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Aislamiento del RNA total

De frijol comn (Phaseolus vulgaris)
1. Recolectar tejido fresco en una hielera con hielo seco. Se recomienda usar guantes. La cantidad
de
muestra depender de realizar previamente un ensayo en el cual definas el total de la
muestra necesaria.
2. Moler las hojas en un mortero (eliminar nucleasas a 220C toda la noche) con Nitrgeno lquido.
Transferir de 50-100 mg de tejido en un tubo de polipropileno de 1.5 ml para centrifugacin. El
tejido restante lo puedes almacenar en un tubo de polipropileno a -80C.
3. Agregue 1ml de Trizol ( Invitrogen No. Cat. 155596-026). Mezclar con vortex por 30
4. Incube durante 10 min. a TA
5. Centrifugue en una centrifuga de mesa durante 10 min. A 10,000 rpm 12,000 xg.
6. Trasfiera el sobrenadante ( RNA) a un tubo nuevo de 1.5 ml. Incubar a TA 5 min.
7. Agregue 200 l de Cloroformo. Mezclar vigorosamente de forma manual por 15 . Incube por 23 min. A TA.
8. Centrifuge durante 15 min. A 10,000 rpm o 12,000 xg.
9. Con una pipeta, traslada la capa acuosa superior a otros tubos de 1.5 ml nuevos.
10. Agregue 500l de isopropanol (2-propano) fro ( almacenado en un congelador a -20C) . Mezcle
invirtiendo con suavidad los tubos. Incube la muestra a TA por 10 min.
11. Centrifugue 10 min. A 13,000 xg. Decantar el lquido.
12. Lave la pastilla con 500 l de Etanol 75% ( Fro) ( almacenado en el congelador a -20 C). Mezcle
con vortex. Centrifuge 5 min. A 14,000 xg.
13. Decante el etanol y seque la pastilla colocando el tubo hacia debajo de 5-10 min. ( no secar en
exceso, ya que pierde solubilidad).
14. Agregue de 20-50 l de ddH2ODEPC estril, de acuerdo al tamao de la pastilla.
15. Almacenar a -80C o si va hacer utilizado comnmente almacenar a -20C
16. Si se requiere almacenado por ms tiempo, agregue 5 l de NaOAc 2.5 M y 150 l de etanol
Absoluto. Almacenado a -20C.

Soluciones
75% Etanol
Sol. Conc.
ETNOL ABSOLUTO
ddH2O dEPC aforar-

100 ml
75 ml
100 ml

ddH2O DEPC
Sol. Conc.
ddH2O
DEPC

1 litro
999 ml
1 ml

200 ml
150 ml
200 ml

2 litros
1999 ml
1 ml

Nota: Mezclar esta solucin y dejarla a TA toda la noche. Esterilizar y eliminar el DEPC a 115C por 10
min.
2.5 M NAOAc
Sol. Conc.

100 ml

NaOAc (P.M. 82.03)

ddH2o dEPC-aforar-

20.5 ml
100 ml

200 ml
41 g
200 ml

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Aislamiento de DNA de tejido foliar de frijol

comn (Phaseolus vulgaris)
con CTAB 2X
(Basado en el mtodo de Doyle & Doyle, 1987)

