Staphylococcus

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
APLICACION DE MARCADORES EPIDEMIOLOGICOS

EN
LA
EVALUACION
AISLAMIENTOS
DE
MICROBIOLOGICA
Staphylococcus
DE
sp.
COAGULASA NEGATIVOS EN HEMOCULTIVOS
TESIS DOCTORAL
M Teresa Boquete Blanco

Madrid, 1996
A la memada de mi hermano Jos Agustn

A mi hijo Jos Agustn
A mi hermano David
A mis padres
II
Esta tesis ha sido realizada en el Servicio de Bacteriologa del Centro

Nacional de Microbiologa, Virologa e Inmunologia Sanitarias del Instituto
de Salud Carlos III por M8 Teresa Boquete Blanco, bajo la direccin del Dr.
Juan Antonio Sez Nieto, Jefe del referida Servicio y ha tenido como
ponente a la Dra. Josefina Rodrguez de Lecea, Profesora Titular del
Departamento de Microbiologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la
Universiada Complutense de Madrid.
El Director
Dr. Juan
I5
Sez Nieto
Fdo. M~ Teresa ~uete Blanco
III
AGRADECIMIENTOS
La realizacin de esta tesis ha sido posible gracias a la colaboracin

de numerosas personas y a todas ellas quiero expresar mi agradecimiento.
De una forma muy especial al Dr. Juan Antonio Sez Nieto, que fue
la persona que me abri las puertas del mundo de la microbiologa y gracias
a su inestimable apoyo y estmulo consigui animarme a realizar este
trabajo.
A la Dra. Rodrguez de Lecea, por haber accedido a ser la ponente de
esta tesis.
Al Dr. Oscar del Valle y a la Dra. Planes, microbilogos hospitalarios
que me proporcionaron la materia prima con la que fue posible que esta
tesis se Ilevara a cabo.
Al Central Public Health Laboratory, y en particular al Dr. Pitt porque
gracias a ellos aprend la metodologa de la electroforesis en campo
pulsado.
A la Dra. Ana Vindel, por todos los consejos y ayuda incondicional
que me ha ofrecido a lo largo de todos estos aos.
A mis compaeras Pilar Trincado, Eloisa Gomez y Luisa Azaedo por
ofrecerme todo su apoyo y ayuda en los momentos que ms lo necesitaba.
IV
A la Dra. Pilar Aparicio, por ser una fuente inestimable de consejos
y por aportarme la visin clnica necesaria para abordar la problemtica
planteada en esta tesis.
A mi amiga Paloma Rius por revisar la expresin literaria de esta
tesis, pero especialmente porque siempre he podido contar con ella.
A mi amiga Dolores Vicioso, porque cuando las fuerzas ya me hablan
abandonado estuvo conmigo para echarme una mano.
A todos mis compaeros del Servicio de Bacteriologa y en particular
a aquellos que de una manera u otra siempre estuvieron disponibles cuando
los necesit: Laura de la Fuente, Sonsoles Berrn, Julio Vzquez, Elena
Martn, Pedro Anda, Manuela de la Fuente, Miguel Angel Usera, Aurora
Echeita
Carmen Pelaz y Asuncin Fenol.
A mis padres y hermano porque, sin lugar a duda, unto con mi hijo
fueron los que ms soportaron mis momentos de irascibilidad y mal humor
cuando el trabajo no se desarrollaba segn yo esperaba.
Y muy especialmente a mi hijo por todas las horas que no pude estar
junto a l.
y
iNDICE GENERAL
Pgina
x
xi
NDICE DE TABLAS
NDICE DE FIGURAS
1INTRODUCCiN
1.1
1.2
1.3
REVISIN HISTRICA DEL GNERO STAPHYLOCOCCUS

SIGNIFIcACIN CLiNICA DE LOS ESTAFILOCOCOS
COAGtJLASA NEGATIVOS <ECN>
1.2.1 DESCUBRIMIENTO DEL POTENCIAL PATGENO DE LOS ECN
1.2.2 ECN ASOCIADOS A INFECCIONES HUMANAS
IMPLICACIN DE LOS ECN EN LA INFECCIN NOSOCOMIAL
1.3.1 CRITERIOS UTILIZADOS PARA DETERMINAR EL AGENTE
ETIOLGICO DE LA INFECCIN NOSOCOMIAL
1.3.2 EPIDEMIOLOGA DE LA INFECCIONES NOSOCOMIALES
Prevalencia de Las infecciones nosomiales
a)
b)
Distribucin de los distintos tipas de infecciones
rosocomiales
c>
8
9
13
13
16
16
18
Distribucin de los principales microorganismos

patgenos implicados en la infeccin nosacomial
1.4
23
UTILIDAD EPIDEMIOLGICA Y CLNICA DE LOS MTODOS

DE TIPIFICACIN
25
1.4,1
CRITERIOS PARA EVALUAR UN SISTEMA DE TIPADO
25
1.4.2
CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE TIPIFICACIN
26
a) Tcnicas fenotpicas
27
a.1> Identificacin
27
a.2> Biotipia
30
a.3) Antibiotipia
30
a.4) Serotipia
31
a.5) Fagotipia
a.6) Anlisis electrofortico de proteinas
31
b) Tcnicas genotrpicas
32
33
b.1) Plasmidotipia
33
b.2) Anlisis molecular de plsmidos
34
b.3) Anlisis del polimorfismo de los

fragmentos de restriccin
34
VI
b.4) Southern blot de la huella gentica DEL ADN
cromosmico
b.5) Ribotipia
36
b.6) Electroforesis en campo pulsado
37
b.7) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
38
OBJEUVOS
MATERIAL Y MTODOS
3.1
40
42
AISLADOS
43
3.1.1
PROCEDENCIA DE LOS AISLADOS
3.1.2
ASPECTOS CLNICOS
43
a) Pacientes
43
b Casos y episodios
44
o) Valoracin crnica de los distintos casos
44
CRECIMIENTO Y CONSERVACIN
55
3.1.3
3.2
35
43
IDENTIFICACIN
55
3.2.1
ESTUDIO MORFOLGICO Y PRODUCCIN DE PIGMENTO
55
3.2.2
ACTIVIDAD COAGULASA
56
3.2.3
NUCLEASA TERMOESTABLE
56
3.2.4
ACTIVIDAD HEMOLTICA
57
3.2.5
ACTIVIDAD DESOXIRRIBONUCLEASA (DNAsa)
57
3.2.6
ACTIVIDAD UREASA
57
3.2.7
ACTIVIDAD DECARBOXILASA
58
3.2.8
ACTIVIDAD FOSFATASA
58
3.2.9
PRODUCCIN DE ACETILMETILCARBINOL (ACETOINA)
59
3.2.10 REDUCCIN DE NITRATOS
59
3.2.11 FERMENTACIN DE HIDRATOS DE CARBONO
60
3.2.12 SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
61
3.2.13 PRODUCCIN DE CIDO A PARTIR DEL GLICEROL

AERBICAMENTE EN PRESENCIA DE ERITROMICINA
3.3
61
FAGOTIPIA
3.3.1
PROPAGACIN DEL JUEGO DE FAGOS DE DEAN Y WILLIAMS

Y DEL JUEGO OBTENIDO EN EL C.N.M.V.I.S
62
a) Determinacin del RTD
62
b) Propagacin en medio semislido
63
o) Espectro ltico
63
VII
3.3.2
67
a) Realizacin
67
b Lectura de resultados
67
ci Interpretacin de los resultados
68
cl) Controles
68
3.4
TCNICA DE FAGOTIPIA INVERSA
70
3.5
TCNICA DE FISK
70
3.6
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
71
3.6.1
AGENTES ANTIMICROBIANOS PROBADOS
71
3.6.2
MEDIO. INOCULACIN Y DETERMINACIN DE LA
3.7
3.8
TCNICA DE FAGOTIPIA
...
CONCENTRACIN MIMIMA INHIBITORIA (CMI)
72
3.6.3
CONTROLES
72
3.6.4
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
73
...
PLASMIDOTIPIA
74
3.7.1
PREPARACIN DE LOS LISADOS
74
3.7.2
ELECTROPORESIS DEL AON PLASMIDICO
3.7.3
CONTROLES
75
..
75
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO
76
3.8.1
OBTENCIN DEL ADN
76
3.8.2
DIGESTIN DEL ADN
77
3.8.3
ELECTROFORESIS
77
3.8.4
ANLISIS ESTADSTICO DE LOS DATOS
78
APNDICE: MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
79
RESULTADOS
94
4.1
VALORACIN DE LOS DATOS CLNICOS DE LOS CASOS ESTUDIADOS
....
95
4.1.1
SELECCIN DE LOS AISLADOS
95
4.1.2
ORIGEN DE LOS AISLADOS
95
4.1 .3
CARACTERSTICAS CLNICAS DE LOS PACIENTES
95
4.1.4
VALORACIN CLNICA DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS POR ECN. 96
4.1.5
DISTRIBUCIN POR REAS DE LOS CASOS

DE BACTERIEMIAS ESTUDIADOS
96
4.2
IDENTIFICACIN DE LOS AISLADOS
97
4.3
ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE FAGOTIPIA
99
4.3.1
PROPORCIN DE TIPABILIDAD
99
4.3.2
PATRONES OBTENIDOS POR FAGOTIPIA CON EL

JUEGO DE FAGOS COMBINADO
100
VIII
4.4
4.5
4.3.3
FRECUENCIAS DE PATRONES DE FAGOTIPIA
102
4.3.4
FRECUENCIAS DE REACCIN DE LOS PAGOS
102
ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE FAGOTIPIA INVERSA
104
..
4.4.1
104
4.4.2
PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
104
4.4.3
FRECUENCIA DE PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
106
..
UTILIZACIN DE UN JUEGO DE PAGOS ADICIONALES PARA LA

TIPIFICACIN DE LOS ECN
107
4.5.1
107
4.5.2
PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON EL JUEGO

DE FAGOS ADICIONALES
4.6
4.7
107
ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA TCNICA DE FISK
108
4.6.1
108
4.6.2
PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON LA TCNICA DE FISK
..
108
EVALUACIN DE LAS TCNICAS DE FAGOTIPIA EN LA

CARACTERIZACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS
109
4.8
SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
110
4.9
CARACTERIZACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS MEDIANTE
4.10
4.11
LA APLICACIN DE MARCADORES FENOTPICOS
115
ANLISIS PLASMDICO
116
4.10.1 NMERO DE PLSMIDOS PRESENTES EN LOS AISLADOS
116
4.10.2 TAMAO DE LOS PLSMIDOS
117
4.10.3 PERFILES PLASMDICOS
119
121
4.11.1 DETERMINACIN DE LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN PTIMA
121
4.11.2 DETERMINACIN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS
121
4.11.3 PERFILES DE RESTRICCIN OBTENIDOS POR

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFGE)
4.12
VALORACIN MICROBIOLGICA DE LOS CASOS
123
130
4.12.1 CRITERIOS SEGUIDOS EN EL LABORATORIO PARA

DETERMINAR CUANDO DOS CEPAS SON IGUALES
131
4.12.2 DESCRIPCIN DE LAS DISTINTAS SITUACIONES

ENCONTRADAS AL VALORAR LOS CASOS DESDE
UN PUNTO DE VISTA MICROBIOLGICO
142
4.12.3 PORCENTAJE DE CASOS EN LOS QUE CON LA APLICACIN

SUCESIVA DE LOS MARCAORES EPIDEMIOLGICOS SE HAN
PODIDO ESTABLECER SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ENTRE
AISLADOS DE UN MISMO PACIENTE
144
lx
4.13
COMPARACIN ENTRE LA VALORACIN CLNICA

Y LA VALORACIN MICROBIOLGICA
145
DISCUSIN
148
5.1
VALORACIN DE LOS DATOS CLNICOS DE LOS CASOS ESTUDIADOS
5.2
VALORACIN DE LOS MARCADORES FENOTPICOS
....
EN EL ANLISIS DE LOS AISLADOS DE ECN
151
5.2.1
ANLISIS DE LOS AISLADOS POR FAGOTIPIA
151
5.2.2
ANLISIS DE LOS AISLADOS POR FAGOTIPIA INVERSA
155
5.2.3
ANLISIS DE LOS AISLADOS POR FAGOTIPIA CON EL

JUEGO DE FAGOS ADICIONALES
156
5.2.4
ANLISIS DE LOS AISLADOS POR LA TCNICA DE FISK
156
5.2.5
ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LOS AISLADOS A LOS

ANTIMICROBIANOS
5.3
157
VALORACIN DE LOS MARCADORES FENOTIPICOS EN LA CARACTERIZACIN

DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS
5.4
160
VALORACIN DE LOS MARCADORES GENOTIPICOS EN EL ANLISIS DE LOS

AISLADOS DE ECN
161
5.4.1
ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE PLASMIDOTIPIA
161
5.4.2
ANLISIS DEL ADN DE LOS AISLADOS MEDIANTE

5.5
165
VALORACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS EN BASE A

LOS DATOS MICROBIOLGICOS Y CLNICOS
5.5.1
168
VALORACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS

EN BASE A LOS DATOS MICROBIOLGICOS
5.5.2
168
COMPARACIN ENTRE LA VALORACIN MICROBIOLGICA Y

CLNICA DE LAS BACTERIEMIAS RELACIONADAS CON ECN
5.6
150
ESQUEMA JERARQUIZADO PARA LA CARACTERIZACIN DE LOS ECN
174
....
175
CONCLUSIONES
178
BIBLIOGRAFA
182
INDICE DE TABLAS
Tabla
Pgina
GNERO
1.
HISTORIA EVOLUTIVA DEL
2.
ECN Y SU FRECUENCIA DE APARICIN EN CLNICA
12
3.
DISTRIBUCIN DE LAS INFECCIONES SEGN LOS SERVICIOS
22
4.
DESCRIPCIN Y VALORACIN CLNICA DE LOS CASOS
45
5.
ESPECTRO LfTICO DE LOS FAGOS DEL JUEGO DE DEAN Y WILLIAMS
65
6.
ESPECTRO LTICO DE LOS FAGOS AUTCTONOS
66
7.
PATRONES DE FAGOTIPIA DE LAS CEPAS CONTROL
69
8.
ANTIBITICOS Y RANGOS DE CONCENTRACIONES WIml)
71
9.
VALORES ESTANDAR DE CMI (ji/m> <NNCLS, 1993>
73
10.
PATRONES DE PAGOTIPIA CON EL JUEGO DE FAGOS COMBINADOS
101
11.
FRECUENCIAS DE PATRONES DE FAGOTIPIA
102
12.
PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
105
13.
FRECUENCIA DE PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
106
14.
PATRONES DE PAGOTIPIA CON EL JUEGO DE PAGOS ADICIONALES
108
15.
PATRONES OBTENIDOS CON LA TCNICA DE FISK
109
16.
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ECN
111
17.
PATRONES DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS
112
18.
PROPORCIN DE AISLADOS EN RELACIN AL NMERO DE PLSMIDOS
116
19.
PORCENTAJE DE PLSMIDOS SEGN SU TAMAO

N0 DE AISLADOS EN LOS DISTINTOS PERFILES PLASMDICOS
117
119
COEFICIENTE DE SIMILITUD DE SORENSEN
128
22.
VALORACIN MICROBIOLGICA DE LOS CASOS
133
23.
CARACTERIZACIN DE LOS CASOS ESTABLECIENDO SIMILITUDES Y
20.
21.
STAPHVLOCOCCUS
DIFERENCIAS ENTRE AISLADOS DE UN MISMO ENFERMO MEDIANTE

LA APLICACIN DE MARCADORES EPIDEMIOLGICOS
24.
145
VALORACIN DE LOS MARCADORES EPIDEMIOLGICOS

EN EL ESTUDIO DE LOS ECN
176
xl
INDICE DE FIGURAS
Figura
Pgina
1.
ESTUDIOS HOSPITALARIOS DE PREVALENCIA DE INFECCIONES NOSOCOMIALES
2.
DISTRIBUCIN DE LOS DISTINTOS TIPOS DE INFECCIN NOSOCOMIAL

EN LOS AOS 1990-1992
3.
97
DISTRIBUCIN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES DE ECN AISLADAS

EN LOS HEMOCULTIVOS ESTUDIADOS
7.
24
DISTRIBUCIN POR REAS DE ASISTENCIA DE LOS CASOS DE

BACTERIEMIAS EN LOS QUE SE AISLARON ECN
6.
20
DISTRIBUCIN DE LOS PRINCIPALES PATGENOS IMPLICADOS EN

LAS INFECCIONES NOSOCOMIALES (INFORMES EPINE Y NNIS)
5.
19
EVOLUCIN DE LA DISTRIBUCIN DE LOS DISTINTOS TIPOS

DE INFECCIONES NOSOCOMIALES NNIS 1980-1992
4.
18
98
PROPORCIN DE AISLADOS CARACTERIZADOS POR FAGOTIPIA AL

APLICAR LOS DISTINTOS JUEGOS DE FAGOS
100
8.
FRECUENCIA DE REACCIN DE LOS FAGOS DEL JUEGO COMBINADO
103
9.
PROPORCIN DE AISLADOS CARACTERIZADOS POR FAGOTIPIA INVERSA
106
10.
CARACTERIzACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS MEDIANTE

LAS DISTINTAS TCNICAS DE FAGOTIPIA
110
11.
CASOS CARACTERIZADOS CON MARCADORES FENOTPICOS
115
12.
PERFILES PLASMDICOS DE ECN AISLADOS DE HEMOCULTIVOS

DE DIFERENTES PACIENTES
118
13.
ESQUEMA DE LOS PERFILES PLASMDICOS
120
14.
PERFILES OBTENIDOS POR CAMPO PULSADO PARA SELECCIONAS

LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN
122
15.
ESQUEMA DE LOS PERFILES OBTENIDOS POR PFGE
124
16.
DENDOGRAMA DE LOS PERFILES ELECTROFORTICOS
127
17.
PERFILES ELECTRODORTICOS DE CEPAS DE ECN PERTENECIENTES

A DISTINTOS CASOS
129
INTRODUCCIN
1.-INTRODUCCIN
INTRODUCCIN
1.1.- REVISIN HISTRICA DEL GNERO STAPHYLOCOCCUS

Han transcurrido ms de 100 aos desde que por primera Vez fueron
observados cocos en heridas y en pus procedente de abscesos humanos.
Pero hasta 1880, fecha en la que Alexander Ogston publica sus datos
donde mostraba la existencia de numerosas infecciones piognicas
Causadas por cocos, no se empieza a utilizar el trmino Staphy/ococcus,
nombre derivado de las palabras griegas staphy/e
y coccus cuyo
significado etimolgico es, respectivamente, racimo de uvas y grano.

Rosenbach en 1884, fue probablemente la primera persona que
creci e) estafilococo en un cultivo puro y que estudio sus caractersticas
en e) laboratorio. Observ que los aislados formaban dos tipos de colonias,

nicamente diferenciables por el color: naranjas y blancas. Propuso el
nombre
de
Staphy/ococcus pyogenes aureus para
la
primera
Staphylococcuspyogenes a/bus para la segunda.

Winslow y Winslow, en
1908,
Clasificaron los estafilococos cuyas
colonias eran naranjas dentro del gnero Aureococcus y los de colonias

blancas dentro
del gnero Albococcus,
describiendo al Albococcus
epidermidis. Posteriormente en 1920, Winslow y colaboradores incluyeron

Staphylococcus en la familia Micrococcaceae.
Hucker en 1948, al realizar la
revisin
de la sexta edicin del Manual
de Bergey concluy que los estafilococos y micrococos no eran distintos,

dio prioridad al nombre genrico de Micrococcus e incluy
a los
estafilococos dentro de ste gnero, a pesar de que el manual haba

reconocido al gnero Staphy/ococcus en todas sus ediciones anteriores,
desde la primera a la quinta (1939>. En este mismo ao, Abd-EI-Malek y
Gibson (1948> llamaron al grupo de estafilococos y micrococos complejo
Stap/iy/ococcus-Micrococcus, considerando a los estafilococos como

patgenos y a los micrococos como saprofitos.
INTRODUCCIN
En 1955, Evans y cols. propusieron separar estos organismos

basndose en la necesidad de oxgeno para su crecimiento. Situaron las
especies que eran aerobias facultativas en el gnero Staphy/ococcus y las
aerobias estrictas en el gnero Micrococcus. Esta clasificacin fue aceptada
por Breed y cols. en la sptima edicin del Manual de Bergey (1957> siendo
posteriormente confirmada por Baird-Parker (1963, 1965>.
En la sptima edicin del Manual de Bergey <1957> se reconocan dos
especies de estafilococos: Staphy/ococcus aureus <coagulasa positivo y con
capacidad de fermentar el manito y Staphy/ococcus epidermdis (negativo
a ambas pruebas>. El uso de la taxonoma numrica en 1959 indic que los
estafilococos coagulasa positivos constituan un grupo homogneo,

mientras que los estafilococos coagulasa negativos no
lo eran (Hill, 1959>.
Baird-Parker (1963), fue el primero en reconocer tipos especficos

dentro del grupo heterogneo de los estafilococos coagulasa negativos.
Dividi a los estafilococos en seis subgrupos basndose en pruebas

fisiolgicas y bioqumicas; as, el subgrupo 1 contena la especie S.aureus:
coagulasa y fosfatasa positivas que generalmente producan cido a partir
de manitol aerbica y anaerbicamente; los subgrupos II hasta VI contenan
una nica especie: S. epidermidis, que se diferenciaba en la produccin de
fosfatasa y acetoina, as como en la capacidad de producir cido
aerbicamente a partir de la lactosa, maltosa y manitol. En 1965, BairdParker defini a los subgrupo del II hasta el VI como biotipos del 1 al 5, e
indic que la mayora de estos biotipos mereceran tener el rango de
especes.
Los criterios que hasta 1965 haban sido utilizados para distinguirlos
miembros del gnero Staphy/ococcus de los del gnero Micrococcus
<capacidad de crecimiento anaerbico y fermentacin de la glucosa en un
medio peptonado con extracto de levadura> fueron ampliamente criticados
por autores como Klesius y Schuardt (1968>, Auletta y Kennedy <1966>,
Mortensen y Kocur (1967> y Gibson (1967), quienes argumentaban la
existencia de cocos Gram y catalasa positivos con dbil crecimiento
INTRoDUCCION
anaerbico y fermentacin lenta de la glucosa. An a pesar de sus crticas

estos autores estaban de acuerdo en la separacin de ambos gneros; as,
mientras Klesius y Schuardt (1968> argumentaban dicha separacin
basndose en la distinta susceptibilidad a la lisostafina, Auletta y Kennedy
<1966) y Mortensen y Kocur (1967> la apoyaban en base al distinto

contenido en guanina y citosina del ADN de la especies pertenecientes a
ambos gneros.
En
la octava
edicin
del
Manual de
Bergey,
Micrococcus
saprophyticus fue transferido al gnero Staphylococcus. En esta misma

edicin, basndose en la produccin de acetoina, actividad fosfatasa y
produccin anaerbica de cido a partir de la lactosa, maltosa y manitol, se
reconocen tres especies de Staphy/ococcus: 3. aureus,
biotipos 1-4, y
S.
3.
epidermdis,
saprophyticus, biotipos 4.
Una vez separados ambos gneros (por el contenido de guaninacitosina de su ADN, la composicin de la pared celular, la susceptibilidad
a la lisostafina, el crecimiento en un medio de tioglicolato semislido y la
produccin
aerbica de cido a partir de glicerol), los taxnomos empezaron
a disear esquemas que permitan dividir cada gnero. De este modo,

Schleifer y Kloos <197%> y
Kloos y Schleifer (1975a> publicaron sus
estudios taxonmicos de las cepas estafiloccicas aisladas de piel humana,

describiendo en base a sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y
bioqumicas, siete nuevas especies de coagulasa negativos llamadas: 3.
cohnii, 5. haemo/ytcus, 5. xy/osus, 3. warneri, 3. capitis, 3. homnis y 3.

simu/ans.
Simultneamente a la descripcin de estas nuevas especies, Kloos
y Schleifer (1975b> propusieron un esquema simplificado para la
identificacin rutinaria de los estafilococos basado en una seleccin de
diversos caracteres bioqumicos.
Una nueva especie, S.sciuri, fue descrita por Kloos y cols (1976>, la
cual contiene dos subespecies sc/un y lentus.
Mcrococcus
hycus fue aislado por Sompolinsky <1953> de
INTRODUCCIN
exudados de piel en cerdos y fue transferido al gnero Staphylococcus por

Baird-Parker en 1963. Devriese y cols. (1978> subdividieron la especie
3.
hyicus en dos subespecies: hyicus y chromogenes, aunque sta ltima
fue considerada posteriormente como una nueva especie (Hek y

cols.,1986>.
Hjek (1976>, describe la especieS. intermedius aislada de nariz de
palomas, visones, caballos y focas.
En las dcadas de los aos 80 y los 90 es donde tiene lugar la
descripcin de una gran cantidad de nuevas especies de estafilococos
coagulasa negativos. As
Skerman y cols., en 1980, determinan la
existencia de trece especies dentro del gnero Staphylococcus.

El sistema de clasificacin propuesto por Kloos y Schleifer (1975b>
para estafilococos de origen humano fue aplicado ms tarde a aislados de
origen animal. De este modo se identificaron las siguientes especies:
3.ga//narum yS. caprae (Devriese y cols., 1983>, 3./entus <Schleifer y cols.,
1983J, 3. carnosus <Schleifer y Fischer, 1982>, 3. caseo/yticus <Schlefer
y cols., 1982>.
Una nueva especie, S.auricu/aris, fue aislada del hombre <Kloos y
Schleifer, 1983> y el organismo anaerbico Peptvcoccussaccharo/yticusse
transfiri al gnero Staphy/ococcus (Kilpper-B~lz y Schleifer, 1981>.
En 1985, De la Fuente y cols. describen la subespecie 3. aureus
subsp. anaerobius. Tres aos ms tarde se descubren tres nuevas especies:
3.
de/ph/ni (Varaldo y cols., 1988> es un estafilococo coagulasa positivo
aislado de delfines, 3. /ugdunensis y 3. schleiferi (Freney y cols., 1988>

son coagulasa negativos de origen humano. De sta ltima especie se ha
descrito la subespecie coagu/ans (lgimi y cols., 1990> aislada de perros con
capacidad de coagular el plasma.
3. fe/ls es otra especie de estafilococos coagulase negativos aislada
de gatos <lgimi y cofs., 1989). 3. capitis subsp. ureo/yticus, aislada de piel

humana ha sido descrita en 1991 por Bannerman y Kloos.
3.
muscae,
3. pscifermentans, 3.
vitulus,
5.
pasteuri y 5. pu/vereri
INTRODUCCIN
son cinco nuevas especies descritas recientemente que todava no estn

recogidas en la ltima edicin del Manual de Bergey.
5. muscae aislada de moscas, cuyo husped natural son los

mamferos domsticos, fue descrita por Hjek y cols. en 1992.
5.
piscifermentans aislada de pescado fermentado (Tanasupawat y cols.,
1992). 5. pasteur/descrita en 1993 por Chesneau y sus colaboradores, es

fenotpicamente muy similar a 3. warner/, siendo los perfiles obtenidos por
ribotipia los que permiten diferenciar ambas especies. Otra especie descrita
ese mismo ao es 5. vitulus (Webster y cols., 1993>. La ltima resea de
una nueva especie de ECN la encontramos en 1995, ao en el que
Zakrzewska y colaboradores describen la especie 5. pulvereriaislada tanto
en hombre como en animales.
En la actualidad, el gnero Staphy/ococcus comprende treinta y tres
especies diferentes, En la Tabla 1 se resume la historia evolutiva del gnero
Staphy/ococcus.
INTRODUCCION
TABLA 1: HISTORA EVOLUTIVA DEL GNERO STA PH YLOCOCCUS

1980~
1986 ~
5. auraus
8. aurej.
5. aureus
5. orIettae
8. epidermidis
5. capitis
8. auricularis
8. aureus
8. .sprophyticus
5. cohnii
8. capitis
5. epidemidis
8. Cap,..
5. capitia
5. haernolvticus
5. carnosus
8. capree
8. homini.
5. csnlyticu.
5. cdrnosu.
5. hyicus
5. cohnii
8. nterrneditja
8. opidermidis
8. chron,og.nes
S. saprophyticus
5. gallinarum
8. cohni
8. aciu,-i
5. haemolyticus
8. dolphini
5. simulsos
5. hominis
5. epidsrrnidia
5. wan,eri
8. hyicus
8. oquorum
5. intermedius
8. felia
5. saccharoyticus
8. gallinwum
1974
8. xylosua
5. .aprophyticus
5. auiicula,is
5. caaeolyticus
8. hasndytiom
5. .ciu.i
5. honinia
8. simulan.
5. hyicu.
8. warneri
5. intermedios
5. >cyloaus
5. kloosii
5. lontus
5. lugdun.n.i.
8. musca.
8. paat.uri
8. pulvoreri
5.
f,infl.
5. ssxtudyte
5. sqrortydo.
5. schldferi
8. colon
5. sim.jlans
5. vitulus
5. warn.n
5. xvEogus
Borneys Manual of dotorrninative Bacteriolooyt 8 edicin. 1974.

Skerman y cola.. 1980.
9eroeys Manual of Syetematic Ractoriologyt 1 edicin. 1986.
Citas en el texto.
>
INTRODUCCION
1.2.- SIGNIFICACIN CLNICA DE LOS ESTAFILOCOCOS COAGLJLASA

NEGATIVOS CEON
Los
ECN son unos de los principales microorganismos causantes de
infeccin nosocomial. Aunque se encuentran entre las especies ms

frecuentementeaisladas en los laboratorios de microbiologa clnica (Patrick,
1990>, <Pfaller, 1988>, el hecho de que sean organismos ubicuos y que
constituyan el principal componente de la microflora normal de la piel,
mucosas y glndulas de mamferos y pjaros; ha dado lugar a que hayan
sido considerados como saprofitos y durante aos se discutiera acerca de
su significacin clnica. An actualmente uno de los problemas de cara al
laboratorio es distinguir silos aislados de ECN son cepas con significacin
clnica, es decir, cepas productoras de infeccin, o simplemente cepas
contaminantes (Kleeman y cols., 1993>.
1.2.1.- DESCUBRIMIENTO DEL POTENCIAL PATGENO DE LOS ECN
Revisando la bibliografa vemos como con el paso de los aos los
ECN se han ido reconociendo progresivamente como importantes agentes

etiolgicos de una gran variedad de stuaciones clnicas. As, en 1958
Smith y cols. descubrieron el potencial patgeno de los ECN al analizar
datos procedentes de pacientes con septicemia. Dos aos ms tarde Brandt
y Swahn, (1960) sugieren que ms del 1% de todos los casos de
endocardtis podan ser debidos a ECN. Posteriormente, Pereira (1962>
public que un cierto grupo de ECN, actualmente llamado 5. saprophyticus,
causaba infecciones en el tracto urinario <ITUs>.
En 1965, Wilson y Stuart encontraron que en el 4,4% de los casos
de infecciones en heridas, los ECN eran los nicos microorganismos
aislados
Ese mismo ao Gallagher y cols., y cuatro aos ms tarde
Mabeck (1969) informaron acerca de infecciones del tracto urinario
INTRODUCCIN
causadas por ECN.

Pulverer y Pillich (1967) notificaron la existencia de 128 casos de
endocarditis que pensaron que estaban causadas por ECN; aos ms tarde,
Pulverer en el Fifth International Symposium on Staphylococci and

Staphylococcal lnfections <1985)
manifest su
frustracin con la
comunidad mdica al hablar acerca de todas las trabas que les haban
puesto los editores cuando publicaron el artculo anteriormente citado. En
1971, Holt inform sobre la colonizacin de derivaciones ventriculoatriales
por ECN, colonizacin que frecuentemente iba seguida por una septicemia.
En 1985 Pulverer hace una revisin bibliogrfica de 2276 pacientes
con derivaciones ventriculoatriales o peritoneales, de los cuales el 8%
sufrieron infecciones, siendo ms de la mitad de estas infecciones causadas
por ECN.
De modo que, anteriormente a los aos 70, tanto clnicos como
microbilogos generalmente consideraban a los ECN como contaminantes
y nicamente 5. aureus fue considerado como patgeno dentro de las
especies estafiloccicas
y es en las ltimas dos dcadas cuando se han
realizado considerables progresos tanto en la clasificacin de los

estafilococos como en el desarrollo de mtodos de upado; progresos que
han permitido a la comunidad mdica estar ms al corriente acerca de la
gran variabilidad de especies clnicas de ECN y aumentar la credibilidad de
que estos organismos son agentes etiolgicos de una variedad de
enfermedades.
1.2.2.- ECN ASOCIADOS A INFECCIONES HUMANAS

Los ECN actualmente son considerados como microorganismos
patgenos oportunistas que se aslan frecuentemente en cuatro tipos de
pacientes: un primer tipo lo constituiran aquellos pacientes con rotura de
la barrera natural de la piel, como son los sujetos sometidos a ciruga, con
lesiones uraumatolgicas, o aquellos que presentan patologa dermatolgica
INTRODUCCIN
10
(eccemas, psoriasis>. Un segundo tipo estara constituido por pacientes con

dispositivos implantados como catteres, prtesis, derivaciones, etc.. El
tercer grupo lo formaran pacientes inmunocomprometidos y/o con
enfermedad de base. Y el ltimo grupo seria el de los neonatos.
De todas las especies de ECN, 5. epidermidis y 3. saprophyticus son
las que aparecen con mayor frecuencia en los aislamientos clnicos,
mientras que el resto de las especies raramente se encuentran en
infecciones humanas. (Tabla 2>.
5. epidermidis es el principal agente Causal de sepsis nosocomial en
neonatologa y oncologa <Baumgart y cols.,1983>. Es el responsable del
74% al 92% de las bacteriemias adquiridas en hospitales causadas por los
ECN (Martn y cols.,1989>. Las infecciones cardiovasculares debidas a
S.epidermidis son frecuentes despus de procedimientos tales como ciruga
valvular, ciruga cardiovascularycardiotoma <ArcheryTenenbaum, 1980>.
Tambin es el principal patgeno en infecciones de pacientes con

derivaciones de lquido cefalorraquideo, produciendo frecuentemente
bacteriemias en estos pacientes. Es el microorganismo ms comnmente
aislado de infecciones secundarias a la implantacin de una gran variedad
de prtesis ortopdicas (Clarke, 1979>. Raramente causa osteomielitis,

aunque se han publicado algunos casos (Paley, 1986>. Es el principal
agente causal de peritonitis en pacientes sometidos a dilisis peritoneal
ambulatoria continua (Kraus y Spector, 1983). Y es aislado comunmente
en infecciones del tracto urinario tales como cistitis, uretritis y pielonefritis.
5. saprophytcus, ha sido identificado como una de las causas ms
frecuentes de ITUs en mujeres jvenes sexualmente activas. Produce
prostatitis en hombres (Akatov y cols., 1981>. Ha sido aislado en heridas
infectadas y se ha asociado con casos de septicemia, (Fleurette y cois.,
1987>.
3. haemolyticus, es la tercera especie de ECN. ms frecuentemente
aislada en infecciones clnicas, ha sido implicada en endocarditis,
bacteremias, peritonitis, infecciones del tracto urinario y heridas (Fleurette
11
INTRODUCCIN
y cols.,1987>, (Leighton y Little, 1986>, <Martn y cols.,1989>.

5. hominis es una de las especies del gnero Staphy/ococcus que
encontramos mayoritariamente sobre la piel y puede estar asociado con una
variedad de infecciones tales como septicemias, conjuntivitis, infecciones
del tracto urinario y heridas (Kloos y Schleifer. 1986> e infecciones debidas
a catteres peritoneales.
5.
/ugdunensis y
5.
sch/eiferi son dos especies recientemente
descritas que parecen ser significantes patgenos oportunistas, ambas

especies son poco comunes en la flora normal de la piel y cuando aparecen
estn normalmente presentes en poblaciones muy pequeas. S/ugdunensis
ha sido implicado en infecciones serias tales como endocarditis,
septicemias, abscesos cerebrales, infecciones profundas de tejidos,
infecciones peritoneales e infecciones asociadas con el uso de catteres.
5. schleiferi es menos frecuente que 3. /ugdunensis, y ha sido aislado de
empiema cerebral, infecciones de herida, etc.( Freney y cols.,1988>.
Otras especies tales como 5. warneri, 5. smulans, 5. cohnii, 5.
saccharo/yticus, 5. capitis y 5. xylosus, aparecen con baje incidencia en
una variedad de infecciones humanas. Encontramos ITUs debidas a 5.
warneri y 5. cohnii; infecciones producidas por catteres peritoneales
debidas a 5. werner/y 3. capitis; bacteriemias por S.simu/ans, 5. sch/eteri
y 5. haemo/yticus; osteomielitis y endocarditis por 3. warneri; infecciones
de heridas por 5. intermedius. (Rupp y Gordon, 1994).
INTRODUCCIN
12
TABLA 2: ECN Y SU FRECUENCIA DE APARICIN EN CLiNICA
Especies estafiloccicas
Frecuencia de aparicin clnica
5. epidermids
Patgenos comnes
3. saprophyticus
5.
capitis, 5. cohnll, 5. haemo/yticus
Patgenos poco frecuentes
5. hominis, 3. /ugdunensis,
3.
5.
saccharo/yticus, 3. sch/eifer
simu/ans, 3. warneri, S.xylosus.
3. ar/ettae, 5. auricu/aris, 5. caprae
Patgenos raros
3. carnosus, 3. caseo/yticus,
o no determinada su
S.
5.
patogenicidad.
chromogenes, 3. de/ph/nt
fe/ls, 3. gallinarum, 5. k/oosii,
3. lentus, 5. muscae, 5. pasteun,

5. piso/formentans, 5. sc/ud,
5.
5.
equorum, 5. vitu/us, S hyicus,

intermedius, 5. pu/vereri.
13
INTRODUCCIN
1.3.- IMPLICACIN DE LOS ECN EN LA INFECCIN NOSOCOMIAL

Las infecciones hospitalarias o nosocomiales son aquellas que se
desarrollan en pacientes hospitalizados
que no
las padecan,
ni
presumiblemente las estaban incubando en el momento de admisin.

Los pacientes hospitalizados son ms susceptibles a adquirir estas
infecciones debido a la existencia de factores de riesgo como son: el
presentar una grave enfermedad de base, el haber estado expuesto a
procedimientos diagnsticos o teraputicos invasivos y el haber sido
tratados con inmunosupresores. As, microorganismos que no son
habitualmente patgenos, como es el caso de los ECN, son capaces de
causar infecciones en este tipo de enfermos convirtindose en importantes
patgenos nosocomiales.
Los problemas originados por las infecciones nosocomiales no slo
afectan a los pacientes sino que tambin repercuten sobre la comunidad y
el Estado, ya que la mortalidad y morbilidad causadas por las infecciones
hospitalarias generan grandes costes. <Dixon, 1987).
1.3.1-
CRITERIOS UTILIZADOS
PARA DETERMINAR EL AGENTE
ETIOLOGICO DE LA INFECCIN NOSOCOMIAL

La gua publicada por el CDC (Horan y cols., 1992> para definir las
infecciones nosocomiales contienen criterios clnicos y de laboratorio para
las principales infecciones y localizaciones especficas. La mayora de las
principales infecciones pueden ser establecidas mediante la aplicacin de
criterios clnicos y los resultados de laboratorio aportan una evidencia
adicional en la determinacin de la existencia de infeccin.
Los criterios clnicos que generalmente utilizan los mdicos para
definir las infecciones del torrente circulatorio se basan en mltiples
factores, incluyendo la historia, el examen fsico, el cuadro clnico y el
INTRODUCCIN
14
curso de la evolucin que presenta el paciente. Entre las variables clnicas
que se consideran como signo de infeccin podemos sealar: fiebre,

escalofros, hipotensin, apnea, bradicardia, acidosis, etc. <Weinstein,
1983>.
En el caso de las bacteriemias producidas por ECN, los criterios
utilizados en el laboratorio para determinar la significacin clnica de los
mismos estn fundamentalmente basados en dos parmetros, por un lado
la intensidad de la bacteriemia que se determina analizando el nmero de
unidades formadoras de colonia por mililitro de sangre inoculada <UFC/ml>,
de modo que un alto nmero de UFC/ml se interpretara como indicio de
infeccin. (Bryan, 1989), siendo ste un parmetro que adquiere especial
importancia en el caso de los nios recin nacidos a los que slo se es
realiza una extraccin. Y por otro lado la obtencin de repetidos cultivos
positivos de la misma cepa de ECN, obtenidos separadamente dentro de un
perodo de 24 horas, en intervalos superiores a una hora. Aunque el nmero
de muestras que se deben obtener de un mismo paciente depender del
propio enfermo, as en los pacientes que han recibido previamente
tratamiento antimicrobiano generalmente se necesita tomar mayor nmero
de muestras para aislar el agente etiolgico, mientras que en neonatos de
bajo peso solamente se suele tomar una muestra y en este caso los
neonatlogos ponen mayor confianza en el criterio clnico. Tradicionalmente
se ha considerado al crecimiento en ms de una botella o al crecimiento
en ms de un juego de botellas como evidencia de cultivo positivo; aunque
tiene una mayor relevancia clnica el obtener crecimiento en ms de un
juega de botellas ya que cada juego representa una muestra distinta <Bryan,
1989>. Young y cols., en 1977, proponen la regla de tres, segn la cual
casi todos los casos de bacteriemia sern reconocidos despus de la
incubacin de tres cultivos sanguneos de un mismo enfermo durante tres

das, de este modo se detectarn no slo las bacteriemias continuas sino
tambin las intermitentes y transitorias, y al mismo tiempo se facilitar la
valoracin de microorganismos que pueden ser considerados contaminantes
INTRODUCCIN
15
como es el caso de los ECN. El volumen de sangre a cultivar generalmente

aceptado es de lO ml por extraccin para el caso de adultos, aunque
algunos autores recomiendan de 20 a 30 m, y de 1 a 5 ml en recin
nacidos (Planes, 1990).

Para evitar falsos positivos es esencial que la muestra de sangre de
los cultivos sea tomada aspticamente, siendo adems preferible recolectar
la sangre de ms de un lugar del cuerpo, por el hecho de que un
contaminante puede ser introducido accidentalmente <Kloos y Bannerman,
1994). Adems hay que ser extremadamente cuidadoso a la hora de la
manipulacin de la muestra en el laboratorio.
As cuando de un mismo enfermo se obtienen una serie de distintos
cultivos positivos y en todos ellos se aisla el mismo ECN, ste es

considerado como patgeno, mientras que si despus de un primer cultivo
positivo los siguientes cultivos son negativos o positivos pero se aislan
microorganismos diferentes al ECN del cultivo inicial entonces se habla de

contaminacin.
Como vemos, establecer si un ECN es el agente causal de una
infeccin determinada es un problema controvertido. De hecho, Koontz y

Pfaler <1989> dan un doble significado a las siglas inglesas CNS (coagulasenegative staphylococci> Ieyndolas como controversy never stops <la
controversia nunca para>. Para dar una solucin a esta controversia es
necesario que tres grupos distintos de profesionales trabajen juntos:
-
El personal de enfermera obteniendo muestras de buena calidad.
El microbilogo identificando y caracterizando el microorganismo

aislado en la muestra y dando una valoracin desde el punto de
vista del laboratorio.
El clnico valorando conjuntamente la clnica del paciente con los

resultados del microbilogo.
INTRODUCCIN
16
1.3.2.- EPIDEMIOLOGA DE LAS INFECCIONES NOSOCOMIALES

La epidemiologa es el estudio dinmico de los determinantes,
incidencia y distribucin de la salud y las enfermedades en una poblacin,
que en el caso de las infecciones nosocomiales, es la poblacin hospitalaria
(Brachman, 1979>.
a.- Prevalencia de las infecciones nosocomiales
Definimos prevalencia de las infeccines nosocomiales como el

nmero de infecciones por cada cien enfermos hospitalizados, expresado
en porcentaje.
Los datos de prevalencia de las infeccines nosocomiales, que se
obtienen de los principales estudios multihospitalarias slamente nos dan
una idea a ttulo informativo, puesto que dichos estudios no son
comparables entre s debido a las diferentes metodologas empleadas y las
diferentes caractersticas de las poblaciones encuestadas.

En 1975 en Suecia la tasa de prevalencia se situaba en un 10,5%
(Bernarder y cols., 1978>. La misma tasa presenta Dinamarca en 1978,
tasa que se incrementaba a un 12,1% en 1979, para bajar a un 7,3% en
1980 (Jepsen y Mortensen, 1980>. En Noruega se inform una tasa de un
9% en 1979 (Hovig y cols., 1981) disminuyendo a un 6,3% en 1992
(Aavistsland y cols., 1992>. En el Reino Unido se encontr un ndice de
prevalencia de 9,2% en un estudio realzado durante 1979-1980 en 43
hospitales de Inglaterra y Gales (Meers y cols, 1981>. En Italia, en 1983,
fue de un 6,8% (Moro y cols., 1986>. En Blgica, estudiando 8.723

pacientes de 106 hospitales en 1984, se encontr que un 10,3% de los
enfermos hablan desarrollado una o ms infecciones hospitalarias (Mertens
y cols., 1987). La antigua Checoslovaquia inform de un 6,1% (Sramov
y cols., 1984>. Ese mismo ao en Australia la tasa fue de un 8,1%.
INTRODUCCIN
17
(Mclaws y cols, 1988>. Francia tena un 7,4% en 1990. (Quenon y cols.,

1992>. En Espaa encontramos diferentes estudios, el realizado por el
Ministerio de Sanidad en 1986 public una tasa del 11,2%; EPINCAT en
1988, un 12,1%; y en los informes EPINE la prevalencia ha descendido

desde un 9,9% en 1990 a 8,5% en 1992. La Organizacin Mundial de la
Salud realiz un estudio internacional entre 1983 y 1985 en el que
participaban 47 hospitales de 14 pases <entre ellos Espaa>, en el cual se

obtena una tasa de prevalencia de 9,9% <Mayon-White y cols., 1988>.
Fig. 1.
El nivel de riesgo de adquisicin de una infeccin est determinado
por varios factores:
Tamao y tipo del hospital: hay un aumento de los Indices de
-
infeccin al aumentar eltamao del hospital <Hughes y cols.,

1983>.
-
Gravedad de la enfermedad base del paciente.
Frecuencia de utilizacin de mtodos teraputicos agresivos en el

hospital (Hughes y cols., 1983>.
Factores como la edad, sexo, tratamiento con inmunosupresores,

etc. (Haley y cols., 1981; Centers of Disease Control, 1977>.
INTRODUCCIN
21
En la Tabla 3, se presenta la distribucin de las principales

localizaciones de las infecciones nosocomiales en las cinco grandes reas
de asistencia segn los informes EPINE y NNIS, en los que se analizan
datos de los aos 1990-1992. Observndose una cierta equivalencia en los
datos de ambos informes, predominando en medicina las infecciones
urinarias, en atencin intensiva las respiratorias, en pediatra las
bacteriemias, ocupando un lugar importante las infecciones quirrgicas y
las urinarias en las reas de ciruga y obstetricia. Esta diferente distribucin
en los distintos servicios pueden explicarse por variaciones en los
procedimientos de alto riesgo. Por ejemplo, pacientes que han sufrido una
operacin quirrgica, rara vez estn en el servicio de medicina interna, por
lo que el nmero de infecciones quirrgicas en este servicio es pequeo. De
manera similar, las infecciones del tracto urinario son infrecuentes en
pediatra y neonatos debido a que estos servicios raramente utilizan
catteres , los cuales son el factor de mayor riesgo para este tipo de
infeccin nosocomial. Estos hechos resaltan la importancia de agrupar
pacientes con riesgo similar antes de intentar comparar la distribucin o el
rango de infeccin. (NNIS, 1991>.
22
INTRODUCCIN
TABLA 3: DISTRIBUCIN DE LAS INFECCIONES SEGN LOS SERVICIOS
NNIS, 1990-1992
TIPO DE INFECCIN (%>

SERVICIO
ITU1
RESP2
QUIR3
BACT4
OTRAS
CIRUGA
30.2
16.4
24.5
9.6
19.4
MEDICINA
42.1
17.0
2.3
14.8
23.8
NEONATOS
4.2
14.9
1.8
36.1
43.1
PEDIATRA
12.7
12.7
6.1
29.7
38.8
OBSTRETICIA
16.5
2.3
45.0
2.2
34.0
GINECOLOGA
39.7
6.5
37.2
3.9
12.7
TOTAL
33.1
15.5
14.9
13.1
23.4
EPINE, 1990-1 992

TIPO DE INFECCIN C%>
RESP2
QUIR3
BACT4
SERVICIO
ITU1
OTRAS
CIRUGA.
22.1
9.4
40.0
5.9
22.7
MEDICINA
38.4
20.2
4.0
10.7
26.7
PEDIATRA
13.9
14.9
6.5
17.4
47.3
OBST.-4-GINE.5
45.7
1.7
26.2
4.9
21.5
ATEN.INT.6
13.8
41.3
11.8
16.9
16.2
OTROS
31.6
20.9
9.5
6.3
31.7
TOTALES
27.3
16.6
21.0
9.6
25.3
1.- Infeccin del tracto urinario 2.- Infeccin del tracto respiratorio.
3.- Infeccin quirrgica. 4.- Bacteriemia. 5.- Obstetricia + Ginecologa.
6.- Atencin intensiva.
INTRODUCCIN
23
c.- Distribucin de los principales microorganismos patgenos

implicados en la infeccin nosocomial
Segn los datos publicados por el informe NNIS y el EPINE

correspondientes a los aos 1990-1992, los cinco microorganismos que
producen un mayor nmero de infecciones nosocomiales nos encontramos
con E. coY, 3. aureus, ECN, Enterococcus sp, y P. aerugnosa. Analizando
la informacin del NNIS observamos que E. coY y 3. aureus serian los
principales productores de infecciones nosocomiales siendo responsables
cada uno de ellos del 12% de dichas infecciones, seguidos de ECN con un
11%, Enteracoccus sp (10%> y P. aeruginosa (9%>. Mientras que en la
informacin del EPINE, E. cali sera el principal microorganismo responsable

del 15,9% de este tipo de infecciones, seguido por 5. aureus y ECN con un
12,4% cada uno de ellos, Enterococcus sp (7,7%> y P. Beruginosa
(10,7%>. Como vemos en ambos informes los ECN ocupan un relevante
lugar dentro de la distribucin de los patgenos nosocomiales.
Al estudiar dicha distribucin segn los distintos tipos de infecciones
nosocomiales, en ambos estudios observamos que los ECN son los
principales agentes etiolgicos de las bacteriemias; 3. aureus seria el
principal responsable de las infecciones quirrgicas; E. col seguido de
Enterococcus sp juegan un papel importante en las infecciones del tracto
urinario; as como 3. aureus y P. aeruginosa en las respiratorias. Fig 4.
25
INTRODUCCIN
1.4.- UTILIDAD EPIDEMIOLGICA Y CLINICA DE LOS MTODOS DE

TIPIFICACIN
Actualmente se estn utilizando tcnicas en el laboratorio que
permiten establecer relaciones biolgicas y genticas entre organismos
cercanos, normalmente de una misma especie. Estas tcnicas estn
basadas en caracteres sencillos del microorganismo a los que denominamos
marcador. Realmente, estos mtodos nos discriminan la no relacin
epidemiolgica entre las cepas, ms que su relacin, ya que ninguno, por
sI solo, tiene una fiabilidad del cien por cien.
El empleo de marcadores epidemiolgicos nos permite realizar dos
importantes tipos de evaluacin. Una evaluacin epidemiolgica en la que
a travs de los datos obtenidos por la aplicacin de dichos marcadores
podemos determinar cuando una serie de pacientes infectados con una
especie bacteriana representan un brote nosocomial. Otra evaluacin de
carcter clnico, en la que determinamos si diferentes aislados procedentes
de un mismo enfermo son una nica cepa o si por el contrario son cepas
diferentes; esta evaluacin adquiere una especial importancia en el caso de
los ECN puesto que basndonos en ella vamos a poder establecer la
significacin clnica de dichos microorganismos.
1.4.1.- CRITERIOS PARA EVALUAR UN SISTEMA DE TIPADO
En la evaluacin de un marcador debemos tener en cuenta criterios
como la tipabilidad, reproducibilidad y poder discriminatorio.

Tinabilidad
Capacidad de obtener resultados positivos y claros de cada aislado
analizado. Se consideran no tipables aquellos aislados en los que el
marcador no permite obtener ningn
ininterpretable.
resultado o el obtenido es
INTRODUCCIN
26
Reoroducibilidad
Se refiere a la capacidad de obtener el mismo resultado cuando se
estudia la misma cepa repetidamente; ste criterio puede verse afectado

por la variacin obtenida en el da a da de los resultados de un mtodo
particular o bien por la variacin en la estabilidad de la caracterstica
bacteriana que se est analizando.
Poder discriminatorio
Capacidad para diferenciarentre aislados no relacionados. Idealmente
un buen marcador epidemiolgico reconocera cada aislado no relacionado
como nico, pero en la prctica una tcnica se considera estadsticamente
til cuando el tipo ms comn se detecta en un nmero menor al 5% de la

poblacin <Hunter, 1990>.
La evaluacin rigurosa de cualquier mtodo de tipado requiere
analizar un nmero adecuado de aislados tanto espordicos como
relacionados epidemiolgicamente y comparar los resultados con los
obtenidos previamente con otro marcador.
Un buen mtodo de tipificacin ha de ser altamente reproducible,
discriminatorio y capaz de tipificar un gran nmero de aisjados; tambin
debe ser rpido, barato y tcnicamente sencillo.

1.4.2.- CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE TIPIFICACIN
Los mtodos de tipificacin pueden ser aplicados en los estudios de
brotes infecciosos para determinar la fuente de infeccin, reservorios y su

amplitud, as como en los programas de vigilancia para controlar la
aparicin de dichos brotes.
En la mayora de los laboratorios microbiolgicos de los hospitales se
puede iniciar un somero estudio epidemiolgico utilizando mtodos de
tipificacin sencillos, como pruebas bioqumicas de identificacin, de
sensibilidad a antimicrobianos e incluso serolgicas. Cuando aparecen
INTRODUCCIN
27
aislados epidemiolgicamente importantes que requieren una tipificacin

ms exhaustiva, son los laboratorios de referencia microbiolgica los que
disponen de mtodos ms precisos tales como sensibilidad a fagos, anlisis
del DNA plasmdico o cromosmico, electroforesis de protenas y de
isoenzimas, etc.
A continuacin describimos los principales mtodos de tipificacin.
-Tcnicas fenotloicas
Detectan caractersticas expresadas por el microorganismo.
-Tcnicas penotinicas
Basadas en el anlisis del ADN cromosmico o extracromosmico.
a.- Tcnicas fenotpicas
Estas tcnicas estn limitadas por el hecho de que todo
microorganismo tiene la capacidad de alterar de forma impredecible la
expresin de la caracterstica que se est analizando.
a. 1.-
Identificacin
desarrollo de los distintos sistemas para identificar los ECN ha sido
El
paralelo al aumento de la consideracin de dichos microorganismos como

patgenos.
La identificacin de los estafilococos coagulasa negativos as como
una buena caracterizacin de los mismos, es aconsejable por varias
razones:
-
para proporcionar un valor predictivo sobre si el germen aislado
tiene significacin clnica o si se trata de un contaminante.

-
para aumentar el conocimiento de la patognesis de las especies
estafiloccicas.
-
para poseer informacin til en estudios epidemiolgicos. (Koontz
y Pfaller, 1989>.
28
INTRODUCCIN
Kloos y Schleifer <1975b> fueron los primeros que describieron un

esquema simplificado para la identificacin de los ECN. Ellos seleccionaron
caracteres claves de los estafilococos y llegaron a identificar ms de un
80% de las cepas. Estos autores se basaron en los siguientes datos:
-
Crecimiento anaerbico en un medio de tioglicolato.
Susceptibilidad a la lisostafina (50 pg/ml>.
Prueba de la coagulasa y factor de agregacin <cumpling factor>.
Actividad hemoltica.
Reduccin de nitratos.
Actividad fosfatasa.
Produccin de cido a partir de carbohidratos bajo condiciones aerbicas.

Debido a que este mtodo requiere unos largos perodos de
incubacin, se han desarrollado sistemas comerciales rpidos y algunos

automatizados para la identificacin de los ECN. As, mientras en los
laboratortos de referencia se utiliza el esquema de identificacin propuesto
por Kloos y Schleifer, este esquema resulta impracticable en los laboratorios
clnicos por lo que en ellos prevalece el uso de los sistemas comerciales. A

continuacin haremos una breve descripcin de las ventajas y desventajas
de varios de estos mtodos:
a.1.1- Staoh Ident Svstem (Analvtab Products. Plainview. N.Y.
Kloos.y Wolfshohl (1982>, encontraron que las identificaciones
conseguidas con este sistema
coincidan en un 90%
con las
identificaciones por mtodos convencionales.

Presenta la ventaja de no requerir instrumentacin, sin embargo es
necesario hacer pruebas adicionales, como la actividad fosfatasa para
identificar los 3. epidermidls y la susceptibilidad a la novobiocina para
aislados de orina de 3. saprophyticus (Aldridge y cols., 1983>.
)>
29
INTRODUCCIN
a.1.2.- Staph-Tract Svstem (Analvtab Products. Plainview. N.Y.

Las ventajas que tiene son su fcil inoculacin e interpretacin.
Adems no requiere instrumentacin. Sin embargo, se han observado fallos
en la identificacin de 3. warneri, 3. capitis y 5. haemo/ytcus (Giger y
cols., 1984>.
a.l .3.- M1NITEK IBBL Microbioloav Svstem. Cockevsville. MD.
Tiene la ventaja de ser un sistema flexible, puesto que se puede
elegir el disco de trabajo segn la situacin. No es un sistema automatizado
con lo que su coste es menor, pero tiene la desventaja de que no identifica
todas las cepas de
3.
hominis y 3. warneri (Watts y cols., 1986>.
aA.4.- Microscan Pos Comb <American Microscan Mahwah. N.JJ

Despus de la inoculacin e incubacin, los paneles pueden ser ledos
manualmente o bien mediante un lector <auto-SCAN-4). Se ha encontrado
una coincidencia del 79% al 95% en la identificacin de los ECN al
comparar este sistema con mtodos convencionales. La desventaja del
Microscan es que no identifica todas las cepas de 3. warneri y
3.
hominis
y adems el 66% de las identificaciones requieren 48 horas de incubacin.

Las ventajas son la lectura automatizada del biotipo y del antibiograma
<Hussain y cos.,
1986>.
a. 1.5.- Scentor Gram positive MICIID (Johnston Labs. Towson. MD.

Es un panel que tiene las mismas ventajas que el anterior sistema de
identificacin. Con l, el 91 % de las identificaciones coinciden con Ias
realizadas por el mtodo de l<loos y Schleifer. (Skulnick y cols., 1987).
>
INTRODUCCIN
30
a. 1.6.- Automicrobic Svstem Gram nositive Identification Card (Vitek

systems. Inc.. Hazel Wood. Mo.
Mtodo de identificacin automatizado, de corto tiempo de
incubacin. Su desventaja es que slo identificaba seis especies, aunque
actualmente su base de datos identifica doce. (Almeida y cols., 1983).
a.2.- Biotipia
Consiste en la diferenciacin de los aislados basndose en pruebas
bioqumicas. La variacin de la expresin gentica es la razn ms comn
de que los aislados de la misma cepa difieran en una o ms reacciones
bioqumicas. Se aplica a gran cantidad de bacterias como Serrat/a
marcescens <Pitt, 1982>, Staphylococcus aureus (Goldmann, 1980> y
estafilococos coagulasa negativos (Christensen y cols., 1983>.
a.3.- Antibiotipia
Est basada en la determinacin de los patrones de sensibilidad de
los aislados a los agentes antimicrobianos. Se practica de forma rutinaria
en los laboratorios clnicos microbiolgicos, mediante procedimientos
estandarizados, a la mayora de los aislados bacterianos ya que les
proporciona una importante informacin acerca de las pautas a seguir en
la terapia del enfermo (Aber y Mackel, 1981).
Que la antibiotipia para los ECN es un marcador epidemiolgico
aceptable lo demuestra un estudio publicado por Christensen y sus
colaboradores en 1983 y en otros publicados por Ludlam y sus
colaboradores (1989a,b) quienes encontraron que los antibiogramas tenan
un 98% de reproductibilidad y un alto poder discriminatorio en un estudio
de peritonitis causadas por estafilococos coagulasa negativos en pacientes
que reciban diariamente dilisis peritoneal.
31
INTRODUCCIN
a.4.-
Serotipia
Es uno de los marcadores clsicos en el que la caracterizacin de los
aislados se realiza mediante antisueros especficos que reaccionan con

antgenos
especficos
del
microorganismo.
En
algunas
especies
microbianas, la serotipia se ha usado como un mtodo de tipificacin para

la diferenciacin de cepas en importantes situaciones epidemiolgicas.
En los ECN la serotipia no se ha desarrollado tanto como la fagotipia,
debido a las dificultades en la preparacin de los antisueros especficos y
en la estandarizacin del mtodo. Las reacciones de aglutinacin cruzadas
entre
3.
epidermidis y 3. aureus fueron descubiertas hace tiempo <Morse,
1962; Pillet y Orta, 1954>. No obstante, algunas pruebas de absorcin

cruzada indicaron que 3. epidermidis tena su propio juego de aglutingenos
<Aasen y Oeding, 1971>. Mientras que el ribitol-cidoteicoico con residuos
N-acetil glucosamina es caracterstico de las paredes celulares deS. aureus,
el glicerol-cido teicoico con residuos glucosilo est presente en la pared
celular de 3. epidermidis (Davison y Baddlley, 1963; Morse, 1963>.
ltimamente se ha desarrollado un sistema de tipificacin serolgica
basado en anticuerpos monoclonales <Gabelish y cols., 1990).
a.5.- Fagotipia
Con esta tcnica, los aislados se caracterizan por su susceptibilidad
o resistencia a la lisis por cada miembro de un juego de fagos. Debido a la
necesidad de mantener el juego de fagos activos y lo laborioso que ello
resulta, la realizacin de la fagotipia queda casi prcticamente restringida
a los centros de referencia.
El xito de la fagotipia en 3. aureus indujo a la utilizacin del mismo
juego internacional de fagos para 5. epidermidis. Los resultados fueron
desalentadores, pues los estafilococos coagulasa negativos raramente eran
INTRODUCCIN
32
lisados por estos fagos <Pereira, 1962; Pulverer y Pillich, 1971>. De ah se

dedujo la necesidad de desarrollar un sistema de fagotipia para los ECN.
El primer juego de fagos fue desarrollado en 1970 por varios autores
<van Boyen y cols., 1969; van Boyen, 1976; Verhoef y cols., 1972> en
Holanda. Posteriormente, en distintos pases se obtuvieron otros juegos de
fagos como los de: Pulverer, Pillich y Krivankova en Alemania occidental y
Checoslovaquia (Pulverer y Pilich, 1971; Pulverer y cols., 1973); Jean,

Williams, Hall y Corse en Inglaterra <Jean y cols,, 1973> y Martn de
Nicolas y cols. en Espaa <Martn de Nicols, 1990>.

a.6.- Anlisis electrofortico de protenas
a.6.t- Electroforesis de oroteinas totales e inmunoblottinp
Las protenas y otros productos bacterianos pueden ser detectados
por aislamiento de la pared celular o de los productos de la superficie
celular separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (Costas y cols., 1989>. Alternativamente las

protenas pueden ser marcadas radioactivamente y detectadas por
autorradiografa <Stephenson y cols., 1986>.
El inmunoblotting se realiza por transferencia de los productos
bacterianos a una membrana de nitrocelulosa se utiliza un antisuero
especifico o un pool de suero humano como fuente de anticuerpos
<Mulligan y cols., 1988> y as se detectan los polisacridos y glucolipidos.
Todos los aislados se pueden tipificar por estas tcnicas y tienen
buen poder discriminatorio. Sin embargo, debido a la complejidad de los

patrones obtenidos, la comparacin entre las distintas cepas puede ser
difcil y el significado de pequeas diferencias incierto (Gaston y cols.,
1988). El anlisis mediante ordenador puede facilitar estos estudios (Costas
y cols, 1989>. Adems se requieren estudios adicionales para determinar
si las variaciones detectadas entre los productos bacterianos o entre los
productos antigenicamente activos reflejan diferencias genotpicas estables
INTRODUCCIN
33
en los aislados o son alteraciones fenotpicas potencialmente menos

reproducibles, sujetas a presin ambiental.
a.6.2.- Anlisis electrofortico de isoenzimas
Detecta diferencias en la movilidad electrofortica de enzimas
metablicas solubles. Las protenas se separan en un gel <de poliacrilamida
o almidn) y las enzimas se detectan de forma individual con el uso de
sustratos especficos (Whittam y cols, 1983>. Variaciones en la movilidad
electrofortica reflejan sustituciones de aminocidos que alteran la carga de
la protena. Estas sustituciones identifican variaciones en los genes
cromosmicos que codifican para la enzima. Aunque en determinados
aislados alguna actividad enzimtica est ausente, la evaluacin de
mltiples enzimas metablicas asegura que todos los aislados sean tipables.
Los estudios iniciales se realizaron para anlisis de poblacin de una
determinada especie <Selander y cols., 1986).
b.- Tcnicas genotiolcas
Debido a los problemas de tipabilidad, reproductibilidad o poder
discriminatorio de muchas de las tcnicas fenotpicas, se han desarrollado
numerosas mtodos de tipificacin basados en estudios de ADN.
b.1
.-
Plasmidotipia
Fue la primera tcnica basada en estudios de ADN desarrollada para

anlisis epidemiolgicos. Los plsmidos que se obtienen de cada aislado se
separan electroforticamente en geles de agarosa para determinar su
nmero, su tamao y establecer una serie de perfiles tiles para diferenciar
unos microorganismos de otros, ofreciendo la posibilidad de establecer
relaciones epidemiolgicas entre ellos.
INTRODUCCIN
34
Parisi y Hecht (1980>, fueron los primeros que utilizaron los perfiles
plasmidicos para distinguir diferentes cepas de 3. epidermidis. Archer y
cols. <1982>, han combinado esta tcnica con la fagotipia y antibiogramas
para establecer la relacin epidemiolgica entre aislados de pacientes con
endocarditis. Tambin ha sido utilizada para diferenciar los contaminantes
de la piel de los cultivos responsables de endocarditis, infecciones del fluido
cerebroespinal, infecciones del tracto urinario, osteomielitis (Archery cols.,
1984> y bacteriemia por catteres intravenosos <Struelens y cols., 1990).
b.2.- Anlisis molecular de plsmidos
La plasmidotipia es una metodologa que tiene ciertas limitaciones
inherentes a la propia tcnica debido a que un plsmido puede existir en
diferentes formas moleculares <superhelicoidal, circular y lineal> que migran

de forma diferente en los geles de agarosa; adems plsmidos que han
migrado de igual forma no implica que se trate de un mismo plsmido, este
hecho se ha tratado de solventar utilizando endonucleasas de restriccin.
Al realizar la digestin de los plsmidos mediante endonucleasas de
restriccin <que catalizan la rotura de la doble hebra de ADN en sitios de
reconocimiento especficos), obtenemos unos fragmentos de ADN de

diferentes tamaos que son separados por electroforesis,resultando una
serie de patrones que pueden ser comparados para determinar su grado de
afinidad.
b.3.- Anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin
Cada enzima de restriccin (endonucleasa> corta el ADN en una
secuencia especfica de nucletidos. El nmero y tamao de los fragmentos
est relacionado con la composicin de los nucletidos en la secuencia de
reconocimiento, as como con el nmero de dichas secuencias presentes en
la cadena de ADN.
INTRODUCCIN
35
El ADN cromosmico cuando es digerido con endonucleasas de alta

frecuencia de corte ocasiona un elevado nmero de fragmentos de
restriccin relativamente pequeos. Los perfiles se obtienen por separacin
en geles de agarosa. Todos los aislados bacterianos son tipables mediante

esta tcnica.
Una limitacin de este mtodo es el alto nmero de bandas que se
obtienen lo que hace muy dificultoso la interpretacin de los resultados.
Adems
Bialkowska-Hobrazanska y
cols.
(1990>,
demostraron en
estafilococos coagulasa negativos que diferencias en el contenido de

plsmidos de aislados relacionados epidemiolgicamente puede causar
variaciones en los patrones obtenidos.
b.4.- Southern blot de la huella gentica del ADN cromosmico
En orden a reducir la complejidad de los patrones obtenidos por la
digestin del ADN cromosmico con endonucleasas de restriccin, los
fragmentos obtenidos en electroforesis de geles de agarosa se transfieren
a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Usando un fragmento de ADN
como sonda, pueden detectarse fragmentos de restriccin que contengan
secuencias homlogas a la sonda (Southern, 1975). Las variaciones en el
nmero y tamao de estos fragmentos reflejan variaciones en el nmero de
locus homlogos a la sonda.
Todas las cepas que posean el locus homlogo son tipables y los
resultados muy reproducibles. El procedimiento requiere alguna experiencia

tcnica. El poder discriminatorio est directamente relacionado con el
nmero y la variabilidad de los fragmentos detectados. Las sondas ms
efectivas son aquellas que detectan mltiples bandas simultneamente.
INTRODUCCIN
36
b.5.- Ribotipia
Esta basada en la tcnica anterior y del mismo modo se usa una
sonda para reducir el elevado nmero de bandas generadas por REA

<anlisis con enzimas de restriccin) y simplificar la interpretacin de los
perfiles genmicos. Pero en este caso la sonda es de ARNr, por lo tanto, la
utilizacin de sondas basadas en un ARNr con fines de tipado recibe el
nombre de ribotipia.
En 1986, Patrick y Francine Grimont describen por primera vez esta
tcnica e informan del uso de una sonda universal de ARNr de E. coil.
En el cromosoma bacteriano los genes que codifican para la
produccin de 165, 23S y 55 ARN estn organizados en unidades de
transcripcin policistrnicas u operones. El hecho de que en ribotipia se
trabaje con los operones ADNr se debe a que estn presentes en mltiples
copias y tienen un alto grado de conservacin (Woese, 1987>. En las
bacterias muchas de tales secuencias, que
codifican para el ARNr,
encontradas en las bacterias parecen haber presentado cambios pequeos

durante el proceso de evolucin, con lo que sondas especficas para estas
secuencias pueden tipar un amplio rango de bacterias entre las que se
encuentran los ECN <lzard y cols, 1992).
El ARNr <16S+23S) de E.colles usado como molde para obtener la
sonda por medio de la transcriptasa inversa, dicha sonda es un ADNc que
se marca radioactivamente o enzimaticamente. Se hibrida el ADN

bacteriano problema <que previamente ha sido digerido con endonucleasas
de restriccin y transferido por el mtodo Southern a una membrana de
nylon o nitrocelulosa) con la sonda, y las variaciones obtenidas en el
nmero y tamao de los fragmentos de la digestion del ADN bacteriano
<complementarios con el ARNr> es lo que permite tipificar las bacterias.
INTRODUCCIN
37
b.6.- Electroforesis en campo pulsado

Variante de la electroforesis convencional en campo unidireccional.
Fue descrita por primera vez por Schwartz y Cantor en 1984, los cuales
demostraron que grandes molculas de ADN <mayores de 50 kb) pueden
ser separadas en un gel de agarosa cuando estn sometidas a la influencia
de campos elctricos alternos que provocan continuos cambios en la
direccin de migracin de los fragmentos de ADN. En estos cambios de
reorientacin juega un papel importante el peso molecular del fragmento de
ADN; ya que los fragmentos de mayor peso molecular necesitan ms
tiempo para reorientarse, antes que puedan migrar a traves del gel, que los
de menor peso molecular.
Este proceso se conoce como electroforesis en campo pulsado.
<PFGE>. Existen muchas variantes de PFGE; aunque la ms usada es el
campo elctrico homogeneo de contorno cerrado (CHEF> descrito por Chu
y cols. en 1986, en el que 24 electrodos estn ordenados en un contorno
hexagonal que ofrece ngulos de reorientacin de 600 y 1200.
En el PFGE, una suspensin de clulas bacterianas se incluye en
bloques de agarosa. Siendo muy importante estandarizar cuidadosamente
la cantidad de clulas bacterianas, ya que la concentracin de ADN va a
influir en las distancias absolutas de migracin y en la resolucin.
Posteriormente el material celular es digerido con proteinasa K y el ADN que
queda en los bloques es expuesto a la accin de las endonucleasas de
restriccin, los fragmentos de ADN que se generan son separados al ser
sometidos a la influencia de campos elctricos alternos y posteriormente
teidos con bromuro de etidio.
Para obtener una buena resolucin en los geles obtenidos por PFGE
hay que ajustar, para cada especie bacteriana y cada endonucleasa de
restriccin, una serie de parmetros: pulsos elctricos, voltaje, temperatura
y concentracin de agarosa.
INTRODUCCIN
38
El PFGE ha sido aplicado a estudios epidemiolgicos de un amplio

rango de especies entre las que se encuentran los ECN (Lina y cols., 1992>.
Ello se debe a que es capaz de detectar variaciones sutiles entre
aislamientos relacionados filogenticamente y epidemiolgicamente.
b.7.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR>
Como hemos visto, los distintos procesos de hibridacin de cidos
nucleicos actualmente estn desarrollados hasta el punto de que pueden ser

usados
para
la
identificacin
tipado
de
un
amplio
rango de
microorganismos, pero estos procesos requieren que el organismo sea

cultivado previamente. El hecho de que para algunos microorganismos no
se hallan desarrollado mtodos de cultivo <particularmente virus> y que
otros requieran un largo periodo de cultivo para proporcionar suficientes
cidos nucleicos para su deteccin y caracterizacin, ha llevado a que se
desarrollara la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa <PCR> con la
que se consigue replicar (amplificar) una secuencia especfica de cido
nucleico.
La PCR fue introducida por Saiki y cols. en 1985 y es un mtodo
enzimtico para amplificar exponencialmente un fragmento especfico de
ADN. Con este mtodo una simple secuencia de ADN puede ser copiada
1 o~ veces en unas tres horas. La reaccin necesita de una ADN polimerasa
termoestable, dos iniciadores o primers (que son oligonucletidos

sintticos de 20 a 30 bases de longitud y cuyas secuencias son
complementarias a cada uno de los extremos de las dos hebras del
fragmento de ADN molde del que solo se requiere cantidades del orden de
nanogramos> y los cuatro deoxirribonucleosidos trifosfatos que sern
incorporados en el ADN.
Cada amplificacin de PCR se subdivide en tres pasos:
-
a> Desnaturalizacin: separacin de las hebras de la doble cadena
de ADN molde.
INTRODUCCIN
39
b) Apareamiento: el ADN molde desnaturalizado hibrida <se aparea>
con las secuencias complementarias de los iniciadores.

