LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

INTEGRANTES:

JESUS DAVID BAYTER PINEDA

OSCAR FIGUEREDO
JIMMY
EMIRO PINTO

PROFESORA:
SANDRA RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

VALLEDUPAR-CESAR
2013

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIETAL

RECUENTO MICROBIANO POR LA TECNICA DE FILTRACION POR

MEMBRANA

INTEGRANTES:

JESUS DAVID BAYTER PINEDA

OSCAR FIGUEREDO
JIMMY
EMIRO PINTO

PROFESORA:
SANDRA RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

VALLEDUPAR-CESAR
2013

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL

RECUENTO MICROBIANO
MEMBRANA

POR

LA TCNICA DE

FILTRACIN

POR

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

La filtracin por membrana sirve para la esterilizacin en frio de lquidos o

soluciones, por ejemplo de azucares, micronutrientes y en especial de antibiticos
y vitaminas termolbiles, las cuales se adicionan a los otros componentes de un
medio de cultivo recin esterilizado y a temperaturas de fusin. Igualmente esta
tcnica se usa para el control microbiolgico de muestras liquidas, tales como
aguas potables o bebidas. Las membranas sintticas poseen poros de tamao
definido, 0.22um para levaduras y hongos filamentosos. la cuadricula delineada en
la superficie superior
de la membrana permite cuantificar el nmero de
UFC/volumen liquido filtrado y de acuerdo al medo selectivo utilizado, el cual se
transmite a la membrana, se puede cuantificar diversos tipos de bacterias y
hongos.
OBJETIVOS:

Cuantificar coliforme de una muestra de agua potable mediante filtro de

membrana
Obtener destreza en el manejo del equipo de filtracin por membrana
(millipores)

MATERIALES:

Muestra liquida (agua potable) 100ml

Cajas de Petri con mac konkye o EMB
Equipo de filtracin por membrana (millipores)esterilizados
Membranas de 0.22um
Pinzas para membranas
Alcohol 90%
Agua estril
Bomba de vaco
Mechero

FILTRACIN

TRAVS

DE

MEMBRANA

El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la

filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana.
Por lo general, estn compuestos de steres de celulosa, tpicamente con poros
de 0,45 mm de dimetro que retienen los coliformes totales y otras clases de
bacterias presentes en la muestra. Despus se incuban las membranas vueltas
hacia arriba en un medio selectivo. En la prctica, la tcnica de filtracin de
membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el mtodo de
tubos
mltiples.
Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud
con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a
cabo rpidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en
forma normal. Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de
agua, tambin se utiliza en el anlisis de leche y otros alimentos lquidos.
TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES
La tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo en el cual se capturan
en la superficie de una membrana microorganismos cuyo tamao es mayor que el
tamao del poro 0.22um esto gracias a una bomba elctrica que ejerce presin
diferencial sobre la muestra de agua haciendo que esta se filtre. Los
microorganismos de menor tamao que el especfico del poro pasan la membrana
o quedan retenidos en su interior. Las bacterias quedan en la superficie de la
membrana y luego esta se lleva al medio de cultivo( EMB Y mac conkey).luego es
incubado y pasado el tiempo de incubacin se observa el crecimiento y el nmero
de unidades formadoras de colonia.
VOLUMEN

DE

AGUA

ANALIZADA

El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas

envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo,
en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el nmero de
bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares.
La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientacin:

Tipos de agua

Coliformes totales

Potable de consumo pblico

100 ml

Envasadas

250 ml

Manantiales

15; 60; 100 ml

Lagos, depsitos

4; 15; 60; 100 ml

Acometidas

0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De playas

0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De ros

0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales cloradas

0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales sin tratar

0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente

aadindolas
al
embudo
de
filtracin.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30 ml de solucin
tamponada estril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente
diluciones con solucin tamponada estril.
E.M.B. Agar.
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo
de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
FUNDAMENTO
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos
capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de
hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico brillo metlico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad
permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en
este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que
Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a

partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a

sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de
especies de Salmonella y Shigella.
MAC CONKEY AGAR.
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo
de
gran
parte
de
la
flora
Gram
positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las
colonias,
y
la
precipitacin
de
las
sales
biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

PROCEDIMIENTO:

Trabaje en condiciones aspticas

Marque la caja (muestra y tipo de medio)
Sumerja aproximadamente 2cm en el recipiente con alcohol y pselas por
la llama y deje que arda el alcohol
Abra una membrana individual levantando el celofn completamente hacia
atrs y sostenga la membrana en el centro
Separe la membrana con las pinza y retire el embudo del aparato filtrador,
desenroscndolo de la base
Sobre la plataforma de la base reinstale el embudo enroscndolo hasta que
sienta leve presin
Vierta el volumen apropiado y aplique al vaco hasta que el fluido se halla
filtrado, cierre al vaci
Desensamble nuevamente el aparato y retire con las pinzas estriles la
membrana con cuidado de no romperla
Coloque la membrana sobre el medio de cultivo con cuidado de no dejar
burbujas de aire por debajo de la membrana.
Incube en posicin invertida a 35 C/22-24h

ANALISIS:
Para este laboratorio trabajamos con una muestra de agua de uno de los baos de
las instalaciones de la universidad para los dos tipos de cultivo utilizados (EMB Y
mac conkey)
Se realiz el debido montaje para el laboratorio con los materiales y las muestras
de agua con una cantidad de agua establecida para cada filtracin de 100ml

CONCLUSIONES:

Luego de que se cumpliera el tiempo de incubacin establecido se produjo a

observar los microorganismos que pudieron crecer en los distintos tipos de cultivo
y esto fue lo que observamos:
En el cultivo de EMB pudimos observar que hubo crecimiento en la membrana por
parte de la E coli en una cantidad considerable lo cual indica claramente la
presencia de este microorganismo en esta muestra de agua.
Pero por el contrario en el medio de cultivo con mac conkey no se pudo observar
ningn crecimiento en la membrana por parte de ningn microorganismo, al ver
esta reaccin llegamos a una conclusin en la que podemos afirmar lo siguiente:
Como el nico microorganismo que creci es E coli el cual entra en el grupo de los
coliformes fecales o termo tolerantes llamados as debido a que pueden soportar
hasta temperaturas de 45C y como solo creci en el medio de cultivo de EMB
podemos concluir tambin que este tipo de cultivo entra entre los indicadores
fecales en el cual se pueden encontrar microorganismos especficos como
salmonella endobacter o E coli que es la que se puede encontrar en un 80 -90%.
Mac conkey tambin es un cultivo para determinar coliformes totales y fecales
pero con lo visto en el laboratorio destacamos al medio de EMB como un medio
especfico para E coli principalmente y por ende pues ms efectivo para el
crecimiento de este microorganismos que en el medio con mac conkey.

ANEXOS:

(E. coli en agar EMB)

Nota: las imgenes originales se extraviaron debido a fallas tcnicas en el
dispositivo donde se encontraban almacenadas, por lo que se nos fue imposible
anexar en el laboratorio la cantidad de unidades formadoras de colonias en E. coli.

BIBLIOGRAFIA:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf