Pesquisa

TOXINAS DE BACILLUS
THURINGIENSIS

Pesquisa

toxicidade de B. thuringiensis est relacionada sntese das protenas Cry que

atuam especificamente no
intestino mdio dos insetos,
as quais so codificadas por
genes cry. Essas protenas tm atividade
inseticida a diferentes ordens de insetospraga, de acordo com a presena dos genes cry, nas cepas bacterianas. Alm dessas protenas, o entomopatgeno produz
outros tipos de toxinas, como exotoxinas,
protenas Vip, endotoxinas, entre outras.
Sendo assim, esse artigo apresenta a atual
classificao dos genes cry, as ordens de
insetos-alvo das protenas Cry e outros fatores de toxicidade da bactria.
1.1 Protenas Cry

Laura Massochin Nunes Pinto

Biloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda
em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
Diouneia Lisiane Berlitz
Biloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Raquel Castilhos-Fortes
Biloga (UNISINOS) e Mestre em
Microbiologia Agrcola e do Ambiente
(UFRGS)
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrnoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Cincias Agronmicas
(ENSAM-Montpellier) e Ps-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

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Juntamente com a esporulao, B. thuringiensis libera incluses cristalinas paraesporais que podem conter uma ou mais
protenas inseticidas, denominadas Cry, as
quais so codificadas por genes tambm
denominados cry. Estas protenas apresentam peso molecular entre 40 e 140kDa e
tornam-se txicas a insetos, aps sua ingesto e solubilizao, no intestino mdio
das larvas (Bravo, 1997).
Estudos sobre a seleo de B. thuringiensis tm identificado diferentes cepas
desta bactria, as quais mostram ao sobre diversas ordens de insetos, como Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Orthoptera, Siphonaptera, Thisanoptera e
Mallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagd
et al., 2001; Cavados et al., 2001; CastilhosFortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Maagd et al., 2003), alm de nematides (Marroquim et al., 2000).
Assim, sabe-se que diversos grupos de
insetos so suscetveis aos cristais txicos
de B. thuringiensis e que uma espcie de
inseto pode ser afetada por mais de uma
cepa da bactria, pois estas freqentemente produzem diferentes protenas inseticidas. Isso significa que um cristal protico
pode ser txico a uma grande variedade
de insetos, principalmente lepidpteros.
Alm disso, as protenas Cry de B. thuringiensis podem ter seu efeito alterado de
acordo com a radiao solar, temperatura
e pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Ro-

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sas-Garca et al., 2008).

A busca por novos genes cry, que sintetizem novas protenas Cry, com diferentes efeitos inseticidas tem sido uma das
grandes metas na pesquisa com B. thuringiensis, desde os primeiros trabalhos publicados sobre a manipulao gentica de
B. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).
As toxinas Cry tm sido classificadas de
acordo com sua homologia na seqncia
de aminocidos (Figura 1), na qual a denominao Cry apresenta quatro ranques
hierrquicos de nmeros e letras (maisculas e minsculas), como por exemplo,
Cry3Aa2. As protenas Cry (Tabela 1) com
cerca de 45% de homologia em sua seqncia so colocadas no primeiro ranque e
quando apresentam 78 e 95% de identidade, constituem o segundo e terceiro ranque, respectivamente.
Cinco blocos de seqncias so comuns
a maioria das protenas Cry. Quando se
analisa o tamanho destas protenas tambm
fica evidente sua diversidade entre as diferentes protoxinas. A extenso C-terminal,
encontrada nas protenas mais longas, no
faz parte da toxina ativa, pois digerida
pelas proteases no intestino dos insetos,
mas pode ter ao na formao do cristal
(Schnepf et al., 1998).
A estrutura tridimensional das formas
ativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,
1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quando
analisadas em cristalografia de raio X, mostraram-se muito similares, cada uma apresentando trs domnios. As incluses cristalferas ingeridas por larvas susceptveis
dissolvem-se no intestino dos insetos e as
protoxinas inativas so solubilizadas e clivadas na longa regio C-terminal, por proteases intestinais, originando fragmentos resistentes a proteases com cerca de 60 kDa
(Maagd et al., 2003).
O domnio I, N-terminal, consiste em sete
alfa-hlices e participa na insero da membrana intestinal e formao do poro. O domnio II, ou beta-prisma, apresenta trs
folhas dobradas simtricas, formando as
beta-folha. O domnio III C-terminal consiste em duas beta-folha antiparalelas. Estes dois domnios esto envolvidos no reconhecimento dos receptores e ligao,
alm do domnio III tambm ter sido associado formao de poros (Maagd et al.,
2001).