-
c> Extensin: la ADN polimerasa termoestable cataliza la reaccin
de extensin de los iniciadores por la adicin de nucletidos para producir

dos copias de la secuencia original.
Estos tres procesos (desnaturalizacin, hibridacin y extensin> se
dan en cada ciclo y la repeticin de 20 30 ciclos produce rpidamente un
gran nmero de copias del ADN molde.
Para analizar los productos de la amplificacin se han utilizado varios
mtodos. El mtodo ms simple es realizar una electroforesis para
identificar el tamao de los productos de la reaccin, los productos
obtenidos tambin se pueden digerir con una endonucleasa y analizar los
fragmentos resultantes por electroforesis, pero se consigue una mayor
especificidad y sensibilidad al analizar los productos mediante hibridacin
con una sonda especfica. Aunque el mtodo ms informativo es determinar
la secuencia de nucletidos de la molcula de cido nucleico amplificada.
40
OBJETIVOS
2.-o BJETIVOS
41
OBJETIVOS
Los ECN son uno de los principales microorganismos causantes de

infeccin nosocomial. Estas especies son aisladas frecuentemente en los
laboratorios.de microbiologa clnica, pero el hecho de que estos organismos
estn presentes en la microflora de la piel y mucosas ha dado lugar a que
el establecimiento de si un ECN es agente causal de infeccin sea un
problema controvertido.
En esta tesis se abordar la problemtica de valorar la significacin
clnica de los ECN aislados de hemocultivos, por lo que los estudios que
hemos realizado con las cepas de ECN recibidas en nuestro laboratorio
durante 1991, procedentes del Hospital Val dHebron, van encaminados
a conseguir los siguientes objetivos:
1.-
Valorar
los
marcadores
fenotpicos
genotpicos
en
la
caracterizacin de los ECN, para conseguir este objetivo tendremos

que:
1.1.-
Analizar los aislados recibidos mediante la aplicacin

de
marcadores
epidemiolgicos
convencionales
(identificacin, fagotipia con dos juegos de fagos (el de

Jean y William? y el de Martn de Nicols> y otras
tcnicas alternativas de fagotipia>.
1 .2.-
Estudiar los patrones de sensibilidad a antimicrobianos

de los aislados.
1 .3.-
Analizar los aislados mediante la aplicacin de

marcadores epidemiolgicos moleculares (plasmidotipia
y electroforesis en campo pulsado>.

2.-
Valorarla utilidad de los marcadores epidemiolgicos convencionales
y moleculares para la confirmacin de la significacin clnica de los

3.-
ECN.
Establecer un esquema jerarquizado de utilizacin de los marcadores
epidemiolgicos en la caracterizacin de los ECN.
MATERIAL Y MTODOS
42
3-MATERIAL
Y MTODOS
MATERIAL Y MTODOS
43
3.1.- AISLADOS
3.1.1.- PROCEDENCIA DE LOS AISLADOS
Durante 1991, el Departamento de Microbiologa del Hospital Val
dHebron de Barcelona usando el sistema de botellas Bactec (NR 660 HS>
obtuvo una serie de hemocultivos en los que se aislaban ECN. Estos
aislados fueron enviados a nuestro laboratorio (Laboratorio de Infecciones
Intrahospitalarias del Centro Nacional de Microbiologa. Virologa e
Inmunologa Sanitarias <CNMVIS para su caracterizacin.
Una vez recibidos todos los aislados correspondientes a 1991
procedentes del citado hospital, escogimos aquellos que una vez
caracterizados nos permitiran realizar una valoracin acerca de la
significacin clnica de los ECN. Para lo cual seleccionamos todos aquellos
casos que presentaban ms de un aislamiento de ECN, de esta manera
elegimos 158 aislados de ECN que correspondan a 63 episodios de
bacteriemia de 52 pacientes.
3.1.2.- ASPECTOS CLNICOS
a- Pacientes
Los aislados seleccionados corresponden a 52 pacientes, siendo 13
de ellos nios y 39 adultos. Entre los cuales encontramos: pacientes
inmunocomprometidos que presentan enfermedad de base severa,
pacientes que han sido sometidos a procesos quirrgicos, pacientes con
prtesis,catteres, etc. y neonatos.
MATERIAL
Y MTODOS
44
b.- Casos y episodios

Hemos considerado 52 casos correspondientes a 52 pacientes en los
que se sospech bacteriemia y de los que se ais la misma especie de ECN
de distintos hemocultivos.
El hecho de que en algunos casos existieran, a lo largo del tiempo,
numerosos hemocultivos en los que se haban aislado ECN, hizo que para
obtener una mayor comprensin de lo que estaba ocurriendo durante el
proceso infeccioso dividieramos los casos en periodos de tiempo que
llamamos episodios. Considerando que los hemocultivos pertenecan a
episodios distintos cuando transcurra al menos seis das sin hemocultivos
positivos.
Siguiendo los criterios anteriormente expuestos, entre los 52
pacientes seleccionados tenemos casos con uno, dos, tres y cuatro
episodios. De manera que los 158 aislados de ECN seleccionados
pertenecan a 63 episodios de 52 pacientes en los que se sospech
bacteriema.
c.- Valoracin clnica de los distintos casos
Una vez elegido el conjunto de casos con los que bamos a trabajar,
solicitamos a los mdicos del hospital que en base a los criterios clnicos de
que disponan realizaran una valoracin en la cual determinaran, desde el
punto de vista clnico, silos estafilococos coagulasa negativos aislados de
cada caso eran agentes etiolgicos de las enfermedades o si por el
contrario eran simplemente contaminantes. En la Tabla 4. describimos tanto
los casos como su valoracin clnica.
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54
MATERIAL Y MTODOS
Las abreviaturas utilizadas en la tabla 4 son las siguientes

La clasificacin que a continuacin se cita para las distintas reas y
servicios hospitalarios, se realiz basandonos en los criterios del informe
EPINE (1992>:
-
C: rea de ciruga. Servicios del rea de ciruga:

Cl: ciruga general.
C6:
ciruga cardiaca.
C9:
neurociruga.
C14:
-
oftalmologa.
M: rea de medicina. Servicios del rea de medicina:

Mi: medicina interna.
M2: enfermedades infecciosas.

M4: digestivo; neurologa.
-
P: rea de pediatra. Servicios del rea de pediatra:

P2:
neonatos.
P3: lactantes.
P4: escolares.
PS: hematologa infantil.
P7: oncologa infantil.

-
A: rea de atencin intensiva. Servicios del rea de atencin

intensiva:
A3: Ud mixta.
OT: rea de otros servicios. Servicios del rea otros servicios:

0T3: otros servicios.
A cada paciente se le asign un nmero de caso y para diferenciarlos

episodios de un mismo caso se les nombr con el nmero de caso al que
pertenecan seguido de apstrofe. D: Diciembre; E: Enero; F: Febrero; M:
Marzo; A: Abril; Y: Mayo; J: Junio; L: Julio; G: Agosto; O: Octubre; M:
mujer; V: varn; NC: no consta edad. HE: hemocultivo.
55
MATERIAL Y MTODOS
3.1.3.- CRECIMIENTO Y CONSERVACIN
Los aislados eran enviados por el laboratorio de microbiologa del

hospital identificados como estafilococo coagulasa negativo
En el momento de su recepcin en nuestro laboratorio, cada aislado

se sembr en una placa de agar sangre y se incub a 370C durante 18
horas.
Aquellos aislados que llegaban contaminados, eran reaislados a partir
de la colonia sospechosa en placas de agar sangre incubndose bajo las
condiciones anteriormente descritas con el fin de obtener un cultivo puro.
Para asegurarnos que el nuevo cultivo era un ECN se sembraba en placas
de manitol salado incubndose bajo las condiciones ya descritas.
Tras corroborar que se trataba de un ECN y que trabajbamos con un
cultivo puro el microorganismo se conservaba en leche descremada a -700C
hasta su estudio.
3.2.- IDENTIFICACIN
Ls aislados que estaban conservados en leche descremada se
sembraban en agar sangre obtenindose un cultivo a partir del cual se
realizaba la identificacin del microorganismosiguiendo el esquema de Kloos
y Schleifer (1975a,b>, realizndose las siguientes pruebas:
3.2.1- ESTUDIO MORFOLGICO Y PRODUCCIN DE PIGMENTO
En el estudio morfolgico de las colonias se consider la forma, el
tamao, el perfil, el borde, la transmisin de la luz y la pigmentacin de las
mismas. La determinacin de estos caracteres se hizo en agar-P despus de
incubar los diferentes aislados durante 4-5 das a 37W.
MATERIAL Y MTODOS
56
3.2.2.- ACTIVIDAD COAGLJLASA
Se realiz segn el mtodo de Barry y cols. (1973>. Segn el cual, se

sangraba un conejo de nuestro animalario, recogiendo la sangre en citrato
trisdico con una concentracin final del 1%. Se separ el plasma por
centrifugacin a 3.000 r.p.m. durante 15 minutos, y se guard el
sobrenadante a 40C hasta su utilizacin.
Por cada aislado se distribuy en un vial 300 pl de PBS, 100 pI de
plasma y dos gotas de un cultivo de estafilococos crecido en EHI (infusin
de cerebro, corazn> durante 18 horas a 37W. A continuacin, se
incubaban dichos viales en un bao a 3700 durante 4horas, y se observaba
la presencia o ausencia de cogulo. Cualquier grado de coagulacin era
considerado como positivo.
Se incluyeron dos cepas como control: la cepa Oxford, como control
positivo y la cepa de nuestra coleccin 8887, como control negativo.
3.2.3.- NUCLEASA TERMOESTABLE
Esta prueba fue realizada siguiendo la tcnica de Barry y cols. (1973>.
El mismo cultivo liquido de BHI, utilizado para hacer la prueba de la
coagulasa, se calent a 100W durante 15 minutos y fue distribuido
mediante una pipeta Pasteur en los pocillos de aproximadamente 3mm de
dimetro de una placa de agar que contena ADN y azul de toluidina.
Tras la incubacin a 3700 durante 4 horas, los estafilococos
productores de nucleasa termoestable lisaban el ADN contenido en el agar
produciendo un halo rosado alrededor del pocillo que contena el extracto
de estafilococo correspondiente. Aunque el mtodo no es cuantitativo, el
logaritmo de la concentracin de ADNsa/ml est relacionado linealmente con
el dimetro de la reaccin. En esta tcnica se incluyeron los mismos
controles que para la prueba de la coagulasa.
MATERIAL Y MTODOS
57
3.2.4- ACTIVIDAD HEMOLTICA
Las diferencias en la actividad hemoltica de las especies fueron

puestas de manifiesto sembrando los aislados en placas de agar sangre
preparadas con agar Mueller-Hinton y 5% de hemates de carnero. Las
placas se incubaron a 370C y se realiz la lectura a las 48 horas de
incubacin. Los resultados fueron interpretados de acuerdo con el siguiente
esquema:
(+): fuerte hemlisis (=1,5mm de halo>.
(>:hemlisis dbil o moderada <<1,5 mm de halo).
-
>: hemlisis no detectable.
3.2.5.- ACTIVIDAD DESOXIRRIBONUCLEASA (DNAsa>

Para detectar la actividad DNAsa, los aislados se siembran rayando
un medio que contiene cido desoxirribonucleico y azul de toluidina, se
incuban a 370C durante 24 H.
Los microorganismos que tienen actividad DNAsa despolimerizan el
DNA, y sta degradacin del DNA se detecta porque se produce un viraje
de color (de azul a rosa) alrededor de la siembra del microorganismo.
3.2.6.- ACTIVIDAD UREASA
Con sta prueba determinamos la capacidad de un microorganismo
de desdoblar la urea, por la accin de una enzima amidohidrolasa llamada
ureasa formando dos molculas de amonaco y dando carbonato amnico
como producto final (Christensen, 1946>.
Los aislados fueron sembrados en tubos que contenan 2 ml de agar
urea de Christensen y se incubaron a 370C durante 24 h. Si haba actividad
ureasa, la urea era metabolizada producindose una alcalinizacin del medio
MATERIAL Y MTODOS
58
que era detectada gracias al indicador rojo fenol. De modo que en una
reaccin positiva apareca un color rosa intenso y en una reaccin negativa
no se produce cambio de color.
3.2.7.- ACTIVIDAD DECARBOXILASA
La decarboxilacin es un proceso por el cual las bacterias que poseen
enzimas decarboxilasas especficas son capaces de atacar a los aminocidos
(arginina y ornitina> en su grupo carboxilo (-COOH> dando una amina o una
diamina y anhdrido carbnico (Smith y cols, 1968).
Las decarboxilasas son inducidas por el microorganismo cuando este
es cultivado en un medio cido en presencia del sustrato especfico, los
productos de la decarboxilacin, provocan una desviacin del pH hacia la

alcalinidad <MolIer, 1955>.
Cada aislado es sembrado en tres tubos de caldo decarboxilasa,
segn la frmula descrita por Falkow (1958), un tubo control sin
aminocidos, otro con arginina y el ltimo con ornitina. Se cubren con
aceite mineral y se incuban a 3700 durante 5 das. Durante la incubacin las
bacterias fermentan la dextrosa acidificando el medio (el medio vira de
prpura a amarillo>; en este momento en el que el medio es cido, si la
bacteria produce la enzima decarboxilasa especfica, se decarboxilan los
aminocidos y los productos de dicha decarboxilacin alcalinizan el medio
<produciendose un reviraje al color prpura inicial>.
3.2.8.- ACTIVIDAD FOSFATASA
Los microorganismos fueron sembrados en un tubo que contena agar
nutritivo inclinado, al que se le aadi sal sdica difosfato de fenoftaleina
(PDP al 1,5%), y se incubaron a 37W durante cinco das.
Se utiliz 0,5 ml de hidrxido sdico (NaOH> iON como reactivo para
revelar la actividad fosfatasa.
59
MATERIAL Y MTODOS
Se consider una prueba positiva cuando las colonias se volvan de

rojo-rosado brillante, mientras que, si las colonias se mantenan claras o
blancas, se consider la prueba negativa.
3.2.9.- PRODUCCIN DE ACETILMETILCARBINOL (ACETOINA>
A partir de un inculo poco denso, los aislados fueron sembrados en
2,5 ml de caldo de Clark y Lubs (1915>, caldo
RM/VP que contiene
peptona y glucosa, y se incubaron a 30 oc durante cinco das. En presencia

de oxgeno atmosfrico, los productos finales (acetoina y 2,3-butanodiol>
son oxidados a diacetilo. Despus de la incubacin a los cultivos se le
agregaron los reactivos VP de Barritt (1936> directamente y en el siguiente

orden:
-
0,6 ml de una solucin a-naftol al 5%. Se trata de una solucin
alcohlica que acta como intensificador del color.

-0,2 ml de una solucin de hidrxido potsico al 40% que contribuye
a la absorcin del CO2.
Se agit el tubo suavemente para exponer el medio al oxgeno
atmosfrico con el fin de oxidar la acetoina en diacetilo, que es el reactante

para el color producido en la reaccin de Voges-Proskauer. Se dej
descansar el tubo por lo menos 10 15 minutos antes de la interpretacin
de los resultados.
La reaccin es positiva cuando aparece un color rosado en la
superficie del medio (presencia de acetoina> y es negativa cuando aparece
un color amarillo.
3.2.10.- REDUCCIN DE NITRATOS
Los aislados se sembraron en un tubo que contena 5 ml de caldo
nitratado <medio de nitrato potsico>. Este medio favorece el crecimiento y
ofrece las condiciones anaerbicas necesarias para que sea activada la
60
MATERIAL Y MTODOS
enzima nitratasa sensible al oxgeno. Se incubaron a 30~C durante cinco

das, junto a un tubo sin inocular que haca de testigo, al cabo de los cuales
se aadieron los reactivos:
-
1 ml de reactivo A (dimetil-a-naftilamida al 0,6%>.
1 ml de reactivo B (cido sulfanlico al 0,8%>.
La reduccin del nitrato <NO2) est indicada por la aparicin de color

cuando el nitrato reacciona con los dos reactivos y se forma un compuesto
diazoico (p-sulfobenceno-azo-anaftilamida>. El enlace del grupo azo (-N
N-)
da como resultado un compuesto de color rosado a rojo intenso. Cuando no

se desarrolla color, se interpretan los resultados como negativos. Se
atribuye un a los aislados que reducen dbilmente los nitratos, en cuyo
caso adquieren un color rosado El tubo testigo debe presentar muy poca o
ninguna coloracin.
Algunos microorganismos son capaces de reducir el nitrato a nitrito,
aunque destruyen el nitrito con la misma rapidez con la que se form dando
un resultado falsamente negativo. Por ello, se realiz la prueba de la
reduccin del zinc con el objeto de confirmar los resultados. Para lo cual se
agrega una pequea cantidad de polvos de zinc sobre los tubos que no
desarrollaron color. Una prueba positiva de esta reduccin se traduce por
una ausencia de color, e indica que el nitrato fue reducido a nitrito y este
ltimo fue reducido a gas. Una prueba negativa dar un color rosado intenso
indicando que el nitrito no ha sido reducido por el microorganismo y est
presente en el medio.
3.2.11.- FERMENTACIN DE HIDRATOS DE CARBONO
La capacidad de un organismo de fermentar los hidratos de carbono

incorporados a un medio bsico bajo condiciones aerbicas fue detectada
usando el mtodo de agar en placa. Cada carbohidrato filtrado fue aadido
a un medio llamado prpura agar-base previamente esterilizado en
autoclave, que tiene como indicador de pH prpura de bromocresol. La
61
MATERIAL Y MTODOS
concentracin final del carbohidrato en agar fue del 1%.

A partir de un cultivo fresco en BHI, las cepas fueron inoculadas en
las placas mediante un inoculador mltiple. Se incubaron a 300C durante
cinco das, al cabo de los cuales se realiz una lectura.
Las reacciones fueron interpretadas de la siguiente manera:
-
<+>: produccin de cido. Aparece un color amarillo en el medio
alrededor del inculo.

-
<>:dbil produccin de cido. Color amarillo plido en el lugar
donde est el inculo.

( ): no ha habido produccin de cido y no existe viraje de color.
-
Los azcares estudiados fueron los siguientes: galactosa, glucosa,

lactosa, maltosa, manitol, manosa, sacarosa, trealosa, xilitol, xilosa y
trealosa combinada con manitol.
3.2.12.- SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
La susceptibilidad de los estafilococos coagulasa negativos a la
novobiocina se comprob inoculando las cepas crecidas en BHI mediante un
inoculador mltiple en una placa que contiene medio A y novobiocina a una
concentracin de 1,6 pg/ml.
Las placas fueron incubadas durante 48 horas a 3700 y se procedi
a su lectura. Los microorganismos se consideraban sensible cuando no se
observaba ninguna colonia.
3.2.13.-
PRODUCCIN
DE
CIDO
PARTIR
DEL
GLICEROL
AERBICAMENTE EN PRESENCIA DE ERITROMICINA

Esta prueba est basada en la propiedad que tienen los estafilococos
<pero no los micrococos> de crecer y producir cido a partir del glicerol en

presencia de 0,4 pg/ml de eritromicina. Para su ejecucin se sigui la
tcnica propuesta por Schleifer y Kloos <1975b>.
MATERIAL Y MTODOS
62
Como medio basal utilizamos el agar prpura de bromocresol al que

se le aadi un 1% de glicerol y eritromicina. Cada placa se sembr con un
inoculador mltiple y la lectura se realiz tras 24, 48 y 72 horas de
incubacin a 37W, considerando positivas las cepas que crecan y
evidenciaban un cambio en la coloracin del medio por viraje del indicador
prpura original a amarillo alrededor del inculo.
3.3.- FAGOTIPIA
3.3.1.- PROPAGACIN DEL JUEGO DE FAGOS DE DEAN Y WILLIAMS
Y DEL JUEGO OBTENIDO EN EL C.N.M.V.I.S.
En este estudio se utilizaron dos juegos de fagos; el juego de Dean
y Williams (1973> compuesto por veinte fagos y otro juego de doce fagos
obtenido en el Centro Nacional de Microbiologa del Instituto de Salud
Carlos III <Martn de Nicols y cols., 1990>. Cada fago tiene su cepa
propagadora en la cual se multiplica, fagos y cepas se conservan a -70W.
a> Determinacin del RTD
Antes de realizar la propagacin de un fago, hay que determinar su
RTD (routine test dilution> titulndolo sobre su cepa propagadora. Para ello,
se inundaba una placa de agar comn 1,1 con un cultivo de caldo de la
cepa propagadora, retirando el exceso de lquido con una pipeta Pasteur. A
continuacin se colocan sobre la superficie de la placa de agar, ya inoculada
y seca, gotas de diluciones crecientes del fago que queremos titular, desde
10.1 hasta iO7. Tras incubar durante 18 horas a 300C se observa la
presencia de placas de lisis, considerando como RTD la mxima dilucin que
produce lisis confluente.
MATERIAL Y MTODOS
63
b> Propagacin en medio slido
Se realiz por el mtodo de agar semislido descrito por Swanstrom

y Adams <1951>. Se calent el agar semislido distribuido en tubo a 6m1.
para fundirlo, dejndolo enfriar a 450C. Se aadi entonces:
-
0,6 ml. de un cultivo en caldo comn de la cepa propagadora
crecido a 37W durante 4 horas en agitacin.

-
0,6 ml. de fago diluido a su RTD.
0,25 ml. de cloruro clcico al 1%.
Sobre una placa de agar comn 1,1 de 15 cm. de dimetro se aadi

el agar semislido que contena la mezcla de fago y de la cepa propagadora
en proporciones equilibradas, para que se produjera una lisis semiconfluente.
Se incub durante 18 horas a 30W y se recogi el fago contenido en la
sobrecapa aadiendo 15 ml. de caldo comn a la placa. La sobrecapa se
desprendi y se resuspendi en caldo por medio de una pipeta Pasteur
doblada en ngulo recto. Esta suspensin se centrifug a 5.000 r.p.m. una
hora y el sobrenadante fue recogido y filtrado mediante unas membranas de
0,22 pm.
Por ltimo, se realiza una nueva titulacin sobre la cepa propagadora
y se desecharon aquellos fagos cuyo ttulo no era elevado. Se conservaron
a 4W hasta su uso. Tambin se liofilizaron y fueron guardados a -70W.
c> Espectro ltico
Cada fago propagado fue enfrentado a 20 cepas patrn para
comprobar su espectro ltico. As se consigue detectar cualquier mutacin
o modificacin que haya podido tener lugar durante su propagacin.
El espectro ltico de los fagos se determin segn la descripcin de
Blair y Willams <1961>. Cada fago se titul sobre las siguientes cepas: 15,
27, 28, 28A, 37, 48, 71, 82, 155, 157A, 165, 275. 275A, 456, 459,
471A, A6C, A9C, 81 y RG, y se compararon los ttulos obtenidos sobre
MATERIAL Y MTODOS
64
ellas con el obtenido sobre la cepa propagadora. Se evaluaron estos ttulos

en una escala de 1 a 5 en la que el nmero 5 se adjudicaba a aquellas cepas
en las que el ttulo obtenido era igual al de la cepa propagadora, el 4 a las
cepas que presentaban un ttulo 10.1 o 10.2 veces menor, el 3 a ttulos o~
o i0~ veces menor y as sucesivamente.
Los valores del espectro ltico de cada fago fueron comparados con
los ya conocidos (elaborados previamente por nosotros) y se desecharon
aquellos cuyo espectro no coincida. Las Tablas 5 y 6 muestran los
espectros lticos de los fagos de los dos juegos utilizados.
Una vez obtenidos los fagos en las condiciones mencionadas se
conservaban a 40C, y a partir de ellos se prepararon las diluciones al
1000xRTD para
hacer la fagotipia. Diluciones que se repusieron
peridicamente en previsin de una posible prdida de ttulo.
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(u>
-4
El
-a
4
xi
04
u
[1
u
4
04
xi
O
66
MATERIAL Y MTODOS
67
3.3.2. TCNICA DE FAGOTIPlA
a> Realizacin
Cada aislado se inocul en un tubo de caldo comn a partir de un cultivo
puro y se incub a 48W durante 4 horas en agitacin. Una vez crecidos los
cultivos lquidos, se sembraron por inundacin en placas de agar comn 1,1
secadas previamente a 370C durante al menos 2 horas. Se retir el exceso
de liquido con una pipeta Pasteur y se dejaron secar las placas, destapadas
y boca arriba, entre 15 y 20 minutos a temperatura ambiente.
A continuacin se aplicaron los fagos, mediante el dispensador de fagos
diseado por Lindwell (1959) que deposita simultneamente todas las gotas
de fagos <0,02 m> cargadas en asas metlicas espirales. Cada asa se carg
con el fago contenido en los pocillos de un bloque de metacrilato estril en
los que previamente se hablan colocado las suspensiones de los fagos.
Cuando las gotas estuvieron secas, se taparon las placas, se incubaron a
37W durante 18 horas y se procedi a su lectura.
b> Lectura de resultados
Debido a la diferente sensibilidad de las cepas para ser lisadas por los
distintos fagos, la lectura se realiz de acuerdo con el siguiente criterio:
CL
: lisis confluente.
+ + : ms de 50 placas de lisis.
: entre 20 y 50 placas de lisis.
+
+
menos de 20 placas de lisis.
MATERIAL Y MTODOS
68
cl Interpretacin de los resultados

Como describieron Williams y Rippon <1952>, se pueden encontrar
pequeas diferencias en el fagotipo de cultivos individuales derivados de la
misma cepa. Estos autores sugirieron la aplicacin de la norma de las dos
diferencias, segn la cual, cuando dos cultivos presentan dos o mas
diferencias significativas, la posibilidad de que tengan un origen comn es
menor del 5%. As pues, la fagotipia, igual que otros mtodos de
tipificacin, reconocer aislados diferentes, pero, en el caso de ofrecer
patrones iguales, indicar una probable (aunque no segura> identidad.
d> Controles
Para garantizar la reproductibilidad de la tcnica de fagotipia, es necesario
realizar controles de forma continuada. As, en la rutina de la fagotipia se
incluan siempre tres cepas control <3002, 11684, 11334), cuyo fagotipo
es conocido <Tabla 7>,corrigiendo aquellas diluciones cuyo efecto no era el
esperado.
MATERIAL Y
MTODOS
69
TABLA 7: PATRONES DE FAGOTIPIA DE LAS CEPAS CONTROL
CEPAS
FAGOS
3002
11334
11684
15
27
28
28A
37
48
cL
CL
++
+
++
71
++
cL
82
155
157A
165
275
275A
456
CL
++
4+
CL
459
CL
4-
CL
++
CL
4-
CL
CL
CL
CL
4-
CL
CL
CL
CL
4+
+
471 A
A6C
el
RG
A9C
cL
CL
ci
CL
CL
++
4-
89904
CL
cL
CL
4+
89954
90319
90338
90340
90341
90352
90502
90509
43763
43764
43785
4+
4-
4+
+4
CL
CL
cL
cL
CL
CL
4+
++
+4
cL
CL
CL
CL
+4
4+
++
++
+4
Fagotipia realizada al 1.000 RID.
CL
CL
+4
+
CL
4+
4+
CL
MATERIAL Y
MTODOS
70
3.4.- TCNICA DE FAGOTIPIA INVERSA

La tcnica fue realizada segn el mtodo de De Saxe y
Notley
<1978> por induccin de los profagos o fagos lisognicos de los

estafilococos con mitomicina C.
Cada cepa problema se haca crecer en caldo comn durante 18
horas. Este cultivo era diluido 1/3 con caldo comn e incubado en bao a
370C durante 30 minutos. Transcurrido dicho tiempo, se aadi mitomicina
C para obtener una concentracin final de 0,5 pg/ml. Tras incubar
nuevamente en bao a 37W durante media hora se centrifug a 5.000
r.p.m. durante 15 minutos y se descart el sobrenadante. Se resuspendi
el sedimento en 2 ml de caldo comn y se incub 90 minutos en bao a
370C. Para permitir la liberacin de los fagos de los restos bacterianos, se
centrifug nuevamente a 5.000 r.p.m. 15 minutos y se recogi el
sobrenadante, en donde se supone que se encontraban los fagos inducidos.
A partir de aqu, se procedi igual que en la fagotipia, utilizando
estos fagos inducidos (como supuestos fagos> y estudiando los patrones de
lisis que producan sobre las cepas propagadoras de los dos juegos
utilizados. La lectura se realiz siguiendo los mismos criterios que en la
fagoti p ia.
3.5.- TECNICA DE FISK
Se inducen los fagos lisognicos mediante mitomicina C de igual
manera que en al apartado anterior.

Los fagos inducidos de cada aislado se enfrentan con cada uno de
los aislados a partir de los cuales se haba realizado la induccin <Fisk,
1942>.
MATERIAL
71
Y MTODOS
3.6.- PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIAI4JOS
3.6.1.- AGENTES ANTIMICROBIANOS PROBADOS
La seleccin de los agentes antimicrobianos con los que bamos a

trabajar se hizo combinando tres criterios:
-
Tratamos que estuvieran representados el mximo nmero de
grupos antimicrobianos.
-
Elegimos aquellos que estaban ms indicados en el tratamiento de
infecciones causadas por el gnero Stap/y/ococcus.

-
Escogimos aquellos sobre los que haba publicados numerosos
estudios acerca de la sensibilidad en los ECN.

Los antibiticos utilizados y los rangos de concentracin en
microgramos por mililitro se pueden observar en la Tabla 8
TABLA 8: ANTIBITICOS Y RANGOS DE CONCENTRACIONES (ng/m>
cido fuesdico
Ampicilina/Clavulnico
Cefotaxima
Ciprofloxacina
Clindamicina
Cloranfenicol
Cloxacilina
Eritromicina
Fosfomicina
Gentamicina
Penicilina
Tetraciclina
Rifampicina
Vancomicina
0,03
0,12
0,12
0,06
0,06
0,25
-32
-64
-1024
-16
-64
-64
0,12 -512
0,03 -512
0,12 -256
0,06
0,03
0,125
0,03
0,25
1024
1024
64
1024
64
MATERIAL Y MTODOS
3.6.2.-
MEDIO,
INOCULACIN
72
DETERMINACIN
DE
LA
CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA (CMI>
Las diluciones de los antimicrobianos probados utilizadas fueron

preparadas en agua destilada estril a partir de soluciones madre
preparadas en el momento de hacer las placas para el estudio de las CMIs.
Esta solucin madre correspondi en todos los casos a una dilucin 10
veces mayor que la concentracin ms alta que fuera a ser utilizada, y a
partir de ella se hicieron diluciones 1:2 para conseguir el resto de las
concentraciones mencionadas. El medio utilizado fue un agar Muller-Hinton.
El inculo de las cepas se realiz a partir de un cultivo de 18 horas
en agar sangre. Para ello se haca una suspensin de la cepa ya crecida en
PBS, ajustndola a una concentracin de 108 microorganismos/mililitro.
Las cepas se inocularon con un multirreplicador (Microtitter) que
deposita 0,001 ml de cada suspensin, con lo que de cada cepa se
inocularon aproximadamente 1 o~ unidades formadoras de colonias/mililitro.
En todas las ocasiones se incluy una placa del mismo medio sin
antibiticos como control de crecimiento.
Las placas inoculadas fueron incubadas a 370C entre 18-24 horas.

Al cabo de este tiempo se realiz la lectura del antibiograma, siendo la CMI
la menor concentracin del antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano tras 18 horas de incubacin. Se expresa en ng/ml.
3.6.3.- CONTROLES
Se emplearon las cepas 5. aureusNCTC 6571, NCTC 10442, ATCC
29213 y ATCC 25923.
73
MATERIAL Y MTODOS
3.6.4.- INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Para la interpretacin de los resultados se siguieron los criterios del
NCCLS. (National Committe for Clinical Laboratory Standards, 1993>. Tabla
9.
TABLA 9: VALORES ESTANDAR DE CMI (pglml> <NNCLS, 1993>

Sensible
Intermedia
Resistente
cido fucsdico
=1
Ampicilina/clavulnico
=4/2
Cefotaxima
=8
16-32
=64
Ciprofloxacina
=1
=4
Clindamicina
=0,5
1-2
=4
Cloranfenicol
=8
16
=32
Cloxacilina
=2
Eritromicina
=0,5
Fosfomicina
=32
Gentamicina
=4
=16
Penicilina
=0,12
=0,25
Tetraciclina
=4
=16
Rifampicina
=1
=4
Vancomicina
=4
8-16
=32
NCCLS Vol 13, N025, 1993.
=2
-
=8/4
=4
1-4
=8
=64
MATERIAL Y MTODOS
74
3.7.- PLASMIDOTIPIA
3.7.1.- PREPARACIN DE LOS LISADOS
La preparacin de lisados para la electroforesis en geles de agarosa
se hizo mediante el protocolo de Birnboim y Doly (1979> con algunas
modificaciones:
Las cepas se hicieron crecer en placas de agar sangre durante 18
horas a 370C.
-
Un asa bien cargada se resuspendi en 100 pl de solucin de lisis,
con lisostafina (Sigma> a una concentracin final de 250 U/ml. para

romper la pared celular.
-
Se incubaron en bao con agitacin durante media hora a 37W.
Se aadieron 200 ,uI de la solucin alcalina (NaOH y SDS>, agitando
suavemente el tubo. La solucin se hizo viscosa debido a la lisis

celular alcalina.
-
El tubo se mantuvo en un bao con hielo durante 5 minutos y
entonces se aadieron 150 pI de una solucin salina alta <acetato
potsico>, que proporciona una alta concentracin de sales que

aseguran la estabilidad de la doble hlice de DNA.
-
Se mantuvo el tubo Eppendorf a 00C durante 30 minutos.

Estas tres macromolculas contaminantes fueron separadas por
centrifugacin a 12.000 r.p.m. durante 5 minutos. Se retiraron 400

pl de sobrenadante mediante una micropipeta, transfirindolo a otro
tubo Eppendorf.
-
Un volumen de la solucin fenol-cloroformo fue aadido al
sobrenadante, para eliminar los lpidos y protenas residuales antes de

precipitar el ADN plasmdico con etanol.
MATERIAL
Y MTODOS
75
Se centrifug 5 minutos a 12.000 r.p.m. y se recogieron 300 pl de
sobrenandante, que se transfirieron a otro Eppendorf.

