Engenharia Biomdica

Bioqumica e Biologia Molecular

Relatrio

Cintica da Enzima Invertase

Relatrio realizado por:

Ana Calhau n54605
Drcio Silva n54214
Jos Frazo n54198
1 Semestre, Ano Lectivo 2005/2006

Sumrio
Usam-se diversas abordagens no estudo do mecanismo de aco
de enzimas purificadas, mas a abordagem principal determinar a taxa
da reaco enzimtica e como muda em resposta mudana dos
parmetros experimentais, esta conhecida como cintica enzimtica.
Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cintica da
enzima invertase, ou seja, determinar o valor da velocidade mxima
(mxima velocidade a que a enzima degrada o substrato) e determinar
o valor do Km que uma medida da afinidade enzimtica para o
substrato (essa afinidade igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade
baixa. A invertase uma enzima que catalisa a degradao da
sacarose em glucose e frutose.
Inicialmente, obteve-se a absorvncia e a concentrao dos
acares redutores (tendo-se feito dois ensaios). Depois, calculou-se a
velocidade de reaco para cada concentrao inicial de sacarose.
Para se obter os valores usou-se a equao da recta Y=0,0004x-0,0186,
em que Y a absorvncia. Em seguida colocaram-se estes resultados
num grfico (concentrao de sacarose x velocidade de reaco),
obtendo-se uma curva de Michaelis-Menten (fig.1).

Fig.1 Variao da velocidade de reaco em funo da

concentrao de substracto curva de Michaelis-Menten.
Esta curva descrita pela equao que leva o mesmo nome:

Apesar de ser possvel calcular o valor de Km e da velocidade

mxima atravs desta curva frequente utilizar-se a representao
grfica de 1/v em funo de 1/[S] representao de Lineweaver-Burkpois torna mais simples o estudo da cintica bioqumica, j que o

traado de uma recta exige menos leituras experimentais (menos

pontos) do que o da curva e permite uma determinao de Km mais
expedita.

Fig.2 Representao de Lineweaver-Burk para a determinao

de Km
Esta representao descrita pela equao

Assim, o objectivo de estudar a cinemtica da enzima invertase

foi alcanado, obtendo-se valores de Km iguais a 12,52 g/L (36,6mM)
pela interpretao linear de Lineweaver-Burk e de 11,5 g/L (33,6mM)
pela interpretao de Michaelis Menten. Os valores da velocidade
mxima foram de 1,84g/(L.min) e 1,6 g/(L.min) respectivamente.

Resultados
Nos primeiros resultados, aps se ler a densidade ptica,
obtiveram-se logo valores mximos para a velocidade. Assim, reduziu-se
a quantidade de invertase utilizada.
Aps a reduo a 1/5 de invertase quantos aos resultados,
obteve-se, relativamente cor, que esta passava de transparente para
amarelo, aps adio da invertase, qualquer que fosse a concentrao
de sacarose. Aps passagem pelo banho de gua a 100C passava a
castanho.
Contudo, para os tubos aos quais no foi adicionado invertase e
que correspondem ao tempo zero para cada uma das concentraes
de sacarose verificou-se a passagem do transparente para o amarelo e
a permanncia desta cor.
Quanto aos valores obtidos para a absorvncia e para a
concentrao os resultados so os seguintes:
9 Valores obtidos para as concentraes de 15, 30 e 45 g/l
Ensaio 1
Concentrao de
sacarose 15g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,1

296,5

0,24

646,5

60

0,59

1521,5

120

0,85

2171,5

180

2546,5

240

1,1

2796,5

300

1,2

3046,5

360

1,35

3421,5

420

Concentrao de
sacarose 30g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,011

74

0,525

1359

60

1,112

2826,5

120

1,561

3949

180

1,867

4714

240

2,936

7386,5

300

2,37

5971,5

360

2,59

6521,5

420

Tempo (s)

Tempo (s)

Concentrao de
sacarose 45g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,018

91,5

0,622

1601,5

60

1,171

2974

120

1,693

4279

180

1,967

4964

240

2,35

5921,5

300

2,597

6539

360

2,697

6789

420

Concentrao de
sacarose 15g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,032

126,5

1
2
3
4
5
6
7

0,574
1,021
1,392
1,76
2,048
2,338
2,516

1481,5
2599
3526,5
4446,5
5166,5
5891,5
6336,5

Concentrao de
sacarose 30g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2
3
4
5
6
7