1. Para aislar ADN de tejido fresco moler las hojas de frijol con nitrgeno lquido en un mortero
hasta obtener un polvo fino, una vez pulverizado el tejido se transfieren aproximadamente de
100 a 500 mg (0.5 mL de un tubo eppendorf de 1.5 mL ) de muestra molida a un tubo eppendorf
estril de 1.5 mL etiquetado utilizando una esptula. Para el tejido liofilizado molido utilizar
100 mg (0.1 mL de un tubo eppendorf de 1.5 mL) aproximadamente.
2. Agregar 700 L de buffer CTAB 2X, mezclar manualmente por 2 min (dando pequeos golpes
con pluma o lpiz) (no vrtex), incubar en bao mara a 65 C durante 1hr.
3. Sacar las muestras del bao mara y esperar por 2 min, de esta manera la muestra se enfriar a
temperatura ambiente. Si se mantiene caliente la muestra se corre el riesgo de inactivar la
RNasa que se adiciona en el siguiente paso.
4. Agregar 10 L de RNasa (20 mg/mL) (Invitrogen, Cat. No. 12091-021,) mezclar manualmente
(por inversin por 2 min) e incubar por 30 min a 37C en bao mara.
5. Sacar del bao mara y esperar por 2 min hasta que se enfre a temperatura ambiente. Agregar
500 L de cloroformo-octanol 24:1 (Karal: No. Cat. 3052) (Sigma: No. Cat. 112615) y
homogenizar en vrtex.
6. Centrifugar por 14 min a 12,000 rpm. Transferir la fase acuosa (sobrenadante) a un tubo nuevo
estril de 1.5 mL.
7. Agregar al sobrenadante 600 L de isopropanol (J.T Baker: No. Cat. 9084-03) frio (almacenado
a -20 C) y 200 L de CH 3COONH4 7M (J.T Baker: No. Cat. 0596-01), para precipitar el DNA,
mezclar manualmente (por inversin) y almacenar a -20 C por 30 min.
8. Centrifugar por 8 min a 14,000 rpm, decantar el isopropanol para dejar solamente la pastilla en
el fondo del tubo (cuidado de no eliminar la pastilla de ADN).
9. Lavar la pastilla con 200 L de etanol (J.T Baker: No. Cat. 9084-03) fro al 70 % (almacenado a
-20 C) y centrifugar 5 min a 14,000 rpm.
10. Desechar el etanol y dejar secar la pastilla colocando el tubo boca abajo sobre una toalla
absorbente por 20 min.
11. Disolver la pastilla en 50 L de ddH 2O DEPC estril. El ADN puede ser almacenado a -20 o -80
C, segn la frecuencia del uso para evitar su degradacin.

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BUFFER CTAB 2X
Solucin/Reactivo
EDTA 0.5 M
TRIS 1M pH 8.0
NaCl 5 M
ddH2O (aforar)
CTAB
(USB: 13353)

&

Final
20 mM
100 mM
1.4 M
-

10 mL
0.4 mL
1 mL
2.8 mL
5.8 mL

20 mL
0.8 mL
2 mL
5.6 mL
11.6 mL

30 mL
1.2 mL
3 mL
8.4 mL
17.4 mL

2X (2%)

0.2 g

0.4 g

0.6 g

50 mL
2 mL
5 mL
14 mL
29 mL
1g

NOTA: Al final de la preparacin del buffer se coloca en una plancha de calentamiento y agitacin, se
agrega el CTAB y se deja en estas condiciones hasta disolverse, observando una solucin
completamente clara.
SOLUCIONES STOCK
0.5 M EDTA pH 8
Reactivo
EDTA

50 mL
10.405g

100 mL
20.81g

150 mL
31.215g

200 mL
41.62g

(Sigma: ED4SS)

NaOH (perlas)

En 30 mL ddH2O agregar el EDTA y mezclar

Para disolver el EDTA agregar una a una las perlas de NaOH, hasta
disolverlo
50 mL
100 mL
150 mL
200 mL
3 mL de HCl
6 mL de HCl
9 mL de HCl
12 mL de HCl

(J.T Baker:372201)

ddH2O-aforarAjustar pH

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

Nota: Esterilizar en autoclave.

1 M TRIS pH 8
Reactivo
TRIS base

50 mL
6.057g

100 mL
12.114g

150 mL
18.171g

200 mL
24.228g

50 mL
2.45 mL de HCl

100 mL
4.9 mL de HCl

150 mL
7.35 mL de HCl

200mL
9.8 mL de HCl

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

(Sigma: 258148)

(Sigma:93362)

ddH2O-aforarAjustar pH

Nota: Esterilizar en autoclave.

5 M NaCl
Reactivo
NaCl

50 mL
14.5275g

100 mL
29.055g

150 mL
43.5825g

200 mL
58.11g

100 mL

150 mL

200 mL

(Sigma: S7653)

ddH2O-aforar50 mL
Nota: Esterilizar en autoclave.
ddH2O DEPC
Reactivo
ddH20
DEPC

1000 mL
999mL
1 mL

(Research Organics:

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2106D)

Nota: Mezclar esta solucin, incubar a TA toda la noche. Esterilizar y eliminar el DEPC a 115C por 10
min.