-
Se aadieron dos volmenes 1600 pI) de etanol fro y iSp de
cloruro sdico SM. Se centrifug durante 5 minutos a 12.000 r.p.m.

El sobrenadante se retir con una pipeta.
-
El sedimento se resuspendio en 25 pl de una solucin de Tris CIH
y EDTA <TE) con ARNasa a una concentracin final de 25 pg/ml.

-
Se incub en estufa a 37W 15 minutos para que actuara el enzima
eliminando los restos de RNA.

33.2.- ELECTROFORESIS DEL ADN PLASMIDICO.
En los pocillos de los geles de agarosa al 0,8% fueron colocados 10
pl de muestra, obtenida por el procedimiento anteriormente descrito, junto
con 2 pl de colorante <azul de bromofenol y xilencianol). Los plsmidos
fueron separados en razn de su peso molecular mediante una electroforesis
horizontal a 60 voltios con tampn de electroforesis TAE 1X. Tras ser
teidos con bromuro de etidio media hora, los plsmidos fueron visualizados
con un transiluminador de luz ultravioleta de 250 nm.
3.7.3.- CONTROLES
En un pocillo de los extremos se coloc, como control de peso
molecular, el ladder <Supercoiled ladder de Sigma> que contena 11

plsmidos cuyos tamaos variaban desde 2,1 a 16,2 kb.
MATERIAL Y MTODOS
76
3.8.- ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO

En 1984, Schawartz y Cantor observaron que molcuias de ADN
mayores de 50 Kb podan ser separadas mediante el uso de campos
elctricos alternativos en un proceso conocido como electroforesis en
campo pulsado (Cantor y cols., 1988>.
3.8.1.- OBTENCIN DEL ADN
De un cultivo puro de 24 horas, se inocularon 10-20 colonias en
20 ml de BHI y se incub a 37W en agitacin durante 3-4 horas.

-
Tras aadir 0,5 ml de EDTA fro a cada cultivo y se centrifug
durante 20 minutos a 3.000 r.p.m.

-
Lavar el sedimento con solucin de lavado <fro> (lOmM Tris CIH,
lOmM EDTA, lOmM EGIA, 1M CINa> y centrifugar de nuevo.

<Repetir este paso dos veces>.
-
Se resuspendi el depsito en 7 ml de solucin de lavado.
Se prepar un dilucin 1/10 en solucin de lavado y se midi la
densidad ptica <D.O.) a 420 nm.

-
Una vez medida la 0.0. se calcula el nmero de clulas en la
suspensin y a partir de esta suspensin inicial se obtiene otra de iO~

U FC/ml.
-
Preparar la agarosa LMP <agarosa de bajo punto de fusin> al 2% en
solucin de lavado, mezclar a partes iguales dicha agarosa y la

suspensin bacteriana. Con esta mezcla se rellenan los moldes,
preparndose as los bloques.
-
Dejar los bloques de agarosa a 4W y una vez endurecidos volcar
en bijoux , a los que se ha aadido 3 mt de solucin de lisis < 6mM

Tris CIH, lOOmM EDTA, 1M CINa, 0,5% Brij 59, 0,2% Deoxicolato
sdico, 0,5% Lauril sarcosil> que contiene 30 U/ml de lisostafina
MATERIAL Y MTODOS
77
(Ambicin L> y SOOpg/ml de lisozima. Incubar toda la noche a 37W en

un bao con agitacin.
-
Se retir la mezcla de lisis y se reemplaz con 3 ml de solucin de
proteolisis < 0,25M EDTA, 2OmM EGTA, 1% Lauril sarcosil> con 250
pg/ml de proteinasa K.
-
Se incub a 56W durante 5-6 horas en agitacin, transcurridas las
cuales se cambia la mezcla de proteolisis con proteinasa K por otra
fresca y se deja durante toda la noche.

-
Se procedio a realizar tres lavados en TE, para eliminar la proteinasa
K, dejando cada lavado al menos 10 minutos a 4W. Los cambios se

realizaron a 40C.
-
Los bloques pueden ser conservados en TE durante al menos 6
meses, cambiando la solucin de TE mensualmente.

3.8.2.- DIGESTIN DEL ADN
Se transfiere medio bloque a un Eppendorf y se aadi 100-200 pl
de la solucin Y (33 mM Tris-acetato <pH 7,9>, lOmM acetato de

magnesio y 66 mM de acetato potsico>
Se dej equilibrando
durante 30 minutos en hielo.

-
Se sustituy la solucin por 100 pl de solucin fresca que contiene
10 unidades de Smal y se incub a 30W durante 3-4 horas.

-
Se repiti este ltimo paso de nuevo.
Para terminar la digestin se aadi TE y se conserv a 4W hasta
su utilizacin.
3.8.3.- ELECTROFORESIS
Para la electroforesis se utiliz un equipo CHEF-DR II de Biorad.
Se prepar 400 ml de agarosa al 1,2% en solucin 0,5 X de Tris
borato <TEE>
Tras disolverla mantenerla a 55-600C
MATERIAL
Y MTODOS
78
Ensamblar el molde y comprobar que est nivelado, colocar el peine
y volcar la agarosa dejndola enfriar.

-
Una vez solidificada, retirar el peine e introducir en los pocillos los
bloque de agarosa y rellenar los pocillos con agarosa, para inmovilizar

el ADN.
-
En el ltimo pocillo se coloc un marcador de pesos moleculares <E.
coil MG 1655 digerida con Nor 1>.

Se llen el tanque de electroforesis con 2,5 litros de TBE 0,5 X y se
dej recircular hasta que se enfri a 120C
-
Se introduce el gel de agarosa comprobando que lo cubre el TBE
0,5 X.
-
Las bandas de ADN fueron separadas con pulsos de 1 a 35
segundos durante 42 horas a 200 y.

-
Una vez finalizada la electroforesis, el gel fue teido con bromuro
de etidio a 1 pg/ml durante media hora y fue desteido en agitacin

por espacio de dos o tres horas.
El gel fue visualizado en un transiluminador de luz ultravioleta de
250 nm., y fotografiado con una cmara Polaroid.

3.8.4.- ANLISIS ESTADiSTICO DE LOS DATOS
Se asign un tipo arbitrario a cada uno de los patrones de bandas
obtenidos con la electroforesis en campo pulsado. La similitud entre los
tipos fue evaluada con el programa informtico MVSP (Kovach Computing
Services, 85 Nant-y-Felin, Pentraeth, Anglesey LL758UY, Wales, Reino
Unido> que realiza el anlisis estadstico de multivariables.
El programa cre una matriz de coeficientes de similitud, coeficiente
de Sorensen o Dice <Rmling, 1992) y gener un dendograma, por
emparejamiento de medias no ponderadas, que relacionaba los diferentes
patrones segn los indices de similitud <Li, 1981>.
MATERIAL Y MTODOS
.79
APNDICE
Como regla general, salvo que se indique lo contrario, todas los
medios, reactivos y soluciones una vez elaborados se conservarn en nevera
a 40C hasta su uso.
MEDIOS
DE
CULTIVO
UTILIZADOS
EN
EL
AISLAMIENTO
CONSERVACIN
AGAR SANGRE
Sangre de carnero
Bacto Mueller Hinton medium
5%
gr
300
gr
Ingredientes <por litro>:

Infusin de carne
Acidos de casamino
17,5
gr
Almidn
17
gr
Bacto agar
17
gr
pH final 7,3.
Preparacin: resuspender 38 gramos de polvos Mueller Hinton en un
litro de agua destilada y hervir hasta disolver el medio completo. Esterilizar
en autoclave a 1210C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50W y aadir 50
ml de sangre para obtener una concentracin del 5%.
AGAR MANITOL SALADO
Ingredientes <por litro):
Peptona proteasa
10
gr
Extracto de carne
gr
0-manitol
10
gr
Cloruro sdico
75
gr
MATERIAL Y
MTODOS
Bacto agar
Rojo fenol
80
15
gr
0,025 gr
pH final 7,4
Preparacin: resuspender 111 gramos en un litro de agua destilada
y calentar hasta la ebullicin para disolver completamente. Esterilizar en
autoclave 15 minutos a 121 0C y enfriar hasta 45-500C. Dispensar en
placas Petri estriles.
LECHE DESNATADA
Es un producto estandarizado recomendado para la conservacin de
los cultivos. Cuando se prepara al 10% equivale a leche desnatada fresca.
Preparacin: disolver 100 gramos en un litro de agua destilada.
Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 0C. Ajicuotar a 0,5 men viales.
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACIN
MEDIO P
Ingredientes (por litro>:

Peptona
10
gr
Extracto de levadura
gr
Cloruro sdico
gr
Glucosa
gr
15
gr
Bacto agar
pH final 7,2
Preparacin: disolver en un litro de agua destilada y ajustar el pH a

7,2. Calentar para que se disuelva. Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 1210C y repartir en placas.
)
>
MATERIAL
81
Y METODOS
BHI (infusin de cerebro y corazn

Infusin de cerebro de ternera
200
gr
Infusin de corazn de vacuno
250
gr
10
gr
Dextrosa
gr
Cloruro sdico
gr
2,5
gr
Peptona proteosa
Fosfato disdico
.....,....
pH final 7,4.
Preparacin: disolver 3? gramos en un litro de agua destilada.
Distribuir a 5 ml por tubo y autoclavar.
PES (Tamnn fosfato
Fosfato disdico
1,09 gr
Fosfato sdico
0,31
gr
Cloruro sdico
.8,5
gr
pH final 7
Preparacin: disolver las cantidades indicadas en un litro de agua

destilada. Esterilizar en autoclave a 121 oc durante 15 minutos.
82
MATERIAL Y MTODOS
AGAR NUCLEASA TERMOESTABLE

Tris(hidroximetil)aminometano
6,1
gr
ADN
0,3
gr
Cloruro sdico
10
gr
Bacto agar
10
gr
Cloruro clcico anhidro
1,1
Azul de totuidina
0,083gr
gr
Preparacin: pesar 6,1 gramos de Tris y aadir un litro de agua

destilada. Ajustar el pH a 9. Aadir el ADN, cloruro sdico, agar y cloruro
clcico anhidro y disolver calentando hasta la ebullicin. Enfriar a 45-500C
y aadir O,083.gramos de azul de toluidina. Mezclar bien y repartir en
placas. No es necesaria la esterilizacin.
MEDIO PARA LA DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DNAsa
DNAsa test agar

Triptosa
cido deoxirribonucleico
Cloruro sdico
Agar
20
gr
gr
gr
15
gr
Preparacin: Disolver 8,4 gr de DNAsa test agar en 200 ml de agua

destilada. Calentarlo hasta la ebullicin para la disolucin completa del
medio. Aadir azul de toluidina al 0,01% y autoclavar.
MATERIAL Y MTODOS
83
MEDIO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD UREASA

Urea agar base
Peptona
gr
Dextrosa
gr
Cloruro sdico
gr
Fosfato potsico monobsico
gr
20
gr
Urea
Rojo fenol
0,01 2gr
Preparacin: Disolver por ebullicin 12,45 gr de agar en 750 ml de

agua destilada, esterilizar en autoclave y enfriar hasta 50W, entonces
aadirte 75 ml de una solucin filtrada de urea agar base <21,75 gr de urea
agar base en 75 ml de agua destilada>. Distribuir en tubos a 2 ml.
MEDIO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DECARBOXILASA
Decarboxilasa medio base
Peptona
gr
Extracto de levadura
gr
Dextrosa
gr
Prpura de bromocresol
0,02 gr
Preparacin: A un litro de medio base decarboxilasa, que

previamente ha sido disuelto calentadolo suavemente, se le aade 0,5% de
los minociod-L apropiados. Se distribuye en tubos a 5 ml por tubo y se
autoclava.
>
MATERIAL Y MTODOS
84
MEDIO Y REACTIVO PARA LA DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD

FOSFATASA
Aaar nutritivo difosfato de fenolftaleina

-
Agar:
Extracto de carne
gr
Peptona
gr
Cloruro sdico
gr
15
gr
Sal sdica difosfato fenoftaleina<5%>2

98
Agar nutritivo fundido <450C>
ml
ml
Bacto agar
pH final 7,3
-
Sustrato:
.
Preparacin: fundir la cantidad exacta de agar en un litro de agua

destilada. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 11 50C y enfriar hasta 4550W. Agregar el sustrato previamente filtrado mediante una membrana de
0,22 pm de dimetro y volcar aspticamente en placas Petri.
Reactivo cara la crueba de la fosfatasa
Hidrxido sdico iON <40%>:
Hidrxido sdico
Agua destilada
40
gr
100
ml
gr
100
ml
REACTIVOS RM/VP <produccin de acetoina

Reactivo A): a-naftol al 5%
a-naftol
Alcohol etlico <absoluto)
85
MATERIAL Y MTODOS
Reactivo 6): hidrxido potsico al 40%

Hidrxido potsico
Agua destilada
40
gr
100
ml
REACTIVOS PARA LA REDUCCIN DE NITRATOS

Reactivo A>: Dimetil-a-naftilamida al 0,6%
Dimetil-a-naftilamida
cido actico SN <30%>
6
.
gr
Reactivo 6>: cido sulfanilico al 0,8%

cido sulfanflico
cido actico SN (30%>
8
-
gr
Preparacin: disolver el dimetil-a-naftilamida en el cido actico

mediante un suave calentamiento. Ambos reactivos se filtran y se guardan
protegidos de la luz en un frasco de topacio.
MEDIO PARA DETERMINAR LA FERMENTACIN DE HIDRATOS DE
CARBONO
Prpura aaar base
-
Agar:
Peptona
10
gr
Extracto de carne
gr
Cloruro sdico
gr
15
gr
Bacto agar
Prpura
0,02 gr
pH final 6,8
-
Sustrato:
Azcares al 10% en H20 destil.
200
ml
MATERIAL
86
Y MTODOS
Preparacin: disolver la cantidad apropiada de agar para un litro de

agua destilada calentando hasta la ebullicin. Esterilizar en autoclave a
121 0C durante 15 minutos. Enfriar hasta 45-50W y aadir 200 mililitros del
carbohidrato que queremos preparar previamente esterilizado por filtracin
para obtener una concentracin final del 1 %.
MEDIO PARA DETERMINAR LA SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Ingredientes:
MedioP
Novobiocina <16 pg/ml)
180
ml
20
ml
PRODUCCIN DE CIDO A PARTIR DE GLICEROL CON ERITROMICINA
Ingredientes:
Prpura agar base
Glicerol
Eritromicina
1
10
ml
ml
Preparacin: aadir al prpura agar base 10 mililitros <1%> de glicerol.

Esterilizar en autoclave a 116W durante 20 minutos y enfriar en bao hasta
50 0C. La solucin de eritromicina se prepara disolviendo 40 mg en 5 ml de
etanol al 95% y aadiendo agua hasta 100 ml. Se esteriliza por filtracin y
se aade 1 ml a un litro del medio base con glicerol estril y enfriado a
500C. Se mezcla perfectamente por agitacin y se reparte en placas Petri.
La concentracin final de eritromicina es de 0,4 pg/ml.
MATERIAL Y MTODOS
87
MEDIOS Y REACTIVOS UTILIZADOS EN LAS TCNICAS DE FAGOTIPIA
CALDO COMN (Nutrient broth

Extracto de carne
gr
Peptona
gr
pH final 6,8.
Preparacin: disolver los 8 gramos en un litro de agua destilada.
Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 12100.
AGAR COMN 1.1
Agar nutritivo
TSB
17
7,8
gr
gr
Preparacin: pesar las cantidades necesarias par un litro. Esterilizar

en autoclave durante 15 minutos a 121 0C y verter en placas Petri.
AGAR SEMSLIDO
Ingredientes:
Caldo comn
1,2
gr
Bacto agar
0,75
gr
Agua destilada
150
ml
Preparacin: disolver las cantidades indicadas en un bao de

ebullicin y cuando el agar est disuelto, repartir a 6 ml en tubos. Esterilizar
en autoclave a 210C durante 15 minutos.
88
MATERIAL Y MTODOS
CLORURO CLCICO
Ingredientes:
Cloruro clcico
gr
Agua destilada
100
ml
Preparacin: disolver un gramo de cloruro clcico en 100 ml de agua

destilada y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 0C.
REACTIVOS UTILIZADOS EN LA TCNICA DE PLASMIDOTIPIA
SOLUCIN DE LISIS
Ingredientes:
TrisCIH1MpH8
2,5
ml
EDTAO,5MpH8
ml
Glucosa 500 mM
10
ml
85,5
ml
Agua destilada
Preparacin: Para elaborar el Tris-CIH 1M pesar 121,14 gr y

disolverlos en 800 ml de Agua destilada, aadir cido clorhdrico puro hasta
conseguir un pH de 8 y enrasar con agua destilada hasta un litro. El EDTA

O,5M se obtiene al disolver 186,12 gr en 800 ml de agua destilada, se
aade NaOH 10 N para disolverlo hasta llegar a un pH de 8 y se enrasa con
agua destilada hasta un litro. En el caso de la glucosa 500 mM pesamos
9,908 gr de glucosa y los disolvemos en 100 ml de agua destilada estril,
esterilizando por filtracin dicha solucin. Las soluciones anteriormente
descritas se guardan a temperatura ambiente exceptuando la glucosa 500
mM que se guarda a 4aC.
Una vez que tenemos todas las soluciones medimos todos los
MATERIAL
89
Y MTODOS
componentes y los mezclamos obteniendo la solucin de lisis que se filtra

mediante una membrana de 0,22 pm. Guardar a 40C.
Al utilizar la solucin de lisis hay que aadir 25 pl de lisostafina
(preparada con Tris CIH lM a una concentracin de 10.000 pg/ml para
conseguir una concentracin final de 250 pg/ml> a 1 ml de solucin de lisis.
SOLUCIN ALCALINA
Ingredientes:
Hidrxido sdico 0,2M
SDS 1%
Preparacin:
-
El NaOH se prepara 0,4M <1,6 gramos en 100 mIde agua destilada
estril>.
-
EJ SDS se prepara al 2% <2 gramos en 100 mi de agua destilada
estril>
En el momento de usarse se coge un volumen de NaOH 0,4M y un
volumen de SDS al 2&, obtenindose as las concentraciones necesarias.

SOLUCIN SALINA ALTA
Ingredientes:
Acetato potsico SM
60
ml
cido actico glacial
11,5
ml
Agua destilada
28,5
ml
Preparacin: el acetato potsico 5M se prepara pesando 490,75

gramos y disolvindolo en un litro de agua destilada.
90
MATERIAL Y MTODOS
SOLUCIN FENOL-CLOROFORMO
Ingredientes:
Fenol
500
ml
Cloroformo
500
ml
Alcohol isoamlico
10
ml
Hidroxiquinoleina
gr
Agua destilada estril
100
ml
TNE lx
100
ml
Preparacin: mezclar todos los ingredientes y dejarlos reposardurante

18 horas en un recipiente bien tapado. Aspirar toda la fase acuosa, tirarla
y aadir 100 mIde TNE
lx (10 ml Tris 1M, 2 ml EDTA 0,5M, 20 ml CINa
SM y agua hasta un litro> Mezclar bien y dejar reposar otras 18 horas.

Aspirar de nuevo toda la fase acuosa, desecharla y aadirle otros 100 ml de
TNE lX. Mezclar y dejar reposar. Guardar a 40C en oscuridad.
CLORURO SDICO SM
ingredientes:
CINa
Agua destilada
292,2
gr
enrasar hasta un litro
Preparacin: disolver el cloruro sdico en un litro de agua en bao a

500C mediante agitacin.
MATERIAL Y MTODOS
SOLUCIN
91
TE
Ingredientes:
Tris 1M
EDTAO,5M
Agua destilada
10
ml
ml
Preparacin: medir las cantidades indicadas y filtrar en una membrana

de 0,22 pm de dimetro.
TAMPN DE ELECTROFORESIS CTAE lx
Ingredientes para el TAE 50X:
Tris
cido actico glacial
EDTAO,5M
Agua destilada
242
57,1
100
gr
ml
ml
Preparacin: disolver todos los componentes a temperatura ambiente

y en agitacin.
Para preparar el TAE lx se cogen 40 ml de TAE SOX y se enrasa con

agua destilada hasta 2 litros.
COLORANTE PARA ELECTROFORESIS
Ingredientes:
Glicerol en agua
30 %
Azul de bromofenol
0,25 %
Xilencianol
0,25 %
92
MATERIAL Y MTODOS
BROMURO DE ETIDIO
Ingredientes para una solucin stock <lOmg/ml>:
Bromuro de etidio
Agua destilada
250
25
mg
ml
Preparacin: solubilizar el bromuro de etidio mediante agitacin.

Para la solucin de uso se aaden a un litro de agua lOOpl de la
solucin stock de bromuro de etidio. La concentracin final es de lpg/ml.
SOLUCIONES UTILIZADAS EN LA TCNICA DE PFGE
EGTA 0.1M
Ingredientes:
EGTA
Agua destilada
19,02 gr
300
ml
Aadir NaOH 1 N hasta un pH 8 para conseguir una buena disolucin.

Enrasar con agua destilada hasta 500 ml. No necesita esterilizacin
y conservar a temperatura ambiente.
SOLUCIN DE LAVADO PARA ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO
Ingredientes:
Tris CIH IM
10
ml
EDTAO,5M
20
ml
100
ml
EGTAO,1MpH8
200
ml
CINa SM
Preparacin: ya ha sido descrita en la tcnica de plasmidotipia.
MATERIAL Y MTODOS
93
SOLUCIN DE LISIS
TrisCIH1M
0,6
ml
EDTAO,SM
20
ml
CINa SM
20
ml
0,5% Brij 59
0,2% Deoxicolato sdico
0,5% Lauril sarcosil
0,5
gr
0,2
gr
0,5
gr
Ajustar al pH a 7,5 con CIH. Enrasar a 100 ml con agua destilada.

Conservar a temperatura ambiente.
SOLUCIN DE PROTEOLISIS
EDTAO,5M
250
ml
EGTAO,1M
100
ml
Ajustar el pH a 9 con NaOH y aadir

Lauril sarcosil 30%
ml
Enrasar hasta 500 ml con agua destilada. No necesita esterilizacin.

Conservar a temperatura ambiente.
TAMPN TBE 10 X
Tris
EDTA Na2
cido brico
Agua destilada
108
gr
4,65 gr
55,65 gr
1000
ml
94
RESULTADOS
4.-RESULTADOS
95
RESULTADOS
4.1- VALORACIN
DE LOS DATOS CLINICOS DE
LOS CASOS
ESTUDIADOS
4.1.1.- SELECCIN DE LOS AISLADOS
Para realizar nuestro estudio seleccionamos los estafilococos
coagulasa negativos basndonos en dos criterios:
-
Que los ECN fueran aislados en diferentes hemocultivos de un
mismo paciente.
-
Que dispusiramos de ja informacin cimba dei paciente.
De este modo seleccionamos 158 estafilococos coagulasa negativos

de 63 episodios pertenecientes a 52 pacientes.
4.1.2.- ORIGEN DE LOS AISLADOS
El origen de todas las muestras en las que se aislaron los 158
estafilococos coagulasa negativos seleccionados fue la sangre.
4.1.3.- CARACTERISTICAS CLINICAS DE LOS PACIENTES
Al analizar los datos obtenidos de las historias clnicas observamos
que los ECN seleccionados fueron aislados de pacientes que cumplan al
menos una de las siguientes caractersticas:
-
Rotura de la barrera natural de la piel como es el caso de las
pacientes de ciruga, traumatologa, etc.

-
Presencia de dispositivos implantados como catteres, prtesis, etc.
Ser pacientes inmunocomprometidos.
Ser neonatos.
RESULTADOS
96
4.1.4.- VALORACIN CLNICA DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS POR

ECN
Los hemocultivos de los 52 casos fueron valoradas por el clnico en
funcin de los resultados preliminares obtenidos en el laboratorio de
microbiologa del hospital estableciendo tres categoras:
-
-lemocultivo sin significacin clnica en cuyo caso al ECN aislado
no se le daba un valor clnico, pudiendo ser considerada como

contaminante.
-
Heniocultiva de dudosa significacin clnica en el que no estaba
claro el valor clnico del ECN aislado de hemocultivo.

-
Hemocultivo con significacin clnica en el que el ECN aislado de
sangre fue considerado el patgeno causante de la bacteriemia.

Segn esta valoracin clnica, de los 52 casos seleccionados 37
(71,1%) presentaron hemocultivos con significacin clnica, 8 (15,4%)
dudosa significacin clnica y 7 (13,5%) sin significacin clnica.
4.1.5.- DISTRIBUCIN POR REAS DE ASISTENCIA DE LOS CASOS DE
BACTERIEMIA ESTUDIADOS
En relacin a las cinco grandes reas de asistencia establecidas en
el informe EPINE, observamos que en el hospital Val DHebron de los 52
pacientes ingresados durante 1991 en cuyas hemocultivos se aislaron ECN:
el mayor porcentaje de pacientes fue ingresado en el rea de ciruga donde
tuvo lugar el 30,8% de los ingresos, seguido del rea de pediatra (25%),
atencin intensiva <23,1 %), rea de medicina (19,2%), otros servicios
(1,9%), no encontrndose ningn ingreso en el rea de obstetricia y
ginecologa. Fig. 5.
RESULTADOS
99
4.3.- ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA FAGOTIPIA

Los 158 aislados fueron fagotipados al aplicarles dos juegos de
fagos: el de IDean y william? (De Saxe y Notley, 1978) y el cte Martin de
Nicols y colaboradores (1990>, juego autctono obtenido en nuestro
laboratorio. La fagotipia se realiz al 1000 RTD, los fagos fueron aplicados
a una concentracin mil veces mayor que la dilucin de rutina sobre los
aislados crecidos en un caldo comn durante 4 horas a
480
C.
El uego de Dean y Williams est constituido por los siguientes fagos:

15, 27, 28, 28A, 37, 48, 71, 82, 155, 157A, 165, 275, 275A, 456, 459,
41 7A, A6C, 81, RG, A9C. Los fagas pertenecientes al luego autctono
son: 89904, 89954, 90319, 90338, 90340, 90341, 90352, 90502,
90509, 43763, 43764, 43785.
4.3.1.- PROPORCIN DE TIPABILIDAD
La proporcin de cepas tipificadas por fagotipia varia al utilizar
nicamente el juego de fagos de Dean y Williams, el autctono y el juego
de fagos combinado <que resulta de la aplicacin conjunta de ambos juegos
de fagas).
Cuando realizamos la fagotipia con los dos juegos de fagos por
separado nicamente el 24,7% de los aislados fueron sensibles a algn
fago del juego de Dean y william?. El porcentaje de tipabilidad aument
ligeramente con el juego de fagas autctono, de manera que un 26,6% de
las cepas result sensible a algn fago de ese juego. El hecho de que se
obtuviera un bajo porcentaje de tipabilidad al aplicar ambos juegos de fagas
por separado nos llev a aplicarlos conjuntamente aumentando la
proporcin en un 10,1%, llegndose a tipar un 34,8% de los aislados y
quedando el 65,2% sin caracterizar. Fig. 7.
101
RESULTADOS
TABLA 10: PATRONES DE FAGOTIPIA CON EL JUEGO DE FAGOS

COMBINADO
Pagotipo
Fago. qn. produj.ron
.flctc
iltico
Nnsmao.
(U. caso.>
43705
2 (1>
90241
6 (4)
13
2 (2.>
456
2 (2.>
90352
1 (2.)
27
2 (1)
27,90509
2 (2.>
456,459
4 (2>
90319,43705
2 (2.>
2.0
90328,90241
2. (1)
2.1
27.471A
1 (12
2.2
456,47fl,90509
2 (1>
2.2
275A,459,9O341
2 (1)
14
456,459,90341
2. (2.>
15
456,459,471A
2. (1)
2.6
90340,90341,43785
1 ~)
2.7
ASC.45.459.MC
1 (11
2.8
MC.456,459,471.90341
2. (2.>
19
27,459,471A,R0.90240,90509
1 (1>
90,27,9031E90330.90340,90341,42785
2 (2.>
21
90319,90338,9030,90341,43763,43764,42783
3 (2>
22
27,82.157,454,471A,9034O
2. (1>
23
27,90319,90220>90240,90241,90252.90509,43763.43764>43785
1 <1)
2*
27,275.456,459,471,46C,S1.89904,90240,90341,90509,,3705
1 (2.>
25
15,27,12,155,275,451,459,47fl,51,90319,90238,90340,90241,90509.43783,43785
1 (1>
26
A9C,275.27M.456,45$,472.A,MO,S1,89954,9O319,90236.90340,90341,90352.90502,
90509.43762,43764,43705
2. (1>
27
APC,S2,275,275A,456,459,471A.AC.8t59904,90319,90234,90340,90341,90352,
90502 90509,43763,43764>43705
X II)
20
90,15,44,B2,15fl,275,27fl,456,459.471,,MC,S2.,89904,19954,90319.90338,90240
90341.90352,90502,90309,43763
0 (1>
29
27,29,82 , 2.57k, 275, 275A,456 .459, 471A,~6C,81>09904,89954,90319 .90338,90240,

90341,90252,90502.90509,43763>43764,43785
2. (1>
SO
2(0 t1
20
91f1ch1
CV?>
103 (38)
RESULTADOS
102
4.3.3.- FRECUENCIAS DE PATRONES DE FAGOTIPIA

Los patrones encontrados entre los aislados tipificados se dividieron
en tres categoras: patrn largo (seis o ms reacciones), intermedio <de tres
a cinco reacciones) y corto <una o dos reacciones>. En la Tabla 11 se
recogen los porcentajes de patrones obtenidos con el juego de lagos
combinado, siendo el patrn corto el que present un mayor porcentaje
(15,8%) seguido muy de cerca por el patrn largo (13,3%).
TABLA 11: FRECUENCIAS DE PATRONES DE FAGOTIPIA

Aislados
N0 (%)
Patrn de fagotipia
N0 (%)
Aislados tipificados
55(34,8)
Patrn corto
25<15,8)
Patrn intermedio
9<5,7)
Patrn largo
21 (13,3)
Aislados no tipificados
103(65,2)
4.3.4.- FRECUENCIAS DE REACCIN DE LOS FAGOS

En el juego de Dean y William? el fago que presenta una mayor
frecuencia de reaccin es el 471A <16,7%) seguido del 456 (16,4%) y del
459 <15,8%). En el juego autctono la mayor frecuencia de reaccin la
presentan los lagos 90341 <19,6%>, 90340 (13,9%) y 90338 <12,0%)
como se puede comprobar en la Figura 8.
Al analizar las frecuencias de reaccin de los distintos fagos hemos
observado que tanto en el juego de Dean y William? como en el
RESULTADOS
104
4.4.- ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE FAGOTIPIA INVERSA

El hecho de que con la fagotipia el 65,2% de los aislados quedaran
sin tipificar, nos llev a realizar la fagotipia inversa para conseguir una
mejor caracterizacin de los casos.
La fagotipia inversa se realiz sobre todos los aislados recibidos de los
52 pacientes. Los 158 aislados fueron tratados con mitomicina C para
convertir sus lagos lisognicos en lticos. Cada fago supuestamente
inducido fue aplicado de igual manera que en la fagotipia, pero en este caso
sobre 32 cepas patrn (20 cepas propagadoras del juego de fagos de
Dean y Williams y 12 del juego autctono).
La proporcin de aislados tipificados por fagotipia inversa vara al
utilizar nicamente las cepas propagadoras del juego de Dean y Williams,
las del juego autctono y las de ambos.
Cuando realizamos la fagotipia inversa con las cepas patrn de Dean
y William? el 22,8% de los aislados se tiparon. El porcentaje de tipabilidad
fue menor con las cepas propagadoras del juego autctono (17,7%).
Los bajos porcentajes de tipabilidad nos llevaron a que realizramos
la fagotipia inversa con las propagadoras de ambos juegos de fagos,
aumentando la tipabilidad en un 2,5%, llegndose a tipar un 25,3% de los
aislados y quedando sin caracterizar el 74,7%. Fig. 9.
4.4.2.- PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
Los patrones de lisis obtenidos al realizar la fagotipia inversa sobre las
cepas propagadoras del juego de Dean y Williams y del autctono estn
recogidos en la Tabla 12.
105
RESULTADOS
TABLA 12: PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA
!
ragotipo 1 capas patrdn las qn. los fagos Inducidos han producido lIsis 1 rflslados.
2.
71
1 (1)
90319
2 (1>
90343
2 (2)
48,71
3 (2)
48,153
1 (1>
15,90374
1 (1)
2.5,90342
2 (1>
456,471k
1 (1>
2&h~,1SS
1 (1)
10
190,21,71
a ci>
11
15,48,155
4 (1)
2.2
15,71,2754,456,47fl,90319
1 (1>
13
90.89925,89939,90319 ,90418 ,90510
1 (11
14
48,71,459,471,90319.90343,90374.90510
2 (1)
15
MC.28,456,89925,89929,90319,90343,9041B.90510
1 (1)
16
15,155,157k, 275L456 .89939 90319,90243 90418 90310
1 (11
15.48.71,155,275,275k,459,471k,89939 ,90243.9041B
4 (2>
2.8
15,2B,4B,71,B2,275,459,4711.,89929,90343,9041B
19
15.28L48.71.1S5,275.275L459,472A,89929,90343
20
15,28k,6B,71,B2,155,157.27M,456,89939,90319,90343,90418.90510
1 (11
21
15,27,2fl.48,71,155.275,2?5L456,459,47fl,99939,90243.9041B
2 (1>
22
15.2B.2B,,1,82.155.157k.16S.2,5.2,5A.456,459.47..SC,89925,89939,90319
2 (1>
23
15,2BL82,137A,275,275k,456,459,4711,16C.81,B9925,89939,90319,90343,90374,
90416,90510
1 (1)
24
fl tipificahl.8
,90347,9OUB
(U)
Aislados en los que se han inducido Lagos.
(1)
2 (1)
119
(42)
RESULTADOS
107
4.5.- UTILIZACIN DE UN JUEGO DE FAGOS ADICIONALES PARA LA

TIPIFICACIN DE LOS ECN
La baja proporcin de aislados tipificadas mediante fagotipia y
fagotipia inversa nos llev a la utilizacin de un juego de fagos adicionales
con el fin de conseguir una mejor caracterizacin de los casos.
Para obtener el juego de fagos adicionales entre nuestros aislados
fueron elegidas cinco cepas en las que se indujeron sus profagos mediante
mitomicina C. Esta seleccin se realiz basndonos en el gran efecto ltico
producido por los fagas obtenidos a partir de las citadas cepas sobre las
cepas propagadoras de los juegos de Dean y Williams y autctono. Este
juego est constituido por los fagos: 8596, 8620, 11697, 11711, 12366.

