UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO- HUMACAO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
BIOL 3013
Experiencia de Laboratorio: Macromolculas: cidos nuclicos y mtodo
de separacin
Adaptado y traducido por la Dra. Melissa Coln Cesario, UPRH 2009 de:
Exercise Seven: Separating Organic Compounds, Biology Laboratory
Manual, Vodopich & Moore, McGraw Hill, 2008.
Objetivos:
1. Describir y utilizar procedimientos clsicos para aislar DNA.
2. Reconocer que la gel de electroforesis es una tcnica utilizada
para separar molculas orgnicas.
Introduccin:
Todo sistema vivo se compone de molculas orgnicas que forman las
estructuras principales de la clula. Las molculas orgnicas de mayor
abundancia en la clula son los hidratos de carbono, los lpidos, las protenas y
los cidos nuclicos. En la unidad pasada utilizamos pruebas para detectar la
presencia de los hidratos de carbono y los lpidos en diferentes soluciones. En
esta unidad vamos a utilizar una prueba bioqumica para detectar la presencia
de las protenas en una solucin y un procedimiento para aislar el DNA de las
clulas.
El DNA y el RNA son cidos nuclicos compuestos por pequeas
unidades conocidas como nucletidos. Los nucletidos se caracterizan por estar
compuestos de tres grupos: un azcar (desoxirribosa o ribosa), un grupo fosfato
y una base nitrogenada. Existen cuatro nucletidos que componen la molcula
del DNA: timina, citosina, guanina y adenina, los cuales varan en la base
nitrogenada. Un nucletido se une a otro nucletido mediante un enlace
fosfodiester, esta unin ocurre entre el grupo fosfato de un nucletido y el del
azcar del nucletido adyacente. Esta cadena larga de nucletidos forma los
cidos nuclicos. Aunque el DNA y el RNA son cidos nuclicos
estructuralmente stas molculas difieren. La molcula de DNA se caracteriza
por tener dos cadenas de nucletidos que permanecen unidas por puentes de
hidrgeno, mientras que la molcula de RNA se compone de una cadena
sencilla de nucletidos. Los nucletidos de DNA estn compuestos por una
azcar conocida como desoxirribosa, mientras que la molcula de RNA est
compuesta por una ribosa. Adems, la molcula de RNA carece de timina, la
cual es sustituida por uracilo. Tanto la molcula de DNA como la de RNA son de
gran importancia en los organismos vivos porque son las molculas que estn
asociadas con la herencia.

Extraccin de DNA
El siguiente procedimiento experimental es para aislar (extraer) DNA de
las clulas de un organismo. Este mtodo es una versin modificada del
procedimiento que se utiliza en los laboratorios de biotecnologa. El objetivo es
extraer DNA del filtrado de una fruta o vegetal.
Procedimiento para extraer DNA de una fresa:
1. Coloca en una bolsa zip-locked una fresa. Aade 6 mL de detergente de
fregar o SDS/NaOH. Cuidadosamente remueve el aire de la bolsa y
cirrala apretadamente.
2. Suavemente, pero completamente, tritura la fresa de forma tal que no
queden pedazos grandes (tipo pur). El filtrado de fruta se obtiene de la
mezcla de la fruta con un detergente. El detergente emulsifica y forma
complejos con los lpidos y las protenas de la membrana plasmtica
precipitndolas fuera de la solucin. El contenido celular, incluyendo el
DNA, queda suspendido en la solucin. La mezcla celular se purifica para
producir un filtrado que contenga el DNA y protenas adheridas.
3. Coloca el jugo de fresa y detergente en un filtro de caf. Recoge el
filtrado lquido en un beaker o tubo de ensayo limpio. No te preocupes si
parte de los desechos de fresas caen en el filtrado. Presiona suavemente
el filtro a la pared del tubo de ensayo para facilitar el flujo del jugo de
fresa.
a. Vas a obtener ms o menos 8 mL del jugo de la fresa.
b. El jugo de fresa contiene el DNA, pero no se puede observar
porque est disuelto en el agua.
4. Cuidadosamente aade 2 mL de 100% alcohol etlico (EtOH) al jugo de
fresa filtrado. Aade el EtOHl de forma tal que este baje por las paredes

