Actividad antioxidante total de la piel avellana

(Nocciola Piemonte IGP):

condiciones de tostado

Impacto

de

diferentes

MonicaLocatelli *, Fabiano Travaglia, Jean Daniel Coisson, Aldo Martelli, CarolineStevigny 1, Marco
Arlorio
Resumen
Las delgadas peris perma marrn (piel) que envuelve los granos de avellanas se retira
generalmente despus del proceso de torrefaccin,que conduce un subproducto fenlico rico.
Principal objetivo de este trabajo fue caracterizar el antioxidante total la actividad de los extractos
fenlicos obtiene a partir de tostado '' NocciolaPiemonte IGP "piel de avellanas.
Diferentes disolventes de extraccin (metanol, metanol acidificado, etanol, etanol acidificado, y
acetona /protocolos de agua) y diferentes (extraccin y disolvente asistida fro semi-automatizado
de extraccin de Soxhlet)fueron empleados. La influencia de diferentes grados de tostado (180 _C
/ 10 min y 180 _C / 20 min) fue tambininvestigado. DPPH_ y ABTS_ + mtodos de barrido de
radicales, iones ferrosos actividad de quelacin y la inhibicin de la per oxidacin lipdica
investigado en este estudio demostrado propiedades antioxidantes significativas para avellana
compuestos fenlicos de la piel. El mecanismo principal implicado apareci la actividad
antirradical, estrictamente relacionados con el contenido fenlico total (r = _0.8798 y _0.8285
para los ensayos de DPPH_ y ABTS_ +, respectivamente). La acidificacin de extraccin de
solventes llevaron a una disminucin significativa de la actividad anti radical, mientras que el
diferente tueste condiciones influidas significativamente la actividad de quelacin y la inhibicin
de la per oxidacin lipdica, mostrando una mayor efectividad de los extractos de piel de avellana
alta asadas. Por el contrario, la medida directa dela capacidad antioxidante de la piel avellana
desgrasados revel mayores ABTS_ + propiedades de eliminacin de mediano muestra asado.
1. Introduccin
En ciencia de los alimentos, los antioxidantes son muy importantes, ya que actan en la
prevencin de la oxidacin de lpidos en los alimentos y la disminucin de los efectos adversos
especies de reactivo (ROS: especies reactivas del oxgeno; RNS: reactivaespecies de nitrgeno) en
las funciones fisiolgicas normales en los seres humanos (Huang, Ou, y Prior, 2005).
Antioxidante obtenidos sintticamente, como BHA (butil adohidroxianisol) y BHT (hidroxito
luenobutilado), son en gran parte utilizado en la industria alimentaria y se incluyen en la dieta
humana. Sin embargo, en los ltimos aos se ha promovido el uso de antioxidantes naturales
debido a las preocupaciones sobre la seguridad de los sintticos. Diettico componentes,
incluyendo polifenoles, carotenoides y vitaminas Cy E, se consideran efectivos antioxidantes tiles
en la prevencinde las enfermedades de estrs oxidativo y afines (Kaur y Kapoor,2001; Moure et
al., 2001).
Ampliamente distribuido en el reino vegetal y abundante en nuestra dieta, los polifenoles se
encuentran entre los ms estudiados sobre las clases de antioxidantes.

Fenlicos son los productos del metabolismo secundario en plantas, proporcionando funciones
esenciales en la reproduccin y el crecimiento de las plantas, actuando como mecanismos de
defensa contra agentes patgenos,parsitos y depredadores, as como contribuir al colorde las
plantas (Liu, 2004). Adems de sus funciones en las plantas, varios epidemiolgica investigaciones
clnicas demostraron que fenlicoantioxidantes presentes en los cereales, las frutas y las verduras
son directorfactores que contribuyen a la disminucin de la incidencia de variosenfermedades
crnicas y degenerativas (Shahidi, 2000).
Por todas estas razones, en los ltimos aos, varios estudios han sido conducidos con el fin de
investigar la actividad antioxidante de Fito extractos obtenidos a partir de fuentes vegetales.
Particularmente, agrcolay residuos industriales son considerados como fuentes muy atractiva de
antioxidantes naturales (Moure et al., 2001). Los subproductos de la uva (Vitisvinifera L.) de
procesamiento, tales como semillas y cscaras, son los ms fuentes de antioxidantes estudiados y
prometedores (Shi, Yu, Pohorly, yKakuda, 2003). La extraccin y la actividad antioxidante fenlico
decompuestos de otros materiales residuales, tales como cscara de la manzana (Kimet al., 2005),
pulpa de manzana (Lu y Foo, 2000), cscara de naranja dulce(Anagnostopoulou, Kefalas, Kokkalou,
Assimopoulou, y Papageorgiou,2005), alcachofa blanqueadas y aguas de alcachofa
escaldado(Llorach, Espn, Toms-Barbern, y Ferreres, 2002), las hojas ytallos de coliflores
(Llorach, Espin, Toms-Barbern, y Ferreres,2003), de oliva residual de molienda (Mulinacci et al.,
2005), el cacao subproductos(Arlorio et al, 2008;. Azizah, RuslawatiNik, y SweeTee, 1999)
ycscaras de frutos secos (cacahuetes, anacardos, avellanas, almendras, pistachos,* Autor para la
correspondencia. Tel .: +39 0321375774; fax: +39 0321375621.
E-mail: monica.locatelli@pharm.unipmn.it (M. Locatelli).
1 Direccin actual: Universidad Libre de Bruselas (ULB), Instituto de Farmacia,Laboratorio de
Farmacognosia, Bromatologa y Nutricin Humana, CP 205/9, Bd duTriunfo, Bruselas 1050, Blgica.
Avellana chilena, etc.) (Goli, Barzegar, y Sahari, 2005; Kamath yRajini, 2007; Moure et al., 2000;
Shahidi, Alasalvar, y Liyana-Pathirana,2007; Wijeratne, Abou-Zaid, y Shahidi, 2006; Yu, Ahmedna,Y
Goktepe, 2005) han sido tambin investigados. La presencia depolifenoles en las capas exteriores
(pieles, cscaras y cscaras) de frutas, verdurasy semillas (nueces) puede ofrecer proteccin contra
la oxidacinestrs: se sabe que los cascos juegan el papel principal en la defensade las semillas de
la planta y, junto con fracciones de salvado, concentrarsela mayora de los fenoles y taninos
(Shahidi y Naczk, 1995). Por otra parte,polifenoles desempean un papel importante en el sabor
astringente, causandotpica de larga duracin arrugas, encogimiento, spero, y sensacin de
sequedaden la cavidad oral (Stark, Bareuther, y Hofmann, 2005).
La actividad antioxidante de los frutos secos y sus productos derivados, ha sido estudiada
previamente. Estos estudios han puesto de manifiesto que los productos derivados de frutos
secosson fuentes ricas en antioxidantes naturales y fenlicacompuestos. Entre los frutos secos, las
avellanas (Corylus avellana L.) son muyinteresante en ese rico en fenoles y, en particular, las
proantocianidinas(Gu et al., 2003). Estudios recientes identificaron tentativamente varioscidos
fenlicos en ambos ncleos de avellanas (Alasalvar, Karamac', Amarowicz,Y Shahidi, 2006; Yurttas,
Schafer, y Warthesen, 2000) yavellana subproductos (piel, cubierta de hojas verdes, cscara dura y
el rbolhoja) (Contini, Baccelloni, Massantini, y Anelli, 2008; Shahidiet al., 2007). Estos trabajos
demostraron que la piel de avellana (o perisperma,o testa) es una fuente rica y bajo costo de

