MICROBIOLOGIA SANITARIA

I.

Objetivos

Comprobar si el microorganismo es capaz de producir enzimas

para sintetizar los sustratos.
Determinar si ocurri la hidrolisis del almidn mediante el uso de
un colorante (lugol).
Observar si hay presencia de almidn o no en los cultivos.
Observar las caractersticas al ocurrir la fermentacin de un
carbohidrato.

II. Fundamento terico

HIDRLISIS DEL ALMIDN
Lo que llamamos almidn no es realmente un polisacrido, sino la mezcla de
dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos estn formados por unidades de
glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces a 1-4 lo que da
lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen
ramificaciones debidas a enlaces a 1-6.

El almidn sufre hidrlisis por accin de la amilasa, esta puede ser alfa amilasa
o beta amilasa, en el caso de la primera la hidrlisis produce principalmente
dextrina y en menor proporcin la alfa maltosa. La beta maltosa procude alfa
maltosa totalmente debido a que acta desde el extremo no reductor de la
cadena, catalizando la hidrlisis del segundo enlace -1,4, rompiendo dos
unidades

de

glucosa

(maltosa)

la

vez.

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Los microorganismos pueden usar alimentos macromoleculares; para ello, es
necesaria una hidrlisis extracelular preliminar, igual que en los animales
superiores. Los distintos microorganismos elaboran para este fin una cierta
variedad de enzimas extracelulares que segregan al medio, el objetivo de esta
prctica es evaluar que microorganismos producen amilasa y son por tanto
capaces de utilizar el almidn.

ALMIDN + H 2 O amilasa DEXTRINA+ AZCARES

HIDRLISIS DE PROTEINAS
Muchas bacterias heterotrficas degradan protenas exgenas utilizando los
productos como fuentes de energa de carbono-nitrgeno. Como las molculas
de protenas son demasiadas grandes para pasar por las membranas, las
bacterias producen proteasas que hidrolizan las protenas a pptidos
As bacterias producen peptidasas que desdoblan los pptidos en aminocidos
sencillos que son entonces catabolizados de alguna manera depende de la
especie,, la cepa y el tipo de aminocido.
Cuando las bacterias utilizan los aminocidos, los esqueletos de carbono de los
aminocidos sufren degradacin oxidativa a compuestos que entran en el ciclo
ATC para oxidacin. La entrada en el ciclo ATC puede ser por la va acetil-CoA,
-cetaglutarato, succinato, fumarato u oxaloacetato.
La hidrlisis

de

las

protenas termina

por

fragmentar

las

protenas

enaminocidos.
Existen 3 tipos de hidrlisis:

Hidrlisis cida: Se basa en la ebullicin prolongada de la protenacon

soluciones

cidas

fuertes

(HCl

H 2SO4).

Este

mtodo

destruye

completamente el triptfano y parte de la serina y la treonina.

Hidrlisis bsica: Respeta los aminocidos que se destruyen por la

hidrlisis anterior, pero con gran facilidad, forma racematos. Normalmente
se utiliza (NaOH e BaOH).

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Hidrlisis enzimtica: Se utilizan enzimas proteolticas cuya actividad es

lenta y a menudo incompleta, sin embargo no se produce racemizacin y no
se destruyen los aminocidos; por lo tanto es muy especfica.

PROTEINA + H 2 O proteinasa POLIPEPTIDOS

POLIPPTIDOS+ H 2 O peptidasas Mezcla de amino cidosindividuales

HIDRLISIS DE GRASAS
Las grasas se pueden hidrolizar hirvindolas con lcalis, con lo que se forma,
glicerina y jabones.
Esto puede ocurrir de forma natural por la accin del grupo de enzimas
llamadas lipasas.
Las grasas de las dietas sufren una liplisis intensa en el duodeno y durante su
absorcin en el intestino delgado

LPIDOS+ H 2 O lipasa ACIDOS GR ASOS +GLICERINA

FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
3

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Los mecanismos anaerbicos de produccin de energa que no estn
implicados en la cadena respiratoria o en los citocromos se llaman
fermentacin.
La fermentacin de carbohidratos, realizada por bacterias facultativas bajo
condiciones de anaerobiosis, es una oxidacin incompleta. Un metabolito,
derivado del sustrato que se fermenta, acta como aceptor final de electrones.
Los productos de fermentacin son frecuentemente cidos orgnicos, alcoholes
y otras sustancias de bajo peso molecular, incluidos gases como hidrogeno y
dixido de carbono.
La fermentacin se denomina segn los productos finales predominantes:
- Fermentacin hemolctica: se produce solo cido lctico.
- Fermentacin heterolctica: se produce cido lctico, etanol y

C O2 .

- Fermentacin acida mixta: se produce etanol, cido actico, frmico,

Y

C O2

H2 .

- Fermentacin alcohlica: se produce solo etanol.

FERMENTACIN LCTICA: se llama al proceso celular donde se utiliza glucosa
para obtener energa y donde el producto de desecho es el cido lctico.
La fermentacin lctica es una ruta metablica anaerbica que ocurre en el
citosol de la clula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener
energa y donde el producto de desecho es el cido lctico.
Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas),
algunos protozoos y ocurre en los tejidos animales, en ciertos protozoarios,
hongos y bacterias.
El patrn de fermentacin de un microorganismo es de gran valor taxonmico y
es influenciado por el tipo de sustrato disponible en el medio de cultivo, su pH
y la temperatura de incubacin. Los caldos para fermentacin tienen
indicadores de pH, cuyo cabio de color evidencia la produccin de cidos.
Adems se le coloca a estos tubos una campana de Durham (tubo invertido),
para detectar la posible produccin de gas. La gran cantidad de cido
producido por la fermentacin en bacterias facultativas es suficiente para
hacer virar el indicador incorporado al medio a su forma cida.
III. Metodologa
4

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HIDRLISIS DE ALMIDN
El almidn es un carbohidrato complejo que es degradado por microorganismos
que contienen amilasas.Las molculas de yodo estn atrapadas dentro de la hlice
no ramificada de unidades de glucosa de la cadena de amilosa para formar un
compuesto de inclusin azul. Si la red se desintegra como ocurre durante la
hidrlisis del almidn y las dextrinas por definicin se produce una mezcla de dos
molculas de polisacridos poliglucosa: amilosa lineal que solo da glucosa con la
hidrlisis se denomina glucosn.

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS
Este medio se usa como prueba presuntiva en la deteccin del grupo coliforme.
El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de
bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de
stos, sin embargo s se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La
triptona proporciona nitrgeno, azufre, carbono y algunos minerales que son
esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como
amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el
equilibrio osmtico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los
microorganismos. La fermentacin de la lactosa da como productos finales
cido y gas, este ltimo es detectado en las campanas de fermentacin
(Durham).

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IV. Procedimiento
Preparacin de Medios de Cultivo
Medio
Agar Almidn
Caldo Lauril
triptosa
Agua destilada

Volumen
15 ml x 5 = 75ml
15 ml x 10 =
150ml
150ml

A. Hidrlisis de almidn
a. Seleccionar las colonias que se utilizaran.

b.
una

Enumerar las placas Petri y dividirlas con

lnea vertical en dos secciones: A y B.
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c. Agregar el agar almidn a las placas Petri.

d. Con el inoculador obtener una pequea muestra de la colonia para la

seccin A, otra para la B.

e. Incubar por 48hrs a una temperatura de 35C.

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f.

Se le agregara lugol al cultivo despus de incubarlo para determinar si hay

presencia de almidn o no

B. Fermentacin de carbohidratos
g. Identificar dos tubos de fermentacin con caldo lauril triptosa: A y B.

h. Con el inoculador obtener una muestra de la colonia para cada tubo de

fermentacin.

i.

Incubar por 24hrs a una temperatura de 37C. Observar a las 24hrs si hay
formacin de gas.
8

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j.

Despus de incubar, observar las caractersticas

cada tubo y determinar el pH.

de

V. Resultados
HIDRLISIS DEL ALMIDN
GRUPO
N1: Bao de la FIA
N2: Lavadero Teatro UNI
N3: Lavadero Teatro UNI
N4: Estanque de
Arquitectura
N5: Estanque de
Arquitectura

HIDRLISIS
SECCIN A
SECCIN B
No hay
Si hay
No hay
No hay
No hay
No hay
Si hay
Si hay
Si hay

oloracin con lugol en cada placa Petri.

Si hay

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FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
GRUPO
N1
N2
N3
N4
N5

TUBO A
TUBO B
TUBO A
TUBO B
TUBO A
TUBO B
TUBO A
TUBO B
TUBO A
TUBO B

CANTIDAD DE
CRECIMINETO
Escaso
No hay
No hay
No hay
Escaso
Escaso
Abundante
Abundante
No hay
Abundante

FORMACIN DE
GAS
No hay
No hay
No hay
No hay
No hay
No hay

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PRODUCCIN
DE CIDO
pH = 7
pH = 7
pH = 7
pH =6
pH = 7
pH = 7

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VI. Conclusiones

Si agregamos LUGOL al cultivo y este adquiere una coloracin azulvioleta podemos decir que el cultivo presenta almidn, si es
incoloro entonces no hay almidn por lo tanto el microorganismo
presente ha hidrolizado el almidn.

La enzima requerida para la hidrolisis el almidn es la AMILASA. En

los cultivos en donde hubo una coloracin azul podemos decir que
los microorganismos de ese cultivo no producen esa enzima.