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Aislamiento del DNA genmico de tejido foliar

de maz (Zea mays)
(Basado en el mtodo de Saghai-Maroof et al., 1984*)

Ponga 300-400 mg de tejido liofilizado y molido en un tubo de polipropileno de

15 ml para centrifugacin. Se obtienen de 50 a ms de 100 g de DNA/100 mg
de tejido seco. Si se requieren cantidades mayores, comience con 1 g de tejido
liofilizado en un tubo de polipropileno de 50 ml para centrifugacin y triplique
todas las cantidades dadas anteriormente.
2. Agregue 9.0 ml de solucin amortiguadora CTAB para extraccin, calentada
(65C), a los 300-400 mg de tejido liofilizado molido. Es mejor distribuir el
tejido sobre las paredes laterales del tubo antes de agregar la solucin
amortiguadora, con el fin de evitar que se apelmace el tejido seco en el fondo.
Mezcle invirtiendo el tubo varias veces con suavidad.
3. Incube durante 60-90 min en un horno a 65C, agitando los tubos
continuamente con suavidad.
4. Retire los tubos del horno, espere 4-5 min para que se enfren los tubos y
agregue 4.5 ml de cloroformo/octanol (24:1). Agite suavemente los tubos
durante 5-10 min para mezclar.
5. Centrifugue en una centrifugadora de mesa durante 10 min a 1300-1500 x g 1
a TA.
NOTA: a menos de 15C, el complejo de CTAB/cido nucleico puede
precipitarse; esto podra arruinar la preparacin y daar la
centrifugadora.
6. Vierta la capa acuosa superior en otros tubos de 15 ml. Agregue 4.5 ml de
cloroformo/octanol y agite suavemente durante 5-10 min.
7. Centrifugue en una centrifugadora de mesa durante 10 minutos a 1300-1500 x
g2 a TA.
8. Con una pipeta, traslade la capa acuosa superior a otros tubos de 15 ml que
contengan 25-50 l de 10 mg/ml de RNasa A (hervida previamente). Mezcle
invirtiendo con suavidad los tubos e incube durante 30 min a TA.
9. Agregue 6.0 ml de isopropanol (2-propanol). Mezcle invirtiendo con suavidad
los tubos.
10. Retire el DNA precipitado con un gancho de vidrio 2. Contine con las OPCIONES
A, B o C.
1.

OPTION A: Extraccin con fenol para obtener DNA de mayor pureza

NOTAS: Se recomienda mucho esta opcin para los anlisis del DNA basados
en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), como los RAPDs.
Para los anlisis de RFLPs, por lo general no es necesaria esta opcin
a menos que el DNA no se digiera adecuadamente. De hecho, es
mejor realizar una extraccin con fenol slo despus de la digestin
*

Saghai-Maroof, M.A., K. Soliman, R.A. Jorgensen and R.W. Allard. 1984. Ribosomal DNA spacerlength polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location , and population
dynamics. PNAS 81:8014-8018.

3000-3200 rpm en una centrifugadora Beckman GP o GPR con rotor oscilatorio (que puede
contener 56 x tubos de 15 ml).

Prepare el gancho de vidrio sellando primero el extremo de una pipeta de vidrio de 23 cm

para transferencia, calentando el extremo en una llama durante unos segundos. Caliente luego 1
cm de la punta mientras hace rotar la pipeta. Cuando se ablande, deje que la punta se doble para
formar un gancho. Enfre antes de usarlo. Los ganchos usados se pueden limpiar lavndolos en
dH2O y EtOH.

