AISLAMIENTO DE Halobacterium Sp A PARTIR DE PESCADO DE MAR.

Janier Ariza1, Jess Baena Negrete1, Yenis Olivera Pjaro1, Ibeth Padilla Lobo1
Estudiantes de IV semestre de Ingeniera de Alimentos de la universidad de Crdoba.

(1)

El gnero Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia hetertrofa que se caracteriza por ser
halfila estricta, consigue su equilibrio osmtico con concentraciones elevadas de cloruro potsico,
carece de murena y por tal razn su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la
estabilidad; debido a su estilo de vida intenso Halobacterium sp, existe en extremas o altas
concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el mundo. Es una bacteria Gram-negativa, con
forma de bastn en una disposicin nica que es importante en su capacidad para moverse y
sobrevivir en las duras condiciones en que viven.

[1]

Para aislar Halobacterium Sp, se utiliz una

muestra de pescado de mar, el cual se enriqueci en agua peptonada con una concentracin de
2.5M de cloruro de sodio e incubada propiciamente para luego propagarla en el medio Agar salado
manitol (A.S.M), del cual se extrajeron las colonias para realizar tincin y pruebas bioqumicas, que
nos darn indicios de la naturaleza de la bacteria aislada y de alguna manera confirmar su identidad,
procedimientos que profundizaremos ms adelante.
Palabras claves: agua peptonada, bacteria, colonias, agar salado manitol.

ABSTRACT
The genus Halobacterium sp, is an archaebacterium that aerobic heterotrophic halophilic is
characterized by strict gets its osmotic balance with high concentrations of potassium chloride, no
murein and for this reason their cell wall sodium ion required to achieve stability, because his intense
lifestyle Halobacterium sp, exists in extreme or high salt concentrations and can be found worldwide. It
is a Gram-negative, rod-shaped in a unique arrangement that is important in their ability to move and
survive in the harsh conditions in which they live.[1] To isolate Halobacterium sp, we used a sample of
sea fish, which was enriched in peptone water and incubated auspiciously and then spread it on

Mannitol Salt Agar (ASM), which were removed for staining colonies and biochemical tests, which will
give us clues to the nature of the bacteria isolated and somehow confirm their identity, deepen
procedures below.
Key words: peptone water, bacteria, colonies, mannitol salt agar
INTRODUCCIN
La percepcin humana se ha derrochado generosamente con el espritu de un verdadero cazador
detrs de cada posibilidad de dar con los microorganismos que circundan en nuestro medio, y no
obstante no se conforma solamente con conocerlos, observarlos, sino tambin aislarlos para as
saber las condiciones a las cuales estos crecen y se desarrollan. Con tal objeto se han descubierto
numerosos mtodos, muchos de los cuales no han persistido porque resultaban demasiado
laboriosos o porque los resultados obtenidos no eran fciles de interpretar. Aun en la actualidad existe
un mtodo mucho mas prctico, econmico y menos laborioso o tedioso, ste es el aislamiento de
microorganismos a nivel de laboratorio conociendo el sustrato o alimento donde estos crecen y
suministrndole los nutrientes necesarios y de igual forma, dotando al microorganismo de las
condiciones necesarias para su crecimiento.
En el estudio realizado por los autores [1], se aisl el microorganismo Halobacterium Sp, El gnero
Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia hetertrofa que se caracteriza por ser halfila
estricta, consigue su equilibrio osmtico con concentraciones elevadas de cloruro potsico, carece de
murena y por tal razn su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la estabilidad;
Halobacterium sp, existe en extremas o altas concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el
mundo. Estos incluyen las instalaciones de produccin de sal, de inclusiones de salmuera en los
cristales de sal en las salinas, as como lagos y lagunas naturales y en los mares.
Halobacterium Sp es una bacteria Gram negativa, Este microorganismo mesfilo es una bacteria con
forma de bastn en una disposicin nica que es importante en su capacidad para moverse y

sobrevivir en las duras condiciones en que viven, no tienen endosporas, por lo tanto, pueden ser
daados por los rayos ultravioleta, gamma y la temperatura.

[1].

Son aerobios obligados que crecen sobre aminocidos. Tienen forma de coco o de bacilo, un color
rojo o prpura y son mviles. La temperatura ptima de Halobacterium Sp es de 42 C y una
alcalinidad (NaCl) ptima de 4,3.
La experiencia fue realizada en el Laboratorio de Microbiologa de Alimentos de la Universidad de
Crdoba, y tuvo como objetivo principal el aislamiento de la bacteria Halobacterium Sp de pescado de
mar.
MATERIALES, REACTIVOS Y METODOLOGA
MATERIALES

Materia prima (pescado de mar)

Esptula estril.
Balanza analtica.
Bolsa plstica para el agua peptona.
Agua peptonada (con cloruro de sodio a una concentracin de 2,5M).
Mecheros.
Agar ASM (con cloruro de sodio a una concentracin de 2,5M).
Asa bacteriolgica redonda.
Asa bacteriolgica en punta.
Incubadora.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Batera para las pruebas bioqumicas respectivas: (Nitrato, Catalasa, Motilidad y H2S,
Ureasa, KIA, Rojo de metilo y Citrato)

REACTIVOS

 Reactivos para Tincin de Gram: cristal violeta, agua destilada, lugol, alcohol acetona,
safranina de Gram.
Perxido de hidrgeno (Para prueba de Catalasa).
METODOLOGA (ETAPAS DEL PROCESO)
ETAPA N1: OBTENCIN DE LA MATERIA PRIMA
La materia prima bajo la que se trabaj, fue pescado de mar el cual se obtuvo en el mercado pblico
de Cinaga de Oro Crdoba.
ETAPA N2: PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA.
Para esta etapa se llev al laboratorio pescado de mar. Seguidamente, se pesaron 10g de pescado
se introdujo en una bolsa plstica con 90 ml de agua peptonada. Se agito manualmente, luego se
llevo a incubar a 37C por 24 horas.

Fig. 1: Pre-enriquecimiento de la muestra (pescado de mar en agua peptonada)

ETAPA N3: SIEMBRA POR MTODO FRANCS

Al segundo da luego del enriquecimiento de la muestra de pescado, se realiz la siembra por mtodo
francs en el Agar ASM (Agar salado manitol). Se dej transcurrir 24 horas ms y se pudieron
observar los resultados del crecimiento de la bacteria.

ETAPA N4: TINCIN DE GRAM

Se realiz la tincin de Gram despus de pasadas 24 horas para observar el crecimiento del
microorganismo en el medio. Se tomaron muestras de colonias del cultivo de Halobacterium Sp con
respecto al crecimiento de la bacteria en cuestin, en efecto, el medio ASM, presento caractersticas
de crecimiento del Halobacterium Sp debido a que es un medio muy selectivo para este
microorganismo. Posteriormente, siguiendo el procedimiento de este mtodo se realiz el montaje
para la tincin diferencial de Gram.
ETAPA N 5: PRUEBAS BIOQUMICAS
Luego de haber realizado las tinciones se procedi al desarrollo de las pruebas bioqumicas, basadas
en los siguientes principios:

KIA: Determina la capacidad de la bacteria de atacar un hidrato de carbono especifico, incorporado

en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la posible formacin de
H2S.(1)
NITRATO: esta prueba bioqumica evala la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito
o gas nitrgeno libre. Esta reduccin se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales un
organismo produce su oxigeno del nitrato(2).
CATALASA: determina la presencia de la enzima catalasa la cual elimina de manera cataltica el
anin superxido. Esta enzima es esencial en la defensa biolgica contra la toxicidad del oxigeno (3).
UREASA: Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos molcula de
amoniaco por accin de la enzima ureasa. Indicador, Rojo de fenol (4)
MOTILIDAD Y SH2: esta prueba se basa en observar la motilidad de un microorganismo, gracias a la
baja concentracin de agar, lo cual nos indica la presencia de flagelos. Por otro lado se puede
determinar si se ha liberado H2S por la accin enzimtico de los aminocidos que contienen azufre,

produciendo una reaccin visible de color negro, se usan como indicadores tiosulfato de sodio y
sulfato ferroso. Adems tambin se observa en el medio la formacin de indol (4).
ROJO DE METILO: Comprueba la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los
productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora
del sistema.
CITRATO: Determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono
para el metabolismo provocando alcalinidad. La utilizacin de cidos orgnicos y sus sales como
fuente de carbono
alcalinos en nueva

Prueba

Resultado +

Resultado /

Kia

de pH: azul de

:No

:Fermentacin

hay

de G y L

fermentacin

No mvil y no

SH2

se

metilo
Citrato

de

Sin burbujeo

produce

Anillo rojo en la

SH2
Amarillo en la

superficie

superficie

Azul

degradacin. Indicador
bromotimol.

Nitrato
Burbujeo
Catalasa
Ureasa
Motilidad y Mvil y SH2

Rojo

produce carbonatos

Verde

Tabla 1.1 de coloracin de las pruebas en los medios

RESULTADOS Y DISCUSIN:
1. SIEMBRA EN MEDIO A.S.M

Fig.1 crecimiento de la cepa en el medio A.S.M

La siembra realizada en el medio selectivo para el crecimiento de Halobacterium Sp. Fue satisfactoria
dado que el crecimiento se manifest en el medio (fig.2.)
TINCIN DE GRAM
De acuerdo a lo observado despus de haber realizado el procedimiento se puede decir que la cepa
de estudio es un bacilo Gram negativo, debido la coloracin violeta que se observa en la figura 3.
Aunque cabe resaltar que tambin se observaron bacilos Gram positivos.