fenlicos naturalesantioxidantes. Ms recientemente, Alasalvar et al. (2009) obtuvieron

dosfracciones de extractos fenlicos brutos de avellanas turcas tombulla piel (compuestos
fenlicos de bajo peso molecular y taninos, respectivamente),que muestra mayor actividad
antirradical / antioxidante para la fraccin tanino,seguido por el extracto crudo y de peso
molecular bajo fenlicocompuestos. Sin embargo, el impacto de las diferentes condiciones de
tostadotanto en la extraccin de fenoles y actividad antioxidante tambin debea investigar,
especialmente teniendo en cuenta la formacin de Maillard productos (melanoidinas) durante el
tostado.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar el antioxidante totalla actividad de los extractos
fenlicos obtiene a partir de tostado '' Nocciola PiemonteIGP "avellanas piel, considerando
diferentes enfoques (gratisactividad de los radicales de captacin, la quelacin de iones ferrosos
pro-oxidantes, inhibicin de la peroxidacin de lpidos). Diferentes protocolos de
extraccin(extraccin fueron empleados fro solvente asistida y semi-automatizado Extraccin de
Soxhlet) y la influencia de diferentes tostadoprocesos (grados de media y alta para asar) se
investig.
Por ltimo, la capacidad antioxidante total de pieles de avellana (desgrasadapolvos) se determin
usando un protocolo de medicin directa.
2. Materiales y mtodos
2.1. Muestras
Las muestras de pieles de avellana fueron amablemente proporcionadas por el Dr. GiuseppeZeppa
(Universidad de Turn, Italia). Se obtuvieron pieles Avellana del italiano '' Nocciola Piemonte IGP
"ncleos de avellanas (C. avellanaL.), a saber Tonda gentil del eLanghe cultivar, cultivado slo
enreas especficas y de acuerdo con la disciplina de la produccin dela indicacin geogrfica
protegida (IGP) '' Nocciola Piemonte".
Avellanas con cscara secos se tuestan en dos condiciones diferentes:
180 _C durante 10 minutos (medio asar, MR) y 180 _C para 20 min (alta tostado, HR), y avellana
pieles fueron recuperados despus de la separacin espontnea de los granos despus del
tostado. TodosLas muestras se almacenaron bajo vaco y se mantienen en la oscuridad a_20 _C
Hasta que se analizaron.
2.2. Productos Qumicos
Todos los reactivos y productos qumicos estndar - catequina monohidrato,Trolox, monohidrato
de cido glico, cido cafeico, epicatequina, dihidratoquercetina, hidroxianisolbutilado (BHA) y
disdicodihidrato de etilendiaminotetraacetato (Na2-EDTA)) utilizadopara la determinacin del
contenido de fenoles totales y la actividad anti radical fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Miln,
Italia). Todos los productos qumicosy disolventes eran de nivel de grado reactivo y comprar ya sea
de Sigma-Aldrich (Miln, Italia).

2.3. Anlisis de la composicin proximal

Se determin el contenido de humedad de las muestras de piel de avellanautilizando un termo
balanza Sartorius MA30 (Sartorius AG, Goettingen, Alemania). Contenido de nitrgeno total y el
contenido total de protenas (conversinFactor: 6,25) se obtuvieron segn el mtodo
Kjeldahlutilizando el sistema de Kjeltec I (FOSS Tecator, Suecia). El contenido de cenizasse
determin en un horno de mufla segn la AOAC (1990) procedimiento.
Fraccin lipdica se extrae de pieles de avellana planta (despus de la molienda y las partculas de
tamizado tamao de <1 mm) utilizando un semi automtica Soxhlet Buchi Sistema de Extraccin B811 (BuchiLabortechnik AG, Flawil, Suiza) durante 12 h, empleando di cloro metano como
disolvente. Todos los resultados han reportado como porcentajesobre la base de peso seco (PS).
2.4. Extraccin de la fraccin fenlica
La extraccin de la fraccin fenlica de alta y mdium roasted pieles avellana desgrasadas se ha
realizado mediante dos diferentesmtodos: (i) de extraccin en fro bajo agitacin magntica y (ii)
Soxhlet extraccin. Para extraccin en fro cinco disolventes diferentes eranutilizado: metanol
(cido clorhdrico 0,1%, v / v), metanol acidificado,etanol, etanol acidificado (cido clorhdrico
0,1%, v / v), acetona /agua 80:20, v / v; metanol fue elegido como disolvente para Soxhlet
extraccin.
2.4.1. Fra-extraccin con agitacin
Se extrajeron cuatro gramos de desgrasados pieles de avellana polvosutilizando 100 ml de
disolvente; la extraccin se llev a cabo en Erlenmeyer cerradofrascos y con agitacin magntica
constante, en la oscuridad atemperatura ambiente (22 _C). Despus de 1 h de agitacin /
extraccin, la suspensin se filtr (embudo Buchner) a travs de papel Perfecte 2filtrar
(Superfiltro, Miln, Italia), y el residuo slido se volvi a extraercon 50 ml de disolvente para 30
min. Este ltimo paso se repitihasta que se logr la completa decoloracin(extraccin
exhaustiva); a continuacin, se recogieron los filtrados. El totaltiempo necesario para obtener la
extraccin completa vari segnen los disolventes empleados y en las diferentes condiciones de
tostado(datos no presentados). Finalmente, el disolvente se evapor a sequedad(vaco, 40 _C) y
extracto seco se almacen a _20 _C hasta su uso.
2.4.2. Extraccin Soxhlet
Diez gramos de los polvos de la piel desgrasada de avellana eranse extrajo con un aparato Soxhlet
usando metanol durante 7 h. el disolventeA continuacin se evapor a sequedad (vaco, 40 _C) y la
secaextracto se almacen a _20 _C hasta su uso.
2.5. Determinacin del contenido fenlico
Se obtuvo la determinacin del contenido de fenoles totales usandoel clsico ensayo de FolinCiocalteu, como se ha descrito anteriormente en Arlorioet al. (2008). Los resultados se expresaron
como equivalentes de catequina, a travs de la curva de calibracin de (??}) catequina
monohidrato. Lacalibracin rango de la curva de linealidad 50-250 lg (r = 0,9987).