0,023
0,565
0,921
1,21
1,52
1,845
2,121
2,235

104
1459
2349
3071,5
3846,5
4659
5349
5634

Concentrao de
sacarose 45g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1

0,009
0,779

69
1994

Tempo (s)

Ensaio 2
Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60

2
3
4
5
6

1,304
1,834
2,48
2,467
2,81

3306,5
4631,5
6246,5
6214
7071,5

120

2,744

6906,5

420

180
240
300
360

9 Valores obtidos para as concentraes de 45, 60 e 75 g/l

Ensaio 1
Concentrao de
sacarose 60 g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,008

66,5

1
2
3
4
5
6
7

0,64
1,311
1,828
2,221
2,535
2,672
2,809

1646,5
3324
4616,5
5599
6384
6726,5
7069

Concentrao de
sacarose 75g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2
3
4
5
6
7

0,009
0,638
1,145
1,604
2,076
2,326
2,59
2,684

69
1641,5
2909
4056,5
5236,5
5861,5
6521,5
6756,5

Concentrao de
sacarose 100g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2

0,024
0,941
1,428

106,5
2399
3616,5

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60
120

3
4
5
6

1,997
2,406
2,598
2,759

5039
6061,5
6541,5
6944

180

2,836

7136,5

420

240
300
360

Ensaio 2
Concentrao de
sacarose 60 g/L

0
1
2
3
4
5
6
7

Concentrao de
sacarose 75g/L

0
1
2
3
4
5
6
7

Concentrao de
sacarose 100g/L

0
1
2
3
4
5
6

[] (mg/L)

Absorvncia

Tempo (s)

0,185

509,000

0,850

2171,500

90

1,400

3546,500

150

2,203

5554,000

210

2,479

6244,000

270

2,626

6611,500

330

2,814

7081,500

390

2,848

7166,500

450

[] (mg/L)

Absorvncia
0,58

Tempo (s)
1496,5

0
60

1,456

3686,5

120

2,04

5146,5

180

2,405

6059

240

2,72

6846,5

300

360

420

[] (mg/L)

Absorvncia

Tempo (s)

0,038

141,5

0,787

2014

60

1,4

3546,5

120

1,864

4706,5

180

2,191

5524

240

2,546

6411,5

300

2,741

6899

360

2,666

6711,5

420

Assim, a mdia para cada grupo de valores obtidos :

Concentrao de
sacarose 15g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,066

211,5

0,407

1064

60

0,8055

2060,25

120

1,121

2849

180

1,38

3496,5

240

1,574

3981,5

300

1,769

4469

360

1,933

4879

420

Concentrao de
sacarose 30g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,017

89

0,545

1409

60

1,0165

2587,75

120

1,3855

3510,25

180

1,6935

4280,25

240

1,845

4659

300

2,2455

5660,25

360

2,4125

6077,75

420

Concentrao de
sacarose 45g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0,0135

80,25

0,7005

1797,75

60

1,2375

3140,25

120

1,7635

4455,25

180

2,2235

5605,25

240

2,4085

6067,75

300

2,7035

6805,25

360

2,7205

6847,75

420

Tempo (s)

Tempo (s)

Tempo (s)

Concentrao de
sacarose 60g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2
3
4
5
6
7

0,008
0,64
1,311
1,828
2,221
2,535
2,672
2,809

66,5
1646,5
3324
4616,5
5599
6384
6726,5
7069

Concentrao de
sacarose 75g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2
3
4
5
6
7

0,009
0,638
1,145
1,604
2,076
2,326
2,59
2,684

69
1641,5
2909
4056,5
5236,5
5861,5
6521,5
6756,5

Concentrao de
sacarose 100 g/L

Absorvncia

[] (mg/L)

0
1
2
3
4
5
6
7

0,024
0,941
1,428
1,997
2,406
2,598
2,759
2,836

106,5
2399
3616,5
5039
6061,5
6541,5
6944
7136,5

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Tempo (s)
0
60
120
180
240
300
360
420

Desta forma, graficamente obtemos:

8

Conc de Aucares Reduzidos (g/L )

Conc.S acaros e 15g/L

Conc.S acaros e 30g/L
Conc.S acaros e 45g/L

Conc.S acaros e 60g/L

Conc.S acaros e 75g/L
Conc.S acaros e 100g/L

0
0

Tempo (min)

Pelo clculo do declive das rectas anteriores obtm-se a curva de

Michaelis-Menten:
1,8
1,6

Velcidades (g/L .min)

1,4
1,2
1
Srie2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

15

30

45
C onc. Sacaros e (g/L )

60

75

100

Desta forma (pela aplicao das frmulas apresentadas no

sumrio), obtm-se:
Km=11,5 g/L (33,6mM)
Vmx=1,6 g/(L.min)
Pela inverso dos valores dos eixos acima obtm-se o grfico de
Lineweaver-Burk:
y = 6,806x + 0,5435

1,5

1,3

1,1

0,9

0,7
Srie1

0,5

Linear (Srie1)

0,3

0,1
-0,1

-0,05

-0,1

0,05

0,1

-0,3

-0,5
1/[ ]

Mais uma vez, pela aplicao das frmulas apresentadas no

sumrio, obtm-se:
Km=12,52 g/L (36,6mM)
Vmx=1,84 g/(L.min)

Discusso
Os primeiros resultados obtidos evidenciaram, muito inicialmente,
valores de velocidade mxima, uma vez que, a reaco deu-se muito
depressa devido ao excesso de produto, ou seja, utilizou-se enzima em
excesso, tendo-se, posteriormente, devido a tal acontecimento,
diminudo a sua quantidade em 1/5.
Quanto colorao obtida, verifica-se que, apenas para o tubo
correspondente ao tempo zero esta no muda pois no foi adicionada
invertase, que ao reagir provoca o escurecimento da soluo.
Para a construo dos grficos e clculo das mdias foram
desprezados valores, os correspondentes a tempos diferentes e valores
em que a velocidade mxima era rapidamente atingida.
Para o grfico da concentrao de aucares reduzidos (g/L) por
unidade de tempo (s) foi desprezado um valor correspondente ao tubo
5 de concentrao 30g/L por apresentar um valor anmalo derivado a
um erro de leitura.
O valor terico de Km para a enzima invertase (segundo o Brenda)
de 14,09 g/L (41,02mM). O valor obtido neste trabalho experimental foi
diferente do valor terico possivelmente porque as condies
requeridas para estipular um valor tabelado so muito mais exigentes e
precisas do que as que conseguidas numa aula laboratorial.
Por outro lado, foi tambm diferente o valor de Km obtido,
dependendo este da representao utilizada a de Michaelis-Menten
(Km=11,5 g/L (33,6mM)) ou a de Lineweaver-Burk (Km=12,52 g/L
(36,6mM)) - devido diferente preciso dos mtodos. Contudo, verificase, nitidamente, que o valor obtido pela recta de Lineweaver-Burk
bem mais aproximado ao terico, devido, precisamente, sua maior
preciso.
Vrias podem ter sido as razes que explicam a diferena entre
os valores obtidos e os tericos, assim como a diferenas nos ensaios
para iguais concentraes de sacarose. Destacam-se:
- A impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45C a
soluo de sacarose esta estivesse exactamente a 45, visto que o
sistema partilhado por 4 grupos o que pode originar pequenas
oscilaes de temperatura, assim como a impossibilidade de garantir
que o banho de gua estivesse a 100C pelas mesmas razes.
- O prprio facto de se agitar o tubo de forma diferente e durante
tempos diferentes aps de adicionar a invertase pode influenciar o
resultado, uma vez que, se formam agregados mais ou menos maiores;

- Mau manuseamento do material em especial das pipetas.

Podem surgir erros ao pipetar e ao transferir para o recipiente;
- O facto de ser impossvel cumprir escrupulosamente com os
tempos estipulados no protocolo;
- Aproximaes no tratamento dos resultados;
- Erros de leitura no espectrofotmetro, nomeadamente, erros de
paralaxe, uma vez que os valores foram lidos por ns;
- O facto de terem sido desprezados vrios pontos no traado das
rectas cujo declive d a velocidade. A escolha dos pontos pode no
ter sido a mais correcta. Como as velocidades foram utilizadas na
determinao das constantes cinticas, pode ter ocorrido propagao
de erros.
Contudo, apesar de todas as diferenas verificadas, pode
concluir-se que se obteve valores aceitveis de Km e de velocidade
mxima (constantes cinticas) pela leitura da recta de Lineweaver-Burk.

Bibliografia

Campos, Lus S., Entender a Bioqumica, 4 edio. Escolar

Editora. Lisboa, 2005;