Llegamos a darnos cuenta de que si no usamos el lugol no

sabramos si es que hay hidrlisis o no, resaltando la importancia
de su uso en el laboratorio.

La fermentacin de carbohidratos es un proceso que se lleva a

cabo sin la presencia de oxigeno (anaerbico).

Si ocurre la fermentacin del carbohidrato entonces se adquiere un

color amarillento y la acidez que presenta el medio de cultivo
tambin se puede observar la formacin de un gas con la ayuda de
la campana de Durham.
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VII.

Recomendaciones

VIII.

Con el papel indicador comprobamos la acidez del medio de

cultivo, algunas veces se ver formacin de un gas dependiendo
del tipo de bacteria que se haya sembrado.

Repetir el procedimiento en cultivos donde no se vi la formacin de

gas, ni crecimiento en los tubos.
Para esterilizar, poner al fuego el inoculador y la boquilla de cada
tubo por unos segundos.
Al inocular las placas hacerlo cerca a la llama del mechero.
La prueba debe interpretarse inmediatamente despus de aadir
el reactivo LUGOL porque ste tiende a desvanecerse con el
tiempo.

Anexos

AGAR ALMIDN
Frmula:
Ingredientes por litro.
Extracto de carne
Almidn Soluble
Agar

3g
10 g
12 g

pH final: 7.5 0.2 a 25 C

Mtodo de preparacin:
1) Suspender 25 g en 1 litro de agua destilada o desmineralizada.
2) Calentar a ebullicin para disolver completamente.
3) Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C.
4) Distribuir en la forma deseada.
CALDO LAURIL SULFATO
Medio selectivo recomendado para la deteccin y recuento de coliformes en
aguas, aguas residuales y alimentos.
Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.
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Frmula (en gramos por litro)
Triptosa
Lactosa
Cloruro de sodio
Lauril sulfato de sodio
Fosfato dipotsico
Fosfato monopotsico

20.0
5.0
5.0
0.1
2.75
2.75

Instrucciones
Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de
agua destilada. Dejar reposar 5 minutos.
Calentar a ebullicin hasta la disolucin
total. Distribuir en tubos conteniendo
tubos de fermentacin. Esterilizar en
autoclave durante 15 minutos a 121C.

pH final: 6.8 0.2

Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriolgico en el medio de cultivo
para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicacin.
El resultado de una siembra se llama: Cultivo
Las siembras pueden ser:
- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez
- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria
Mtodos Generales:
1) Siembra por dilucin: Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el
caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso
del asa cargada con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos
moderados.
Medio de cultivo: Liquido
Instrumento: Asa
Finalidad: poner la bacteria en suspensin
2) Siembra por estras en superficie: Se siembra el material en la superficie de
el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie
con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a
sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se
inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra
en la parte ms cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: agar base inclinado
Instrumento: asa o aguja bacteriolgica
3) Siembra por estra por agotamiento:
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Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las
colonias y aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca
en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se
toma material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del
medio formando estras. Esto puede realizarse de varias formas:
a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando
se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas
de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar con el asa nuevo
material.
b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado
el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace
una estra luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar
nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas
c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde,
se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as
sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento. Asa
Finalidad. Obtener colonias aisladas

4) Por picadura o puncin: Con una aguja se toma el material que se quiere
sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja
hasta el fondo, formando un canal de puncin, trayecto por el cual la
retiraremos luego. Este mtodo se utiliza para estudiar la movilidad de las
bacterias.
Medio de cultivo. Semislido

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Instrumento: aguja bacteriolgica
Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias
5) Siembra en TSI: (Por picadura y estras en superficie): el TSI (Triple Sugar
Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un
indicador que es el rojo fenol.
En este medio sembraremos por picadura y estras en superficie, como ya
conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirn en superficie y
profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y segn lo
hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarn indicando su
comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

IX. Cuestionario
1. Definir
ENZIMAS: Algunas sustancias, en pequeas cantidades tienen la capacidad
de acelerar las reacciones quimias sin que se alteren ellas mismas despus de
la reaccin; aceleran la velocidad de esta sin que necesariamente la inicien.
Las sustancias que se comportan as se llaman catalizadores o agentes
catalticos. Las enzimas pertenecen a esta categora de sustancias y son
producidos por los organismos vivos. As podemos definir una enzima como el
agente cataltico orgnico producido por las clulas vivas.
HIDRLISIS: Es una reaccin qumica entre una molcula de agua y
otra molcula, en la cual la molcula de agua se divide y sus tomos pasan a
formar parte de otra especie qumica. Esta reaccin es importante por el gran
nmero de contextos en los que el agua acta como disolvente.
FERMENTACIN: La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin
incompleta, que no requiere oxgeno,15y el producto final es un compuesto