2.6. Actividad de barrido DPPH_

El DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) radical de captacinensayo se realiz de acuerdo con el
mtodo descrito por Locatelliet al. (2009). Las muestras estndar y las molculas se disolvieron
enmetanol y diluido apropiadamente con el fin de obtener una calibracincurva (intervalo de
concentracin de 1 a 20 lg mL_1). Antiradicalla actividad se expres como porcentaje de inhibicin
(I%) y calculausando la siguiente ecuacin:

Los resultados se expresaron finalmente como dosis CE50 (antioxidante requierepara obtener una
inhibicin del 50%), calculado por regresin y anlisis.
2.7. ABTS_ + actividad de barrido
El catin radical ABTS (ABTS_ +) se realiz ensayo de depuracinde acuerdo con el mtodo
descrito por Re et al. (1999). Muestrasy molculas estndar se disolvieron en etanol ydiluido
apropiadamente con el fin de obtener una curva de calibracin (concentracionesrango de 10 a 900
lgmL_1). Actividadanti radical se expres como porcentaje de inhibicin (I%), como se describi
previamentepara el ensayo de DPPH_. Los resultados se expresaron como EC50, calculanpor
anlisis de regresin lineal.

2.8. La actividad de quelacin (ferrozina mtodo)

Se realiz la determinacin de iones ferrosos actividad de quelacin de acuerdo con el mtodo
descrito por Liyana-Pathirana y Shahidi (2005) con algunas modificaciones. Brevemente, 500
LLmuestra o su disolvente relativa (control: agua para Na2-EDTA, metanolpara los extractos de piel
de avellanas y otras molculas estndar),10 lL acuosa de FeCl2 2 mM, 35 lL de ferrozina 5 mM (3(2-piridil) -5,6-difenil-1,2,4-triazina-40400-disulfnico sal sdica del cido)y se aadieron 2,5 ml de
etanol, se mezclan adecuadamente, y se dejanreposar durante 10 min. Se ley la absorbancia
inmediatamente a 562 nm, utilizando un Kontron UVIKON 930 espectrofotmetro (Kontron
Instruments, Miln, Italia). Las muestras se disolvieron y las molculas estndaren metanol (agua
en el caso de Na2-EDTA) yapropiadamente diluido para obtener una curva de calibracin. Debido a
la altaconcentraciones de extracto empleadas (comprendido entre 0,2 y 7 mg mL_1),absorbancia
de las soluciones en blanco (sin ferrozina) se midi a corregir cualquier influencia debido al color
de los extractos. La quelacin actividad, medida como porcentaje de inhibicin de la ferrozina-Fe2
+ complejo la formacin, se calcul utilizando la siguiente ecuacin:

Los resultados se expresan como finalmente EC50, calculado por linealanlisis de regresin.

2.9. La inhibicin de la peroxidacin lipdica (mtodo de tiocianato frrico)

Se realiz la determinacin de la inhibicin de la peroxidacin lipdica de acuerdo con el mtodo
de tiocianato frrico (FTC) inform por Zin, Hamid, Osman, y Saari (2006), con algunas
modificaciones.
En primer lugar, 100 lL de cido linoleico se disolvieron en 4 ml de EtOH, 8 mlde tampn fosfato
0,05 M (pH 7,0) y 3,9 ml de agua destilada.
Trescientos cincuenta micro litros de muestra o disolvente (5%etanol metanlico, control) se
aadieron a 1,4 ml de la anteriormente solucin de cido linoleico descrito. Esta mezcla se
mantuvo en un contenedor atornillado en la oscuridad y a una temperatura de 50 _C;la oxidacin
acelerada de cido linoleico se midi despus de 24,48, 72 y 96 h de tratamiento trmico. La
determinacin de la oxidacin degrado (como la formacin de perxidos) se realiz segn el
mtodo de tiocianato frrico: 30 lL de la mezcla de reaccin se aadido a 2910 lL de 75% de
etanol, tiocianato de amonio 30 lL del 30%tiocianatoy 30 lL de cloruro ferroso 0,02 M en 3,5%
clorhdricocido. Las mezclas se agitaron y se exactamente despus de 3 min la absorbanciase
midi a 500 nm, utilizando un espectrofotmetro Kontron UVIKON 930(Kontron Instruments,
Miln, Italia). Las muestras y los estndarmolculas se ensayaron a tres concentraciones
diferentes (10,100, y 1000 lgmL_1). Los resultados se expresaron como la inhibicin de los lpidos
porcentaje peroxidacin calculado utilizando la siguienteecuacin:

Donde (t) y (0) indican que la absorcin de las muestras y lade control se mide en el tiempo t (t =
24, 48, 72 y 96 h de trmicatratamiento) y en el tiempo cero (antes de la puesta en marcha de la
oxidacinreaccin), respectivamente.
2.10. La medicin directa de la capacidad antioxidante total (extintorenfoque)
La medicin directa de la capacidad antioxidante total de la avellanala piel se obtuvo siguiendo el
procedimiento descrito por Serpen, Gokmen, Pellegrini y Fogliano (2008). ABTS_ + reactivo
sepreparado como se describe y se diluy adicionalmente en una mezcla de etanol:agua (50:50, v /
v) para obtener una absorbancia de 0,700 ) 0,020 a734 nm. Piel Avellanas (polvos desgrasados)
fueron finamente molidas y se tamizaron (tamao de partculas <250 lm); a continuacin, las
muestras se ensayaron enla proporcin de 0,15 mg por 6 ml de ABTS_ + reactivo. Las mediciones
de absorbanciase realizaron a 734 nm despus de exactamente 6, 15, 30 y60 min para determinar
el tiempo requerido para alcanzar el estado estacionario.
Los resultados se expresaron como moles de equivalentes de Trolox por kg de muestraa travs de
una curva de calibracin (rango de linealidad: 20-160 mmol;r = 0,9998).
2.11. El anlisis estadstico
Los resultados se expresaron como media desviacin estndar (SD) de por lomenos tres
experimentos independientes. Las diferencias se estimaronpor anlisis de varianza (ANOVA)

seguido de Tukey de '' honesto significativoDiferencia "de prueba. Las diferencias se consideraron
significativas ap<0,05. Se utiliz el anlisis de correlacin de Pearson para determinar la
correlacincoeficientes y su significacin estadstica. Toda estadsticaanlisis se realiz utilizando
el software estadstico R gratis
3. Resultados y discusin
3.1. Composicin aproximada de piel avellana tostadaEn primer lugar, la composicin proximal de
la piel de avellana tostada eradeterminado (Tabla 1). Como era de esperar, tiempo de coccin
prolongada permitila disminucin del contenido de humedad. A fin de evitar lainfluencia de las
condiciones de torrefaccin, lpidos, protenas y contenidos cenizasse inform sobre el peso seco
(ps) base. Tanto la RM y muestras de recursos humanos mostraron una composicin proximal
similar a la reportada para crudos avellana piel (Anil, 2007).

3.2. Extraccin de la fraccin fenlica

La extraccin de compuestos fenlicos es fuertemente afectada por sunaturaleza qumica, el
tamao de partculas de la muestra, el mtodo de extraccinempleado, y la presencia de
sustancias interferentes. Por otra parte,la solubilidad de sustancias fenlicas depende
estrictamente por lapolaridad del disolvente utilizado, as como su grado de polimerizacin(Naczk
y Shahidi, 2004). En este trabajo, la extraccin de fenlicofraccin de la piel de la avellana se
realiz primero utilizando diferentesdisolventes (metanol, metanol acidificado, etanol, etanol
acidificado,y acetona / agua). Una extraccin adicional por semiautomticoSoxhlet tambin se
llev a cabo utilizando metanol como disolvente (MeOHsox).
Con el fin de evitar la influencia de compuestos lipdicos interferir enanlisis fenoles extraccin y
siguientes, la matriz fue previamentedesgrasado mediante extraccin con diclorometano.
Fenlicos extraccinrendimiento, expresado como gramos por 100 g de muestras desgrasados,
estaba en el
Para MeOH>MeOH / H +> Ac2O / H2O>EtOH / H +>EtOH>MeOHsoxMR para la piel de avellana
(rango de 43,67% a 28,59%) y en el ordenAc2O / H2O>MeOH / H +>EtOH / H
+>MeOHsox>MeOH>EtOHde HR piel avellana (rango de 42.65% a 27.95%). Extraccinlos
rendimientos obtenidos para los extractos acetnicos acuosas (38,54% y 42,65%para muestras de
RM y de RH, respectivamente) fueron superiores a lo reportadopor Contini et al. (2008), que
obtuvo una extraccin de 32,6%producir empleando el mismo disolvente, pero el uso de una

maceracin de largo plazomtodo de extraccin. Un estudio reciente mostr que la acetona

acuosa(80:20 acetona / agua, v / v) era un disolvente ms eficazde metanol acuoso (80:20 metanol
/ agua, v / v) para extraertaninos condensados de piel avellana (Alasalvar et al., 2009).
Los otros disolventes utilizados en este trabajo (MeOH, MeOH / H +, y EtOH / H +) no fueron
considerados anteriormente para la extraccin fenlicaa partir de piel de avellana. Se puede
observar un orden diferente de disolventesdependiendo de las muestras de tostado medio y alto
tostados: de hecho, diferentes tratamientos trmicos podran inducir modificaciones enla
composicin qumica y la estructura celular de la matriz original(Saklar, Ungan, y Katnas,
2003;.Ozdemir et al, 2001).

3.3. Determinacin del contenido de fenoles totales

Contenido de fenoles totales de piel avellana se muestra en la Tabla 2; resultadosse expresan en
miligramos equivalentes de catequina (CE) por gramo de extracto. La cantidad de compuestos
fenlicos rangos de 637,65 a 380,24 mg g_1 CE y 706,35 a 551,59 mg g_1 CE paraMuestras de RM
y de RH, respectivamente. El muy bajo contenido de fenolesobtenido para la muestra asado a
medio usando metanol bajo agitacines presumiblemente debido a la solubilidad incompleta
inesperadode este extracto en metanol. Por lo tanto, este valor se considera subestimado.

