieron comprobar en la prctica, pero el comportamiento de las dems temperaturas no es
claro.
Aun que si se compara la grfica obtenida con la bilbiografa, se aprecia que el comportamiento
es similar
}
Figura 4. Efecto de la temperatura en la hidrlisis de almidn por la enzima alfa- amilasa
1.9.5 Conclusiones
Al trmino de la prctica, se concluye que:
El pH ptimo de la alfa- ailasa fngica es cercano a 6.
49
La temperatura ptima para la hidrlisis de almidn por alfa- amilasa es de 55C, pero no
quiere decir que slo a temperaturas elevadas realiza una buena funcin, sino tambin en
temperaturas bajas puede tener un funcionamiento bueno.
En medios cidos, la actividad enzimtica de alfa- amilasa es mejor que en medio alcalinos.
1.9.6 Bibliografa
Worthington Corporation, Enzyme concentration, recuperado de http://www.worthingtonbiochem.com/introbiochem/enzymeconc.html, el da 8 de Septiembre del 2013.
Bioqumica experimental. Actividad enzimtica. Disponible en

http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/seccic3b3n3-curvastemporales.pdf. Revisado el 08 de septiembre de 2013.
Manuel Tena Aldave y Jess Jorrn Novo. Estudio cintico de la actividad de invertasa de levadura
de panadera. Departamente de Bioqumica y Biologa molecular.
50

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Walton, H. F., & Reyes. (1983). Anlisis qumico e instrumental moderno.

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Daz N, Brcela J. A., Fernndez E., et al.(2008). Cap. 8. Espectrofometra:

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