Figura 1. Dendograma de protenas Cry

de Bacillus thuringiensis (Fonte http://
www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/
2008).

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Tabela 1. Classificao e caracterizao das protenas Cry de Bacillus thuringiensis.

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L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leuccitos cancerosos humanos.

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Figura 2. Dendograma das protenas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis

(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)
Atualmente, existem 428 protenas Cry
descritas, que esto classificadas em 55 classes Cry (Tabela 1). O autor Crickmore mantm um site na internet, o qual rene as
informaes sobre todas as toxinas Cry j
publicadas, alm de permitir o acesso s
caractersticas moleculares de cada uma.
Estes dados so atualizados periodicamente e podem ser acessados no endereo:
http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt.
Este nmero tem crescido regularmente, pois a descoberta de novos genes implica na obteno de novas toxinas que
possam ter maior especificidade ou toxicidade. Dentre os grupos de genes cry mais
estudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,
os quais j foram descritos com amplo es28

pectro inseticida aos lepidpteros.

Dentre estes grupos, os genes cry1 so
os mais freqentes na natureza, representando mais de 43% dos genes cry caracterizados e freqentemente as bactrias que
possuem genes deste grupo codificam protoxinas entre 130 e 140kDa, que so armazenados em cristais bipiramidais (Hofte &
Whiteley, 1989; Rosas-Garca et al., 2008;
Thammasittirong & Tipvadee, 2008).
O dendograma da Figura 1 mostra os
grupos de protenas Cry, que so classificados de acordo com a similaridade entre
a seqncia de genes que codificam as referidas toxinas bacterianas.
De acordo com Crickmore et al. (1998),
o primeiro domnio apresenta em torno de
45% de similaridade entre si, ao passo que

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o segundo domnio mostra-se entre 45 e 75%

similares e o terceiro domnio a partir de 75%
de similaridade, quando se trata da seqncia
de aminocidos.
Carlson et al. (1994) relatam que B. thuringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a
5,7 milhes de pares de bases, e a maioria dos
isolados apresentam elementos extra cromossmicos lineares ou circulares. Os genes cry
esto localizados em plasmdios e muitos isolados de B. thuringiensis possuem diversos genes cry responsveis pela sntese de diferentes protenas inseticidas (Lereclus et al., 1993).
Durante seu desenvolvimento, B. thuringiensis passa por duas fases, a fase vegetativa e a
estacionria, semelhantes ao desenvolvimento
de Bacillus subtilis.
A primeira fase caracteriza-se pelo crescimento exponencial das clulas de B. thuringiensis, momento em que h grande disponibilidade de nutrientes no meio. A fase estacionria ocorre quando o meio se torna hostil e a
bactria adapta-se diminuio de nutrientes
atravs de mecanismos genticos. A expresso dos genes cry de B. thuringiensis geralmente ocorre na fase estacionria da clula,
acumulando seu produto na clula me, na
forma de uma incluso cristalfera, a qual
liberada no meio ao final da esporulao (Lereclus et al., 2000). Esta incluso pode representar cerca de 25% do peso seco de clulas j
esporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Esses
autores relatam que apesar da expresso dos
genes cry estarem estreitamente relacionada
ao evento da esporulao, existem genes cry
que so expressos independentemente da esporulao.
A quantidade de protena produzida por
uma clula de B. thuringiensis no est diretamente relacionada com o nmero de cpias
de genes cry, pois a capacidade de produo
de protena pela clula, mesmo com apenas
uma cpia de um determinado gene cry, pode
ser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringiensis kurstaki HD73, possui apenas uma cpia
de gene cry1, mas sintetiza cristais bipiramidais em quantidades semelhantes quelas produzidas por cepas que apresentam trs ou quatro diferentes genes cry1. Desta forma, a sntese protica atinge um limite mximo, com certo nmero de cpias de genes cry na clula e
acima deste no h acrscimo na produo de
toxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).
As toxinas Cry so as mais proeminentes
de uma srie de fatores que permitem o desenvolvimento de sua virulncia morte ou enfraquecimento dos insetos. Esses dados sugerem
que muitas estirpes de B. thuringiensis podem
ser consideradas como patgenos oportunistas
de insetos. Seria de grande importncia uma
compreenso mais profunda das verdadeiras
funes ecolgicas de B. thuringiensis, tanto
para melhorar a confiabilidade da avaliao dos
riscos e para o desenvolvimento de mtodos
eficientes de isolamento de estirpes de B. thuringiensis, contendo genes cry ativos.
1.2 Protenas Vip
As protenas VIP foram descritas por Estru-