del tubo de ensayo, se formar una capa de alcohol sobre el jugo de

fresa. NO mezcle el alcohol con el jugo.
a. En este punto se va a observar que se forma una interfase borrosa
entre las capas del alcohol y el jugo de fresa. Este es el DNA que
se est precipitando del jugo de fresa. El DNA es insoluble al
alcohol.
5. Sin alterar las dos capas, sumerge una varilla fina de cristal dentro del
jugo de fresa y alcohol. Con la varilla obtn la molcula de DNA (tiene
forma de algodn) que se va a encontrar en la zona del EtOH.
Preguntas:
1. Cul es la funcin del detergente en este protocolo de extraccin de
DNA?

2. Qu sucedi con el jugo filtrado al aadir el EtOH 100%?

3. Cul es la funcin del EtOH 100% en este protocolo de extraccin de

DNA?

Separar molculas orgnicas:

Como podemos reconocer las clulas se componen de una mezcla de
molculas orgnicas (hidratos de carbono, protenas, lpidos y cidos nuclicos).
Para poder caracterizar todas estas molculas los cientficos utilizan ciertos
mtodos para separar los compuestos de la clula.
Entre los diferentes mtodos que existen, la gel de electroforesis se utiliza
para separar las molculas de acuerdo a sus cargas, estructuras y tamao. Las
muestras (molculas orgnicas) son ubicadas en los pozos que se encuentran
en la gel (parecida al Jello). Luego a la gel se le aplica una corriente elctrica
que permite que las molculas orgnicas se muevan fuera del pozo y atraviesen
la gel. La velocidad, la direccin y la distancia de movimiento de cada molcula
est asociado a su carga, tamao y estructura.

Segn ilustrado en la figura, el aparato

para una gel de electroforesis se
compone de una cmara de
electroforesis, una gel, un buffer (solucin
amortiguadora), las muestras y una
fuente de energa.
La gel: consiste de agarosa
(derivado de agar) disuelta en una
solucin amortiguadora caliente.
Cuando la solucin se enfra esta
se solidifica en una gel porosa que
funciona como un cedazo. La gel
se sumerge en una cmara que
contiene electrodos y est llena de
solucin amortiguadora.
La solucin amortiguadora
conduce electricidad y controla el pH. El pH suele afectar la estabilidad y
cargas de las muestras.
Las muestras son una mezcla de molculas (DNA o protenas) ubicadas
en los pozos de la gel y migran a lo largo de la gel durante la
electroforesis.
La fuente de energa provee la corriente que pasa a travs de la gel.
Las molculas con cargas responden a la corriente migrando desde el
pozo a lo largo de la gel. Las molculas con cargas negativas migran
hacia el electrodo positivo (el nodo), mientras que las molculas con
cargas positivas migran hacia el electrodo negativo (el catin). Mientras
ms alto sea el voltage ms rpido migran las molculas.
Las propiedades de cedazo de la gel afecta la velocidad de movimiento de
las molculas a travs de la gel. Las molculas pequeas se mueven ms
facilmente por los poros de la gel que las molculas grandes. Por tanto,
molculas pequeas y compactas (esfricas) se mueven ms rpido que las
molculas grandes. Si las molculas tienen estructuras similares y el mismo
peso, entonces la molcula con mayor carga se mueve ms rpido.

En la mesa de demostracin usted podr observar el equipo para una

electroforesis. Aunque en esta experiencia no tendremos la oportunidad
de llevar a cabo una electroforesis para la muestra de DNA obtenida, si
tendremos la oportunidad de manejar una micropipeta digital y hacer un
simulacro de cmo cargar unas muestras en una gel.

Analizar e interpretar una Gel de electroforesis

Utiliza la siguiente situacin para analizar los resultados representados en la
caricatura, de una electroforesis.
Situacin: La hemoglobina que genera anemia (HbS) migra ms lentamente al
polo positivo que la hemoglobina normal (HbA). Esta condicin se genera por
una mutacin en donde glutamato (polar,
hidroflica) es sustituida por valina (no polar,
hidrofbica).
1. Cul carril contiene solo a HbS,
indicando que el individuo es HbS
HbS?

