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DE CLOROPLASTOS
QUAIS AS VANTAGENS EM SE MODIFICAR ESTA ORGANELA?
Helaine Carrer
Pesquisadora do Centro de
Biotecnologia Agrcola (CEBTEC)
Professora doutora do
Departamento de Qumica,
ESALQ/USP
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Cloroplastos so organelas
intracelulares presentes em algas e plantas, responsveis pelo processo
fotossinttico, desde a captao da energia luminosa at a formao de compostos orgnicos, participando tambm da
assimilao do nitrognio, na sntese e
armazenamento de amido e na
biossntese de aminocidos e lipdios. A
estrutura desse centro fotossintetizador
est representada na figura 1, onde se
pode observar a presena da membrana
dupla, a qual caracterstica da organela
que se originou atravs do processo
endossimbitico de integrao de uma
cerevisae j foram obtidas, acreditandose que num futuro prximo, esta organela
tambm ser alvo de transformao gentica em plantas superiores.
organela. O sucesso obtido com a transformao de cloroplastos exigiu: 1) desenvolvimento de um mtodo de introduo
dos
transgenes
(DNA
transformante) atravs da membrana
dupla do cloroplasto; 2) disponibilidade
de genes marcadores seletivos com expresso na organela e 3) eficiente escolha do local de integrao do transgene
para no interferir com a funo normal
dos genes no genoma. Essa transformao foi obtida primeiramente em
Chlamydomonas reinhardtii, uma alga
unicelular, por Boyton et al., 1988
(Science 240: 1534-1538), e em plantas
superiores a transformao foi obtida
em tabaco (Nicotiana tabacum) por Svab
et al. 1990 (PNAS 87: 8526-8530). Sistema
de liberao do transgene no cloroplasto:
Atravs do sistema de biolstica (biologia
+ balstica) desenvolvido por Klein et al.,
1987 (Nature 327: 70-73) foi possvel
introduzir transgenes no interior dos
cloroplastos. Outro mtodo que demonstrou resultados positivos foi descrito por
Golds et al., 1994 (Biotechnology 11: 9597) e O'Neill et al., 1993 ( Plant J. 3: 729738), utilizando tratamento com PEG
(polietileno glicol), mas a eficincia de
transformao menor comparando-se
com o mtodo de biolstica. A utilizao
de Agrobacterium vem sendo objeto de
estudo em muitos laboratrios sem resultado satisfatrio at o momento. O
protocolo de transformao de
cloroplasto de tabaco est apresentado
na figura 3. A metodologia consiste em
introduzir o transgene no interior dos
cloroplastos atravs de biolstica. Cpias
do transgene ficam aderidas s partculas de ouro ou tungstnio de aproximadamente 1mm em tamanho, elas so
aceleradas pelo gs de hlio em alta
presso em cmara de vcuo, so
introduzidas no cloroplasto onde liberam o DNA. Inicialmente, somente uma
ou poucas cpias do genoma so alteradas entre as 10.000 cpias presentes nas
clulas do mesfilo foliar. Aps serem
Transformao de
cloroplastos
Atravs do desenvolvimento da
tecnologia de manipulao de genes de
cloroplastos in vivo criou-se uma nova
ferramenta para estudar os aspectos da
biologia celular e molecular desta
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os antibiticos espectinomicina,
estreptomicina e lincomicina. Entretanto, a freqncia de transformao de
cloroplastos utilizando este gene
marcador seletivo foi muito baixa, em
mdia entre 0.5 a 2 transformantes para
cada 100 bombardeamentos (Svab e
Maliga, 1991. Mol. Gen. Gen. 228: 316319; Staub e Maliga, 1993. EMBO J. 12:
601-606). Existe sempre a necessidade
de identificao de genes marcadores
seletivos para facilitar a introduo dos
transgenes com alta eficincia de seleo. Os genes bacterianos: aadA (Svab e
Maliga, 1993. PNAS 90: 913-917) e nptII
(Carrer et al., 1993. Mol Gen Gen 241: 4956) conferem resistncia aos antibiticos
espectinomicina e canamicina, respectivamente. Estes genes utilizados como
marcadores seletivos apresentaram melhores resultados na eficincia de transformao, em torno de 2 a 10
transformantes por bombardeamento,
sendo que o gene nptII apresentou menor freqncia de transformao e tambm expresso nuclear. O gene de planta
que confere resistncia aos herbicidas
inibidores da enzima acetolactato sintase
(ALS) foi testado para utilizao como
marcador seletivo (Carrer e Maliga, resultados no publicados). Recombinao
homloga: A integrao de um transgene
no genoma de cloroplasto ocorre atravs
de recombinao homloga, como demonstrado na figura 4. Para tanto, na
construo de um vetor de transformao, seqncias do ptDNA devem
flanquear o gene de interesse, indo desta
forma o transgene para o local de insero no genoma. Quando o local de
insero a regio duplicada invertida
do cloroplasto, existe a necessidade de
"correo" da segunda cpia, podendo,
ento, ocorrer a correo para a forma
original ou transformada. O transgene
expresso no cloroplasto sob controle de
um promotor procaritico, o qual possui
os sinais de expresso na organela.
Aplicaes da tecnologia de
transformao
At o momento, o tabaco tem sido a
nica planta superior a ter o cloroplasto
transformado, sendo utilizada como planta-modelo. Existe vrias vantagens em se
expressar os transgenes nessa organela
do que no genoma nuclear. Herana
materna: Anlise de plantas variegadas
revelou que os cloroplastos no apresentam segregao mendeliana, apresentando herana maternal dos genes
devido ao fato de no serem transmitidos pelo plen. Isto observado na
maioria das espcies de plantas cultiva-
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