PRACTICA # 7 CRECIMIENTO BACTERIANO

UACJ ICB
MAESTRA VICTORIA SILVA
EQ. MARIO ALBERTO RODRIGUEZ PARRA MAT 123921
Resumen
En esta prctica se realizaron diversos mtodos de conteo bacteriano en E. coli
como: conteo directo al microscopio, mtodo de Breed, vaciado en placa y curva
de crecimiento. Los resultados del conteo bacteriano fueron satisfactorios y se
logr aprender a desarrollar estos mtodos, adems de cumplir el objetivo de la
prctica.

Objetivo
Desarrollas
algunas
tcnicas
comunes para medir el crecimiento
bacteriano en poblaciones, tanto en
clulas vivas, como en muertas,
comprendiendo su funcionamiento y
aplicacin.
Introduccin
En un sistema biolgico se define al
crecimiento
como
el
aumento
ordenado de las estructuras y los
constituyentes celulares de un
organismo. Segn ello, el aumento de
la masa celular producido por
acumulacin de productos de reserva
(glucgeno, poli-hidroxibutirato) no
constituyen crecimiento.
Se
puede
considerar
como
crecimiento al incremento de clulas
individuales por un lado, y por otro
lado se puede considerar al
crecimiento del nmero de clulas
(proliferacin de la poblacin).
En lo que se refiere al crecimiento de
clulas individuales, este consiste en
el aumento del tamao y peso de las
clulas que precede a la divisin
celular. Esta divisin trae aparejado

un aumento en el nmero de clulas

(proliferacin de la poblacin). Las
bacterias se dividen por fisin binaria,
a travs de la una cual clula madre
al alcanzar un determinado volumen
se divide dando dos clulas hijas. El
proceso de fisin binaria consiste en
la autoduplicacin del material
hereditario seguido de la reparticin
en las dos clulas hijas, las que se
separan por estrangulamiento de la
membrana celular y formacin de la
pared celular (Fig. 1).

Figura 1. Division binaria de celulas

procariotas.
Basado en el concepto que una
clula se divide dando dos clulas
hijas, y stas a su vez se vuelven a
dividir dando dos clulas cada una de
ellas, se presenta en el siguiente

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cuadro la proliferacin de una

poblacin de clulas a partir de una
sola, con un tiempo de generacin de
30 minutos.

Los tiempos de duplicacin varan

segn el microorganismo del que se
trate. Por ejemplo:

Eschericha coli 0,35 hs

Rhizobium meliloti 1,8 hs
Nitrobacter
aproximadamente 20 hs

sp

Ciclo normal del crecimiento

Las
poblaciones
microbianas
raramente mantienen un crecimiento
exponencial prolongado. Si ello
ocurriera en poco tiempo la tierra
estara tapada de una masa
microbiana mayor que la de la tierra
misma.
El
crecimiento
est
normalmente
limitado
por
el
agotamiento de nutrientes o por la
acumulacin de productos del mismo
metabolismo microbiano, que les son
txicos
a
la
poblacin.
La
consecuencia es que el crecimiento al
cabo de un cierto tiempo llega a
disminuir hasta detenerse. (Figura 2)

Es posible distinguir cuatro fases:

1) fase de latencia o de retardo
2) fase exponencial
3) fase estacionaria
4) fase de muerte
En la fase de latencia existe un
aparente reposo en el que las clulas
sintetizan las enzimas necesarias
para la actividad metablica que
deben llevar adelante.
Cuando se hacen mediciones del
nmero de clulas en distintos
tiempos dentro de esta fase, el valor
no cambia sustancialmente. En
cambio, interiormente las clulas
trabajan activamente adaptando el
equipo enzimtico al medio de cultivo.
La bacteria se prepara para hacer
uso de los nutrientes que este medio
le aporta, por lo tanto es la fase de
adaptacin al medio, con aumento de
la masa celular pero no del nmero
de clulas. La edad del inculo va a
influir en el tiempo de latencia en el
medio fresco debido a la acumulacin
de materiales txicos y a la falta de
nutrientes esenciales dentro de la
clula durante el crecimiento anterior.
En general, inculos viejos alargan la
fase de latencia.

Figura 2. Curva de crecimiento de

una poblacin bacteriana.
Pasado este perodo, el cultivo entra
en la denominada fase de crecimiento

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exponencial, donde la velocidad de

crecimiento es mxima.
La velocidad de crecimiento que
alcanza un cultivo, depende del tipo
de microorganismo que se trate y
diversos factores ambientales como
son
la
temperatura,
el
pH,
oxigenacin, etc.
La
velocidad
de
crecimiento
comenzar a disminuir hasta hacerse
nula cuando alcance la fase
estacionaria, ya que cambios en la
composicin y concentracin de
nutrientes entre el cultivo del inculo
y
el
medio
fresco
pueden
desencadenar el control y la
regulacin de la actividad enzimtica.
Esta
fase
se
presenta
por
agotamiento del suministro de algn
nutriente esencial o por acumulacin
de productos metablicos que sean
txicos. Tambin puede ser por la
disminucin de la oxigenacin o
cambios en las condiciones de pH del
medio de cultivo (acidificacin o
alcalinizacin):
En esta fase se equilibran el nmero
de clulas nuevas con el nmero de
clulas que mueren.
Por ltimo, el cultivo entra en la fase
de muerte, en la que el nmero de
clulas que mueren se va haciendo
mayor.
Mtodos de medicin del crecimiento
El crecimiento se evala haciendo
mediciones sucesivas en tiempos
determinados de la poblacin en
estudio. En cada momento se evala
cual es la poblacin en ese instante.
Existen diversas formas de evaluar
una poblacin bacteriana.

A. Conteo microscpico directo

Es una tcnica comn, rpida y
barata que utiliza un equipamiento
fcilmente
disponible
en
un
laboratorio de microbiologa, ya que
consiste
en
contar
con
un
microscopio la cantidad de clulas
presentes
en
un
volumen
determinado.
Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos (
cmara de Petroff Hauser, cmara de
Neubaver Fig. 3-). Una de las
mayores ventajas del recuento
microscpico es brindar informacin
adicional sobre el tamao y la
morfologa de los objetos contados La
muestra puede utilizarse tal cual,
(leche, o cultivos puros en medio
lquido), o puede prepararse una
dilucin.

Figura 3.. Camara de Neubaver

Para hacer el conteo se procede de la
siguiente manera. Si se posee una
cmara dividida en 25 cuadrados. El
rea de los 25 cuadrados es
conocida, como tambin el volumen
de muestra que esta rea admite.
Contando el nmero de bacterias
presentes en los cuadrados (o
algunos de ellos) se puede conocer
cuanto hay en volumen conocido.
Suponiendo 50 bacterias en 25
cuadrados, y sabiendo que los 25
cuadrados corresponden a 0,02 mm3.

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que las condiciones ptimas de

conteo se dan cuando desarrollan
entre 30 y 300 colonias.

B. Conteo de clulas viables

El
mtodo
se
basa
en
la
consideracin que el crecimiento
implica
el
aumento
de
los
microorganismos capaces de formar
colonias.
Este mtodo puede hacerse con
medios slidos o lquidos. El mtodo
ms frecuentemente empleado es el
conteo en placas (medios slidos)
formando colonias.
Por lo tanto se determinan por este
mtodo slo las clulas microbianas
viables en las condiciones de trabajo
(nutrientes, atmsfera, temperatura).
Para ello se siembra una cantidad
conocida de la suspensin bacteriana
cuyo nmero se desea conocer. En
un medio slido cada bacteria se
multiplicar formando una colonia
visible a simple vista que puede ser
contada. Como las colonias pueden
originarse tanto de una clula como
de un grupo de clulas, se utiliza el
trmino: unidades formadoras de
colonias (u.f.c.), y esto puede
constituir una desventaja ya que si
dos bacterias no se separan darn
una sola colonia, subestimando de
esta
forma
el
nmero
de
microorganismos en la suspensin.
Adems, a los efectos de que todas
las clulas que queden en una placa
tengan una adecuada disponibilidad
de nutrientes, y que los errores del
mtodo sean menores, se establece

Conteo microscpico directo por el

mtodo de Breed:
Un volumen
conocido
de
la
muestra
(generalmente 0.01 ml) se extiende
sobre un portaobjetos normal en una
superficie conocida. Se examina en
un microscopio calibrado, donde se
conoce el dimetro del campo
microscpico. Se cuentan las clulas
en diversos campos. Se obtiene el
valor medio de clulas por campo y
se multiplica por el nmero de
campos
microscpicos
comprendidos en la preparacin. El
resultado corresponde al nmero de
clulas
en el volumen extendido
(0.01 ml). Multiplicando este valor por
100 se obtiene el nmero total de
organismos por ml o por gramo de
muestra.
D. Conteo turbidimtrico: En una
suspensin microbiana, la cantidad
de
clulas
est
directamente
relacionada con la turbiedad o
densidad ptica de la misma e
inversamente relacionada con la
cantidad de luz que pasa a travs de
ella. Esto permite determinar con
bastante exactitud la cantidad de
microorganismos en la suspensin
mediante la determinacin de la
turbiedad mediante un nefelmetro o
un espectrofotmetro. Los resultados
se comparan con una curva estndar
construida con una suspensin
testigo
de
concentraciones
conocidas. La turbiedad que resulta
en la suspensin microbiana se