En cuanto a la piel tanto de media y alta asado msdisolvente de extraccin efectiva result etanol
contenido (fenoles totalescontenidoexpresado por gramo de extracto); Sin embargo,
considerando los resultadossobre una base dw, se obtuvo el contenido fenlico alto utilizandola
mezcla de acetona acuosa (181,51 y 190,88 mg g_1 CE depiel avellana, dw para muestras de RM y
de recursos humanos, respectivamente). SignificativoNo se observaron diferencias entre los
extractos. En general, se acidificdisolventes extraen cantidades ms bajas de compuestos
fenlicos queno acidificados-uno (p <0,05). En lugar de ello, diferentes condiciones de tostadono
influyen significativamente en la cantidad de polifenoles extrables;el tratamiento trmico
prolongado parece no afectar al total decontenido fenlico de piel avellana (p> 0,05). Resultados
obtenidos eneste trabajo son similares a los obtenidos por otros investigadores que usan

diferentes disolventes y mtodo de extraccin. Alasalvar et al. (2009) report686 y 701 mg g_1 CE
para extractos crudos obtenidos detres extracciones consecutivas en 50 _C (cada uno de 30 min),
usando80:20 acetona / agua (v / v) y 80:20 metanol / agua (v / v) como
disolvente,respectivamente. Shahidi et al. (2007) reportaron una g_1 CE 577,7 mgcontenido
fenlico para la piel de avellana empleando 80/20 (v / v) de etanol /mezcla de agua bajo
condiciones de reflujo en 80 _C; Contini et al.(2008) obtuvieron 499,7, 588,2 y 546,6 mg g_1 CE
para residuos de la pielde kernel asado entero utilizando metanol acuoso (80/20, v / v),etanol
acuoso (80/20, v / v) y acetona acuosa (80/20, v / v),respectivamente, despus de una larga
maceracin a temperatura ambiente. Diferenciasen los fenoles totales de contenido podra ser
atribuida a diferentesdisolventes y mtodos de extraccin utilizados, sino tambin a los diferentes
cultivares,origen geogrfico y la temporada de cosecha de las muestras (todos estosparmetros
estn estrictamente relacionadas con la biosntesis de metabolitos secundariostales como
compuestos fenlicos). En este trabajo, analizamos la piel avellanaobtenido exclusivamente de ''
NocciolaPiemonte IGP "ncleos de avellanas,mientras que los autores anteriormente citados
utilizan los subproductos obtenidosdel turco avellana Tombul (Alasalvar et al, 2009;.Shahidiet de
2007 a partir de una mezcla de diferentes variedades (Tonda italiano al.) oGentil Romana, Tonda di
Giffoni, Tonda gentil delleLanghe; Turco Tombul) (Contini et al., 2008).
3.4. Determinacin de la actividad antioxidante de los extractos de piel de avellana
Con el fin de comprender mejor las propiedades antioxidantes de extractos fenlicos piel avellana,
se realizaron cuatro qumicas diferentes ensayos in vitro, basado en diferente mecanismo
antioxidante.
Propiedades anti radicales se analizaron mediante DPPH_ y ABTS_ +barrido de ensayos, en que
estos mtodos muestran varias importantediferencias en su respuesta a los antioxidantes y en su
manipulacin(Arnao, 2000); a continuacin, los iones ferrosos actividad de quelacin y la
inhibicinde la oxidacin de lpidos (autooxidacin de sistema de cido linoleico)
erandeterminado. Trolox(til y disponible como estndar comercialcompuesto en la evaluacin de
las propiedades antioxidantes), BHA (una sintticaantioxidante ampliamente utilizado por la
industria alimentaria), algunos fenlicocidos (cido glico y cido cafeico) y algunos flavonoides
naturales(epicatequina y quercetina) (cualitativamente identificado en avellanaextractos de piel,
los datos no mostraron) se ensayaron para su antioxidantepropiedades como compuestos de
referencia.
3.4.1. Actividad de barrido DPPH_
DPPH_ es uno de los restos sintticos ms utilizados para evaluarpropiedades antirradicales de
compuestos bioactivos y extractos de alimentos.
Es ms estable que los radicales naturales comunes (hidroxilo yradicales superxido) y no se ve
afectado por ciertas reacciones secundarias,tales como la quelacin de iones metlicos y la
inhibicin de la enzima. En este trabajo,Propiedades de eliminacin DPPH_ se evaluaron las
pruebas de al menos seis diferentesconcentraciones para cada extracto y experimentos que se
repitenal menos por triplicado. Los resultados se informaron como la concentracin
requeridaobtenido a una inhibicin del radical 50% (EC50, expresado como lgde extracto por
mililitro de disolvente; Tabla 2); mayor antiradicalactividad corresponde a valores ms bajos de

EC50. Debido a la restringidagama de linealidad entre la concentracin de antioxidante y