De los 158 aislados, con e> fin de conseguir una mejor caracterizacin
de los casos, seleccionamos 106 para ser fagotipados con los cinco fagos
adicionales <8596, 8620, 11697, 11711, 12366) resultando 22<20,7%)
sensibles a algn fago del juego adicional y 84 (79,3%) fueron no tipables.
4.5.2.- PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON EL JUEGO DE FAGOS
ADICIONALES
Con el juego de fagos adicionales obtuvimos cinco patrones, los
cuales se describen en la Tabla 14.
108
RESULTADOS
TABLA 14: PATRONES DE FAGOTIPIA CON EL JUEGO DE FAGOS

ADICIONALES
<N casos>
Fagotlpo
Fagas que produjeron efecto
N0AIsIados
11697
7(4)
12366
2(1)
11711, 12366
4(2)
11697, 11711, 12366
9(2>
No tipificables <NT)
84 (29)
4.6.- ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA TCNICA DE FISK

Seleccionamos 89 aislados que fueron tratados con mitomicina C
para convertir sus profagos en fagos y se realiz la tcnica de la fagotipia
enfrentando dichos fagos a las 89 cepas parentales.
Esta tcnica nos permiti tipificar el 23,6% de los aislados, quedando
el 76,4% sin caracterizar.
4.6.2.- PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON LA TCNICA DE FISK
Al aplicar los fagos inducidos sobre las cepas parentales obtuvimos
seis patrones como puede verse en la Tabla 15.
109
RESULTADOS
TABLA 15: PATRONES OBTENIDOS CON LA TCNICA DE FISK
Fagotipo
Fagos que produjeron efecto
NAslados
(N casos>
2707
5 (2>
1357
2 (1>
2706,2707,2715
2(1>
8614,8615,8628,8625,1169O
1(1>
2708,2710,2712,2706,2707,2715
loca>
8630.8614,8615.8628,8625,11690,7181,11715
1<1>
No tipifcables <NT>
4.7.- EVALUACIN DE
68 (23>
LAS TCNICAS DE FAGOTIPIA
EN
LA

El
principal
reto
que
se
debe
abordar para
caracterizar
epidemiolgicamente los ECN es el de encontrar un marcador que tipe en

una proporcin suficiente a estos microorganismos, de manera que permita
establecer similitudes o diferencias entre aislados posiblemente relacionados
epidemiologicamente. Con este objeto hemos evaluado las distintas
tcnicas de fagotipia viendo que nmero de casos se caracterizaban al
realizar cada una de estas tcnicas. Conseguimos caracterizar 22 de los 52
casos <22/52) con la fagotipia, y 10 casos ms (32/52) al valorar
conjuntamente los datos de la fagotipia y de la fagotipia inversa. Un caso
ms <33/52) con la valoracin conjunta de la fagotipia, fagotipia inversa y
fagos adicionales. Por ltimo a> analizar los datos obtenidos por las
fagotipias anteriormente citadas con los obtenidos por el Fisk se caracteriza
uno ms <34/52) quedando 18 casos sin caracterizar. Fig. 10.
11~1
RESULTADOS
Como puede verse en la Tabla 17 los ECN son generalmente

microorganismos multirresistentes.
Al
considerar la sensibilidad
antimicrobianos como marcador; hemos podido establecer 66 patrones de

resistencia a antimicrobianos, 15 de los cuales se repiten en dos o ms
casos diferentes. El patrn de resistencia 35 es el que se presenta en un
mayor nmero de casos, un total de 14 aislados pertenecientes a 7 casos
presentaban este patrn.
TABLA 16: SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ECN
50%
90%
cMu Ui9/mI>
Antibitico
Rango
Penicilina
0,03-1024
128
97,4%
cloxacilina
0,12-512
64
>512
84,1%
cefotaxima
0,12-1024
16
256
58,3%
Ampldfflna/clavulnico
0,12-64
16
21,0%
Genamicina
0,06-1024
32
256
66%
clindamlcina
0,06-64
64
>64
65,8%
Eritromicina
0,03-512
512
>512
62,5%
Fosfomicina
0,12-256
>256
24,5%
Clprofloxacina
0,06-16
0,06
23%
Tetracicllna
0,125-64
0,5
64
19,7%
Ac. fusidlco
0,01 5-32
<0,03
17,6%
Rifampicina
0,03-1024
0,03
16,9%
cloranfenicol
0,25-64
32
14,5%
vancomicina
0,25-64
%Reslstencia
0%
112
RESULTADOS
TABLA 17: PATRONES DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS

~1
Amhotipo
ReMst.ncia a antimiorobianos
NaisIado
It esa.>
Sensible a todas lo. antimicrobianos
6(3>
Pan
14(5>
Fmi
141>
Pon. Etr
2(1>
Pon. Ttr
1(11
Pon, CIr
1(11
Pon. Cid
1(1>
Pon. Clx
3(2>
Pon. Tu. Clx
1(1>
10
Pon, LCr, Ctd
1<1>
11
Pon, fu. Clx
141>
12
Pan. dr. Clx
141>
13
Pon, Rfrn, Clx
1(1>
14
Pon. Afe. Clx
1(1>
15
Pon, Cfi, Clx
2(2>
16
Pon, Ffm. Clx
1(1>
17
Pon. Con. fu. Cid
141>
18
Pon. Con. Cid. Clx
743>
19
Pon. Con. Cft. Clx
343>
20
Pon. T. Ato. Clx
21
Pon. Ti,. Cpr. Clx
141>
3(1>
22
Pon. Etr. Cid, Clx
1(1>
23
Pon. Cid. Cfi. Clx
1(1>
24
Pon. Cid. Am. Clx
341>
25
Pon. Ato, Cii, Clx
3(1>
113
RESULTADOS
TABLA 17: CONTINUACIN
Antbo;po
Resistancia a antimiorobiano.
WJ.Iado.
(N%a.o.>
26
Peo, Can. En. Cfi, Clx
2<1>
27
Pon. Gen, Cid. Efx, Clx
141>
28
Pon, Gen. Aof. Cfx. Clx
2(1>
29
Pon. Ttr. Etr. Cor. Clx
1(1>
30
Pon. fir. Cid. Cfx, Clx
1(1>
31
Pon. Con. Ttr. Etr, CId. Clx
4(3>
32
Pon. Con. Ttr, Cfi, Fin,. Clx
141>
33
Pon. Con, Etr. CId. Afe. Clx
1(1>
34
Pon. Gen. En. Cid. Cpr. Clx
4(2>
35
Pon. Gen, Er,. Cid, Cfi. Clx
14(7>
36
Pon. Gen. CId. Cpr, Hm. Clx
1(1>
37
Pon. Ttr. Fir. Cid. Ch, Clx
2(1>
38
Pon. En. Cid. Cfi. Clx. A/C
141>
39
Pon. Gen. Ti,, Fi,, Cr. CId. Clx
1(1>
40
Pon. Gen. Tir. Etr. Cid. Cpr. Clx
2(11
41
Pon. Con. Ttr. Etr. CId. Ch. Clx
7(4>
42
Pon. Gen. Ttr, Etr, Cfi. Fmi. Clx
1(1>
43
Pan. Con. Etr. Cr. Cid. Cfi. Clx
5(3>
44
Pon, Gon. En. Cr, CId. Efm, Clx
241>
45
Pon. Gen, En, Cid. Rfm, Cfx. Cix
242>
46
Pan. Gen. En. Cid. Cpr. Cfi. Clx
1(1>
47
Pan. Con. Fir. Cid. Clx, Ffm, Clx
1(1>
48
Pan. Can. Etr, CId. Cf x. Clx. AIC
1(1>
49
Pon, Gen. Blm. Cfi. Ffm. Clx. A/C
1(1>
60
Pan. Fir. Cr. CId. Rin,. Cfi, Clx
1(1>
114
RESULTADOS
TABLA 17: CONTINUACIN
Ani~bbtpo
Rasisiencia a anilmiorobiano.
Nai.lado.
61
Pan. Gen, Tu. En, Cid. Blm. Ch. Clx
2<1>
52
Pan, Con. Etr. Cr. CId, Cpr. Ch. Clx
2(1>
63
Pon, Con. Etr. Clr, Cid. Cfi. Clx, MC
1(1>
54
Pan. Can, Eir. Cid. Rfrn. Cfi. Clx, AIC
3(1>
56
Pan, Gen. Fir, CId. Cpr. Cli. Cix, AIC
6<2>
56
Pan. Con. En. CId. Ch. Am. Clx, AIC
3<3>
67
Pon. Con. En. Cpr. Cli. FIm. Cix. A/O
2(1>
56
Pan. Con. Ttr, Etr, Oir, Cid. Cfi. Am. Clx
tl
59
Pan. Con, Etr. CId. Cr,r. Ch. Hm. Cix. A/O
4<1>
60
Pan, Con. En. Cl,. Cid. Rfm, Cft. Clx. A/O
3(1>
61
Pon. Can. En. Cl,. CId. Aol. Cpr, Ffm. Clx
1<1>
62
Pon, Can, Etr. Cid. RIn.. Cfi. ~fm. Clx, A/C
1<1>
63
Pan. Con. Ttr. Etr, CId. Blm. Cg,r. Ch. Clx, A/O
1(11
64
Pon. Gen. Er, Cid. Blm. Afe. Cpr. Ch. Ffm, Clx
1<1>
65
Peo. Con, Ttr, En. Oir. CId. Rfm. Cpr. Cfi. Clx. A/O
1<1>
66
Pan. Con, Er. CId. Blm. Ato. Cpr. Ch, Am, Clx, A/O
5<1>
Las abreviaturas utilizadas en la tabla son las siguientes

A/C: Ampicilina/clavulnico, Afc: cido fusidico, Cft: Cefotaxima, CId:
Clindamicina, Cir: Cloranfencol, Clx: Cloxacilina, Cpr: Ciprofloxacina, Etr:
Eritromicina, Ffm: Fosfomicina, Gen: Gentamicina, Pen: Penicilina, Rfm:
Rifampicina, Ttr: Tetraciclina, Van: Vancomicina.
116
RESULTADOS
4.10.- ANLISIS PLASMDICO

4.10.1.- NMERO DE PLSMIDOS PRESENTES EN LOS AISLADOS
Entre los 158 aislados estudiados, 114 (72,2%) cepas presentaban
plsmidos mientras que 44 <27,8%) carecran de ellos.
Como podemos observar en la Tabla 18, el nmero de plsmidos
encontrados en los aislados vara desde ninguno hasta siete. Si analizamos
las cepas que presentan plsmidos, las que poseen dos aparecen en una
proporcin ms elevada que aquellas que tienen mayor nmero de (5, 6 6
7 plsmidos).
TABLA 18: PROPORCIN DE AISLADOS EN RELACIN AL NMERO DE
PLSMIDOS
N0 de plsmidos
N0 cepas
% cepas
44
27,8
28
17,7
55
34,8
12
7,6
11
7,0
3,8
0,6
0,6
117
RESULTADOS
4.10.2.- TAMAO DE LOS PLSMIDOS

El tamao de los plsmidos presentes en los aislados estaba
comprendido en un rango desde <2,1 kb para el plsmido ms pequeo a
>16,2 kb para el ms grande. El plsmido cuyo peso molecular est
comprendido entre 2 y 3 kb es el que se encuentra en un mayor nmero de
aislados.
Podemos establer tres categoras respecto al tamao de los
plsmidos:
mayores de 16,2 kb
entre 16,2 kb y 7 kb
menores de 7 kb
El porcentaje de plsmidos hallados teniendo en cuenta la divisin

anterior se observa en la Tabla 19.
TABLA 19: PORCENTAJE DE PLSMIDOS SEGN SU TAMAO
Tamao
N0 de plsmidos
Porcent~e
>16,2kb
20
7,9
16,2-7kb
66
26,2
166
65,9
<7 kb
El 65,9 % de los plsmidos hallados tenan un tamao menor de 7

kb, por lo tanto son los plsmidos de pequeo tamao los que encontramos
con mayor frecuencia en nuestro estudio mientras que los de ms de 16,2
kb raramente apararecen (7,9%).
La Figura 12 muestra varios perfiles pasmidicos, con plsmidos de
diferentes tamaos, obtenidos de aislados pertenecientes a distintos casos.
119
RESULTADOS
4.10.3.- PERFILES PLASMDICOS

El nmero de perfiles plasmdicos encontrados en los 158 aislados
es alto, 45 de los 46 perfiles se hallan representados grficamente en la
Figura 13, el perfil 46 corresponde a aquellos aislados que carecen de
plsmidos y que por lo tanto eran no tipificables (NT) por plasmidotipia.
El perfil 2 es el que aparece mayoritariamente entre todas aquellas
cepas que presentaban plsmidos. Tabla 20.
TABLA 20: N0 DE AISLADOS EN LOS DISTINTOS PERFILES PLASMIDICOS
Los porflas citados an asa Tabla asAn roprosoniados an la FIg. 13.
PERFIL
N CEPAS
PERFIL
(NCASOS>
N CEPAS
PERFIL
(NCASos)
N CEPAS
II
PERFIL
INCASoS>
NCEPAS
irecAso>
-1
2(1)
13
1(1)
25
1<1)
37
2<1)
20(9>
14
1(1)
26
1(1)
38
3<1>
3(2)
15
5(1)
27
3<2)
39
1(1>
3(3)
16
2<1>
28
2(1)
40
2(1)
2<2)
17
2(1)
29
1<1)
41
2<1>
3(1>
18
1<1>
30
2(1>
42
4(1)
5(3)
19
1<1)
31
1(1)
43
2(1)
3(2>
20
1<1>
32
1<1>
44
1(1)
13(7)
21
1(1)
33
2(1)
45
1(1)
10
1(1)
22
1(1)
34
1(1>
46
44
11
2(1>
23
1(1)
35
2(1>
(NT>
12
3(1>
24
1(1)
36
1(1)
(17>
RESULTADOS
121
4.11.- ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO

4.111.- DETERMINACIN DE LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN
PTIMA
En la eleccin de la endonucleasa de restriccin ms adecuada para
nuestro estudio, por un lado seleccionamos cinco enzimas (Sma 1, Sst II,
Apa l y Pvu II) en base a la proporcin de G+C (30-39%> presente en el
cromosoma de Staphylococcus y a la secuencia de corte de las enzimas,
por otro lado basndonos en los resultados obtenidos en los anteriores
marcadores seleccionamos cinco cepas distintas entre los aislados de
nuestra coleccin. El ADN de las cinco cepas fue digerido con cada una de
las enzimas y el gel obtenido mediante la electroforesis en campo pulsado
se muestra en la Fig. 14.
Despus de analizar los perfiles de restriccin obtenidos con las
cuatro enzimas, decidimos trabajar can Smal ya que producta un perfil con
una fragmentacin de un amplio rango de pesos moleculares, con bandas
claras y en nmero adecuado. La segunda endonucleasa de eleccin fue Sst
II.
4A1.2. DETERMINACIN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS
Se realizaron una serie de ensayos iniciales para determinar las
condiciones de electrofaresis y se estableci que utilizando un equipo
CHEF-DR II <Biorad) las condiciones ptimas de electroforesis en campo
pulsado de los ECN son: para un gel de un tamao de 25x20 cm una
concentracin de agarosa deI 1,2%, pulsos de 1 a 35 segundos durante 42
horas a 200 voltios.
123
RESULTADOS
4.11.3.- PERFILES DE RESTRICCIN OBTENIDOS POR ELECTROFORESIS

EN CAMPO PULSADO (PFGE>
Con el fin de conseguir una mejor caracterizacin de los casos (cuyos
resultados obtenidos por la aplicacin de los marcadores anteriormente
citados resultaron difciles de interpretar>, seleccionamos 114 aislados
pertenecientes a 38 casos, cuyo ADN fue digerido con la enzima de
restriccin Sma 1. Mediante la electroforesis en campo pulsado obtuvimos
68 perfiles electroforticos de los cuales 59eran claramente diferentes y
los nueve perfiles restantes presentaban ciertas diferencias con respecto a
alguno de los anteriores 59 perfiles.
En la Figura 15 podemos ver la representacin grfica de todos los
perfiles electroforticos obtenidos, donde a cada perfil distinto se le asign
un nmero diferente y a perfiles similares el mismo nmero seguido de
distinta letra.
El nmero de
bandas presentes
en los diferentes perfiles
electroforticos variaba desde 3 hasta 21 bandas. El 79,6% de los 3.

epidermidis presentaban perfiles con un nmero de bandas igual o superior
a 13. En general, cuando encontrbamos un perfil con un pequeo nmero
de bandas sola corresponder a las especies 3. haemolyticus (ejemplo Fig.
15 perfil 17) o 3. hominis (ejemplo Fig. 15, perfil 58).
A partir de los 68 perfiles electroforticos se gener un dendograma
(Fig 16) en el que los coeficientes de similitud de Sorensen entre los
agrupamientos quedan reflejados en la Tabla 21. Cuando el coeficiente de
similitud era inferior a 0,69 los perfiles electroforticos eran claramente
distintos y pertenecan a cepas no relacionadas, mientras que cuando era
superior a 0,69 los perfiles guardaban ciertas similitudes y pertenecan a
cepas relacionadas. La mayora de los perfiles encontrados presentaban un
coeficiente de similitud inferior a 0,69. Cepas pertenecientes a distintas
especies de ECN presentaron un coeficiente igual o inferior al 0,48.
127
RESULTADOS
HG 16: DENDROGRAMA DE LOS PERFILES ELECTROFORTICOS.

CoefiCiente
0,05
0,48
de
s.ilitud
0,69
0,84
0,91
&
PE(caso)
1(1>
2<3)
27t28>
7(8>
39(38>
22<20)
22b(20)
22~20>
22e<21>
29(18)
33(34)
64(47>
28
RESULTADOS
TABLA 21: COEFICIENTE DE SIMILITUD DE SORENSEN
Nudo
grupol
grupo2
Similitud
Nudo
grupal
Sa
0.87
36
16
grupo2
Similitud
47
0.38
6.
0.87
37
Nudo 21
48
0.38
22a
22c
0.97
38
Nudo 12
Nudo 37
0.36
46
48b
0.97
39
Nudo 28
53
0.36
28
28a
0.93
40
23
Nudo 32
0.34
Nudo 4
46a
0.87
41
20
Nudo 34
0.33
57
57.
0.84
42
Nudo 13
Nudo 38
0.33
22
22b
0.75
43
Nudo 29
Nudo 11
0.32
18
Nudo 6
0.70
44
Nudo 15
27
0.32
10
21
Nudo 5
0.70
45
Nudo 35
Nudo 26
0.31
11
Nudo 8
Nudo 3
0.69
46
Nudo 19
Nudo 22
0.31
12
Nudo 9
49
0.60
47
Nudo 42
Nudo 23
0.29
13
Nudo 1
60
0.64
48
31
68
0.29
14
37
0.52
49
Nudo 47
Nudo 39
0.28
15
0.50
50
Nudo 24
Nudo 41
0.28
16
12
13
0.50
61
Nudo 27
43
0.28
17
51
56
0.60
62
Nudo 46
Nudo 45
0.27
18
40
52
0.48
53
Nudo 33
Nudo 40
0.27
19
Nudo 2
14
0.48
54
NudoSO
Nudo 49
0.26
20
59
0.47
55
Nudo 64
Nudo 16
0.24
21
45
55
0.47
56
Nudo 44
Nudo 43
0.24
22
25
36
0.46
57
Nudo 56
Nudo 52
0.22
23
32
34
0.46
58
Nudo 51
11
0.22
24
26
0.44
69
Nudo 57
Nudo 53
0.20
25
33
54
0.44
60
Nudo 56
Nudo 30
0.20
26
Nudo 10
Nudo 7
0.43
61
NudoSO
Nudo 36
0.19
27
Nudo 20
0.43
62
Nudo 60
Nudo 69
0.18
28
15
36
0.42
63
Nudo 62
Nudo 31
0.18
29
39
0.41
64
Nudo 63
Nudo 61
0.16
30
29
Nudo 25
0.41
65
Nudo 64
Nudo 48
0.10
31
24
44
0.40
66
Nudo 65
10
0.08
32
30
Nudo 17
0.40
67
Nudo 66
17
0.05
33
18
42
0.39
34
Nudo 18
41
0.39
35
Nudo 14
38
0,38
130
RESULTADOS
4.12- VALORACIN MICROBIOLGICA DE LOS CASOS

Los datos obtenidos por la aplicacin de los distintos marcadores
fueron analizados conjuntamente para valorar desde un punto de vista
microbiolgico los 52 casos estudiados, determinando si los ECN aislados
de distintos hemocultivos de un mismo paciente eran una misma cepa o si
por el contrario eran cepas diferentes. Esta informacin nos permitirla
establecer Ja significacin clnica de dichos microorganismos. Tabla 22.
Con el fin de comprender mejor la Tabla 22 aclararemos que:
1.- Los datos de la Tabla 22 complementan a los de la Tabla 4
(pginas 45-53), de manera que mientras la Tabla 4 detalla los datos
clnicos de cada caso, la Tabla 22 muestra los datos conseguidos en el
laboratorio por la aplicacin de los distintos marcadores epidemiolgicos.
2.- El significado de las siglas utilizadas en la tabla es el siguiente:
PF: patrn de fagotipia, PR: patrn de fagotipa inversa, PFA: patrn de
fagotipia con fagos adicionales, PFisk: Patrn de Fisk, PRA: patrn de
resistencia a antimicrobianos, PP: perfil plasmidico, PFGE: perfil obtenido
por campo pulsado, NT: no tipificable, ND: ADN no digerido, SOMBREADO:
sin dato debido a que no se aplic el marcador correspondiente.
3.- El hecho de que no se pudieran exponer en una misma tabla los
patrones y perfiles obtenidos por los diferentes marcadores, nos llev a
realizar una codificacin en la que se di un nmero a cada uno de estos
patrones o perfiles. Los cdigos y sus descripciones estn recogidos en las
pginas:
pg. 101, patrones de fagotipia.
pg. 105, patrones de fagotipia inversa.
pg. 108, patrones con el juego de fagos adicionales.
pg. 109, patrones de Fisk.
pg. 112 a 114 patrones de resistencia a antimicrobianos.
pg. 120 perfiles plasmdicos.
pg. 124 a 126 perfiles electroforticos de campo pulsado.
RESULTADOS
131
4.12.1.- CRITERIOS SEGUIDOS EN EL LABORATORIO PARA DETERMINAR

CUANDO DOS CEPAS SON IGUALES
Los criterios seguidos en la Tabla 22 para valorar los datos

microbiolgicos y establecer si dos cepas eran idnticas o distintas fueron
los siguientes:
1.- Como norma general hemos considerado que dos cepas son
idnticas cuando presentan los mismos patrones en todos los marcadores.
Ejemplo: caso 23.
2.- Para valorar los patrones de fagotipia seguimos la regla de las
dos diferencias propuesta por Williams y Rippon (1952) y adoptada por el
subcomit de fagotipia de Staphylococcus (Blair y Williams, 1961), segn
la cual dos patrones fueron considerados el mismo cuando presentaban los
mismos efectos o una discrepancia de menos de dos diferencias
significativas. Eemplo: caso 27.
3.- Respecto a los patrones de resistencia a antimicrobianos y los
perfiles plasmidicos aunque en general resultaron de gran utilidad, en
algunos casos era difcil su interpretacin ya que las cepas adquieren y
pierden plsmidos con gran facilidad y tambin adquieren resistencias
debido a la presin hospitalaria a la que estn sometidas. Este hecho nos
llev a considerar dos cepas como idnticas cuando a pesar de presentar
ciertas diferencias en los perfiles plasmdicos o en los patrones de
resistencia a antimicrobianos, presentaban los mismos patrones en el resto
de los marcadores. Ejemplo: caso 31.
4.- De todos los marcadores utilizados, los datos obtenidos por
campo pulsado nos permitieron establecer una mejor caracterizacin de las
cepas. Basndonos en los datos conseguidos por los dems marcadores
junto con los datos obtenidos por campo pulsado establecimos la siguiente
clasificacin de los aislados:
RESULTADOS
132
Cepas que presentaban un coeficiente de similitud de 1 fueron
consideradas cepas idnticas. Ejemplo: caso 2.

-
Cepas con un coeficiente de similitud entre 0,97 y 0,84 fueron
consideradas cepas relacionadas (estrechamente relacionadas).

Ejemplo: caso 51.
-
Cepas con un coeficiente de similitud entre 0,84 y 0,69 fueron
consideradas como posiblemente relacionadas. Ejemplo: caso 20.

-
Cepas con un coeficiente de similitud inferior al 0,69 fueron
consideradas distintas. Ejemplo: caso 4.

Como hemos expresado anteriormente en este punto del estudio
nuestro objetivo era averiguar si los ECN, obtenidos de distintos
hemocultivos de un mismo enfermo, eran una nica cepa o cepas distintas.
Para alcanzar el citado objetivo, a todos los aislados se les realiz
fagotipia, fagotipia inversa, resistencia a antimicrobianos y plasmidotipia.
Con los datos obtenidos de estos marcadores en algunos casos se pudo
determinar si los ECN pertenecientes a cada caso eran o no una nica cepa.
Casos: 1, 10, 15, 22, 32, 33, 43, 49 y 50.
En el resto de los casos con los datos de estos marcadores era difcil
dar una valoracin, por lo que fue necesario la aplicacin de otros
marcadores. De esta manera, cuando aadamos los datos obtenidos por
la fagotipia con fagos adicionales, conseguamos determinar si los aislados
de ECN de algunos casos eran idnticos o distintos; un ejemplo de esto es
el caso 24. Cuando adems agregamos los datos conseguidos con el Fisk
se poda establecer en algunos casos si los aislados eran idnticos o no,
como por ejemplo ocurre con el caso 29.
El alto porcentaje de cepas no tipificables obtenidas por las distintas
tcnicas de fagotipia, hizo que en algunos casos para poder realizar una
valoracin microbiolgica fuera necesario la aplicacin de todos los
marcadores, incluido campo pulsado. Como ejemplo podemos ver en el
caso 34.
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142
RESULTADOS
4. 2.2.- DESCRIPCIN DE LAS DISTINTAS SITUACIONES ENCONTRADAS

AL VALORAR LOS CASOS DESDE UN PUNTO DE VISTA
MICRO BILOGICO.
Siguiendo el criterio microbiolgico utilizado para determinar el
agente etiolgico de la bacteriemia <segn el cual cuando de un mismo
enfermo se obtienen una serie de distintos cultivos positivos y en todos
ellas se asla el mismo ECN, ste es considerado como patgena, mientras
que si despus de un primer cultivo positivo los siguientes cultivos son
negativos o en caso de ser positivos se asla un microorganismo diferente
al ECN del cultiva inicia> entonces se habla de contaminacin) se analiza
conjuntamente la informacin clnica y los datos que obtuvimos en el
laboratorio. Vemos que desde el punto de vista del laboratorio los casos
pueden ser agrupados en distintos tipas de situaciones, pudindose
establecer la siguiente clasificacin:
A. Casos aue oresentan un nico episodio de bacteriemia

De los 52 casos estudiados en la Tabla 22, 45 casos presentaron un
nico episodio de bacteriemia, presentndose entre ellos diferentes

circunstancias que detallamos a continuacin:
-
AA.: 27 fueron casos de bacteriemia con un episodio en el que el
ECN aislado es considerado patgeno. A esta situacin pertenecen

los casos 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 13, 16. 17, 19, 20, 23, 24, 25, 27,
31, 32, 33, 34, 35, 38, 40, 48, 49, 50 y 51.
-
A2,: 5 fueron casos de bacteriemia con un episodio en el que
adems del agente etiolgico de la bacteriemia se aslan uno o ms

ECN que son considerados posibles contaminantes. Casos 18, 21,
30, 46, 47.
-
A3 Hay un nico caso de bacteriemia con un episodio en el que
se aslan simultneamente dos
ECN
distintos que son considerados
RESULTADOS
143
patgenos. Caso 52 (en el que hablaramos de una infeccin mixta

producida por S. hominis y 3. epiderrnidis>.
-
A.4 12 fueron casos de bacteriemia con un nico episodio, en los
que con los resultados microbiolgicos no pudimos determinar si los

ECN aislados eran o no eran contaminantes. Casos 4, 10, 12, 15,
26, 28, 36, 39, 41, 43, 44, 45.
-
B. Casos aue oresentan ms de un episodio de bacteriemia

A continuacin describimos siete casos en los que se encontr ms
de un episodio de bacteriemia.
-
Caso 8: en el primer episodio (8) el ECN patgeno es un 3. hominis,
en el segundo episodio (8> el ECN patgeno es un Sepdermidis,

estafilococo que volvemos a encontrar en el tercer episodio <8>
junto con otro 3- epidermidis que consideramos como un posible
contaminante.
-
Caso 11: presenta dos episodios, en el primer episodio <11>
aparecen dos 3. epidermidis, uno es considerado patgeno y el otro

como posible contaminante. En el segundo episodio <11> vuelven a
hallarse dos 3. epidermidis, uno patgeno <que es distinto de el del
episodio anterior> y otro posible contaminante.
-
Caso 14: en el que hay dos episodios en los cuales la bacteriemia
est producida por un 3. epidermidis distinto.

-
Caso 22: en el que con los datos obtenidos en el laboratorio no
hemos podido determinar cUal era el ECN causante de la bacteriemia.

Caso 29: que presenta tres episodios, en cuyo primer episodio se
asla junto con un posible contaminante, un 3. epidermidis que es
considerado patgeno y que persiste durante el segundo <29> y
tercer episodio (29>.
-
Caso 37: con dos episodios, en el primero <37> la bacteriemia est
producida por un 3. epidermidis y en el segundo (37> par un 8.

haemolyticus-
Caso 42: con cuatro episodios, en cuyo primer episodio (42) con
RESULTADOS
144
los datos de laboratorio no pudimos determinar si los 3. epidermidis

aislados eran agentes patgenos o contaminantes. En el segundo
episodio (42> se asla un 3. epidermidis que es considerado patgeno
y que se vuelve a aislar en el cuarto episodio <42>, mientras que la
bacteriemia del tercer episodio <42> es causada por otro 3.
epidermidis distinto del anterior.
Como vemos en los resultados anteriormente expuestos, con el
anlisis de los datos microbiolgicos, en 39 <75%> de los 52 casos
estudiados un ECN fue considerado como el agente etiolgico de la
bacteriema.
4.12.3. PORCENTAJES DE CASOS EN LOS QUE CON LA APLICACIN
SUCESIVA DE LOS MARCADORES EPIDEMIOLGICOS SE HAN
PODIDO ESTABLECER SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ENTRE
AISLADOS DE UN MISMO PACIENTE.
Una vez que consideramos que todos los casos estaban
adecuadamente caracterizados, analizamos globalmente el hecho de que
con la aplicacin sucesiva de los distintos marcadores ibamos obteniendo
nueva informacin que nos permita ir aumentando el nmero de casos en
los que se podan establecer si distintos aislados pertenecientes a un mismo
paciente eran o no la misma cepa. Encontramos que dicha relacin
epidemiolgica se pudo determinar en 16 <30,8%) casos con el anlisis de
los patrones de las distintas tcnicas de fagotipia; y en 17 casos ms
cuando aadamos los patrones de resistencia a antimicrobianos, lo que
haca un total de 33 <63,5%> casos; cuando a los anteriores marcadores
aadamos los patrones plasmdicos en 9 casos ms, lo que constitua un
42 <80,8%> de los casos, establecamos las similitudes y diferencias; y
cuando por ltimo aadamos los patrones obtenidos por PFGE las
relaciones epidemiolgicas quedaban claras en los 10 casos restantes, por
145
RESULTADOS
lo que en este punto en los 52 (100%) casos se pudo establecer si los ECN
aislados de hemocultivos de un mismo enfermo eran una nica cepa o
cepas diferentes. Estos datos estn reflejados en la Tabla 23.
TABLA 23: CARACTERIZACIN DE LOS CASOS ESTABLECIENDO
SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ENTRE AISLADOS DE UN
MISMO
ENFERMO
MEDIANTE
LA
APLICACIN
DE
MARCADORES EPIDEMIOLGICOS
Tcnicas
Nuevos casos
Total casos
caracterizados
caracterizados
Fagotipias
16 (30,8%>
16(30,8%)
Fag+Antib.
17 <32,7%>
33(63,5%>
Fag. + Antib. + Plasm.
9 (17,3%)
42(80,8%)
Fag. +Antib. +Plasm. + PFGE
10 <19,2%>
52 (1~%>
Fag.: Fagotipias. Antib:
Antibiotipia. Pasm.: Plasrnidotipia. PFGE:
Electroforesis en campo pulsado.

4.13.- COMPARACIN ENTRE LA VALORACIN
CLNICA Y LA
VALORACIN MICROBIOLGICA
Como hemos visto el carcter patgeno o contaminante de los ECN,
ha sido establecido en este estudio en base a dos criterios, por un lado en
base a criterios clnicos y por otro a nuestros datos microbiolgicos. Al
comparar la valoracin clnica y nuestra valoracin microbiolgica sobre la
patogenicidad de los ECN encontramos las siguientes situaciones:
-
En 34 casos existe una concordancia entre el criterio dado par el

clnico y nuestro criterio microbiolgico:
146
RESULTADOS
En 30 de los 34 casos el ECN aislado ha sido considerado

como agente etiolgico de la bacteriemia por ambos criterios.
Tabla 22, casos: 3, 6, 7, 8, 9, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 23, 24, 25, 29, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 40, 46, 48, 49,
50, 51, 52.
En 4 de los 34 casos, el ECN aislado fue considerado sin

significacin clnica por el clnico, corroborndose este criterio
por los datos obtenidos en el laboratorio. Tabla 22, casos: 4,
10, 43 y 45.
En 6 casos los datos de laboratorio ayudan al clnico a decantarse

acerca de la significacin clnica del ECN aislado de sangre, ya que
en todos estos casos conseguimos identificar cual era el ECN
responsable de la bacteriemia. Tabla 22, casos: 1, 13, 27, 30, 35 y
42.
En 3 de los 52 casos exista un desacuerdo entre la valoracin dada
por el clnico y la nuestra dada en base a los datos obtenidos en el
laboratorio, De manera que mientras para el clnico los ECN aislados
de estos tres casos carecan de significacin clnica, en el laboratorio
las cepas de ECN aisladas de los sucesivos hemocultivos eran
idnticas. Tabla 22, casos: 2, 5 y 47.
En los nueve casos restantes los datos de laboratorio no nos
permitieron establecer si los ECN tenan o no tenan significacin
clnica.
-
En 8 de los 9 casos el clnico consider al ECN aislado coma

patgeno, no pudindose corroborar esta valoracin con los
datos microbiolgicos. Tabla 22, casos: 12, 15, 26, 28, 36,
39, 41 y 44.
En 1 de los 9 casos el clnico presentaba dudas acerca del

carcter patgeno del ECN, dudas que no pudieron ser
aclaradas con los datos de laboratorio. Tabla 22, caso 22.
RESULTADOS
147
Como conclusin diremos que los datos obtenidos en el laboratorio

nos permitieron determinar si un ECN tena o no significacin clnica en 43
casos, lo que supone el 82,7% de los casos estudiados. De los 43 casos,
en tan solo tres casos exista un desacuerdo entre el criterio dado por el
clnico y el criterio obtenido en base a los datos del laboratorio, es decir,
que en tan slo un 7% de los casos se han encontrado discrepancias entre
el criterio clnico y microbiolgico.
148
DISCUSIN
5.-DiSCUSiN
DISCUSIN
149
Hasta la dcada de los 70, tanto clnicos como microbilogos

generalmente consideraron a los ECN como contaminantes y nicamente
3. aureus era considerado como patgeno dentro de las especies
estafiloccicas. Es en las ltimas dos dcadas cuando se han realizado
considerables progresos tanta en la clasificacin de los estafilococos como
en el desarrollo de los mtodos de tipado; progresos que han permitido a
la comunidad mdica estar ms al corriente acerca de la gran variabilidad
de especies clnicas de ECN y aumentar la credibilidad de que stos
organismos son agentes etiolgicos de una variedad de enfermedades.
Actualmente los ECN son considerados como microorganismos
patgenos oportunistas causantes de infecciones nosocomiales. Al analizar
la evolucin de los distintos tipos de infecciones nosocomiales, segn los
informes NNIS, desde 1980 se ha producido un aumento progresivo de las
bacteriemias (Emori y Gaynes, 1993); siendo los ECN los principales
agentes etiolgicos de este tipo de infeccin nosocomial <Emori y Gaynes,
1993; EPINE, 1992). Fue este aumento significativo de las bacteriemias lo
que nos llev a estudiar todos los aislados de ECN enviados por el Hospital
Val dHebron durante 1991 que pertenecan a casos de bacteriemia en los
que se dispona de ECN aislados de diferente hemocultivos de un mismo
paciente, as como de la informacin clnica del mismo, con el fin de
conseguir una buena caracterizacin tanto de los aislados como de los
casos, para as poder establecer desde el punto de vista microbiolgico si
el
ECN
presente en el hemocultivo era el agente etiolgico de la
bacteriemia.
150
DISCUSIN
5.t-
VALORACIN DE LOS DATOS CLNICOS DE LOS CASOS

ESTUDIADOS
Al analizar los informes clnicos de los pacientes de nuestro estudio
comprobamos que los
ECN
se aislaban del mismo tipo de pacientes que se
describen en otros estudios <Kloos y Bannerman, 1994>: pacientes con

rotura de la barrera natural de la piel, pacientes con dispositivos
implantados
como
prtesis,
catteres,
etc.,
pacientes
inmunocomprometidos y/o con severa enfermedad de base y neonatos.

Cuando analizamos la distribucin de los casos de bacteriemia en el
hospital Val DHebron basndonos en las cinco grandes reas de asistencia
establecidas en el informe EPINE <1992), observamos que en este hospital
de los 52 pacientes ingresados durante 1991 en cuyos hemocultivos se
aislaron ECN, el mayor porcentaje de pacientes fue ingresado en el rea de
ciruga, seguido de pediatra, atencin intensiva y medicina. Mientras que
en la distribucin dada por los informes NNIS <1991> y EPINE (1992) vemos
que tas bacteriemias aparecen en una mayor proporcin en el rea de
pediatra, seguida de atencin intensiva, medicina y ciruga; adems en
pediatra las bacteriemias aparecen con una mayor frecuencia que otro tipo
de infecciones como las del tracto urinario, tracto respiratorio, etc. Al
-
comparar todos estos datos se deduce que las bacteriemias tienen especial
relevancia en el rea de pediatra.
En los datos publicados acerca de la distribucin de las especies de
los ECN, est descrito que 3. epidermidis, 3. haemolyticus y 3. hominis son
por ese orden las tres especies de ECN ms frecuentemente halladas en los
aislados clnicos (Kleeman y cols, 1993>. Al estudiar la distribucin
porcentual de los ECN aislados en nuestros hemocultivos encontramos que
al igual que en otros trabajos publicados (Neumeister y coK, 1995>, 3.
epidermidis fue la especie que se aisl con mayor frecuencia, y en menor
proporcin tambin se aislaron 3. haemolyticus y 3. hominis.
DISCUSIN
151
52- VALORACIN DE LOS MARCADORES FENOTIPICOS EN EL ANLISIS

DE LOS AISLADOS DE ECN
521- ANLISIS DE LOS AISLADOS POR FAGOTIPIA
Al contrario de lo que ocurre con 3. aureus, en los estafilococos
coagulasa negativos no existe un juego de fagos internacionalmente
admitido , aunque algunos Laboratorios de Referencia de Estafilococos
utilizan este marcador. En la actualidad, los juegos de fagos ms usados en
la fagotipia de los ECN son el de Dean y Williams, juego mixto compuesto
por fagos ingleses y holandeses (en el que 10 fagos fueron aislados por
Dean y cols(1 973>, 9 fagos fueron aislados por Verhoef y colsIl 971) y un
fago aislado en el CentralPublic Health Laboratory> <De Saxe y Notley,
1978) y el juego de Pulverer y cols. <1975, 1976>.
Antes de realizar la fagotipia en nuestro estudio, por los datos que
haba publicados, sabamos que esta tcnica era altamente reproducible
<Dryden y cols, 1992). Que con su utilizacin bamos a encontrar un alto
porcentaje de aislados de ECN no tipificables (Rosdah y cols, 1990; Jarlev
y cols., 1992>. Que la tipabilidad aumentaba cuando la fagotipia se
realizaba tras el crecimiento de los cultivos con calor a 48~C (Dowset y
cols, 1984> y cuando se realizaba al 1000 RTD (De Saxe y Notley, 1978>.
Que para incrementar la tipabilidad era conveniente utilizar otros fagos
adems de los fagos de un nico juego, de manera que trabajamos con un
gran nmero de fagos. <Vandenesch y cols., 1993; De Saxe y Notley,
1978>. Que el juego de fagos de Pulverer aunque proporciona una buena
tipabilidad, con l se obtiene un limitado nmero de patrones por lo que su
poder discriminatorio no es satisfactorio <De Saxe y cols., 1981>. Que la
actividad de los fagos puede presentar algunas limitaciones geogrficas, lo
que hace que los juegos de fagos no sean generalmente intercambiables
<Frdhander y cols., 1978>. La baja proporcin de tipabilidad obtenida en
152
DISCUSIN
Estados Unidos con los fagos de 2Dean a Williams <Talbot y Parisi, 1976;
Blouse y coK, 1975> y las diferencias en los porcentajes de tipabilidad en
los cultivos
de
diferentes ciudades europeas con
los
fagos
de
Pulverer
apoyan esta teora.

Basndonos en todos los datos anteriormente expuestos y tratando
de conseguir los mejores resultados posibles con la fagotipia decidimos

realizar la fagotipia al 1000 RTD, tras el crecimiento de los cultivos a 480C,
usando el juego de fagos de Dean y Williams ya que era el que mayor
poder discriminatorio presentaba. Para paliar las posibles Jimitaciones en la
actividad de los fagos del citado juego por cuestiones geogrficas, usamos
tambin un juego de fagos autctono (Martn de Nicols,y cols. 1990). Al
analizar la proporcin de tipabilidad obtenida con el juego de fagos de
Dean y Williams, mientras que en la bibliografa se describe que de un
18,8% a un 20% de los aislados son tipados por los fagos del citado juego
<Jarlevycols., 1992; Drydenycolt, 1992> en nuestro estudio obtuvimos
un ligero aumento de la tipabilidad <24,7%>, este aumento en la tipabilidad
probablemente se deba a que la fagotipia se realiz al 1000 RTD tras
tratamiento con calor. El porcentaje de aislados caracterizados por fagotipia
con el juego autctono fue un poco mayor que el obtenido con el de Dean
y William? (26,6%>, mientras que dicho porcentaje aument hasta un
34,8% al utilizar conjuntamente ambos juegos de fagos. Estos datos
apoyan por un lado la teora de las limitaciones geogrficas en la actividad
de los fagos y por otro la necesidad de trabajar con el mayor nmero de
fagos posible para incrementar la tipabilidad.
La baja tipabilidad de los aislados puede explicarse por varios tipos
de mecanismos:
-
presencia de cpsula en las cepas.
fallos en la adsorcin del fago a la pared.
actuacin de las endonucleasas de restriccin de la cepa.
inmunidad lisognica.
La presencia de cpsula en las cepas afectara a su susceptibilidad
DISCUSIN
153
hacia los fagos, pero el crecimiento de las cepas a alta temperatura impide
la formacin de la cpsula <Lorian y cols, 1985). Como la fagotipia se
realiza con un tratamiento con calor, supuestamente se habra impedido la
formacin de la cpsula por lo que esta causa por si sola no justificarla los
bajos porcentajes de tipabilidad. Adems Sompolinsky y cols. (1985>
describieron cepas capsuladas tipificables y no tipificables, entonces la
presencia de cpsula no afectara a la susceptibilidad de la cepa por los
fagos, a no ser que las cepas capsuladas se tipifiquen debido a la existencia
de poblaciones heterogneas. Las endonucleasas de restriccin parecen
eliminarse por tratamiento trmico, al haberse realizado la fagotipia a 48 oc,
este no debera ser el problema a menos que se haya producido una
incompleta destruccin de las endonucleasas de restriccin. Entonces la
baja tipablidad podramos explicarla por un efecto de inmunidad lisognica
debida a la presencia de profagos (Rosdah y cols., 1990> o de plsmidos,
ya que los plsmidos pueden llevar genes que controlan la adsorcin de los
fagos (Schaefler, 1972>.
Al analizar la fagotipia con el juego de fagos combinado, constituido
por los fagos de Dean y William? y los de Martin de Nicols, hemos
encontrado numerosos patrones fgicos <30 patrones en un total de 55
aislados tipificados), existiendo pocas cepas que comparten el mismo
patrn de fagotipia; lo que nos permite afirmar que el poder discriminatorio
del juego de fagos combinado es alto- Cuando dividimos los patrones
fgicos en cortos, intermedios y largos de acuerdo con el criterio de
Richardson y Marpes <1987), los patrones cortos fueron los ms
frecuentes al igual que se describe en el trabajo de Martn de Nicols y cols.
<1990>.
En el juego de fagos de Jean y Williams el fago que mostraba una
mayor frecuencia de reaccin con los diferentes aislados fue el 471A
seguido del 456 y 459, mientras que en el juego autctono fue el fago
90341 seguido del 90340 y 90338- La razn por la que un fago tiene
mayor potencia que otro no es bien conocida, probablemente sea debida a
DISCUSIN
154
una cuestin relacionada con los receptores del bacterifago en las cepas,
bien por la naturaleza qumica de los mismos o por alteraciones en el
componente lipidico de la pared celular de las cepas de manera que la
absorcin de los fagos difiere de una cepa o otra y por lo tanto se obtiene
una frecuencia de reaccin cuyo valor vara de un fago a otro. Al estudiar
las frecuencias de reaccin de los distintos fagos hemos observado que
tanto en el juego de Dean y William? como en el autctono hay unos
fagos que respecto a su capacidad de reaccin estn estrechamente
relacionados y actan como si fueran un bloque, de manera que cuando un
fago produce una reaccin tambin la suelen producir los otros fagos
asociados a l. As en el juego de Jean y Wiliams los fagos 456, 459 y
471A suelen actuar en bloque; mientras que en el autctono habra dos
bloques de actuacin, uno constituido por los fagos 90338, 90340, 90341
y otro por 90509, 43763, 43785. Por el hecho de que mantener los fagos
con un ttulo adecuado para realizar la fagotipia resulta un trabajo laborioso
y que el dispensador de fagos de Lindwell <1959> distribuye 25 fagos, se
simplificara mucho el trabajo si el juego de fagos combinado estuviera
constituido por 25 fagos, por lo que proponemos que dicho juego est
compuesto por los 20 fagos de Dean y Williams <puesto que es el juego que
se utiliza en otros Laboratorios de Referencia de Estafilococos como el de
Inglaterra o Dinamarca, siendo entonces posible la comparacin de nuestros
resultados con los obtenidos en otros paises) y los 5 fagos del juego
autctono: 89904, 90319, 90341, 90352 y 90509, la seleccin de estos
fagos la hemos realizado eligiendo aquellos fagos que presentaban una
mayor frecuencia de reaccin y seleccionando un nico fago de aquellos
que actuaban en bloque.
DISCUSIN
155
52.2.- ANLISIS DE LOS AISLADOS POR FAGOTIPIA INVERSA

Segn Marplesy cols. <1978> la fagotipia en los ECN no proporciona
una buena tipabilidad, sobre todo en el caso de cepas multirresistentes, por
lo que la fagotipia inversa podra ser de gran valor para el estudio de los
aislados de ECN.
El bajo porcentaje de tipabilidad obtenido con la fagotipia y el criterio
de Marpes y colsdlS78> anteriormente expuesto, nos llev a aplicar la
fagotipia inversa a nuestros aislados. En esta tcnica se utilizaron las cepas
propagadoras del juego de Jean y Williams y las del juego autctono. El
porcentaje de aislados que se tiparon por esta tcnica con las cepas
propagadoras de Dean y Williams fue del 22,8%, este porcentaje fue del
17,7% con las del juego autctono, mientras que al realizar la fagotipia
inversa con las cepas de ambos juegos de fagos se obtuvo un ligero
aumento de la tipabilidad llegndose a tipar un 25,3% de los aislados.
Al igual que ocurra en la fagotipia, con la fagotipia inversa tambin
obtuvimos un bajo porcentaje de tipabilidad, resultado que concuerda con
el obtenido en otros trabajos (Dryden y cols, 1992>. Este bajo porcentaje
de tipabilidad podran explicarse bien porque no sea muy frecuente la
presencia de profagos en los aislados de ECN o bien porque con la tcnica
no consigamos liberar los profagos de todos los aislados con lo que los
fagos lisognicos no se convertiran en lticos.
El nmero de patrones fgicos conseguidos con esta tcnica, al igual
que ocurra con los obtenidos en la fagotipia, es elevado <23 patrones en
un total de 40 aislados tipificados), lo que indica un alto poder
discriminatorio. Siendo los patrones largos los ms frecuentes.
La fagotipia inversa es un marcador altamente reproducible y
discriminatorio, y aunque proporciona una baja tipabilidad, la valoracin
conjunta de los patrones fgicos de fagotipia y fagotipia inversa nos va a
permitir establecer similitudes y diferencias entre aislados relacionados.
DISCUSIN
5.23-
156
ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA FAGOTIPIA CON EL

JUEGO DE FAGOS ADICIONALES
Con el fin de contrarrestar el posible efecto de una menor actividad
de los fagos debido al tipo de poblacin e intentar aumentar la proporcin

de tipificacin de los aislados, realizamos la fagotipia con un juego de fagos
adicionales constituido por cinco fagos obtenidos por induccin a partir de
cinco de las de cepas de este estudio.
Los fagos fueron obtenidos induciendo los profagos en cinco de
nuestras cepas de ECN. A pesar de que estos fagos haban dado en la
fagotipia inversa un gran efecto ltico, en la mayora de las cepas
propagadoras del juego de fagos de Dean y Williams y autctono tan slo
un 20,7% de los aislados fueron sensibles a algn fago del juego adicional.
Como vemos, el porcentaje de tipabilidad obtenido con el juego de
fagos adicionales es bajo y bastante similar al de la fagotipia con el juego
de fagos combinado y fagotipia inversa. Pero en contra de lo que ocurra
con las tcnicas anteriormente citadas, el nmero de patrones obtenidos
por la fagotipia con el juego de fagos adicionales es pequeo y en
consecuencia existen varias cepas que comparten un mismo patrn de
fagotipia por lo que su poder discriminatorio es menor que el conseguido en
las otras fagotipias.
5L4. ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA TCNICA DE FISK
Como ocurre en el resto de las tcnicas de fagotipia, mediante esta
tcnica conseguimos tipificar un bajo porcentaje de ECN <23,6%> y al igual
que en la fagotipia con los fagos adicionales el nmero de patrones
obtenidos con la tcnica de FISK es pequeno.
157
DISCUSIN
Resumiendo todos los datos obtenidos dei anlisis de los aislados

mediante las distintas tcnicas de fagotipia, diremos que con todas las
tcnicas se obtuvieron bajos porcentajes de tipabilidad y fue la fagotipia
con el juego de fagos combinado la que mayor tipabilidad proporcion,
siendo esta tcnica junto con la fagotipia inversa las que mayor poder
discriminatorio presentaron. Adems cuando valoramos conjuntamente los
fagotipos obtenidos con todas las tcnicas de fagotipia, conseguimos
establecer similitudes y diferencias entre aislados pertenecientes a un
mismo paciente en 16 (30,8%> de los casos.
525.- ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LOS AISLADOS A LOS
ANTIMICROBIANOS
Al analizar los datos obtenidos del estudio de sensibilidad de todos
nuestros ECN frente a 14 antimicrobianos encontramos, como era de
esperar, una alta proporcin de ECN resistentes a los $-lactmicos
obteniendo valores del 97,4% de resistencia a penicilina, del 84,1 % a
cloxacilina y del 58,3% a cefotaxima. Aunque en nuestros datos las
resistencias a los $-lactmicos son ms elevadas que las descritas en el
tercer estudio multicntrico espaol (Diaz y cols., 1994>, nuestros
porcentajes de resistencia concuerdan con los publicados por otros autores
como demuestra el estudio de bacteriemias causadas por ECN realizado por
Jones y cols. (1989> donde la mayora de los aislados eran 3. epidermidis
y
el 78% de los
ECN
fueron resistentes a la oxacilina. En otro estudio se
describe un parcentaie del
84%
de resistencia a meticilina en 8. epidermidis
<Karchmer y cols., 1983). Segn Archer y cols.(1994) los porcentajes de

aislamientos resistentes a la meticilina son mayores si la evaluacin de la
susceptibilidad est nicamente referida a 3. epidermidis, lo cual podra
explicar nuestra elevada proporcin de resistencia a la cloxacitina en
comparacin con la del estudio multicntrico espaol, puesto que en
nuestro estudio el 87% de los ECN eran 3. epidermidis mientras que en el
158
DISCUSIN
estudio multicntrico esta especie representaba el 60% de los ECN

estudiados.
Por otro lado, en nuestros datos encontramos una gran proporcin
de aislados multirresistentes y observamos que la resistencia a la cloxacilina
va asociada a la resistencia a otros grupos de antibiticos adems de los
$-lactmicos. Archer y Climo <1994), describen este hecho en su trabajo
en el que una alta proporcin de los 3. epidermidis resistentes a la oxacilina
y causantes de bacteriemias son multirresistentes presentando resistencias
a eritromicina, clindamicina, gentamicina y otros antibiticos. El hecho de
que los ECN sean microorganismos nosocomiales resistentes a una gran
variedad de antibiticos hace que sean considerados como un importante
reservorio de genes de resistencia en el medio hospitalario <Archer, 1988).
Como era de esperar, no encontramos resistencias a la vancomicina.
Aunque ya se han descrito algunas resistencias clnicas a este glicopptido
en 3. /iaemolyticus <Veach y cols., 1990>. El conjunto de los ECN contina
siendo susceptible a la vancomicina <Archer y Climo, 1994> por lo que es
el antibitico de eleccin utilizado en el tratamiento de los ECN resistentes
a meticilina y multirresistentes.
En su revisin de la susceptibilidad antimicrobiana de los ECN, Archer
y Climo <1994> describen a estos microorganismos como altamente
susceptibles a la tetraciclina, rifampicina y ciprofloxacina, datos que
concuerdan con los bajos porcentajes de resistencia de nuestros aislados
frente a estos antibiticos.
El
hecho
de
que
la
mayora de
nuestros
aislados
sean
multirresistentes es debido a dos causas, por un lado a que la mayora de

nuestros aislados eran 3. epidermidis y est descrito que esta especie es
uno de los cocos gram positivos que muestra con gran frecuencia
resistencia a muchos de los agentes antimicrobianos. Por otro lado a que
todas nuestros ECN fueron aislados de pacientes y est demostrado que los
ECN aislados del medio hospitalario son ms resistentes que los de
portadores sanos <Parisi, 1985>, lo cual podra ser explicado por la
DISCUSIN
159
existencia de una interrelacin compleja entre la terapia antibitica y la

adquisicin de resistencias a antibiticos por parte de las bacterias en la
infeccin nosocomial, en la que el uso de agentes antimicrobianos tiende
a crear una presin selectiva que favorece la aparicin de microorganismos
resistentes y predispone a los pacientes a ser colonizados por tales
microorganismos. <Emori y Gaynes, 1993).
Cuando hicimos el anlisis de los resultados de la sensibilidad a los
antimicrobianos desde el punto de vista de un sistema de tipado
encontramos que con la antibiotipia todos los aislados fueron caracterizados
y obtuvimos 66 patrones. Patrones que junto con los de fagotipia nos
proporcionaron una mejor caracterizacin de los aislados permitindonos en
33 casos <63.5%> establecer similitudes y diferencias entre aislados
relacionados. Al relacionar los patrones de fagotipia con los de resistencia
a antimicrobianos vemos que aquellos aislados que eran multirresistentes
resultaban generalmente no tipificables por las tcnicas de fagotipia,
fenmeno que tambin ha sido descrito por Rosdah y cols. <1990>.
Existen criticas a la antibiotipia como sistema de tipado, una de ellas
es el efevado nmero de patrones que se obtienen y junto con el hecho de
que muchos de los aislados son multirresistentes, hace difcil la evaluacin
de los patrones <Smith y cols, 1982). Adems la expresin de resistencias
a antimicrobianos en algunas cepas de ECN puede ser inestable <Mickelsen
y cols. 1985), hecho que se debe a mltiples mecanismos genticos uno
de los cuales es la presencia de plsmidos portadores de genes que
codifican para la resistencia a antibiticos, plsmidos que son muy
inestables y al igual que se pierden con facilidad tambin pueden ser
adquiridos por conjugacin dando lugar a distintos patrones de resistencia
en cepas con idntico cromosoma. <Maslow, 1993; Hall, 1987Hor otro
lado, aislados no relacionados pueden tener el mismo patrn de resistencia,
mientras que cepas relacionadas pueden ser falsamente consideradas
distintas en base a diferencias en su antibiograma <Dryden y coK, 1992>.
A pesar de estas crticas, nosotros al igual que Ludlam y cols.
DISCUSIN
160
(1989a) consideramos a la antibiotipia como un marcador bastante

reproducible, discriminatorio y de utilidad ya que la informacin obtenida
con la realizacin de antibiogramas de manera sistemtica en los
laboratorios hospitalarios a todos los aislados, tiene gran importancia, pues
conociendo las resistencias ms frecuentes existentes en un determinado
hospital, si aparecen patrones de resistencia nuevos <Goetz y cols., 1992>
o si se observa un incremento en el nmero de un determinado patrn de
resistencia, estos datos constituiran un primer e importante aviso sobra la
posible existencia de un brote nosocomial y adems proporcionada
informacin indispensable para el tratamiento de los enfermos.
5.3.- VALORACIN DE LOS MARCADORES FENOTIPICOS EN LA
Hasta ahora, al analizar los datos obtenidos de los marcadores
fenotipicos y al valorar dichos marcadores, no hablamos considerado las
posibles relaciones epidemiolgicas existentes entre nuestros aislados. Es
a partir de este momento cuando vamos a considerar la posible relacin de
los aislados a la hora de analizar los datos.
Segn describen algunos autores, la inexistencia de un nico mtodo
de tipificacin efectivo para los ECN hace que en el estudio epidemiolgico
de la infeccin causada por estos microorganismos sea aconseable usar un
esquema jerarquizado de una combinacin de marcadores (Christensen y
cols., 1983; Ludlamycols., 1989b; Drydenycols., 1992). Siguiendo esta
recomendacin, valoramos globalmente los patrones que se hablan obtenido
con los distintos marcadores fenotipicos en los aislados pertenecientes a
un mismo enfermo y encontramos que 22 de los 52 casos se
caracterizaban con la fagotipia, diez casos ms (32/52) al valorar
conjuntamente los patrones de fagotipia y fagotipia inversa, un caso ms
<33/52) con la valoracin global de los patrones de fagotipia, fagotipia
inversa y fagos adicionales, otro caso ms (34/52> se caracteriza al analizar
DISCUSIN
161
los fagotipos anteriormente citados con los del Fisk, y los 18 casos
restantes se caracterizaban con la antibiotipia.
Como vemos, a pesar de los bajos porcentajes de tipabilidad
conseguidos con algunos de los marcadores fenotpcos, como las
diferentes tcnicas de fagotipia, con la aplicacin sucesiva de estos
marcadores hemos ido obteniendo cada vez ms informacin que nos
permiti caracterizar todos los casos estudiados. Adems cuando
valoramos conjuntamente los patrones obtenidos con las distintas tcnicas
de fagotipia, en 16 <30,8%> casos pudimos establecer si los aislados
pertenecientes a un mismo paciente eran cepas idnticas o diferentes y
cuando junto con los fagotipos tenamos en cuenta el patrn de resistencia
a antimicrobianos en 17 casos ms, es decir, en un total de 33 (63,5%>
casos pudimos establecer relaciones de similitud o diferencia entre aislados
epidemiolgicamente relacionados. Mientras que en 19 <36.5%) casos a
pesar de haber sido caracterizados por uno o varios de los marcadores
fenotipicos, la informacin que se obtuvo no era suficiente para establecer
estas similitudes o diferencias debido a que los aislados resultaron no
tipificados por la mayora de estos marcadores o a que se obtuvieron
resultados de difcil interpretacin, lo cual nos llev a la utilizacin de
marcadores genotipicos.
5.4. VALORACIN DE LOS MARCADORES GENOTIPICOS EN EL ANLISIS
DE LOS AISLADOS DE LOS ECN
5.41. ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE PLASMJDOTIPIA
Est descrito que generalmente es frecuente encontrar plsmidos en
los ECN (Valentine y cols, 1988>. Algunos de estos plsmidos presentes en
los ECN llevan genes que codifican para la resistencia a determinados
antibiticos, mientras que otros tienen una funcin desconocida <Ludlam y
cols, 1989b>; as, se sabe que un plsmido de pequeo tamao <4,5 kb>
DIBCUSIN
162
es responsable de la resistencia a la tetraciclina <Cooksey y Baldwin 1985)

y que la resistencia a la eritromicina, gentamicina y fosfomicina tambin
puede deberse a plsmidos. <Etienne y coK, 1990).
En nuestro estudio al trabajar con 3. epidermidis, 3. haemolytcus,
y 8. hominis, que son algunas de las especies de ECN que presentan
plsmidos con mayor frecuencia <<loas y Bannerman, 1994>, como era de

esperar, hemos encontrado que la mayora de os aislados de estas espacies
contenan plsmidos <72,2%); dato que se correspondecon el 79,2% dado
por Martin de Nicols y cols.(1 995) en su estudio de aislamientos de ECN
en pacientes espaoles. Al igual que se describe en este trabajo, nosotros
hemos encontrado que el tamao de los plsmidos variaba de 1 a 30 kb;
siendo los plsmidos pequeos (<7 kb) los ms frecuentes, seguidos de los
de tamao intermedio (16,2-7 kb) y los de >16,2 kb los menos frecuentes.
Igualmente vimos que existe una gran variabilidad en el nmero de
plsmidos presentes en los aislados, ya que encontramos desde ECN que
carecan de plsmidos hasta ECN que presentaban siete plsmidos,
variabilidad que tambin se corrobora con el trabajo de Dryden y cois.
(1992) en el cual se describen desde aislados sin plsmidos hasta aislados
con 12.
Del mismo modo que se describe en el trabajo de Martn de Nicols
y cols. (1995>, hallamos un elevado nmero de perfiles plasmidicos y el
perfil 2, que corresponda a un nico plsmido de pequeo tamao, fue el
perfil mayoritario. Tambin observamos que cuando los perfiles plasmdicos
presentaban pequeo nmero de bandas, el mismo perfil apareca en
aislados pertenecientes a distintos pacientes sin una evidente reacn
epidemiolgica; este dato contradice la teora de Archer y cois. (1984)
quienes sugieren que en ausencia de relacin epidemiolgica es muy poco
frecuente encontrar perfiles plasmfdicos idnticos en cultivos de dos
individuos distintos. La nica explicacin que podemos dar a este hecho es
que todos nuestros ECN fueron aislados durante un ao en un mismo
hospital y segn el propio Archer y cols. (1985), los ECN son
163
DISCUSIN
microorganismos nosocomiales que estn sometidos a una fuerte presin

selectiva que favorece el desarrollo de resistencia a antibiticos y como es
frecuente que dichas resistencias estn codificadas por genes que se
encuentran en los plsmidos, tales plsmidos pueden diseminarse de unas
cepas a otras y persistir durante prolongados perodos de tiempo en una
institucin, este hecho explicara que dentro de un mismo hospital aislados
de pacientes distintos presentaran el mismo plsmido.
La plasmidotipia es un mtodo de tipado que presenta ciertas
deficiencias que hacen difcil la interpretacin de los perfiles plasmidicos,
algunas de estas deficiencias vienen dadas por que:
Los plsmidos
son elementos
extracromosomales que
presentan una gran inestabilidad, ya que pueden perderse parcial o

totalmente, existiendo una tendencia en los aislados de ECN a perder
fcilmente plsmidos de resistencia a antimicrobianos (Mickelsen y cols.,
1985; Parisi y Hecht, 1980). Y por otro lado, los plsmidos de resistencia
pueden transferirse por conjugacin dentro de una misma especie, o de una
especie a otra de estafilococos <Parisi, 1985). Esta inestabilidad hace que
a la hora de interpretar los perfiles plasmdicos sea difcil establecer reglas
con respecto a la identidad de los aislados en base nicamente a sus
perfiles. Hay autores que dicen que la prdida de una banda e incluso dos
bandas en los perfiles plasmdicos no justifica que aislados relacionados
sean considerados como pertenecientes a dos cepas distintas <Parisi y
1986),
cols,
otros
autores
han
considerado
que
aislados
epidemiolgicamente relacionados podran presentar hasta tres diferencias

en sus perfiles plasmdicos. <Archer y ceis., 1982 y 1984; Mickelsen y
cols., 1985).
-
Existen variables ligadas al mtodo de extraccin que pueden
dar tres formas del mismo plsmido <superenrrollada, circular y lineal) que
tienen movilidades electroforticas distintas y que no resultan fciles de
distinguir <Archer y coK, 1984).
164
DISCUSIN
Existen variables debidas a las condiciones electroforticas.
<Archer y coL, 1984>.

-
Plsmidos con idntica movilidad electrofortica no tienen
porque ser idnticos, por lo que para aumentar la sensibilidad de esta

tcnica los plsmidos podran estudiarse con endonucleasas de restriccin
o lo que seria ms definitivo realizar estudios de hibridacin con el DNA
plasmdico <Parisi, 1985>.
-
El poder discriminatorio de esta tcnica es pobre en aquellos
aislados que carecen de plsmidos o bien presentan nicamente uno o dos.

(Maslow, 1993>.
A pesar de todos los inconvenientes anteriormente expresados, al
valorar los perfiles obtenidos por plasmidotipia junto con los patrones
conseguidos por los marcadores fenotipicos, pudimos establecer similitudes
o diferencias entre los aislados pertenecientes a un mismo enfermo en 9
(17,3%) de aquellos 19 (36,5%> casos en los que con los patrones de las
distintas tcnicas fenotipicas no hablan podido ser establecidas. Al valorar
conjuntamente los patrones de las distintas tcnicas de fagotipia junto con
los patrones de resistencia a antimicrobianos y de plasmidotipia
conseguimos establecer relaciones epidemiolgicas en 42 (80,8%> de los
casos estudiados. Por lo tanto, pensamos que la plasmidotipia puede ser
til en estudios epidemiolgicos de corta duracin, tomando la precaucin
de no realizar sucesivos subcultivos para evitar la prdida de plsmidos. Al
igual que otros autores (Parisi y cols., 1986; Martin de Nicols y cols.,
1995; Ludlam y cols, 1989b> creemos que la combinacin de la
plasmidotipia con uno o ms marcadores fenotipicos puede resultar til en
determinados estudios bsicos de caracterizacin de los ECN, as como
para establecer posibles relaciones epidemiolgicas en los procesos
infecciosos causados por ECN.
165
DISCUSIN
5.4.2.
ANLISIS
DEL
ADN
DE
LOS
AISLADOS
MEDIANTE

Por ltimo completaremos el estudio de los aislados de ECN mediante
el anlisis del ADN total digerido con endonucleasas de restriccin de corte
infrecuente y su electroforesis en campo pulsado, mtodo que ha sido
propuesto como un nuevo marcador para realizar estudios epidemiolgicos
<AIardet-Servent y cois., 1989).
Segn Goering <1993> la seleccin de la enzima apropiada para
realizar esta tcnica depende de la frecuencia de los lugares de restriccin
de la enzima presentes en el cromosoma del microorganismo, como las
bacterias gram positivas tienen en su ADN un alto contenido en adenina y
timina entonces las enzimas de restriccin que reconozcan secuencias ricas
en guanina y citosina podran proporcionar un pequeo nmero de
fragmentos de ADN adecuado para el anlisis en PFGE. Siguiendo este
criterio probamos las enzimas Sma 1, Sst II, Apa 1 y Pvu II; y despus de
analizarlos perfiles obtenidos decidimos trabajar con Sma 1 ya que produca
un perfil con una fragmentacin de un amplio rango de pesos moleculares,
con bandas claras y en nmero adecuado- Enzima que ha sido utilizada en
el anlisis del ADN de los ECN en PFGE por autores como Vandenesch y
cols. <1993>, Huebner y cols. <1994> y Linhardt y cols. <1992)Mediante esta tcnica obtuvimos un alto nmero de perfiles
electroforticos claramente diferentes, 59 perfiles distintos de un total de
114 aislados pertenecientes a 38 casos y nueve perfiles ms que presentan
ciertas diferencias con respecto a alguno de los anteriores 59 perfiles. Este
alto nmero de perfiles electroforticos est en consonancia con los
numerosos patrones obtenidos con el resto de los marcadores utilizados,
dato que indica una gran variabilidad dentro de los ECIN> y especialmente
dentro de la especie 3. epidermidis, puesto que la mayora de los aislados
que hemos estudiado pertenecan a esta especie. Esta gran variabilidad
DISCUSIN
166
tambin ha sido descrita por Vandenesch y cols. <1993> en su trabajo de

marcadores epidemiolgicos en ECN.
Al digerir el ADN de los ECN con la endonucleasa Sma 1 encontramos
un nmero de fragmentos de restriccin similar al descrito por Tenover y
cols. (1995> que variaba desde 3 hasta 21 bandas.
Las criticas que se le pueden hacer a esta tcnica es que aunque la
perdida o adquisicin de plsmidos normalmente no influyen en el perfil

electrofortico, si existiera un plsmido de gran tamao, este podra ser
linealizado por la endonucleasa interfiriendo tericamente en el perfil
(Vandenesch y cols., 1993>- Esto no constituira un problema dentro de los
ECN puesto que, como ya hemos visto, la mayora de sus plsmidos son
pequeos. Tambin la integracin de fagos en el cromosoma bacteriano
puede ser responsable de pequeas variaciones en el perfil de restriccin
del ADN <Lina y cOIs., 1993>. Pero la crtica ms importante se debe a la
dificultad que conleva la comparacin de geles, puesto que las condiciones
electroforticas influyen en las distancias de migracin de los fragmentos
de restriccin a travs del gel, esta dificultad se puede eliminar analizando
en un mismo gel el ADN de los aislados que queremos comparar y si ello
no fuera posible analizando en el nuevo gel el ADN cuyo perfil
electrofortico hemos considerado patrn junto con los ADN del resto de
los aislados,
A la hora de estudiar las posibles relaciones epidemiolgicas entre

diferentes aislados de un mismo enfermo mediante el anlisis de los perfiles
de restriccin de sus ADN, y aunque conscientes de que la comparacin de
patrones es un proceso subjetivo que no puede ser reducido a estrictas
reglas, siguiendo los criterios de Tenover y cols. <1995> y teniendo en
cuenta que aislados estrechamente relacionados presentaban un coeficiente
de similitud superior al 80% <Goering 1993), sugerimos 4 tipos de
relaciones epidemiolgicas:
-
Cepas idnticas que presentaban el mismo perfil electrofortico con un
coeficiente de Sorensen del 100%.
DISCUSIN
67
Cepas relacionadas con perfiles electroforticos con una diferencia de
hasta 3 bandas y un coeficiente de Sorensen inferior al 00% y superior al

80%.
-
Cepas posiblemente relacionadas cuyos perfiles eran similares aunque con
ms de tres bandas de diferencia y un coeficiente de Sorensen entre el

80% y el 69%.
-
Cepas distintas cuyos perfiles de restriccin eran claramente diferentes y
su coeficiente de similitud inferior al 69%.

Los patrones electroforticos por campo pulsado, por un lado nos
permitieron confirmar la valoracin realizada en base a los patrones
obtenidos por los marcadores anteriormente descritos cuando establecimos
las similitudes y diferencias entre aislados de un mismo enfermo, y por otro
lado nos permitieron determinar las posibles relaciones epidemiolgicas
entre los aislados de un mismo paciente en aquellos 10 (19,2%) casos en
los que con los patrones de los marcadores no pudieron ser establecidas,
debido a una caracterizacin insuficiente de dichos aislados por problemas
de tipabilidad o a dificultades en la interpretacin de los resultados. Por lo
que basndonos en los criterios anteriormente expuestos con los perfiles de
restriccin obtenidos por campo pulsado conseguimos determinar en todos
los casos si aislados de un mismo paciente eran la misma cepas o cepas
distintas. Nosotros al igual que Maslow y cols. (1993> comprobamos que
con esta tcnica cada aislado no relacionado tiene un nico perfil y que
como describe Huebner y cols. <1994>, cuando digerimos el ADN de los
ECN con Sma 1 y realizamos la electroforesis en campo pulsado
encontramos una gran variabilidad de perfiles electroforticos. Adems
observamos que aislados estrechamente relacionados presentan perfiles de
bandas altamente conservados. Al comparar los resultados obtenidos con
PFGE con los conseguidos por el resto de los marcadores fenotipicos y
genotipicos utilizados en este estudio, la electroforesis en campo pulsado
fue la tcnica que de una forma ms clara y convincente nos permiti
establecer las posibles relaciones epidemiolgicas en los aislados
DISCUSIN
168
estudiados. Por lo tanto, del mismo modo que otros autores <Linhardt y
cols., 992) creemos que PFGE es una tcnica muy til para el anlisis
epidemiolgico de las infecciones nosocomiales por ECN.
5.5- VALORACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIA EN BASE A LOS
DATOS MICROBIOLGICOS Y CLNICOS
5.5.1.- VALORACIN DE LOS CASOS DE BACTERIEMIA EN BASE A LOS
DATOS MICROBIOLGICOS
Como hemos visto, el hecho de que los ECN sean microorganismos
ubicuos que constituyen el principal componente de la microflora de la piel
y mucosas da lugar a que cuando se aisla un ECN en un hemocultivo sea
un problema controvertido establecer si es el agente etiolgico de la
infeccin o si es un contaminante <Kleeman y cols. 1993>. El criterio
microbiolgico generalmente aceptado con el que presumiblemente se
diferencia entre verdadera infeccin y contaminacin se basa en dos
parmentros. Por un lado la existencia de un alto nmero de UFC/ml que se
interpretarla como un indicio de infeccin <Bryan, 1989>, siendo ste un
parmetro que adquiere especial importancia en el caso de los neonatos de
bajo peso a los que slo se les realiza una extraccin. Y por otro lado
teniendo en cuenta que es altamente improbable, dada la gran variabilidad
intrnseca de los ECN, que aislados no relacionados epidemiolgicamente
presenten las mismas caractersticas fenotipicas y genotpicas <Etienne y
cols, 1990; Herwaldt y cols, 1990> se considera evidencia de infeccin
el aislamiento de la misma cepa de ECN en diferentes hemocultivos
obtenidos a lo largo del tiempo en un mismo paciente <Etienne y cols.,
1990, Jarl~v y cols., 992). El elevado nmero de patrones que hemos
obtenido por distintos marcadores fenotpicos y genotpicos en el estudio
de nuestros aislados apoya la existencia de una variabilidad intrnseca en
los ECN, lo que hace que confiemos en el criterio anteriormente expuesto
DISCUSIN
169
para determinar la importancia clnica del ECN aislado de hemocultivo.