Fig.3 Coloracin de Gram

2. PRUEBAS BIOQUMICAS:
KIA

Fig. 4 prueba KIA

Prueba KIA gas ac/ac coloracin amarilla en toda la lnea de siembra, con
presencia de gas en el pico de flauta. (fig.4)

NITRATO:

Fig. 5 prueba nitrato

Prueba nitrato positiva, con viraje de color rojo. (fig.5)

CATALASA

Fig. 6 prueba catalasa

Prueba de catalasa positiva, formacin de burbujas en la superficie del portaobjeto que contena la

muestra (fig. 6)
UREASA

Prueba

de

Fig. 7 prueba ureasa

ureasa negativa, coloracin piel de ante (fig.7).
MOTILIDAD Y SH2

Fig. 8 prueba Motilidad y SH2

La prueba de Motilidad y SH2 dio un resultado positivo debido a que los microorganismos mviles
migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio, ennegrecimiento del medio para el H2S.

ROJO DE METILO

Fig. 9 prueba rojo de metilo

Prueba rojo de metilo positiva, anillo rojo en la superficie.

CITRATO

Prueba
color verde.

Fig.
negativa

10 prueba de citrato
debido a que no cambio de color el medio se mantuvo de

KIA

Prueba

Resultado
(+) Ac gas/Ac.

Nitrato

(+) Viraje de color

Catalasa

rojo en la superficie.
(+)Formacin de

Ureasa

burbujas.
(-) no se produce
cambio de color (piel
de ante).

Motilidad y SH2

(+)

hubo

crecimiento
hubo

presencia

Rojo de metilo

de sulfuro.
(+) Medio licuado

Citrato

(-) coloracin verde.

Tincin de Gram

(-)coloracin fucsia

de las clulas
Tabla 2. Resultado de pruebas experimentales
De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas, tincin de Gram, y teora
consultada sobre la cepa de estudio (Halobacterium Sp), se podra decir que la cepa aislada podra
ser la buscada debido que todas las caractersticas obtenidas por pruebas de laboratorio (realizados
por nosotros) fueron las encontradas en la teora, cabe resaltar que no puede afirmar que la especie
encontrada corresponde a la del anlisis dado que para esto se necesita una confirmacin con
pruebas de antibitico las cuales no pudieron ser ejecutadas por falta de recursos.
CONCLUSIN

En este articulo podemos concluir que se pudo llevar a cabo de manera exitosa el objetivo del
trabajo el cual consista primordialmente en aislar la bacteria Halobacterium Sp a partir de pescado
de mar, se puede decir que para tener una certeza razonable de que el microorganismo aislado era
el mencionado anteriormente se realizaron un conjunto de
produjeron unos resultado exitoso concordando
efectuada; para

pruebas bioqumicas las cuales

con la teora consultada al igual que la tincin

finalizar podemos decir que a pesar que todas las pruebas bioqumicas dieron

resultados satisfactorios no podemos afirmar en un 100% que las colonias obtenidas en el cultivo
correspondan a Halobacterium Sp dado que para tener una seguridad absoluta de que la bacteria
asilada corresponda a Halobacterium Sp se deban realizar pruebas ms rigurosas como lo serian
exmenes genticos y pruebas antibiticas.
RECOMENDACIONES
Como recomendaciones tenemos las siguientes, las cuales son muy importantes a la hora de aislar
dicho microorganismo:
Antes de realizar el procedimiento del aislamiento se deben consultar todos los pasos con el
estado del arte de dicho microorganismo que se vaya a aislar.
Mantener el rea de trabajo desinfectada y en buenas condiciones, para evitar la
contaminacin de diversos microorganismos.
Se debe utilizar los medios de cultivos adecuados para as poder evidenciar si existe o no
crecimiento de bacterias.
Trabajar cuidadosamente para as evitar riegos de accidentes con dichas bacterias.
Utilizar adecuadamente todos los implementos necesarios para la realizacin de la prctica y as
evitar la contaminacin de los mismos.
BIBLIOGRAFA
1. GRUPO NORIEGA. EDITORES/Escrito por Agustn Lpez, Mariano Garca Garibay,
Rodolfo Quintero Ramrez, Agustn Lpez-Mungua Canales

 2. BEUCHAT, Thomas J. DOYLE, Michael P.

R. Larry.

Microbiologa de los alimentos,

fundamentos y fronteras editorial Acribia S.A.

3. KONEMAN, Elmer; STEPEN D. Allen. Diagnostico, Microbiolgico. Texto y atlas.5a edicin.
Editorial medica. Panamericana.
4. MACFADDIN, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clnica. 3ra Edicion Argentina (2003), 526-527.
5. RAMON PARES. Bioqumica de los microorganismos. Reverte. Barcelona Espaa. Pg.
118.