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con enzimas de restriccin; esto mejora la separacin en bandas y la

resolucin de stas despus de la electroforesis del DNA (vanse ms
detalles en las secciones posteriores).
10. Coloque el gancho con DNA en un tubo de plstico de 5 ml que contenga 1 ml
de TE; haga girar con suavidad el gancho hasta que el DNA se deslice de l.
Tape los tubos y agtelos suavemente a la temperatura ambiente hasta el da
siguiente, para disolver el DNA.
11. Extraiga cada muestra con 1 ml (1 x el volumen original de TE) de fenol
equilibrado. Centrifugue la muestra durante 10 minutos a 1300 x g 2 en un
rotor de cubeta oscilatoria.
12. Transfiera la capa (acuosa) superior a otro tubo. Extraiga el DNA con 1 ml (1 x
el volumen original de TE) de cloroformo/octanol. Centrifugue la muestra 10
minutos a 1300 x g2 en un rotor con cubeta oscilante. Transfiera la capa
(acuosa) superior a un nuevo tubo. Contine con el paso 14 de la OPCION B.
OPCION B: precipitacin con etanol
13. Coloque el gancho con DNA en un tubo de plstico de 5 ml que contenga 1 ml
de TE; rote con suavidad el gancho hasta que el DNA se deslice del gancho.
Tape los tubos y agite suavemente durante toda la noche a temperatura
ambiente para disolver el DNA.
14. Precipite el DNA agregando 50 l de 5 M NaCl y luego 2.5 ml de EtOH absoluto
(2.5 el volumen original de TE); mezcle invirtiendo con suavidad el tubo.
15. Retire el DNA precipitado con el gancho de vidrio. Contine con el paso 16 de
la Opcin C.
OPCION C: lavados del DNA
16. Coloque el gancho con DNA en un tubo de plstico de 5 ml que contenga 3-4
ml de LAVADO 1. Deje el DNA en el gancho dentro del tubo durante unos 20
min.
17. Enjuague brevemente el DNA del gancho en 1-2 ml del LAVADO 2 y transfiralo
a un tubo de plstico de 5 ml que contenga 0,5-1.0 ml de TE; haga girar con
suavidad el gancho hasta que el DNA se deslice del gancho. Tape el tubo y
agtelo con suavidad a la temperatura ambiente hasta el da siguiente, para
disolver el DNA. Almacene las muestras a 4C.
Solucin amortiguadora con CTAB para extraccin 1
SOL. CONC.

[FINAL]

1 RXN

5 RXN 10 RXN 20 RXN 50 RXN 56 RXN

10 ml

50 ml 100 ml 200 ml 500 ml 600 ml

dH2O
1 M Tris-7.5 100 mM
5 M NaCl
700 mM
0.5 M EDTA-8.050 mM

6.5
1.0
1.4
1.0

CTAB2

0.1 g

0.5 g

1.0 g

2.0 g

4.5 g

6.0 g

0.1 ml

0.5 ml

1.0 ml

2.0 ml

4.5 ml

6.0 ml

1%
3
14 M BME
140 mM

ml 32.5 ml 65.0 ml 130.0

ml 5.0 ml 10.0 ml 20.0
ml 7.0 ml 14.0 ml 28.0
ml 5.0 ml 10.0 ml 20.0

ml 325.0
ml 50.0
ml 70.0
ml 50.0

ml 390.0
ml 60.0
ml 84.0
ml 60.0

ml
ml
ml
ml

1 Use la solucin recin preparada; calintela a 60-65C antes de agregar

el CTAB y el BME.
2 CTAB = bromuro mixto de alquiltrimetil-amonio (Sigma M-7635)
3 Agregue BME (-mercaptoetanol) justo antes del empleo, bajo una
campana para emanaciones.

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LAVADO 1: 76% de EtOH, 0.2 M NaOAc

SOL. CONC.
EtOH absoluto
2.5 M NaOAc
dH2O

100 ml

200 ml

300 ml

400 ml

500 ml

76 ml
8 ml
16 ml

152 ml
16 ml
32 ml

228 ml
24 ml
48 ml

304 ml
32 ml
64 ml

380 ml
40 ml
80 ml

LAVADO 2: 76% de EtOH, 10 mM NH4OAc

SOL. CONC.
EtOH absoluto
1 M NH4OAc
dH2O

100 ml

200 ml

300 ml

400 ml

500 ml

76 ml
1 ml
23 ml

152 ml
2 ml
46 ml

228 ml
3 ml
69 ml

304 ml
4 ml
92 ml

380 ml
5 ml
115 ml

13

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Liofilizacin
1.