En la seleccin de todos los casos estudiados en este trabajo tuvimos
en cuenta la dificultad que tiene el determinar si un ECN es el agente causal
de una infeccin o un simple contaminante. Para reducir en lo posible la
dificultad de esta valoracin elegimos solamente aquellos casos en los que
disponamos de la informacin clnica del paciente as como de distintos
aislados obtenidos de diferentes hemocultivos de un mismo paciente.
Adems debido a que en algunos casos se hablan aislado varios ECN en un
largo espacio de tiempo hizo que, para obtener una mejor compresin de lo
que estaba ocurriendo durante el proceso infeccioso, dividiramos los casos
en perodos de tiempo que llamamos episodios, considerando que los
hemocultvos pertenecan a episodios distintos cuando transcurra al menos
una semana sin hemocultivos positivos.
A causa de que no existe un nico mtodo de tipado efectivo que
caracterice a los ECN, para poder determinar en los casos estudiados silos
ECN aislados eran los agentes causales de las infecciones se les fue
caracterizando, como aconsejan diversos autores (Dryden y cola., 1992;
Parisi y coK, 986), con los patrones obtenidos de un conunto de
marcadores epidemiolgicos. A todos los aislados se les aplic tres
marcadores fenotpicos (fagotipia, fagotipia inversa y resistencia a
antimicrobianos> y uno genotlpico <plasmidotipia), pero debido a que en
algunos casos la caracterizacin result insuficiente a causa del bao
porcentaje de tipabilidad que ofrecan algunas de estas tcnicas y en otros
casos resultaba difcil la interpretacin de los patrones hizo que se fueran
aplicando sucesivamente nuevas tcnicas (fagotipia con fagos adicionales,
Fisk y PFGE> hasta conseguir una suficiente y clara caracterizacin de los
casos que nos permitiera establecer cual era el ECN responsable de la
infeccin y cual el contaminante.
A la hora de valorar los patrones obtenidos por los distintos
marcadores epidemiolgicos para establecer si dos cepas eran iguales o
distintas nos basamos en los criterios utilizados por otros autores <criterios
DISCUSIN
170
que estn ampliamente explicados en el apartado 4.12.1 de resultados>.

De este modo, consideramos que dos cepas eran idnticas si presentaban
los mismos patrones por todos los marcadores y cuando aparecan
pequeas diferencias se seguan los siguientes criterios: para valorar
diferencias en los patrones de fagotipia seguimos la regla de las dos
diferencias <Williams y Rippon, 1952>; diferencias en los patrones de
resistencia a antimicrobianos y perfiles plasmdicos fueron analizadas
teniendo en cuenta que tanto la resistencia a antibiticos como la presencia
de plsmidos son dos caractersticas inestables sujetas a la presin
selectiva hospitalaria <Mickelsen y coK, 1985, Parisi y cols. 1986); en
cuanto a los perfiles electroforticos obtenidos por campo pulsado nos
basamos en que cada aislado no relacionado tiene un nico perfil de
restriccin en PFGE (Maslow y cols., 1993> y analizamos las diferencias en
los perfiles siguiendo los criterios de Tenover y cols. <995) y Goering
(1993) encontrando casos con cepas idnticas, relacionadas, posiblemente
relacionadas y distintas.
Una vez que consideramos que todos
los casos
estaban
adecuadamente caracterizados, analizamos globalmente el hecho de que

con la aplicacin sucesiva de los distintos marcadores bamos obteniendo
nueva informacin que nos permitira ir aumentando el nmero de casos en
los que se podan establecer si distintos aislados pertenecientes de un
mismo paciente eran o no la misma cepa. Encontramos que dicha relacin
epidemiolgica se pudo determinar en 16 <30,8%) casos con el anlisis de
los patrones de las distintas tcnicas de fagotipia; cuando aadamos los
patrones de resistencia a antimicrobianos en 17 casos ms, lo que hacia un
total de 33 <63,5%> casos, era establecida dicha relacin; cuando a los
anteriores marcadores aadamos los patrones plasmidicos en 9 casos ms,
lo que constitua un 42 <80,8%> de los casos, establecamos las similitudes
y diferencias; y cuando por ltimo aadamos los patrones obtenidas por
PFGE las relaciones epidemiolgicas quedaban claras en los 10 casos
restantes, por lo que en este punto en los 52 (100%) casos se pudo
17
DISCUSIN
establecer si los ECN aislados de hemocultivos de un mismo enfermo eran

una nica cepa o cepas diferentes.
Desde nuestro punto de vista de laboratorio vimos que en los casos
de bacteriemias aparecan dos tipos de situaciones: casos con un nico
episodio y casos con varios episodios.
Casos de bacteriemia con un nico episodio
Los casos de bacteriemia con un nico episodio fueron 45, lo que
representa el 87% de los casos, de los cuates en 27 <52%> casos los ECN
aislados eran la misma cepa y por lo tanto fueron considerados patgenos.
En cinco de los casos <0%) adems de cepas idnticas, consideradas
como el agente causal de la bacteriemia, se aislaron algunas cepas distintas
que fueron consideradas como posibles contaminantes, este hecho de
encontrar una cepa de ECN evaluada como significante junto con otras
calificadas como contaminantes no parece ser un hecho inusual y est
descrito en otros trabajos <Harstein y cols, 1988; Mickelsen y cola., 1985,
Panal y cols. 985). En un caso <2%) en el que se aislaron ECN de cinco
hemocultivos, tres de los aislados pertenecan a una misma cepa de 3.
hominis, y los otros dos aislados a una misma cepa de 3. epidermidis; en
este caso existe una infeccin mixta producida por dos especies de ECN,
Weinstein y cola. (983> en su revisin acerca de la significacin clnica de
hemocultivos positivos en episodios de bacteriemia informa que un 18,4%
de los episodios de bacteriemia eran infecciones mixtas y atribuye este alto
porcentae a la gran proporcin de pacientes inmunocomprometidos cuyos
hemocultivos han estudiado. El hecho de que nuestro porcentaje de
infecciones mixtas sea significativamente menor que el de Weinstein y cola.
se explica porque mientras Weinstein estudia todos los microorganismos
aislados en los hemocultivos, nosotros estudiamos tan solo los ECN- En 12
casos (23%> los ECN aislados de los hemocultivos resultaron ser cepas
distintas, y como de la mayora de los pacientes slo tenamos dos
hemocultivos no pudimos determinar el agente etiolgico de la infeccin
pero
tampoco podamos
decir rotundamente
que los
ECN
eran
DISCUSIN
172
contaminantes, puesto que si hubiramos tenido ms hemocultivos tal vez

en algn caso alguno de los ECN aislados hubiera sido considerado con
significacin clnica,
Casos de bacteriemia con varios episodios
Siete de los casos estudiados <13%) presentaron ms de un episodio
de bacteriemia. El anlisis de la mayora de estos casos resulta complejo
porque la infeccin se prolonga durante un largo perodo de tiempo, pero
se consigue llegar a conclusiones acerca de lo que est pasando en el
proceso infeccioso gracias a que de cada caso tenemos un gran nmero de
hemocultivos que nos va a facilitar el determinar qu cepa es el agente
causal de la bacteriemia. En estos casos es frecuente encontrar una cepa
de ECN dominante, que es considerada patgena, junto con otras cepas
que presentan ciertas variaciones y que estn relacionadas con la cepa
dominante y seguramentejuegan un papel infeccioso, y adems otras cepas
diferentes que podran ser consideradas contaminantes; hecho que tambin
ha sido descrito por Ryding y cols. (1992>. Tambin es frecuente encontrar
casos en los que en un episodio una cepa de ECN es la responsable de la
bacteriemia mientras que en el episodio siguiente lo es otra cepa distinta.
Como ejemplos ms representativos de lo que aqu se ha dicho, vamos a
comentar el caso 8 y el caso 42.
El caso 8 es un paciente varn ingresado en la unidad de cuidados
intensivos, con catter intravenoso y present un cuadro de sepsis. Durante
los meses de Enero y Febrero se tomaron varios hemocultivas que
pertenecen a tres episodios. En el primer episodio se estudiaron 4
hemocultivos de los que se aislaron 4 3. hominis, tres de los cuales son
idnticos y constituyen la cepa dominante y el otro resulta estar
estrechamente relacionado con los anteriores, lo que nos lleva a concluir
que en este primer episodio el agente etiolgico de la bacteriemia es un 3.
hominis, del segundo episodio salo habla un hemocultivo del que se aisl
3. epidermidis, que en principio podra haber sido considerado como carente
de significacin clnica pero como en los dos hemocultivos del tercer
DISCUSIN
173
episodio se aislan dos 3- epidermidis, uno de ellos idntico al del segundo

episodio, ello hace que a ste se le considere patgeno; mientras que el
otro que resulta distinto fue considerado como posible contaminante. En
este caso como transcurre un mes entre los hemocultivos del primer
episodio y los del segundo y tercero, podramos hablar de una reinfeccin.
El caso 42 es un paciente varn de un ao ingresado en el rea de
pediatra con una leucemia linfoblstica aguda y durante los meses de Abril,
Junio y Julio se estudiaron varios hemocultivos de los que se aislaron ECN.
En este caso los clnicos tuvieron dudas acerca de la significacin clnica de
los ECN que se aislaron en los sucesivos hemocultivos. Con los datos de
laboratorio en el primer episodio en el que de dos hemocultivos se aislan
dos cepas de 3. epidermidis distintas, no pudimos determinar el agente
etiolgico de la bacteriemia. En el segundo episodio con 4 hemocultivos de
los que se aislaron 4 S. epidermidis dos de los cuales resultaron idnticos
constituyendo la cepa dominante y las otras dos cepas resultaron estar
estrechamente relacionadas con la anterior, habindose as constatado que
en este episodio la bacteriemia fue causada por un ECN. En el tercer
episodio encontramos dos cepas de 3. epdermidis idnticas entre s y
diferentes de las del segundo episodio, por lo tanto la bacteriemia en este
momento estara causada por una cepa distinta de la del episodio anterior.
En el cuarto episodio de dos hemocultivos se aislaron dos 3. epidermidis
que resultaron ser la misma cepa e idntica a la cepa dominante del
segundo episodio. Este caso, a pesar de que no se han aislado los dos 3.
epidermidis patgenos en un mismo episodio, parece ms un caso de
infeccin mixta, en el que no se han detectado a la vez los dos agentes
patgenos, que uno de reinfeccin ya que es improbable que en el cuarto
episodio la reinfeccin sea producida por la misma cepa que en el segundo
existiendo entre medias otro episodio de reinfeccin por una cepa diferente.
DISCUSIN
174
Concluiremos diciendo que la valoracin microbiolgica del proceso

infeccioso es ms exacta cuantos ms hemocultivos de un mismo paciente
podamos analizar y cuantos ms datos epidemiolgicos del paciente
tengamos. Si estas premisas se cumplen la valoracin microbiolgica va ha
determinar si los ECN son los agentes etiolgicos de las bacteriemias.
5.5.2.- COMPARACIN ENTRE LA VALORACIN MICROBIOLGICA Y
CLNICA DE LAS BACTERIEMIAS RELACIONADAS CON ECN
Como hemos visto, en este estudio se ha establecido el carcter
patgeno o contaminante de los ECN aislados de hemocultivos en base a
dos criterios, por un lado al criterio clnico y por otro lado basndonos en
los datos de laboratorio. Al comparar la valoracin clnica con nuestra
valoracin microbiolgica encontramos que en 34- casos existe una
concordancia entre ambos criterios y en la mayora de los casos (30> los
ECN fueron considerados patgenos por ambos criterios. En seis casos
donde el clnico dudaba de la significacin clnica de los ECN, los datos de
laboratorio identificaron al ECN responsable de la bacteriemia. En tan slo
tres casos exista un desacuerdo entre ambos criterios, donde como era de
esperarlos ECN fueron considerados contaminantes segn el criterio clnico
mientras que con los datos de laboratorio se identific al ECN agente causal
de la bacteriemia. Los nueve casos restantes los datos microbiolgicos no
permitieron establecer si los ECN tenan o no significacin clnica.
Resumiendo diremos que los datos microbiolgicos permitieron
identificar al ECN causante de la bacteriemia en un 75% de los casos
estudiados y en tan solo un 7% de los casos exista un desacuerdo entre
el criterio clnico y el microbiolgico.
DISCUSIN
175
5.6.- ESQUEMA JERARQUIZADO PARA LA CARACTERIZACIN DE LOS

ECN
Para poder establecer qu marcadores epidemiolgicos deberamos
utilizar en el estudio de los ECN hay que tener en cuenta tanto las
caractersticas que tiene cada marcador como el tipo de estudio que se
quiere realizar.
En este trabajo hemos debatido ampliamente acerca de las ventajas
e inconvenientes que los distintos marcadores epidemiolgicos presentaban
en el estudio de los ECN, el resumen de Ja valoracin de estos marcadores
epidemiolgicos queda reflejado en la Tabla 24. Como hemos comprobado,
no existe un nico mtodo de tipado que pueda por si solo utilizarse en
estudios de ECN, entonces es necesario utilizar una combinacin de
marcadores epidemiolgicos para caracterizar a estos microorganismos.
En el caso de los Laboratorios Hospitalarios en los que necesitan un
diagnstico rpido y en los que generalmente se realizan estudios
epidemiolgicos de corta duracin, resultara til que junto con las
resistencias a antimicrobianos que se realizan de forma rutinaria con objeto
de establecer el tratamiento del paciente tambin se realizar plasmidotipia,
ya que con la valoracin conjunta de los patrones obtenidos por ambas
tcnicas se puede determinar en un gran proporcin de casos si el ECN es
el agente etiolgico de la infeccin nosocomial, a la vez que se detectaran
la posible aparicin de brotes causados por ECN.
En el caso de los Laboratorios de Referencia, para los trabajos de
vigilancia epidemiolgica continuada es recomendable utilizar las tcnicas
de fagotipia y fagotipia inversa junto con la resistencia a antimicrobianos.
Los patrones obtenidos por estas tcnicas nos caracterizaran los aislados
permitindonos establecer sus posibles relaciones epidemiolgicas de una
forma rpida y econmica pudiendose detectar la existencia de brotes, que
deberan ser confirmados con los patrones conseguidos por algn marcador
176
DISCUSIN
molecular. Segn los datos de este trabajo el ms adecuado seria la tcnica

de PEGE que por su discriminacin y reproducibilidad dara una informacin
ms precisa sobre las relacines epidemiolgicas existentes entre las cepas.
TABLA 24: VALORACIN DE LOS MARCADORES EPIDEMIOLGICOS EN
EL ESTUDIO DE LOS ECN
TCNICA
VENTAJAS
Fagotipia
Buena discriminacin
Tipabilidad baja
Mantenimiento
Buena reproducibilidad
Analiza alto n0 de cepas
Slo Laboratorios Referencia
No necesita
Rpida
Ecanmica
Sencilla
Inestabilidad
Antibiotipia
Plasmidotipia
E. campo pulsado
INCONVENIENTES
de fagos
aparataje
- Aceptable reproducibilidad
Difcil valoracin
Aceptable
discriminacin
Alta
Rpida
Sencilla
Econmica
Realizable
Tipabilidad aceptable
Escasa reproducibilidad
Rpida
Escasa discriminacin
Sencilla
Inestabilidad
Econmica
Difcil valoracin
Aparataje sencillo
Limitada a cortos estudios
Realizable en Lab- hospitalarios
- Alta tipabilidad
Aparataje
Alta
reproducibilidad
No
Alto
poder
Difcil
Sencilla
tipabilidad
en
Lab.
hospitalarios
discriminatorio
es
costoso
rpida
valoracin
DISCUSIN
177
Para concluir diremos que aunque los ECN son importantes agentes
etiolgicos de bacteriemias en pacientes que presentanserias enfermedades
de base, el establecer si estos microorganismos tienen significacin clnica
es un problema controvertido, porque son uno de los componentes
mayoritarios de la microflora de la piel y mucosas y adems no existe un
mtodo eficaz de tipado que los caracterice siendo necesaria la utilizacin
de varios marcadores epidemiolgicos para conseguir tal fin. Estos
inconvenientes dan lugar a que en los estudios epidemiolgicos de los ECN
solamente se consigan buenos resultados si se tiene perseverancia y si
distintos grupos de profesionales trabajan en equipo realizando las
siguientes labores: el personal de enfermera obteniendo muestras de buena
calidad, el microbilogo identificando y caracterizando el microorganismo
aislado en la muestra y dando una valoracin desde el punto de vista de
laboratorio y por ltimo el clnico valorando conjuntamente la clnica con los
resultados del microbilogo.
CONCLUSIONES
78
5.-CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
-179
A partir de los aos 70, los ECN son reconocidos como agentes
causales de una variedad de enfermedades, observndose que se ha
producido un aumento progresivo de las bacteriemias en las que los
ECN son la primera causa de infeccin. De las diferentes especies
estafiloccicas es 3. epidermidis la que con mayor frecuencia se aisla
en las bacteriemias seguido de lejos por 3. haemolytcus y 3. hominis.
1.
Todas las tcnicas de fagotipia analizadas tipificaron un bajo

porcentaje de aislados de ECN. La fagotipia con el juego de fagos
combinado fue la que mayor porcentaje de tipabilidad proporcion
<34,8%>. Esta tcnica junto con la fagotipia inversa, fueron las que
mayor poder discriminatorio presentaron, y resultaron de poca utilidad
en la caracterizacin de estos microorganismos las tcnicas de Fisk y
fagotipia con fagos adicionales.
2.
Se propone reducir el juego de fagos combinado de 42 a 25 fagos,

quedando constituido por los 20 fagos del juego de Dean y Williams
<ya que nos permite comparar nuestros resultados con los obtenidos
en otros paises) y los 5 fagos del juego autctono: 89904, 90319,
90341, 90352 y 90509.
3-
A pesar de los inconvenientes que la antibiotipia presenta, este mtodo

de tipado result ser un marcador reproducible y discriminatorio cuya
realizacin de forma sistemtica en los laboratorios hospitalarios puede
proporcionar un primer aviso sobre la existencia de cepas relacionadas
epidemiolgicamente.
180
CONCLUSIONES
4.
A pesar de los problemas de reproducibilidad y discriminacin, la

plasmidotipia puede resultar de utilidad en estudios epidemiolgicos de
corta duracin tomandose la precaucin de no realizar sucesivos
subcultivos para evitar la prdida de plsmidos.
5.
El PFGE ha sido el marcador que de una forma ms clara y convincente

nos ha permitido establecer las posibles rejaciones epidemiolgicas en
los aislados estudiados, por lo que creemos que PFGE es una tcnica
muy til
para
el
anlisis epidemiolgico de las
infecciones
nosocomiales causadas por ECN.
6.
Con todos los marcadores utilizados en la tipificacin de los ECN

hemos obtenido un elevado nmero de patrones, lo que indica que en
los ECN y especialmente en 3. epidermidis existe una gran variabilidad.
7.
Mediante la aplicacin sucesiva de los distintos marcadores, se

estableci si los ECN tenan o no significacin clnica en los casos
estudiados. Dicha valoracin se realiz en el 30,8% de los casos en
base a los patrones obtenidos por las distintas tcnicas de fagotipia,
en el 63,5% con las tcnicas de fagotipia y antibiotipia, en el 80,8%
con las tcnicas anteriormente citadas junto con plasmidotipia y se
llego al 00% de los casos con los patrones obtenidos por todas las
tcnicas incluida PFGE.
181
CONCLUSIONES
8.
Los distintos ECN aislados de hemocultivos de un mismo enfermo

resultaron ser la misma cepa en 39<52) casos, siendo considerados los
agentes etiolgicos de las bacteriemias. En los 13 casos restantes los
aislados presentaban distintos patrones por lo que eran cepas
diferentes. En la mayora de los casos las bacteriemias presentaban un
nico episodio. Las reinfecciones e infecciones mixtas fueron ms
frecuentes en aquellos casos de bacteriemias con varios episodios. En
tan slo 3 casos <7%) existi desacuerdo entre el criterio clnico y
microbiolgico en la valoracin de los ECN como agentes etiolgicos
de las bacteriemias.
9.
En laboratorios hospitalarios,
caracterizacin de
los ECN
proponemos como
el estudio de
esquema de
la sensibilidad a
antimicrobianos junto con la piasmidotipia; ya que con ambas tcnicas

de una forma rpida y sencilla se va a obtener suficiente informacin
para poder evaluar la situacin epidemiojgica de la infeccJn
nosocomial causada por ECN.
10- En el Laboratorio de Referencia, en el que se van a desarrollar estudios

de vigilancia epidemiolgica continuada, es recomendable utilizar junto
con los datos de sensibilidad a antimicrobianos proporcionados por el
laboratorio hospitalario, las tcnicas de fagotipia y fagotipia inversa
para establecer relaciones epidemiolgicas entre los aislados y detectar
brotes que deberan ser confirmados por los patrones conseguidos por
P FG E
182
BIBLIOGRAFA
7.-BIBLIOGRAFIA
183
EIBLIOGItAPIA
AASEN J.Y.. OEDING P. <1971 >Antigenic atudies
on Staphylacoccus epidermidis,
A.PM.IS.. Sect. 6. 79:827-834.
AAVITSLAND P.. STUMARI< M.. LYSTAD A. (1992>. HOS

Quired infections in
Norway: A national prevalence study survey in 1991. Scand. J. Infec. Vis. 24: 477-483.
ABD-EL-MALEK Y. GIBSON T. (1948). Studies in the bacteriology of milk. II. The
staphylococci and nlicracocci of milk. J. Dairy Res. 15:249-260
ABER C., MACKEL o.c. <1981>.Epidemioogid typing of nosocomil microorganisms, en

Richard E. Dixon <ed.). Nosocomial lnfections, Yorke Medical Books, pp. 161-1 67.
AKATOV A.K., KI-IATENEVER M.L, DEVRIESE GM. <1981>.ldentification of coagulasenegative staphylococci isolated from clinical sourcest pi 53-161. In J. Jeljaszewicz (ed->.
Staphylococci and satphylococcal infections. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart. Federal
Republic of Germany.
ALDRIDGE K.E.. STRA1TON C.W.. PAlTERSON 1.5.. EVANS M.E.. I-IODGES R.L.
<1983>. Comparison of the staph-ldent System with a convetional method for species
identification of urine and blood isolates of coagulase-negative staphylococci. J. Clin.
Microbiol. 17:516-520.
ALMEIDA R.J.. JORGENSEN J.H. JOHSON JI. <l983WEvaluation of the Auto Microbic
Syatem gram-negative identification card for species identification of coaguiase-negative
staphylococci. J. Clin. Mcrobiol. 18:438-439.
ALLARDET-SERVENT A., BOUZIGES
It,
CARLES-NURIT J.. BOURG G.. GOUBY A..
RAMUZ M. <1989>. Use of low-frecuency-cleavage restriction endonucleases for DNA
analyss epidemiologycal investigations of nosocomial bacterial infections. J. Clin.

Microbiol. 27:2057-2061
-
ARCHER G.L.
<1988>Molecular
epidemiology of multiresistant
epidermidis. J. Antimicrob. Chemother. 21:133-138.
Staphylococcus
84-
BIBLIOGRAFA
ARCHER G.. dIMO MW.(1994LAntmicrobal susceptibility of coagulase-negative

staphyococci. Antimicr. Agen. Chemoter. 38:2231-2237.
ARCHER G.L.. DIETRICK D.R, JOHNSTON J.L. <1985LMolecular epidemiolagy of

transmissibe gentamicin resistance among coagulase-negative staphylococci in a cardiac
e
surgery unit. J. lnfect. bis. 151 :243-251.

ARCI-IER G.L. KARCHMER A.W.. VISHNIAVSKY N.. JOHNSTON J.L. <1984VPasmid-
pattern analysis for the differentiation of infecting from noninfecting Staphylococcus

epideirnidis. J. infect. bis. 149:913-920.
ARCHER G.L.. TENENBAUM M.J. (1980> Antibiotic-resistant Staphylococcus epidermidis
in patients undergoing cardiac surgery. Antimicrob. Agents Chemother. 17:269-272.
ARCHER G.L., VISHNIAVSKY N., STIVER HG. (lS82VPIasmid pattern anaysis of
Staphylococcus epidermidis isolates from patients with prosthetic vaNe endocarditis.

lnfect. lrnmun. 35:627-632.
AULETTA A.E.. KENNEDY ER. (1 966LDeoxyribonucleic acid base composition of sorne
members of the Micrococcaceae. J. Bacteriol., 92:28-34.
BAIRD-PARKERA.C. (1 963 VA csasification of micrococci and staphylacocci basad on
phyliological and biochemical testt J. Gen. MierobioL. 30:409-427.

BAIRO-PARKER A.C. (1965> iThe classificatfon of staphylococci and mcrococc from
world-wide sources. J.Gen.MicrobioL, 38:363-387.
RANNERMAN Tt. KLOOS WE. <199 ll7Step/,yiococcus capris subsp.
ureo/vucus
subsp. nov. from human skin. lnt. J. Syst. Bacteriol., 41:144-147.

BARRITT M.M. 11936). The intensification of the voges-praskauer reactian by the addition
of o-naphto. J. Pathol. Bacteriol. 42:441
BARRY A.L.. LACHICA R.VA. ATCHiNSON JtW. (1973>. identificatin of S.
OLJTBJJS
by
simultaneous use of the tuba coagulase and thermonuclease tesC. App Microbiol.
25:426-497.
BIBLIOGRAFA
185
BAUMGART 5.. HALL S.E.. CAMPOS J.M.. POLN R.A. (1983>.Sepsis with coagulasenegative staphylococci in critically il newborns Am. J. Dis. Child. 137:461-463.
-
BERGEYS MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY, The Williams and Wilkins Co.,

Baltimore, Q ed., 1923; Ved., 1925; 30 ed., 1930: 4 ed., 1934; 9 ed., 1939; 6 de.,
1948; 7 ed., 1957; & ed-. 1974; 9 ed., 1994.

BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, <1986), vol 2, P.H.A. Sneath
<ed>, The Williams and Wilkins Co., Baltimore.

BERNARDER 5.. I-IAMBREAUS A, MYBCK. NYSTRM 8.. SUNDELOF 8. (1978>.
Prevalence of hospital-associated infection in five swedish hospitais in november 1975.
Scand. J. lnfec. Da. 10:66-70.
BIALKOWSKA-HOBRAZANSKA H., JASKOTO.. HAMMERBERG 0. (1 99oVEvaluation of
restriction endonuclease fingerprinting of chrornosomal
DNA and plasmid profile analysis
for characterization of multirresistant coagulase-negative staphylococci in bacteremic

neonates. J. Clin. Microbiol. 28:269-275.
BIRNBOIM H.C.. DOLY J. <1 979)A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nuc. Acids. Res. 7:1513-1523.

BLAIR Ji.. WILLIAMS R.E.O. <1961 >7Phage typing of staphylococci. BuIl W.HO.
24:771 -784.
BLOUSE Li., KOLONEL UN., WATKINS CA.. ATHERTON JM- <1975hEfficacy of
phage-typing epidemiologicallyrelatedS. epiderm/disstrains. J. Clin. Microb. 2:318-321.
BRACHMAN P.S. (1 979hepidemiologlade las infecciones nosocomiales, en J.V. Bennett
y P.S. Brachman (eds.>, Infecciones hospitalarias. Little, Brown and Co. Inc., Boston, pp.
29-50.
BRANDT 1.. SWAHN 8. (1960)Subacute bacterial endocarditis due to coagulasenegative Staphylococcus albust Acta Med. Scand. 166:125-1 32.
BIBLIOGRAFA
186
BRYAN CH.S. (1989>.Clinical implications of positive bcod cultures. Clin. Microb. Rey.
2:329-353.
CANTOR C.R.. SMITH C.L., MATHEW M. (1 98BVPulsed-field gel electrophoresis of very
larga DNA molecules. Ann. Rey. Biophys. Chem. 17:287-304.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL. (1977). National nasocomial infectiana study. United
States 1975-1 976. MM.W.R., 26:377-383.
CLARKE A.M. <1 979>.Prophylactic antibiotics for total hip arthroplasty-the significance
of Staphylococcus epidermidis. J. Antimicrob. Chemother. 5:493-502.
CLARK WM.. LUBS H.A. (1915>.The differentiation of bacteria of the colon-aerogenes

family by Ihe use of indicators. J. lnfect. Dis. 17:160.
COOKSEY R., BALDWIN JIJ. (1985).Aelatedness of tetracycline resistance plasmids
among species of coagulase-negativa staphvlococci. Antimicrob. Agents. Chernother.
27:234-238.
COSTAS Nf.. COOKSON 8.0.. TALSANIA H.G. OWEN R.J. (19891/Numarcal analyss
of electrophoteyic protein patterns of methillin-resistant strains of 3. aureus. J. Clin.
Microbiol. 27:2574-2681.
CHESNEAU. O.. MORVAN A.. GRIMONT F., LABISCHINSKI H., EL SOLH N.
(1993>.Staphylococcus pasteuri sp. nov., isoated from human, animal, and toad
specinians. lnt. J. Syst. Bacteriol. 43:237-244.

CHRISTENSEN W.B. (1946>- Urea descomposition as a means of differentiating Piarais
and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shgel/a types. J.
Sacteriol. 52:461.
CHRISTENSEN 0.0.. PARISI JIX. BISNO. A.L.. SIMPSON W.A.. BEACHEY, EH.
<1 983>. Characterization
of
ciinically
significant
staphylococci, J. Clin. Microbiol., 18:258-269.
strains
of
coagulase-negativa
187
BIBLIOGRAFA
CHU G.. VOLLRATH O.. DAVIS R.W. (1986>/Separation of large DNA molecules by
contour-clampad homogeneus aiectrics fields. Sciance, 234:1582-5.
DAVISON AL.. BADDLLEY J. (1 9637The distribution of teichoic acids In staphylococci.
J. Gen. Microbiol., 32:271-276.
DEAN B.A.. WILLIAMS R.E.O.. HALL F., CORSE J. (1973).Phagetyping of coagulasenegativa staphylocci and micrococci. J. Hyg, 71:261-270.
DE LA FUENTE R., SUAREZ G.. SCHLEIFER K.H. <1 985>. Staph y/acoceas aureus subsp.
anaerobis subsp. nov.. the causal agent of abscess disease of sheep. lnt. J. Syst.
Bacteriol.. 35:99-102.
DE SAXE M.J., NOTLEY C-M. (1978>. Experiences with the typing os coagulasa-nagative
staphylococci and micrococci. Zentralb. Bakteriol. Mikrobialg. Hyg., 1. Abt. Orig. A.
241:46-59.
DE SAXE M.J.. CREES-MORRIS JA., MARPLES R.R., RICHARDSON J.F. <1981>.
Evaluation of current phage-typing systems for coagulase-negative staphylococci en J.
Jeljaszewicz Cadi, Staphylococci and Staphylococcal lnfections, Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, ppi 97-204
DEVRIESE
L.A,
HAJEK
it..
OEDING
P..
MEYER
S.A..
SCI-ILEIFER
K.H.
(1978).Staph y/acoceas hy/cus (Sompolinsky 1953) comb. nov. and Staphy/acoceas

hWcus subsp. ebromogenes subsp. nov.
mt. J.
Syst. Bacteriol. 28:482-490.
DEVRIESE L.A., POUTREL 9.. KILPPER-BALZR., SCHLEIFER K.l-I. (1983). Staphy/acoceas

gaIInarum and Staphylococcus capree, two new Staphy/acoceas specias from animals.
lnt. J. Syst. BactarioL, 33:480-486.
DIAZ M.D. SNCHEZ-CARRILLO C.. BOUZA E. (1994>. Evolucin de la resistencia a
antimicrobianos de Staphylococcus aislados an hospitales espaoles. Tercer estudio.
Revis. Clin. Espa. 194:814-820.
BIBLIOGRAFA
DIXON RE. (1987). Cost of nosocomialinfections and benefits
88
of infection control
programs. Prevantion and control of nosocomial infections, Wanzal R.P. (adj. the
Williams and Wilkins Co., Baltimora PP 19-25.
DOWSE~T EG, PETTS D.N., BAKER S.L.. DE SAXE M.J., COE A.E, NAIDOO J. NOBLE
w.c. (1 9S4VAnalysis of an outbraak of staphylococcal acalded skin syndrome: sirategies

br typing non-typabla strains. .1. Hosp. lnfect. 5:391-397.
DRYDEN MS.. TALSANIA HG.. MARTIN S. CUNNINGAM M., RICHARDSON. J.F.

COOKSON B. MARPLES RR. PHILLIPS 1- (1992).Evaluation of methods for typing
coagulase-negative staphylococci. J. Med. Microb. 37:109-117.
EMORIT.G.. GAYNES R.P. (1993>. An owerview of nosocomial infections, including the

role of the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Rey. 6:438-442.
EPINE. <1992>. Prevalencia dalas infecciones nosocomiales en los hospitales espaoles.
Sociedad espaola de higiene y medicina preventiva hospitalarias.
EPINCAT GRUPO DE TRABAJO. (1 990).Pravalencia de las infecciones nosocomiales en
Catalua. <II. Infeccionas y factores de riesgo. Med. ClniBarc. 95:41-52.

ETIENNE J. RENAUD E. BES M. BRUN Y.. GREENLANO T.B.. FRENEV J.. FLEURETFE J.
<1990>. lnstability of characteristics amongst coagulase-negativa staphylococci causing
andocarditist J. Med. Microbiol. 32:115-1 22.
EVANS JB.. BRADFORD W.L.Jr.. NIVEN C.F. <1955>.Comments concerning the
taxonomy of tha ganera Microcaccus y Staphy/ococcus. nter. Bul. Bacteriol. Nomen.
Tax. 5:61-66.
FALKOW 5. (1 958>.Activity of lysina dacarboxylase as a,~ aid in tha idantification of
Salmone/la and Shigellae. Amar. J. Clin. Pathot. 29:598.
ASiC R.T. <1 942VStudias on staphylococci II. Idantification of Laureas strains bv means
of bacteriophage. J. lnfect. Dis. 71:161-165.
189
BIBLIOGRAFA
FLEURETTE J.. BRUN Y.. BES M.. COULET M., FOREY <l987Vlnfections causad by
coagulasa-negative staphylococci other than 3. epidermidis and 3- sapbophyticust r195-208. In G. Pulverer, P.G. Quia, and G. Petars (adj. Pathoganicity and clinical
significanceof coagulase-negativa staphylococci. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart, Federal
Republic of Garmany.
FRENEY J., BRUN Y.. BES M.. MEUGNEIR H.. GRIMONT F., GRIMONT PA.D.. NERVI c.
FLEURETTE J. <1988). Sraphy/ococcus /ugdunensis sp. nov. and Staphylococcus sch/eiferi
sp. nov., two spacies from human clinical specimens. lnt. J. Syst. Bacteriol. 38:168-172.
FRIOHANOLER 1.. GILL P., MARTNEZ L, VAS 1.8. (1978).Comparison of invasive and
non-invasive strains of Sraphy/ococcus epidermidis by phage typing. Zentralb. Bakteriol.
Mikrobiol. Hyg. 1. Abt. Orig. A, 241:136-1 39.
GABELISH C., STEFFE A., HARBOUR C.. STUBBS E.. VICKERY A. BEARO-PEGLER M.
(1 9soVSpecificity
of
monoclonal
antibodies
produced
to
coagulase-negativa
staphylococci, en 2nd International Meating on Bacterial Epidemiological Markers,

Ascent. Ltd., Atenas. p. 259.
GALLAGI-IER DJ.A. MONTGOMERIEJZ. and NORTH J.D.K. <1965).Acute infectione
of the urinary tract and the uretrhal sysrome in general practica. Br. Med. J. 1:622.
GASTON MA.. DUFF P.S.. NAIDOO J. Y COIS. (1988LEvaluation of electrophoresis
rnethods for typing methicillin-resistant 3. aureas. J. Med. Microbiol. 26:189-1 97.
GIBSON T. <1967>.The status of the ganus Micrococcus. lnt. J. Syst. Bacteriol.,
17:231-233.
GIGER o., CHARILAOU C.C.. CUNOY K.R. (1 984WComparison of the API Staph-ldent and
DM5 Staph-Trac systems with convantional methods used for the identification of
coagulase-negative staphylocacci. J. Clin. Mictobiol. 19:68-72.
GOERINO R.V. (1993>.Molecular epidamiology of nosocomial infection: analysis of

chromosomal restriction fragmant patterns by pulsed-ficd gel electrophoresis. lnfact.
Contr. Hosp. Epidem. 14:595-600.
90
BIBLIOGRAFA
GOETZ M-L, MULLIGAN M.E., KWOK R.. OBRIEN H.. CABALLES C.. GARCA J.P.
(1 S92VManagement and epidemiologic analysas of an outbraak due to rnethicillin-
resistant aureust Am. J. Mad. 92:607-614.