2. Cul carril contiene solo a HbA,

indicando que el individuo es HbA
HbA?

3. Cul carril contiene ambos HbA y HbS, indicando que el individuo es HbA
HbS?

4. Basado en la informacin obtenida y el resultado, qu puede decir usted

de los amino cidos de valina y glutamato?

5. Cul caracterstica o factor est determinando el movimiento de las

molculas HbA y HbS a travs de la gelatina?

Separar molculas orgnicas por un gel de electroforesis

Procedimiento:
1. Obtn una cmara de electroforesis. Cubre los extremos del plato con las
gomas apropiadas (en algunos casos puedes utiliza tape), segn le
demuestre el instructor.
2. Ubica el peine en el extremo y en el centro de la cama (segn sea
indicado). Va a observar que existe un espacio entre el peine y el plato.
3. Mezcla 0.8% (peso por volumen) de polvo de agarosa con el buffer
(solucin amortiguadora), suficiente volumen para llenar el plato del gel.
Calienta la mezcla hasta que la agarosa se disuelva.
4. Cuando la solucin de agarosa se enfre (que usted pueda tocarlo) aade
la solucin al plato del gel.
5. Cuando la gel se solidifique, quita las gomas de los extremos. Este paso
hay que hacerlo con delicadeza para que el gel no se rompa. Adems,
quita el peine del gel. Va a observar los pozos del gel.
6. Ubica el plato con el gel en el interior del aparato de electroforesis.
7. Aade el buffer al aparato de electroforesis, de forma tal que el gel quede
sumergido en el buffer.
8. Usted tendr cuatro muestras:
a. Muestra 1: Bromophenol blue (peso molecular = 670 g mole -1)
b. Muestra 2: Methylene blue (peso molecular = 320 g mole -1)
c. Muestra 1: Orange G (peso molecular = 452 g mole -1)
d. Muestra 1: Xylene cyanol (peso molecular = 555 g mole -1)
9. Utilizando una micropipeta carga cada muestra en cada pozo del gel.
Asegrate que la solucin est en la punta de la pipeta (de esta forma la
solucin queda en el interior del pozo y no se forma burbujas dentro del
pozo).
a. Ubica la punta de la pipeta en el pozo sin tocar el fondo. No
absorbas el buffer.
b. Suavemente libera el contenido de la pipeta en el pozo del gel.
Remueve la pipeta, sin absorber el material del pozo o el buffer.
10. Haz el procedimiento 9 para las dems muestras. Recuerda cambiar de
tip para cada muestra. Utiliza los subsiguientes pozos para las diferentes
muestras.
11. Cuidadosamente cubre la cmara de electroforesis con la tapa. Conecta
la cmara con la fuente de energa. La coneccin roja es la carga positiva
y la carga negra es la carga negativa.
12. Enciende la energia hasta que el voltage llegue a 90 V. Rpidamente se
van a formar burbujas en el buffer cerca de los electrodos.
13. Despus de 30 min, apaga la fuente de energa, desconecta la cmara de
electroforesis. Suavemente remueve y dibuje sus resultados.

Preguntas:
1. Utilizando sus resultados, Cu es la carga del bromophenol blue, del
orange G y el azul de metileno? Explique el resultado

2. El orange G, el bromophenol blue se mueven a la misma distancia?

Por qu o por qu no?

Referencias:
Audesirk T, Audesirk, G & Byers B.E. Captulo 4: Molculas biolgicas.
Biologa: La vida en la Tierra. (8va ed.). Pearson Prentice Hall.
Campbell, Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky & Jackson. (2008)
Chapter 4: Carbon and Molecular Diversity. Biology. 8va Ed. Pearson
Benjamin Cummings, USA.
Raven, Johnson, Losos, Mason & Singer. (2008) Biology. 8va Ed. McGraw
Hill, USA