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aproxima a la producida por un cierto

nmero de clulas en suspensin.
Esta tcnica es til solamente para
organismos unicelulares de pocos
mm, como las bacterias, lo que les
permite mantenerse suspendidos y
homogneamente distribuidos.
Contadores electrnicos:
Se hace
pasar un volumen conocido de la
muestra con microorganismos a
travs de un orificio de 5 a 10 mm de
dimetro, mediante manipulacin con
una micropipeta de mercurio. La
resistencia elctrica a travs del
orificio est normalizada y se altera
cada vez que un microorganismo
pasa a travs de l. La modificacin
de la resistencia se amplifica y se
registra electrnicamente.
E. Mtodos de conteo en medio de
cultivo: Mediante cultivo de la
muestra, se detectan nicamente las
clulas vivas. En todos los casos se
parte de un volumen o peso de
muestra conocido. Conociendo la
procedencia de la muestra se puede
esperar la obtencin de cuentas bajas
o altas o incluso ausencia de
organismos. Si se esperan pocos
microorganismos, las muestras se
pueden centrifugar o filtrar. Si se
esperan cuentas altas, se puede diluir
la muestra en cantidades conocidas
del diluyente, utilizando solucin
salina, agua peptonada u otros.
.
F.Otros mtodos: Determinacin del
peso
seco,
determinacin
del
nitrgeno en las clulas cultivadas,
medicin de actividades bioqumicas.
Metodologa
1.
Conteo
directo
de
bacterias al microscopio
mtodo de Breed

En un portaobjetos limpio y
desengrasado, se marc un
rea de 2 cm2 ,se deposit
0.01 mL de un cultivo y se
extendi en toda el rea
marcada del portaobjetos y
se
dej
secar
a
temperatura ambiente. Se
fij con calor y se tio con
azul de metileno, se lav
con agua y se dej secar a
temperatura ambiente, se
coloc al microscopio se
enfoc y se observ a 100X
y se comenz a contar el
nmero de bacterias.
2.

Conteo bacteriano por el

mtodo
de
las
disoluciones y vaciado en
placa

Se prepar un tubo de ensaye con 9

mL de diluyente estril, despus se
tom una caja de petri vaca y estril,
posteriormente se tom 10 mL de una
bacteria con una pipeta y se coloc
junto con el diluyente estril, luego se
tap el tubo y se agito. Esta qued
1:10 y despus se realiz un estriado
en una caja petri y se procedi a
contar el nmero de colonias ms
grandes.
3.

Conteo bacteriano por el

mtodo
de
las
disoluciones y vaciado en
placa

Se prepararon 7 tubos de ensayo de

16 x 150 mm con 9 ml de diluyente
estril cada uno y se marcaron(agua
peptonada al 0.1 % o una solucin

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salina isotnica). Se marcaron 7 cajas

de Petri vacas estriles con los
mismos nmeros de las diluciones.
Se hicieron duplicados con otras 7
cajas. En condiciones estriles se
tomaron 10 ml de una suspensin
bacteriana de E. coli, y con una
pipeta estril y se depositaron en el
frasco con diluyente. El frasco fue
tapado con la muestra y se agito
vigorosamente, aproximadamente 25
veces. Esta fue la dilucin 1:10. Con
una nueva pipeta estril se tom 1 ml
y fue transferido al tubo de la dilucin
1:100, mezclando en igual forma. Con
una nueva pipeta fueron distribuidas
alcuotas de 1 ml al tubo de la
dilucin 1:1000 y a las dos cajas de
Petri correspondientes marcadas. Se
repitio el procedimiento mezclando
bien la dilucin 1:1000 y con una
nueva
pipeta
se
distribuyeron
alcuotas al tubo de la siguiente
dilucin
y
sus
dos
cajas
correspondientes
y
as
sucesivamente con las siguientes
diluciones. Enseguida se adicionaron
a cada caja aproximadamente 20 mL
de medio de cultivo previamente
fundido y mantenido a 50C. Al tapar
cada caja, se mezcl el contenido
muy cuidadosamente, rotando la caja
suavemente sobre la mesa, para que
no se derramara el lquido. Se dej
solidificar a temperatura ambiente e
incube 24 horas a 37C.
1. Curva de crecimiento
Se sembr 0.1 mL de un cultivo de
Escherichia coli en 12 tubos con 10
mL de caldo nutritivo, se incubaron
todo los tubos a 37C. Cada hora se
sac un tubo y se colocaba en el
refrigerador. Al concluir todos los
tubos con la ayuda de un
fotocolormetro
(Fig.
1)
se

determinaron
los
valores
de
absorbancia de cada tubo y se traz
una curva de crecimiento.
Resultados
1. Conteo directo de bacterias
al microscopio mtodo de
Breed (conteo que incluye
clulas vivas y muertas)