GOLDMANN DA. (1980>. Laboratory procedures for intection control. en E.H. Lennette,
A. Balows. W.J-. JA. Hausler y IP. Truant <eda>, Manual of Clinical Microbiology.
American Sociew for Microbiology. Washington D.C., pp. 939-951.
GRIMONT F.. GRIMONT PA.D. <lS86VRibosomaI ribonucleic acid gene restriction

panerns as potantial taxonomic tools. Ann. lnst. Pasteur, 1376:165-75.
HAJEK V. (1976>7 Staphylococcus intermedus a new species isolated from animals. lnt.
J. Syst. Bacteriol., 26:401 -408.

HAJEK V, DEVRIESE L.A.. MORDARSKI Nl.. GOODFELLOW M.,PULVERER G. VARALDO
D.E. (1986>AEievation of Staphy/ococcus hyicas subsp. chromogenes <Devriese et aL,
1978> to species status: Staphylococcus chromogenes <Devriesa et al., 1978> cornb.
nov. Syst. Appl. Microbiol.. 8:169-173.

HAJEK V.. LUDWIG W., SCHLEIFER KM.. SPRINGER N. ZITZELSBERGER W.,
KROPPENSTEDT R.M., KOCUR Nl. (1992>.Sraphylacoccus muscae, a new species
isolated from flies. lnt. J. Syst. Bactariol. 42:97-101.
HALEY R.W.. HOOTON T.M.. CULVER DH.. QUADE D, SCI-IATMAN RJ-I., SCHABERG
D.R., SHAH GV. SHATZ G.D. <19811. Nosocomial infections in US. hospitals, 19751976. Estimated frecuency by selacted characteristics of patients, en R.E:Dixon (edj,
Nosocomial lnfoctions, Vorlco Medical Boolcs, pp. 45-46.
HALL WT.. HALL S.L., BARNES W.G. IZUEGBU J-. ROGOLSKY M.. ZOBAS 1.
<1 987>.Characteristics of coagulase-nagative staphylococci from infants with

bacteriernia. Pediatr. lnfect. Dis. J. 6:377-383.
I-IARSTEINA.L,VALVANOM.A., MORTHLAND V.H., FUSCHP.C.,POrTERSSL.CROSA

J.H. (1988>.Antimicrobic suscaptibility and plasmid profile analysis as identity test for
multiple blood isolatas of coagulase-nagative

Scand. Sea. 6. 95:283-292
staphylococci.
J. Clin. Microbiol.
lmmunol.
191
BIBLIOGRAFA
HERWALDT L.A-, BOYKEN L.D. PFALLER M.A. (lg9OVBiotyping of coagulase-negative

staphylococci: 108 isolates from nosocomial bloodstrearn nfections Diag. Microb. lnfect.
-
Dis. 13:461-466.
HILL L.R. <1 959VThe Adansonian clasaification of the staphylococci J. Gen. Microbiol.,
-
20:277-283.
HOLT R.J. (1971 )/The colonization of vantriculoatrial shunts by coagulase-negative
staphylococci, p.81-8?. In. M. Finand, W- Marget, and K. Bartmann <adj. Bacterial

nfections: changas in their causative agents, trends and possibte basis. Springer-Verlag,
Stutgart, Germany.
HORAN T.C.. GAVNES LP.. MARTONE W.J.. JARVIS WR.. EMORI 116. (1992>/CDC
definitiona of nosocomial surgical site infections, 1 992: a modification of CDC definitions
of surgical wound infections. Am. J. lnfect. Control 20:206-213.
HOVIG B. LYSTAD A.. OPSION 14. (1981). A prevalence survey of infections among
hospitalized patient in Norway. NIPH Annalt, 4:49-60.
I-IUEBNER J.. PIER G.B.. MASLOW J.N, MULLE E.. SHIRO 14., PARENT M., KROPEC A,
ARBEIT R.D., GOLDMANN A. <1994LEndemic nosocornial transmission of
Staphy/ococcus epidermidis bacterernia ls/ates in a neonatal intensive core mit ove, 70

years. 71w Journ. of la fact. Dis. 169:526-531.
HUCKER G.J. (1948).Ganus 1 Mftracoccus, in RS. Bread, EGD. Murray y A.D.
Hitchens <eds), Bergays Manual of Determinativa Bacteriology, 6 ed., The WilIiams and
Wlkins Co.. Baltirnore, PP. 235-246.
HUNTER PR. (1990>.Reproductibility and indices of discriminatory power of microbial

typing methods.
J. Clin. Microbiol,, 28:1903-1905.
HUGHES JM.. CULVER D.H. WHITE 1W.. JARVIS WS.. MORGAN W.M., MUNN V.P.
MOSSER J.L., EMORY 110. (1983). Nosocomial infection surveillance, 1980-1982.
M.M.W.R., 32 <N0 4SShI-16.
192
BIBLIOGRAFA
HUSSAIN Z.. STOAKES L.. STEVENS D.L., SCHIEVEN B.c.. LANNIGAN R. JONES C.
<1986).Comparison of Microscan System with the API Staph-ldent Svstam for specias
identification of coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol. 23:126-1 28.
IGIMI S.. KAWAMURA 5.. TAKAHASHI E, MITOSUOKA T. <1989).

Sraphy/ococcus fe/ls, a new species from clinical spacimens from
cata.
mt. J. Syst.
Bacteriol., 39:373-377.
IGIMI 5., TAKAHASHI E, MIToSuoKA T. <1990LSraphylococcus schleiferi subsp.

coagulans subsp. nov., isolated from the extarnal auditory meatus of dogs wiht estamal
ear otitis. lnt. J. Syst. Bacteriol., 40:409-411
IZARD Nc.. HACHLER 14.. GREHN Nl.. KAYSER F.H. (1992>.Ribotyping of coagulasenegativa staphylococci with special emphasis on intraspecific typing of Staphylacoccus
epidermidis. J- Clin. Microbiol. 30:817-23.
JARLOV J.O.. HANSE J.E.S.. ROSDAHL V.T., ESPERSEN F. (1992)-
The typing of
Setphylococcus epidermidis by a lectin-binding assay. J. Med. Microbiol. 37:195-200.

JEPSENO.P.. MORTENSEN IV. (19803. ?revalence of nosocomial infections and infaction
control
in Denrnark.
J. Hosp. lnfec. 70:960-970.
JONES R.N., BARRY A.L., GARDINER R.Y., PACKER R.R. <1989). The prevalence of
staphylococcal resistance to penicillinase-resistant penicillins. A ratrospective and
praspective national surveiflance trial of isolates from 40 medical centers. Diagn.
Microbiol. lnfact. Dis. 12:385-394.
KARCHMER A.W., ARCHER G.L.. DISMUKES W~E. (1983>.Sraphylacoccus epidermidis

causing prosthetic valva endocarditis: rnicrobiologc and clinical observations as guide to
therapy.
Ann. lntern.
Med. 98:447-455.
KILPPER-BALZ R.. SCHLEIFER K.H. <1981 ).Transfer of Peptococcus saccharolyticus
Foubart and Douglas to the
genus
Staphylococcus: Staphylococcus sacchara/yticus
<Foubert and Douglas) comb. nov. Zntralbl. Bakteriol. Mikrobiol. I-lyg. 1 Abt. Orig. C.
2:324-331.
EZBLIOGRAFIA
193
KLEEMAN K.T., BANNERMAN TL. KLOOS Wi. <1993LSpecies distribution of

coagulase-negativa staphylococcal isolates at a communw hospital and implications for
selection of staphylococcai identification procedures. J. Clin. Microbiol. 31:1318-1321.
<LESIUS P.H. SCHUHARDT V.T. <19681.Use of lysostaphin in the isolation of highly
polimarized deoxyribonucleic acid and in tha taxonomy of aerobic Micracaccaceaet J.
Bacteriot, 95:739-743.
KLOOS W.E, BANNERMAN T.L. <1994>.Update on clinical significance of coagulasenegativa Staphylococci. Clin. Microb. Rey.. 7:117-140.
KLOOS W.E.. SCHLEIFER KM. (1975a>.lsolation and characterization of staphylococci
from skin. II. Description of four new species: Staphylacoccus warneri, Staphy/ococcus
hominis and Staphylacoccus smulans.
lnt.
J. Syst. BacterioL, 25:62-79.
KLOOS W.E., SCHLEIFER K.H. (19?SbLSirnplified acheme for routine identificado,, of

human Staphylococcus spacias. J. Clin. Microbiol., 1:82-88.
KLOOS W.E.. SCHLEIFER <.14. <1983>. Staphylococcus auriculars sp.
of ihe human external aar. mt. J. Syst. Bacteriol., 33:9-14.
nov.: an inhabitarit
<1005 W.E., SCHLEIFER K.14. <1986WGenus IV Staphylocaccus. Bergeys manual of

determinativa bactariology, vol 2. P.HA. Snaath Ced. Tha Williams and Wilkins Co.,
Baltimore.
KLOOS W.E, SCHLEIFER KM.. SMITH R.F. <1976>.Charactarization of Staphylococcus
scuri sp. nov. and ita subapecias. lnt J. Syst. Bacteriol. 26:22-37.
<LaOS W.E.. WOLFSHOHLI.F. <1982LIdentification of Staphylococcus spacias with API
STAPH-IDENT Systern. J. Clin. Microbiol. 16:509-516.
BIBLIOGRAFA
94
KOONTZ F. PFALLER M. (1989>. coagulase-negative staphylococci: why and when to
do what. Clin. Microb. Nawsl. 11:125-1 28.

KRAUS E.S-. SPECTOR D.A. <1 983VCharacteristics and sequelse of peritonitis in
diabetcs and nondiabetics receiving chronic intarmittent peritoneal dialysist Medicine

62:52-57.
LEIGHTON P.M., LITTLE J.A. Cl 986>.Idantification of coagulase-negativo staphylococci
isolated from urinary tract infectiona. Am. J. Clin. Pathol. 85:92-95.
LI. W.H. (1981 ).Simpte method for constructing phylogenetic traes fram distance
matrices. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:1085-1 089.
UNA B.. BES M.. VANDENESCH F.. GREENLAND 7.. ETIENNE J.. FLEURETTE J.
<1993>.Rola of bacteriophagas in ganomic variability of relatad coagulase-negativa
staphylococci FEMS Microbiol. Latters 109:273-278.
LINA 8., VANDENESCH F.. ETIENNE J. <1992>.Comparison of coagulase-negativo
staphylococci by pulsed-fald gel alectrophoresis- FEMS Microbiol. Latters. 92:133-1 38
UNDWELL O.M. <1 SsgrApparatus for phaga-typing of S. aureus. Mth Bul Mnist. HIth
108:195-204.
UNHARDT F.. ZIEBUHR W.. MEYER P., WITrE W.. HAcKERJ. <1992).Pulsed-fleld gel
electrophoresis of genomio retriction fragments as a tool tor the epidemiological analysis
of Stapliylococcus aureus y coagulase-negativa staphylococci. EEMS Microb. lanera.
18 1-186
LORIAN V.. ZAK O., SUTER J.. BREUCHER C. <l985lStaphylococci 9ui viva and In
vitro. Diag. Microb. lnfact. Dis. 3: 433-444.
LUDLAM H.A.. NOBLE W.C., MARPLES R.R.. PHILLIPS 1. (1989b).The evaluation of a
typng schenie for coagulase-negativa staphylococci suitable for epiderniological studies,
J. Med. Microbiol. 30:161-1 65.
BIBLIOGRAFA
195
LUDLAM H.A.. NOBLE W.C.. MARPLES R.R.. BAYSTON R.. PHILLIPS. 1. <1989a>.The
epiderniology of peritonitis causad by coagulase-negative staphylococci in continucus

arnbulatory peritoneal dislysis. J. Med. Microbiol. 30:167-174.
MABECKC C.E. <1969). Significance of coagulase-negativa staphylococcal bacteriuria.
Lancent ii:1 150-1152.

MARPLES R.R., HONE R.. NOTLEY C.M., RICHARDSON J.. CREES-MORRIS J.A.
(1 978>.lnvestigation of coagulase-negativa staphylococci from nfactions in surgical
patients. Zentralb. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1. Abt. Orig. A. 241:140-156.
MARTIN M.A.. PFALLER M.A.. WENZEL R.P. <1989>. Coagulase-negativa staphylococcal

bactararnia. Ann. nter. Med. 110:9-16.
MARTIN DE NICOLS M.M.. VINDEL A.. SAEZ-NIETOJ.A. (1990). Development of a new
set of phages as an epidamiological rnarker in Staphylococcus epdermlds causina
nosocornial infections. Epiderniol. lnfect. 104:111-11 8.
MARTIN DE NICOLAS M.M.. VINDEL A., SAEZ-NIETO JA. <1 995kEpidemiological typing
of clinically significant strains of coagulase-negativa staphylococci. J. Hosp. lnfect.
29:35-43.
MASLOW JN.. MULLIGAN M.E.. ARBEIT R.D.
(1993)Moledlar epiderniology:
application of contemporary techniques to the typing of microorganismst Clin. lnfect. Dis.

17: 153-64.
MAYON-WHITE R.T., DUCEL 0.. <ERESELIOZE 11, TIKHOMROV E. <1988> An

international survay of the prevalance of hospital-acquirad infection. J. Hosp. lnfect.
11 (suppfl:43-48
MCLAWS Mi., 0010 J., KING K.. IRWIG L.M., BERRY 0. <1988). The prevalenca of
nosocomial and communiw-acciuired infections

149:585-590.
in Australian hospitals.
Med. J. Aust.
196
BIBLIOGRAFA
MEERS P.D.. AYLIFFE G.A.J.. EMMERSON A.M.. LEIGH D.A.. MAYON-WHITE. RS..
MACKINTOSH C.A.. STRONGEJ.L. (198U. Repon on national survey of infectons in
hospitals, 1980. J. Hosp. Infect. 2<supp>: 1-53.
MERTENS L, KEGELS G.. y STROOBANT A. et al. (1987>. The national prevalence
aurvay of nosocomial infections in Belgium, 1984. J. Hosp. lnfect. 11:328-334.
MICKELSEN P.A.,
PLORDE J.J., GORDON K.P.,
HARGISS C.. McCLURE J.,
SCHOENKNECHT F.D., CONDIE F.. TENOVER F.C.. TOMPKINS 1.8. (1985>.Inestability

of antibiotia resistance in a strain of S. epidermidis isolated from a outbreak of prosthetic
valva endocarditis. J. lnfect. Dis. 162:50-58.
MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO. (1986). Direccin General de Planificacin.

<1 986).Encuesta epidemioldgica de prevalancia en un punto da la infeccin hospitalaria
y uso clnico da antimicrobianos en Espaa. Anlisis descriptivo de resultados. Madrid
1986; 35 pgs.
M0LLER y. <1 955).Srnplified test for soma amino acid decarboxyases and for tha
arginine-dehydrolasa system. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 36:158.
MORO Mt. STAZI M.A.. MARAS~A O.. GRECO O.. ZAMPIERI A. <1986). National
prevalence survey of hospital-adquired infections in ltaly, 1983. J. Hosp. Infect. 8: 72-85.
MORSE. S.l. (1962>. Studies on the chemistry and immunochemistry of calI walls of
staphy/ococcus careas, J. Exp. Med., 116:229-245.

MORSE, S.l. (1 963>.lsolation and proparties of a group antigen of Staphylococcus albas,
J. Exp. Med., 117:19-26.
MORTENSEN N.. KOCUR Nl. (1967>.Correlation of DNA base composition and acid
formation from glucosa of staphylococci and micrococci. AP.M..S., Sect. 8, 69:445-
457.
MULLIGAN
Mi.,
KWOK
R.Y..
CITRON
O.M.
JOHN
J.F..
SMITH
P.B.
(1988). lmmunoblots. antimicrobial resistance, and bacteriophage typing of oxacillinrasistant S. aureus. J. Clin. Microbiol 26:2395-2401.
97
BIBLIOGRAFA
NATIONAL COMMI1TE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. (1 993VMethods for

dilution antiniicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. Document M7-
A3. Villanova, Ca.

NATIONAL NOSOCOMIAL INFECTIONS SURVEILLANCE SYSTEM. 1991. Nasocornial
infection ratas for interhospital cornparison: limitations and possibla solutions. lnfec.
Control Hosp. Epidemiol. 12:609-621
NEUMEISTER
8.,
KASTNER
5..
CONRAD
5..
KLOTZ
G..
BARTMANN
P.
(1 995>.Characterization of coagulase-negative staphylococci causing nosocornial

infections in preterm infants. Eur. J. Clin. Micro. lnfect. Dis., 14:856-863.
OGSTON A. <1 880).Uber Abscesse. Arch. Klin. Chir., 25:588-600.
PALEY D.. MOSELEY C.F., ARMSTRONG P.. PROBER CG. <1986>. Primary osteornyelitis
caused by coagulase-negativa staphylococci. J. Pediatr. Orthop- 6:622-626.
PARISI JX. (1985>/Coagulase-negativa staphyococci and epidamiological typing of
Staphylococcus epidermidis. Microbiol. Rey. 49:126-139.

PARISI J.T.. LAMPSON B.C.. HOOVER D.L.. KHAN J.A. <1986LCornparison of
epidemiotogic markers lar Stephylococcas epidermidis it J. Clin. Microb. 24:56-60.
PARISIJ.T., HECHT D.W. <1980>.Plasmid profiles in epidemiologic studies of infections

by Staphy/ococcas epidermidis. J. Infect. Dic. 141: 637-643.
PATRICK C.C. <1990>. Coagulase-negativa staphylococci: pathogens with increasing
clinical significance. J. Pediatr.. 116:497-507.

PEREIRA AS. (1 962>.Coagulase-negative strains of Staphylococcus possessng antigen
51 as agents of urinary infection. J. Clin. Pa:hol. 15:252-259.
PFALLER IVLA, HERWALDT L.A. <1 988>.Laboratorv. clinical. and epidemiolagical aspects
of coagulase-negativa staphylococci. Clin. Microbiol. Newsl.. 11:137-142.
BIBLIOGRAFA
198
PILLET J.. ORTA B. (1 S54VRacherches sur la composition antiganiqua des
staphylocoQues non pathoganes. 1. Mise en evidanca dagglutinogenes specifiques et un

agglutinogene common aux souches pathogenes et non pathogenes, Ann. lnst. Pasteur,
86:752-758.
PITT Ti. <1 982).Stata of the art: typing of Serratia marcescens, J. Hosp. lnfect.,
3:261-264.
PLANES A.M. (1990>. Tcnicas de hamocultivo. LaI 2000, 25:5-8.
PULVERER G. <1 985>.On the pathogenicity of coagulase-negativa staphylococci, p. 1-9.
In J. Jeljaszewics <edj, The staphylococci: proceedings of V International Symposiurn on
Staphylococci and Staphylococcal lnfections. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Gerrnany.

PULVERER G.. PILLICH J. <1 967>.Coagulase-negative Staphylokkan (Staphylococcus
albas> ala Krankheitserreger. Dtsch. Med. Wochenschr. 92:1141-1145.
PULVERER G. PILLICH J. (1971 >.Pathogenic significanca of coagulase-negativo
staphylococci, en M. Finland. W. Marget y 1<. Bartmann (eds>. Bacterial Infactiona,
Springer-Verlag, Nueva York, Pp. 91-96.

PULVERER O., PILLICH J., HAKLOVA M. (1 976>.Phaga-typing set for the apecies
staphy/ococcus albas. Zentrab. Baktariol. I-lyg. MikrobioL, 1. Abt. Orig. A. 5:153-1 57.
PULVERER O., PILIJcH J., KLE1N A. <1975LNew bacteriophages of Staphylococcus
epldermidlst J. lnfect. Dis. 132:524-531.
PULVERER G., PILLICH J., KRIVANKOVA M. (1973>. Ditferentiation of coagulase-negativo
staphyococci by bacteriophage typing, en J. Jeljaszewicz <adj. Staphylococci and
Staphylococcal Infections. 5. Karger, Basilea, Pp. 503-508.
QUENON JL.. GOTTOT 5.. DUNETON P., CARLET J.. REGNIER 8.. DESHONS J.,
BROCKNER G. (1992>- First national pravalence study of hospital acQuired infections in
France. ICAAC, Anaheim, USA; October 11-14.
BIBLIOGRAFA
199
RICHAROSON J.F.. MARPLES WR. (1987>.Phage typability of coagulase-negativa

staphylococci in relation to antibiotic resistance. Zentralb. Baktariol. Mikrobiol. Hyg. 1.
Abt. Orig. A. 16:235-246.
RYDING J.. ESPERSEN F., JARL0 J.0., ROSDAHL V.T. <l9S2VCoaguIase-negative
staphylococci in a newborn with a cardic vascular prosthesis. APMIS 100:246-248.
ROMLING U., GROTHUES D., HEUER T.. TIJMMLER B. <1 992).Physical genorne anaysis
of bacteria. Electrophoresis 13:626-631.
ROSDAHL V.T., GRAI-IAN-HANSEN 8.. MOLLER J.H., KJAELDGAARD P. <1 99OVPhagatyping of coagulase-negative staphylococci. Factors influencing wpabilitv
APMIS
98:299-304.
ROSEMBACH F.J. <1884). Mikro-organismen bei den Wund-Infektions-Krankheiten des

Menschen. Bergmann ed, Weisbaden. P.:1-1 22.
RUPP Mi..
GORDON L.A. <1 994).Coagulase-negative staphylococci: pathogens
associated with medical progresst Clin.
mf. Dis.
19:231-245.
SAIKI R.K., SCHARF 5.. FALOONA F.. MULLS K.B., HORN G.T.. ERLICH H.A. ARN14EIM
N.A. <1985>.Enzymatic amplification ob beta-globin ganomic sequances and restriction
site analysis for diagnosis of sickle calI anemia. Science. 230:1530-4.
SCHAEFLER 5. <1972>.Polyfunctional peniciflinaso plasmide in Staphylococcus

epidermidis: bacteriophage restriction and modification rnutants. J. Bacteriol. 112:697706.
SCHLEIFER K.H.. FISCHER U. <1982>.Description of a new species of the ganus
Stephylococcas: Staphylococcus carnosas. lnt. J. Syst. Bactariol. 32:153-156.
SCHLEIFER K. H., GEVER U.. KLIPPER-BALZ R.. DEVRIESE L.A. (1983). Elevation of
Staphylacoccus sciarisubsp. lentas (Koos et al> to species status: Staphylococcus lentas
<Kloos et al) comb. nov. Syst. AppI. Microbio!.. 4:382-387.
BIBLIOGRAFA
SCHLEIFER
K.H.. KILPPER-BLZ R..
200
FISC14ER U.,
FALLER
A.H., ENOL J.
<198212ldentfcation of Micrococcus candidas ATCC 14852 as a strain of

Staphylococcus epidermidis and of Micrococcus caseolyticus ATCC 29750 as mambers
of a new espacies, Staphylococcas caseolyticus. Int. J. Syst. Bacteriol. 32:15-20.
SCHLEIFER <.14.. KLOOS W.E. (1 97saVlsolation and characterization of staphylococci
from human skin. 1. Amended description of Staphy/ococcus epidermidis and

Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticas and descriptions of trae
new species: Staphylococcas co/mil. Staph y/ococcus haemolyticus and Staphylococcus
xylosus. lnt.J. Syst. Bacteriol., 25:50-61.
SCHLEIFER KM.. KLOOS W.E. Ii S75bVA simple test system for the separation of
staphylococci from micrococci. J. Clin. Microbiok, 1:337-338.
SCHWARTZ D.C., CANTOR C.R. <1 984>.Separation of yeast chromosome-sized DNAs

by pulsed-fisd gradiant gel electrophoresis. CalI. 37:67-75.
SELANDER R.K.. MUSSER J.M.. CAUGANT D.A.. GILMOUR M.N., WHI-rrAM 1XS.
(1986>/Population genetios of pathogenic bacteria. Microb. Pathog. 3:1-7.
SKERMAN V.B.D., Mc GOWAN IJ, SNEATH P.H.A. (1980bAppoved list of bactarial

names. Int. J. Syst. Bacteriol., 30:225-240.
SKULNICK M. Y COLS. (1987). Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. MicrobioL, abstr. n0 c 103,
p 340.
SMITH D.T., CONANT N.F., WILLET H.P. (1968>. Zinsaer Microbiology, 14 th ed., New
York: Appeton-Century-Crofts, pp: 169-170.
SMITH l.M., BEALS P.D.. KINGSBURY K.R.. HASENCLEVER N.F. 11958>.Observations
on Staphylococcus albus septicemia in mice and man. Arch. Intern. Med. 103:375-388.
SMITH D.J.. <APLAN R.L.. LANDAU W.. TRENHOLME G.M. (1982>7Speciation and
antibiotic susceptibility patterns of coagulase-negativa staphylococci. Eur. J. Clin.
201
BIBLIOGRAFtA
SOMPOLINSKY D. <1963>/Da Limpetigo contagiosa suis et du Micrococcas hyicus sp.
Schweiz. Arch. Tierheik., 95:302-309.

SOMPOLINSKY D., SAMRA 5.. KARAKAWA W.W., VANN W.R. SCI-IENEERSON R.,
MALEK Z. (1 985)/Encapsulation and capsular types in isolates of S. a2reus frorn
different sources and relationship to phage wpes. J. Clin. Microb. 22:828-834.
SOUTHERN E.M. <1 975).Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophorasis. J. Mol. Biol. 98:503-517.
SRAMOVA 14., BARTONOVA A., BOLEK 5.. et al. (1984). National prevalence survey of
hospital-acquired infactiona in Czachoslovakia. 1 Hosp. lnfect. 11:328-334.
STEPHENSON J.R., CROOK S.J.. TABAQCHALI 5. (1986)/New methods for typing S.
aareus resistant to rnethiciin basad on sulphur-35 methionina labelled protein: its

aplications to an outbreak. Br. Med. J. 293:581-583.
STRUELENS M.J.. DEPLANO A.. MAAS A.. SERRUYS E. <1 990>.ilasmid profile. biotypa
and antibiotc resistance markers for ttie study of an outbraak of coagulase-negativa
staphylococci, en 2nd International Meeting on Bacterial Epidemiological Markers. Ascent
Ltd., Atenas, p. 79.
SWANSTROM Nl.. ADAMS.. M.H. (1951 >.Agar layar method for production of hieh titer
phage stocks. Proc Soc. Exp. Biol. Med. 7:372-275.
TALBOT M.W., PARISI J.T. (1 976>/Phage typing of Staphylococcus epidermidist i Clin.

TANASUPAWAT 5..
HASHIMOTO Y.,
EZAKI
T.,
<OZAKI M.,
KOMAGATAK
(1 992).Staphylococcus piscifermentans sp. nov., from fermentad fish in Thailand. lnt.

J. Syst. Bacteriol. 42:577-581.
TENOVER F.C.. ARBEIT R.D.. GOERINO R.V., MICKELSEN P.A.. MURRAY 8.E.. PERSNG
OH.. SWAMINATHA B. (1995>Intarpreting chromosomal DNA restriction pattems
producel by pused-field elactrophoresis: criteria for bacterial strain typing.
Microbiol. 1995:2233-2239.
J. clin.
BIBLIOGRAFA
202
VALENTINE C.R., VANDLE 5.14.. MARSIK F.J. EBRIGHT J.R.. DAWSON MS.
<1988>. Evaluation of the varety of plasmid profifes in Stap/,ylococcus epidermidis solatas
from hospital patients and staff. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 9:441-446.
VAN BOVEN C.P.A. (1976>.Phage typing of Staphylococcas epidermdis, en J.
Jeljaszewicz (edj. Staphylococcas and Staphylococcal Diseases, Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, pp 149-1 52.
VAN BOVEN C.P.A.. VERI-IOEF J. WINKLER K.C. (1969)/Bacteriophage typing of
coagulase-negative staphylococci. J. Microbiol. Serol. 35:232.
VANDENESCH F.. LINA B.. LEBEAU Cl->. GREENLAND T.B. ETIENNE J. <1993).
Epidemiological markers of coagulase-negativa staphylococci lntens. Cara Med- 19:311
-
315
VARALDO P.E.. KILPPER-BLZ R., BIAVASCO F., SAlTA G., SCHLEIFER KM.
(1 988>.Staphylococcus delphini sp. nov,, a coagulase-positive species isolated from
dophins. Int. J. Syst. Bacteriol., 38:436-439.
VEACH L.A. PFALLER M.A.. BARRET Nl.. KOONTZ FP., WENZEL R. (1 990)/Vancomycin
rasistance in Staphylococcas haemolyticas causing colonization and bloodstream
infection. J. Clin. Microb. 28:2064-2068.
VERI-IOEF J.. VAN BOVEN C.P.A., WINKLER K.C. <1971).Charactars of phages from
coagulase-negativo staphylococci. J. Med. Microbio>. 4:413-424.
VERHOEF J.. VAN BOVEN G.PA. WINKLER K.c. (19?2>/Phagetyping of coagulasenegativa staphylococci. J- Mad. Microbiol. 5:9-19.
WATTS J.L.. OWENS W.E.. NICKERSON S.C. C1986).Evauation of the Miniteck grampositiva set for identification of staphylococci isofated from the bovina mammary glandt
J. Clin. Microbiol. 23:873-875.
BIBLIOGRAFA
203
WEBSTER J., HUBNER R.. COLE E.. BRUCE J., BANNERMAN T.. BALLARD D.. KLOOS
W. <1 993>/The Staphylococcas sc/ud spacies group described by EcoR fragments
containing ribosomal RNA sequences, with recognition of Staphylococcus y/tu/as
Microbiol. 1993. American Society br Microbiology, Washington, D.C.
WEINSTEIN M.P.. RELLER LS.. MURPHY J.R.. LICHTENSTEN K.A. <1983>. Tha clinical
significance of positiva blood cultures: A comprahensive analysis of 500 episodes of
bacteremia and fungemia in adults. 1. Lab. and Epidem. Obser. 5:35-39.
WHITTAM 115., OCHMAN H., SELANDER R.K. <1983)/Multilocus genetic structure in
natural populations of E. cok. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:1751-1194.
WILSON T.S., STUART R.D. <1 965).Staphylococcas albas in wound infection and in
septicemia. Can. Med. Assoc. J. 93:8-16.
WILLIAMS R.EO., RIPPONJ.E. (1 952>.Bacteriophagetyping of S. aabaus. J. Hyg. Camb.
50:320-353.
WINSLOW C-E.A.. ROT14BERG N., PARSONS E-I. <1920)/Notas an tha classification of
tha whita and orange staphylococci. J. Bacteriol., 5:145-1 68.
WINSLOW C-E.A., WINSLOW A.R. (1908>. The sistematic relationships of the
Coccacaae. John Wiley, Nueva York.
WOESE C.R. (1987). Bacterial evolution. Microbiological Raviews. 51:221-71.

YOUNG LS-, MARTIN W.J.. MEVER R.D,, WEINSTEIN R.J.. ANOERSON E.T. 1977).
Gram-negativa bacteramia: microbiologic, irnmunologic and therapeutic considarations.
Ann. nter.
Med. 86:456-471.
ZAKRZEWSKA-CZERWINSKA J.. GASZEWSKA-MASTALARZ A., LIS 8.. GAMIAN A..

MORDARSKI M. <1995). Staphylococcas palver sp. nov., isolated from human and
animal specimens. lnt. J. Syst. Eacteriol. 45:169-1 72.

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

APLICACION DE MARCADORES EPIDEMIOLOGICOS

COAGULASA NEGATIVOS EN HEMOCULTIVOS

M Teresa Boquete Blanco

A la memada de mi hermano Jos Agustn

Esta tesis ha sido realizada en el Servicio de Bacteriologa del Centro

Fdo. M~ Teresa ~uete Blanco

La realizacin de esta tesis ha sido posible gracias a la colaboracin

Carmen Pelaz y Asuncin Fenol.

REVISIN HISTRICA DEL GNERO STAPHYLOCOCCUS

Distribucin de los principales microorganismos

UTILIDAD EPIDEMIOLGICA Y CLNICA DE LOS MTODOS

CRITERIOS PARA EVALUAR UN SISTEMA DE TIPADO

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE TIPIFICACIN

b.2) Anlisis molecular de plsmidos

b.3) Anlisis del polimorfismo de los

b.6) Electroforesis en campo pulsado

b.7) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

PROCEDENCIA DE LOS AISLADOS

o) Valoracin crnica de los distintos casos

ESTUDIO MORFOLGICO Y PRODUCCIN DE PIGMENTO

ACTIVIDAD DESOXIRRIBONUCLEASA (DNAsa)

PRODUCCIN DE ACETILMETILCARBINOL (ACETOINA)

3.2.10 REDUCCIN DE NITRATOS

3.2.11 FERMENTACIN DE HIDRATOS DE CARBONO

3.2.12 SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

3.2.13 PRODUCCIN DE CIDO A PARTIR DEL GLICEROL

PROPAGACIN DEL JUEGO DE FAGOS DE DEAN Y WILLIAMS

a) Determinacin del RTD

b) Propagacin en medio semislido

ci Interpretacin de los resultados

TCNICA DE FAGOTIPIA INVERSA

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

AGENTES ANTIMICROBIANOS PROBADOS

MEDIO. INOCULACIN Y DETERMINACIN DE LA

CONCENTRACIN MIMIMA INHIBITORIA (CMI)

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

PREPARACIN DE LOS LISADOS

ELECTROPORESIS DEL AON PLASMIDICO

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO

OBTENCIN DEL ADN

DIGESTIN DEL ADN

ANLISIS ESTADSTICO DE LOS DATOS

APNDICE: MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

VALORACIN DE LOS DATOS CLNICOS DE LOS CASOS ESTUDIADOS

SELECCIN DE LOS AISLADOS

ORIGEN DE LOS AISLADOS

CARACTERSTICAS CLNICAS DE LOS PACIENTES

VALORACIN CLNICA DE LOS CASOS DE BACTERIEMIAS POR ECN. 96

DISTRIBUCIN POR REAS DE LOS CASOS

IDENTIFICACIN DE LOS AISLADOS

ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE FAGOTIPIA

PATRONES OBTENIDOS POR FAGOTIPIA CON EL

FRECUENCIAS DE PATRONES DE FAGOTIPIA

FRECUENCIAS DE REACCIN DE LOS PAGOS

ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE FAGOTIPIA INVERSA

PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA

FRECUENCIA DE PATRONES DE FAGOTIPIA INVERSA

UTILIZACIN DE UN JUEGO DE PAGOS ADICIONALES PARA LA

PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON EL JUEGO

ANLISIS DE LOS AISLADOS MEDIANTE LA TCNICA DE FISK

PATRONES DE FAGOTIPIA OBTENIDOS CON LA TCNICA DE FISK

EVALUACIN DE LAS TCNICAS DE FAGOTIPIA EN LA