radicalinhibicin (I%), se calcularon los valores de EC50 sobre la base de probitde regresin, de
acuerdo con el mtodo descrito por Locatelli et al.(2009). Como ya se observ para el contenido
de fenoles totales, metanlicoextracto obtenido de MR piel avellana mostraron la ms
bajaActividad anti radical DPPH (EC50: 10,11 lgmL_1), de conformidadcon su solubilidad
incompleta en el disolvente de reaccin (metanol);as, la actividad antirradical de esta muestra
tiene que considerados subestimado.Extractos etanlicos y metanlicos se caracterizaron poraltas
propiedades de eliminacin de muestras de RM y de recursos humanos, respectivamente.
Actividad antirradical DPPH vari desde 3,67 hasta 10,11 lgmL_1; SRy HR actividad muestras no
fue significativamente diferente (p> 0,05),mientras disolventes acidificados extractos eran menos
activos que los correspondientesno acidificados-uno (p <0,05, extracto metanlico deMR piel
avellana no fue considerada debido a su incompletasolubilidad). Actividad antirradical de los
extractos de piel de avellana se comparcon la de compuestos antioxidantes estndar (Tabla 3).
Exceptopara el extracto metanlico MR, todos los extractos de piel de avellana estaban enmenos
1,5 veces ms activo que el BHA; Extracto metanlico HR fuecomparable a Trolox (no se observ
diferencia significativa).
En comparacin con las otras molculas estndar, extractos de piel de avellanaaparecido menos
eficaz para secuestrar DPPH radical. Debido experimentallas diferencias entre los mtodos DPPH
reportados en la literatura,es difcil comparar nuestros resultados con el obtenido porotros
autores.
3.4.2. ABTS_ + actividad de barrido
La base del mtodo es controlar la decadencia de la radicalcationABTS_ + producida por la
oxidacin de 2,20-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonato) (ABTS) causada por la adicin
deantioxidantes. En general, los resultados se expresan en relacin con Trolox(equivalentes
Trolox); sin embargo, en la analoga con DPPH_ ensayo, en estelos resultados del trabajo se
expresaron como valores EC50. Para cada extracto ymolcula estndar al menos nueve
concentraciones fueronprobadas yse realizaron al menos tres experimentos diferentes. Los valores
de CE50,expresado como lg de extracto por mililitro de disolvente (Tabla 2), erancalculado por
anlisis de regresin lineal; rango de linealidad entreconcentracin de antioxidantes y la actividad
antirradical (inhibicin ABTS_ +porcentaje, I%) se verific por I% de los valores superiores al 90%.
Extractos de piel de la avellana se resolvieron en etanol; tanto metanlicoy se acidific extractos
metanlicos de muestra a medio tostadofueron parcialmente insoluble en el disolvente (residuo
slido insolublefue mayor para el extracto metanlico que para metanlico acidificadauno), por lo
que los valores obtenidos para estos extractos se deben considerarsubestimado. ABTS_ + actividad
de barrido (valores de EC50) oscilaron655,15 a 317,24 lg mL_1. Extractos metanlicos obtenidos
porAparato de Soxhlet (317,24 lgmL_1) y de extraccin en fro bajoagitacin (350,05 lgmL_1)
present el mayor ABTS antiradicalpropiedades para la RM y la piel avellana HR, respectivamente.
Como previamentereportado para el mtodo DPPH_, MR y HR actividad muestras no
fuesignificativamente diferentes (p> 0,05), mientras que la acidificacin de los disolventesllevado a
una disminucin significativa de la actividad antirradical (p <0,01, parcialmenteextractos insolubles
no fueron considerados en este anlisis). Comparadoa compuestos estndar, extractos de piel de
avellana MR mostraronABTS_ + propiedades de eliminacin similares a epicatequina y Trolox(p>

0,05, extractos parcialmente insolubles no incluidos). El estudio deAlasalvar et al. (2009)

demostraron por acuosa de acetona y metanolextractos de piel de avellana 6,33 y 6,36 mmol de
equivalentes de Troloxpor gramo de extracto crudo, respectivamente. Shahidi et al.
(2007)obtenido para la piel de avellana extracto etanlico un anin radical ABTS(ABTS__) actividad
de eliminacin de igual a 132,0 mg de equivalentes Troloxpor gramo de extracto (TEAC); a la
misma concentracin del acuosaetanlico (80% de etanol) extracto de piel marrn almendra
mostr una52.9 TEAC (Siriwardhana y Shahidi, 2002). Kamath y Rajini(2007) reportaron que el
extracto etanlico de piel anacardo eraigualmente potente como BHA en ABTS_ + barrido de
ensayo (CE50 de anacardoextracto de cscara de nuez: 1,30 lgmL_1).

3.4.3. Actividad quelacin

Formacin de Metal-mediada de radicales libres puede causar variosmodificaciones a las bases de
ADN, peroxidacin lipdica intensificada ycambios en la homeostasis del calcio y sulfhidrilo. Debido
la altareactividad, el hierro es uno de los ms importantes de oxidacin de lpidos prooxidantes,particularmente en su estado ferroso. As, los quelantes eficaces Fe2 +puede ofrecer
una proteccin contra el dao oxidativo porinhibicin de la produccin de ROS y la peroxidacin
lipdica (Liyana-PathiranaY Shahidi, 2007). En este trabajo, la actividad de quelacin de hierro
extractos de piel de avellana se evalu utilizando el mtodo ferrozina.
Al menos seis concentraciones diferentes para cada extracto se probarony los experimentos se
repitieron al menos por triplicado. Los valores de CE50,expresado como mg de extracto por
mililitro de disolvente, se calcularonpor anlisis de regresin lineal; rango de linealidad entre
antioxidanteconcentracin y la actividad de quelacin (expresado como porcentaje,CA%) se
verific por CA% valores de hasta 75 a 90%, en funcin de diferentesmuestras analizadas.
La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos midiendo la quelacin ferrosola actividad de los
extractos de piel de avellana tostados. Es importanteresaltar que no era posible evaluar la
actividad de lamuestras extradas con disolventes acidificados (sus valores de absorbanciadado
como resultado ms alto que el control y as no se consideran).
Si se compara con la actividad antirradical, la capacidad de quelacin del hierro deextractos de piel
de avellana eran relativamente ms dbil, que van desde4,93 mg mL_1 (MR acuosa extracto de
acetona) a 1,01 mg mL_1 (MRextracto metanlico) valores de EC50. Por tanto la RM y la piel
avellana HR,metanol apareci el mejor disolvente de extraccin. Adems, en contrastea su
solubilidad reducida, extracto metanlico de MR avellanapiel mostr la mayor actividad quelante
del hierro (1.01 mg mL_1); ellaparecera que la fraccin insoluble de este extracto

(presumiblementecompuestos polimricos) tiene una influencia negativa en la quelacin

Propiedades del extracto total. En total, la actividad de quelacin obtenersepara muestras de RM
y de recursos humanos fue significativamente diferente (p <0,001), lo que indicaaltas propiedades
de quelacin para los extractos de recursos humanos. Entreestndarcompuestos, slo quercetina
revelaron la capacidad de unirseFe2 + (CE50: 5,07 mg mL_1), mostrando una actividad comparable
quelacinMR etanlico y extractos acetnicos (p> 0,05); todas las otras molculasfueron ineficaces
en la concentracin de 7 mg mL_1. Etilendiaminotetraacticosal disdica del cido (Na2-EDTA) fue
tambinprobado como control positivo, mostrando la potencia ms alta quelante(EC50: 8,36
lgmL_1). Nuestros resultados estn de acuerdo con la literatura;Kamath y Rajini (2007) informaron
de una mayor actividad de la quelacin con EDTAde extracto de piel de anacardo (CE50: 6,00 mg
mL_1). Liyana-Pathirana y Shahidi (2005) revelaron para solucin de EDTA 100 ppmuna actividad
de quelacin completa, mientras observ que Trolox no lo hizoiones ferrosos quelato en absoluto.
Utilizando el mtodo tetramethylmurexide,Wijeratne et al. (2006) obtuvieron un 96% de
quelacin de iones ferrosos paratanto quercetina (100 ppm) y el extracto de piel de almendra
(quercetina 100 ppmequivalentes).

3.4.4.
La
inhibicin
de
la
peroxidacin
lipdica
El dao oxidativo de los lpidos ha sido reconocido de fundamental importancia debido a
su numerosa biolgico y nutricional implicaciones (deterioro de sabor y aroma de la
comida, la decadencia de cualidades nutricionales y de seguridad, el dao celular
relacionado con la carcinognesis, el envejecimiento prematuro y otras enfermedades)
(Kanner & Rosenthal,1992). Medicin de hidroperxidos de lpidos es una parte esencial
de comprensin de los procesos de oxidacin de lpidos. Un espectrofotomtrico
conveniente mtodo para medir hidroperxidos lipdicos es la ferricthiocyanate
mtodo. Extractos de piel de avellana y estndar compuestos se ensayaron a tres
concentraciones diferentes (10, 100 y 1000 lgmL_1) y su efecto protector contra
hidroperxido generacin se monitoriz durante la oxidacin a 50 _C (24, 48, 72 y 96 h). A
la concentracin de 10 lgmL_1 piel avellana extractos no mostraron una inhibicin
significativa de la peroxidacin lipdica (datos no mostr). En algunos casos, se observ
actividad pro-oxidante; Sin embargo, otros estudios ms especficos y debe ser conducida
con el fin de evaluar las reales propiedades pro-oxidantes de los extractos.
Las muestras analizadas en concentraciones de 100 y 1000 lgmL_1 reducidos la
formacin de complejos de tiocianato frrico, mostrando la absorbancia valores
significativamente ms bajos que en el control (Fig. 1). La actividad antioxidante,
expresada como porcentaje de inhibicin de la peroxidacin de lpidos (IP%), aumento de
de una manera dependiente de la dosis y en funcin de la oxidacin tiempo. De manera
general, se observ que la inhibicin de lpidos peroxidacin aument con el tiempo de
oxidacin. Los valores de% IP obtenidas por RM y extractos de recursos humanos (en
concentraciones 100 y 1000 lgmL_1, despus de 96 h de tratamiento trmico) son
reportado en la Tabla 4. Tambin en este caso, la actividad antioxidante de MR
extracto metanlico piel avellana tiene que ser considerado subestimado.
Como ya se observ para la actividad de quelacin, muestras de RRHH propiedades
antioxidantes significativamente mayores mostraron que los MR (p <0,0001, tanto para
100 y 1000 lgmL_1). La acidificacin de disolvente de extraccin mostr una influencia

significativa y positiva en % Valores IP slo considerando la concentracin 100 lgmL_1

(p <0,05); en 1000 lgmL_1 no se observaron diferencias significativas entre disolventes
acidificado y no acidificado-queridos. Estos datos indican que la eleccin de
concentraciones de la muestra es fundamental en los estudios de actividad antioxidante,
ya que los diferentes resultados podran obtener. La actividad antioxidante determina para
los extractos de piel de avellana no fueron significativamente diferente de la obtenida para
el estndar molculas (Tabla 3).
3.5. La correlacin entre el contenido de fenoles totales y antioxidante
La actividad de los extractos de piel de avellana y la comparacin entre antioxidante
mtodos La medida en que el potencial antioxidante de la piel de avellana
extractos
se
explica
por
se
evalu
su
contenido
fenlico.
El grado de asociacin lineal entre dos radicales de captacin actividad (DPPH_ y
ensayos + ABTS_) y la inhibicin de la peroxidacin lipdica (1000 lgmL_1 despus de la
oxidacin de 96 h), y el contenido fenlico total se determin por medio del anlisis de
correlacin; Pearson coeficientes de correlacin producto-momento (r) y niveles de
significacin (p) se calcul (Fig. 2). Correlacin entre la actividad de quelacin
y el contenido de polifenoles no se consider en esta seccin porque de la falta de
resultados de ensayo de actividad de quelacin. como se representa inFig. 2, una fuerte
correlacin significativa con se observ contenido de polifenoles para la actividad
antirradical, mostrando coeficientes de correlacin r = _0.8798 y _0.8285 para DPPH_ y
ABTS_ + ensayos, respectivamente. Valores de r negativos fueron obtenidos en ese
mayor actividad antirradical correspondi a valores ms bajos de EC50.
Muchos estudios han reportado una gran correlacin entre el total de contenido de fenol y
la actividad antirradical en distintos alimentos y plantas especies (Wojdyo, Oszmian' de
esqu, y Laskowski, 2008). De lo contrario, no se observ una correlacin entre el
contenido de fenoles totales y la inhibicin de la peroxidacin lipdica. Este hecho puede
ser debido a la estructura molecular especfica de compuestos fenlicos que participan en
este especfica accin. Adems, el contenido fenlico total determinado de acuerdo
con el mtodo Folin-Ciocalteu no es una medida '' absoluta " de la cantidad de materiales
fenlicos y diversos fenlico compuestos muestran diferentes respuestas en este ensayo
(Snchez-Moreno, Larrauri, y Saura-Calixto, 1999). Por el contrario, contenido de fenol no
es el nico factor que influye en la antioxidante total la actividad de las muestras y los
efectos sinrgicos de los compuestos fenlicos con otros componentes, por ejemplo
compuestos melanoidinic formado durante el tostado, tambin deben tenerse en cuenta.
La comparacin de los diferentes mtodos antioxidantes utilizados en este trabajo,
Ensayo DPPH_ era la muestra ms sensible, porque requiere menor concentraciones que
otros mtodos. Teniendo en cuenta ABTS_ + y Mtodos DPPH_, DPPH_ es probable ms
selectivo que ABTS_ + en el reaccin con H donantes; Sin embargo, en contraste con
DPPH_, ABTS radicales son capaces de reaccionar con los flavonoides que no contienen
OHgroups en el anillo B, as como con cidos aromticos que contienen slo
Fig. 2. La correlacin de la actividad antioxidante con contenido de fenoles totales y entre
ensayos de antioxidantes (mtodos DPPH, ABTS y FTC). La parte diagonal superior de la
figura muestra lneas de dispersin y de regresin lineal; la parte diagonal representa el
histograma de frecuencias; en la parte inferior diagonal son reportados de correlacin de