Realizamos clculos para poder

determinar cul es el resultado total
de las bacterias:
2
5

D=

= 0.4 mm

r = 0.2 mm
A = r2 = 0.1256 mm
1 Campo 480 bacterias
2 Campo 365
3 Campo 200
4 campo 200
5 campo 200
Total de bacterias 1795
=

1795
5

= 359 bacterias

Entonces 1 campo = 359 bacterias

Areatotal
areadel campo

20 mm2
0.1256 mm2

159.23 campos en 20 mm2

campos
159.23
=
= 0.0887
bacterias
1795
Bacterias/ mL
0.0887 * 1000000 = 88 700 bacterias

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2. Conteo bacteriano por el

mtodo de las disoluciones

y vaciado en placa recuento

de clulas bacterianas vivas

Bacterias

El resultado obtenido fue de 438

000000 colonias de bacterias en la
caja petri
3. Conteo bacteriano por el
mtodo de las disoluciones
y vaciado en placa recuento

Abs

2
1
0

Tiempo

de clulas bacterianas vivas

El tercer mtodo fue exactamente lo

mismo pero con una solucin a
1:1000000 el resultado fue muy
similar al del mtodo 2 es este se
contabilizo de igual forma y es
resultado fue de 478 000000 colonias
de bacterias por caja petri.
4. Curva de crecimiento
A continuacin se muestra una tabla
del proceso que se llevo a cabo para
poder determinar la curva de
crecimiento
Bacterias
0.18
0.65
1.20
1.11
1.45
1.49
1.47
1.53
1.37
1.44
1.61

Tiempo
9:00
10:00
11:00
12:00
1:00
2:00
3:00
4:00
5:00
6:00
7:00

Tabla 1. Crecimiento bacteriano de acuerdo al

tiempo de incubacin.

Despus de realizar esta tabla se

realiz la la curva de crecimiento
(grafica 1).

Bacterias

Grafica 1. Crecimiento bacteriano en funcin del

tiempo incubado.

Discusin
El conteo de bacterias es muy
importante porque con esto se puede
saber que tan rpido pueden crecer
las bacterias y en cuanto tiempo lo
hacen. La mayora de los resultados
obtenidos fue aceptable ya que
coinciden
con
la
bibliografa
consultada exceptuando la curva de
crecimiento.
La curva usual de crecimiento
bacteriano describe las diversas
etapas del crecimiento del cultivo de
una cepa pura de bacterias dentro de
una caja de Petri (Figura 2).La curva
de
crecimiento
que
expresan
nuestros datos no coincide con la que
maneja la bibliografa consultada.
Nuestra curva es diferente por
diversos factores:
Uno de ellos es que los tubos que
contenan a la bacteria no se
cambiaron a la hora que se debi de
cambiar, otro de ellos es que se debi
de haber dejado incubar por ms
tiempo
los
tubos
(24horas
completas), as se podra observar de
mejor forma las diferentes etapas de
la curva.

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Conclusin
El crecimiento es un componente
esencial de la funcion microbiana, ya
que en la naturaleza cualquier celula
tiene un periodo de vida finito y la
especie se mantiene como resultado
del crecimiento continuo de la
poblacion. Ademas de la comprensin
de los aspectos bsicos del
crecimiento
microbiano,
muchas
situaciones practicas hacen necesario
el control del crecimiento microbiano.
El conocimiento de como las

poblaciones bacterianas se amplifican

rpidamente es muy til para el
diseo de mtodos de control del
crecimiento microbiano.
Bibliografa
1. Madigan et al. Biologia de los
microorganismos.
Editorial
Pearson educacin. Madrid.
2004. Pp137-150
2. Crecimiento
bacteriano
(http://www.fca.uner.edu.ar/ac

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ademicas/deptos/catedras/mi
crobiologia/unidad_3_crecimie
nto_bacteriano.pdf)
Recuperado 03/10/13.