Tabela 2. Protenas Vip com efeito txico a diferentes insetos

Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadas

por Rice (1999). As subfamlias Vip1 e Vip2
(Tabela 2) so componentes de uma protena binria com atividade inseticida contra Diabrotica virgifera e D. longicornis
(Han et al., 1999; Warren, 1997). As protenas Vip 3 so ativas contra lepidpteros
(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda e
Helicoverpa zea. Seu modo de ao est
relacionado formao de poros na membrana do epitlio do intestino mdio (Yu
et al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee et
al., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3
apresentou toxicidade sobre lepidpteros
e no mostrou efeitos sobre insetos noalvo (Whitehouse, 2007).
Devido a sua atividade inseticida relacionada a Heliothis zea, as protenas Vip
3A esto sendo expressas em plantas de
algodo, conferindo resistncia ao inseto.
Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),
avaliaram plantas de algodo modificadas
somente com a protena Vip 3A, ou com a
combinao de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)
nos lepidpteros H. zea e H. virescens. Considerando o comportamento das lagartas,
os resultados desses autores mostram que
houve maior ndice de infestao em plantas no modificadas em relao s demais
(Vip 3A e Vip Cot).
O conjunto desses dados demonstra
que s protenas Vip so promissoras no
controle de insetos-praga, uma vez que possuem diferenas estruturais em relao s
demais protenas de B. thuringiensis, o que
pode retardar o processo de resistncia nas
populaes de insetos.
1.3 Demais fatores de virulncia
de B. thuringiensis

ch et al. (1996) e recebem essa denominao por serem produzidas na fase vegetativa de crescimento de B. thuringiensis. Sua
concentrao tambm permanece alta antes e depois da fase de esporulao.
Vrios estudos foram realizados aps
sua descoberta visando a caracterizao,
identificao de novos tipos, ao inseticida e tambm produo de plantas com capacidade de express-las. Estes estudos, porm, so incipientes quando comparados
com as endotoxinas.
A localizao dos genes responsveis
por sua produo ainda no foi determinada, embora existam vrios conjuntos de
primers que podem ser utilizados para identific-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fang
et al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 )
vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al.,
2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002).
A Figura 2 apresenta um dendograma
com as protenas Vip, j identificadas e cahttp://
talogadas,
no
site:
www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mostra primeiramente dois grandes agrupamentos de protenas onde so encontradas seqncias genticas semelhantes entre si,

subdivididos em cinco grupos menores, de

acordo com essa seqncia gentica. Percebe-se, claramente que esses cinco grupos similares so formados por protenas
da mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip
3. A diferena entre a seqncia de genes
que codificam essas protenas que define
sua classificao, como Vip1Aa, Vip1Ab, entre outras.
De acordo com Rang et al. (2005), as
protenas Vip2 exibem entre 21 e 22% de
similaridade com a protena Vip3Ba1, enquanto as protenas da classe Vip1 so entre 8 e 22% similares Vip3Ba1.
Segundo Fang (2007) estas protenas
representam uma das maiores descobertas
de toxinas com capacidade inseticida, sendo extremamente relevante a ausncia de
similaridade nas seqncias de aminocidos destas protenas com as seqncias de
aminocidos das endotoxinas, especialmente, em termos de manejo e evoluo da
resistncia.
De acordo com o dendograma da Figura 2, estas protenas so classificadas em
trs subfamlias diferentes (Crickmore et al.,
2005), sendo que ocorrem em torno de 15%
das cepas de B. thuringiensis avaliadas por