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orgnico. El proceso de fermentacin es caracterstico de algunos
microorganismos: algunas bacterias y levaduras. Tambin se produce en la
mayora de las clulas de los animales (incluido el ser humano), excepto en las
neuronas, que mueren rpidamente si no pueden realizar la respiracin celular;
algunas clulas, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven
obligadas a fermentar; el tejido muscular de los animales realiza la
fermentacin lctica cuando el aporte de oxgeno a las clulas musculares no
es suficiente para el metabolismo aerobio y la contraccin muscular.
2. Qu son las enzimas extracelulares y enzimas intracelulares?
Podemos reconocer dos tipos de enzimas segn el sitio donde acten: enzimas
intracelulares o endoenzimas (funcionan en las clulas), y enzimas
extracelulares o exoenzimas (actan fuera de las clulas). La funcin principal
de las exoenzimas es realizar todos los cambios necesarios en los nutrientes
del medio para permitir que entren en la clula como alimento. Las enzimas
intracelulares sintetizan material celular y efectan reacciones catablicas de
las cuales se desprende la energa que aprovecha la clula.
3. Qu es el almidn y las protenas?
El almidn es el principal polisacrido de reserva de la mayora de los
vegetales, y la principal fuente de caloras de la mayora de la Humanidad. Es
importante como constituyente de los alimentos en los que est presente,
tanto desde el punto de vista nutricional como tecnolgico. Gran parte de las
propiedades de la harina y de los productos de panadera y repostera pueden
explicarse conociendo el comportamiento del almidn.
Lo que llamamos almidn no es realmente un polisacrido, sino la mezcla de
dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos estn formados por unidades de
glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces a 1-4 lo que da
lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen
ramificaciones debidas a enlaces a 1-6.
PROTEINA: un polipptido o grupo de polipptidos que forman una molcula
con una funcin especfica. Las protenas son largas cadenas de aminocidos
unidas por enlaces peptdicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo
amino (-NH2) de residuos de aminocido adyacentes. La secuencia de
aminocidos en una protena est codificada en su gen (una porcin de ADN)
mediante el cdigo gentico.
4. Qu son los polipptidos?
Las molculas que forman las protenas reciben el nombre de polipptidos. Se
trata de pptidos compuestos por, al menos, diez aminocidos (una clase de
molcula de tipo orgnico).
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Un polipptido, en otras palabras, es una secuencia de aminocidos que estn
vinculados a travs de enlaces peptdicos. Si los aminocidos encadenados son
ms de un centenar, ya puede hablarse de protena.
5. Cmo se almacena la energa en la clula?
La energa adquirida por las clulas se conserva en ellas en las mitocondrias
donde ms tarde se liberara por el ciclo de krebs, para ser utilizada
principalmente cuando se requiera en forma de adenosn trifosfato (ATP). Tanto
si proviene de la luz solar o de la oxidacin de compuestos orgnicos, se
invierte en la formacin de ATP, en una proporcin muy alta. El ATP es entonces
el "fluido energtico" que pondr en marcha las dems funciones de la clula.
6. Qu es la respiracin aerbica y anaerbica?
Respiracin aerbica: La respiracin aerbica, o respiracin celular en
presencia de oxgeno, utiliza el producto final de la gliclisis, el piruvato, en el
ciclo TCA, para producir mucha ms moneda de energa en forma de ATP, que
la que se puede obtener por cualquier va anaerbica. La respiracin aerbica
es caracterstica de las clulas eucariotas cuando tienen suficiente oxgeno, y
la mayor parte tiene lugar en las mitocondrias.
Respiracin anaerbica: La respiracin anaerbica (tanto la gluclisis como
la fermentacin), se lleva a cabo en la parte lquida del citoplasma, mientras
que la mayor parte de la produccin de energa de la respiracin aerbica,
tiene lugar en las mitocondrias. La respiracin anaerbica deja una gran
cantidad de energa en las molculas de etanol o lactato, que la clula no
puede utilizar y debe excretar.

17

X.

MICROBIOLOGIA SANITARIA

Bibliografa

http://minificciones.files.wordpress.com/2012/08/13-reacciones-dehidrc3b3lisis.pdf
(Hidrolisis)
http://www.buenastareas.com/ensayos/Hidrolisis-DelAlmidon/2509376.html
(Hidrolisis de almidn)
http://deproteinas.com/hidrolisis-de-proteinas
(Hidrolisis de protenas)
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedra
Micro/carbohidratos.pdf
(Fermentacin de carbohidratos)
PELCZAR. Microbiologa. 4ta edicin
(Enzimas, protenas, hidrolisis)
http://www.monografias.com/trabajos91/reporte-laboratoriorespiracion/reporte-laboratorio-respiracion.shtml
(Respiracin anaerobia y aerobia)
http://definicion.de/polipeptido/
(polipptidos, proteinas)

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