Pearson coeficiente (r) y los valores de probabilidad (p). Las correlaciones fueron
considerados estadsticamente significativos para p <0,05. Contenido en polifenoles se
expresa como CE (mg g_1); antiradical actividad frente a DPPH y ABTS se expresa como
CE50 (lg mL_1); inhibicin de la peroxidacin de lpidos se expresa como porcentaje,
determinado para la concentracin de 1000 lgmL_1, despus de 96-h oxidacin.
un grupo OH (Roginsky y Lissi, 2005). Sin embargo, se debe considerar que las
concentraciones de la muestra dependen en gran medida de las condiciones especficas y
la
composicin
fsica
de
prueba
sistemas.
Se observ una correlacin significativa entre el radical de captacin mtodos activos
(DPPH_ y ABTS_ + ensayos, r = 0,8789), mientras que no se observ correlacin con el
mtodo de la FTC. estos resultados parecera sugerir que la inhibicin de la peroxidacin
lipdica (FTC mtodo) implican un mecanismo antioxidante diferente de radicalscavenging
actividad. Todas estas observaciones confirman la necesidad para realizar ms de una
sola prueba para determinar el antioxidante total la actividad de los extractos complejos.
3.6. La medicin directa de la capacidad antioxidante total (extintor enfoque)
Por ltimo, la actividad antioxidante total de MR y avellana HR la piel se determin
empleando un procedimiento directo, es decir, la Enfoque extintor (Gokmen, Serpen, y
Fogliano, 2009; Serpen et al., 2008). El mtodo se aplic a la piel desgrasada de avellana
polvos y los resultados se expresaron como moles de equivalentes de Trolox (TE) por kg
de muestra. ABTS_ + se midi la actividad de barrido durante diferentes tiempos (6-60
min) con el fin de determinar el tiempo necesario para alcanzar el estado estacionario.
Incluso si en el caso de Trolox la reaccin se complet en 6 min, la ABTS_ + curvas de
barrido de la piel avellana llegaron a la meseta en 30 min. Por lo tanto, la actividad
antioxidante de ambas muestras de piel de avellana andtrolox se midi despus de
exactamente 30 minutos de reaccin. Resultados era 1.10 ??} 0,01 y 0,94 ??} 0,06 mol
TE / kg para el MR y HR desgrasada piel avellana, respectivamente.
Como se sugiri anteriormente en la literatura, muchos alimentos tienen componentes
insolubles que pueden ejercer una actividad antioxidante. Comn procedimientos para
mejorar la solubilidad de las fracciones insolubles (por ejemplo, esterificados cidos
fenlicos) y determinar su contribuir a la actividad antioxidante es llevar a cabo los
tratamientos alcalinos, cidos o enzimticos (por lo general, hidrlisis utilizando NaOH).
Sin embargo, qumica grave la hidrlisis puede alterar la estructura de los alimentos y los
extractos resultantes ya no son representativos de la capacidad antioxidante real que
la comida podra tener (Gokmen, Serpen, y Fogliano, 2009). Adicionalmente, el uso de
extracciones secuenciales y el procedimiento de hidrlisis alcalina para evaluar la
capacidad antioxidante total en productos de cereales permitido a resultados comparables
o, en algunos casos, inferiores a las obtenido utilizando un enfoque de medicin directa
(Serpen et al.,2008). En comparacin con los datos previamente reportados en la
literatura, la avellana piel era ms activo que varios productos de cereales, para los que
se encontraban valores obtenidos inferior a 120 mmol TE / kg (Serpen et al., 2008).
Estos resultados confirman las propiedades antioxidantes muy altas para la avellana
la piel. Adems, en contraste con los resultados previamente obtenidos para
extractos de piel de avellana (ABTS_ mtodo +), se midi la actividad antioxidante
MR para la piel de avellana fue significativamente mayor que la obtenida
de HR (p <0,05). Este hecho podra indicar que fraccin insoluble de la piel avellana es
ms relevante para antioxidante la actividad de la muestra MR.

4. Conclusiones
Todos los mtodos empleados en este trabajo demostraron significativa propiedades
antioxidantes de los extractos de piel de avellana; sin embargo, el mecanismo principal
implicado apareci la actividad antirradical. En particular, teniendo en cuenta la
eliminacin de radicales DPPH las concentraciones empleadas fueron de un orden de
magnitud menor que la quelacin actividad, indicando propiedades antirradicales ms
altas. La acidificacin de los disolventes de extraccin condujo a una disminucin
significativa de actividad antirradical (tanto DPPH_ y ABTS_ + ensayos), mientras que el
diferente condiciones de tostado aparecieron significativamente influyen en la quelacin
quelacin la actividad y la inhibicin de la peroxidacin de lpidos, que muestra mayor
efectividad para los extractos de alto tostado de la piel avellana.
Por el contrario, Los resultados obtenidos por medida directa de la antioxidante
actividad de pieles avellana desgrasados (mtodo extintor) reveladas mayor ABTS_ +
propiedades
de
eliminacin
para
la
muestra
de
mediano
asado.
Concluyendo, la piel de avellana tostada puede ser considerado un bajo costo fuente
natural de antioxidantes; sin embargo, siendo la actividad global de los extractos depende
tanto de disolventes de extraccin y la grado de tostado, la identificacin y cuantificacin
de fenlico (compuestos flavonoides, cidos fenlicos, y proantocianidinas), as como las
melanoidinas formados durante el tostado, deben tienen que ser realizado.
Reconocimiento
Este trabajo fue financiado por subvenciones de la RegionePiemonte y FondazioneCariplo
(Proyecto
Nutrial
Red).
Referencias