Alm das protenas Cry e Vip, os isolados de B. thuringiensis podem sintetizar

protenas denominadas Cyt, que possuem
atividade citoltica in vitro e especificidade
in vivo aos dpteros (Hfte & Whitheley,
1989; De Maagd et al., 2003). De acordo
com esses autores fazem parte desse grupo as protenas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seu
modo de ao tambm pode estar relacionado a um sinergismo com outras toxinas
produzidas pelos isolados.
O entomopatgeno tambm produz
outros fatores de virulncia, como as exotoxinas, -exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas, quitinases e fosfolipases (Hfte & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).
Esses autores declaram desconhecida a
exata contribuio de cada fator na virulncia da bactria, sendo uma dificuldade
determinar o espectro txico de um isolado que sintetiza mais de uma protena. Isso
porque, quando os fragmentos txicos vo
se ligar aos receptores da membrana do
intestino mdio do inseto, ocorre uma competio pelos stios de ligao, que pode
interferir na toxicidade do isolado.
Guttmann & Ellar (2000) identificaram
isolados de B. thuringiensis com a presena de hemolisinas, quitinases e lecitinases,

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de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper-

Tabela 3. Subespcies de Bacillus thuringiensis produtores da -exotoxina da em seus ensaios de toxicidade. Porm, de-

vido as suas propriedades no especficas aos

insetos, ou seja, pode tambm afetar organismos no-alvo, os isolados bacterianos que so
produtores dessa toxina no podem ser comercializados para serem utilizados na agricultura visando o controle de insetos-praga.
1.1 Referncias

sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Bt

fukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmastadiensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt ostrinae. J as subespcies Bt galleriae, Bt aizawai e Bt wuhanensis apresentaram somente hemolisina e quitinase.
Os mesmos autores tambm relatam a
presena do gene que codifica a enterotoxina, uma toxina produzida por diferentes
cepas de B. thuringiensis, com peso molecular em torno de 45kDa, e que pode ser
txica a vertebrados, uma vez que anloga toxina produzida por B. cereus. Considerando a anlise de 13 isolados de B.
thuringiensis avaliados, 9 foram positivos
para o gene entS que codifica a enterotoxina. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)
avaliaram 74 isolados do entomopatgeno,
em relao a presena dos genes bce, hbl e
nhe para a enterotoxina. Os seus resultados mostram que o gene nhe foi o mais
freqente, seguido de hbl e bce mostrando
assim, uma pequena diferena na distribuio desses genes entre B. thuringiensis e
B .cereus.
Outros dados de pesquisa sobre enterotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), revelaram a presena dos genes hbl, nhe, cytK
e entFM em 205 isolados de B. thuringiensis e 411 isolados de B. cereus. Os dados
desses autores mostram que, em 149 isolados de B. thuringiensis todos os genes ocorreram simultaneamente, sendo os genes nhe
e entFM aqueles de menor freqncia. Esses autores relatam a importncia desse
conhecimento uma vez que a enterotoxina
30

pode causar intoxicao alimentar, quando relacionada ao patgeno B. cereus.

Em relao -exotoxina, tambm chamada thuringiensina, uma protena com
peso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Perchat 2001), insespecfica, termoestvel,
identificada por inibir a sntese de rRNA
(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudicar a formao do fuso mittico, dentre
outros efeitos observados em ensaios in vitro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).
Por ser inespecfica e txica a vertebrados,
a thuringiensina avaliada em testes laboratoriais, utilizando roedores como cobaias.
Os dados de Ohba et al. (1981) mostram que, de 740 isolados de B. thuringiensis avaliados quanto a presena da -exotoxina, 28 produziram essa toxina. Alm
desses, dois isolados da espcie B. subtilis,
um isolado de B. natto e dois isolados da
espcie B. megaterium tambm foram produtores da thuringiensina.
Nesse sentido, Hernandz et al. (2003)
revelam que 79% dos isolados de B. thuringiensis thuringiensis so produtores dessa toxina, seguidos de 20% para B. thuringiensis kenyae, 13% para B. thuringiensis
kurstaki, contrastando com 0% de produo para B. thuringiensis aizawai.
Na Tabela 3 constam dados sobre a produo da -exotoxina pelas diferentes subespcies de B. thuringiensis.
A thuringiensina tambm apresenta atividade inseticida a diferentes espcies de
insetos-praga, como demonstra o trabalho

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38

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