2.

3.

4.

5.

6.

Coseche hojas de plantas cultivadas en el invernadero o el campo. Es preferible usar

hojas jvenes sin reas necrticas o lesiones, pero tambin se pueden emplear hojas
algo ms viejas que no estn en la senescencia.
Si la nervadura central es gruesa y dura, elimnela. Corte o doble las hojas en
secciones de 10-15 cm y colquelas en una bolsa de malla de fibra de vidrio junto con
el rtulo que identifica la muestra (se pueden utilizar papel de aluminio o bolsas de
papel si se perforan para permitir el flujo del aire). Coloque las bolsas en una hielera u
otro recipiente con hielo para mantener fras las muestras (pero no las deje congelar).
Ponga las muestras de hojas en un recipiente de espuma de poliestireno o algn otro
tipo de recipiente que pueda contener nitrgeno lquido. Agregue nitrgeno lquido
para congelar rpidamente las muestras. No permita que se descongelen las muestras
hasta que estn liofilizadas.
NOTA: Las muestras de hojas pueden ser conservadas a -80C hasta el momento de
liofilizarlas.
Transfiera las muestras de hojas congeladas al liofilizador. Asegrese de que el
liofilizador est a una temperatura baja (la cmara debe estar a -60C) y produce un
vaco adecuado ( 10 micrones Hg) antes de cargar las muestras. No cargue
excesivamente el liofilizador; asegrese de que el vaco siempre sea de 100
micrones y de que la temperatura del condensador sea de -60C. Las muestras
deben secarse en 72 horas. Por lo general el peso de las hojas frescas equivale a 10
veces el peso en seco.
Las muestras de hojas secas se pueden conservar a temperatura ambiente por unos
das en bolsas de plstico cerradas hermticamente o, preferiblemente, a -20C para
almacenarlas por varios aos.
Llene una hoja de registro de la cosecha.

Molienda
1.

2.

Muela las hojas con un molino mecnico (Tecator Cyclotec Sample Mill, Model 1093)
hasta obtener un polvo fino, en un frasco de plstico para deteccin de centelleos o en
cualquier otro recipiente apropiado de plstico que se pueda cerrar hermticamente.
NOTA:
Si el material vegetal pesara menos de 4 g (peso fresco), muela hasta
obtener un polvo en un mortero con una pizca de arena lavada con cido.
Cuanto ms fino se muela, mayor ser la cantidad de DNA obtenida de una
determinada cantidad de material.
Almacene a -20C las muestras molidas, en frascos cerrados hermticamente. Las
muestras se mantienen estables durante varios aos.

13

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Amplificacin de insertos de plsmidos con la

PCR
1.

Prepare una mezcla de reaccin que contenga todos los componentes enumerados a
continuacin, excepto el plsmido.
SOL. CONC.

[FINAL]

RXN normal Ejemplo de mezcla

de 25 l
de reaccin p/ 40

RXNs
ddH2O

adjustar a 25.0 l
Amortig. Taq (10X; libre de Mg) 1X
2.5 l
MgCl2 (50 mM)1
2 mM
1.0 l
Glicerol2
10-15 %
2.5-3.75 l
Mezcla dNTP (c/u a 10 mM)
50 M c/u
0.5 l (0.125 c/u)
1
Enzima Taq (5 U/l)
0.5 U
0.1 l
Iniciador 1 (2 M) 3,4
0.2 M
2.5 l
Iniciador 2 (2 M) 3,4
0.2 M
2.5 l
3
Plsmido (1 ng/l)
5 ng
5.0 l
2.
3.
4.
5.
6.

7.
8.
9.

variable
100 l
40 l
100-150 l
20 l
4 l
100 l
100 l

Traslade con una pipeta la cantidad correspondiente de mezcla de reaccin dentro de

cada tubo.
Agregue 5 l de plsmido a cada tubo. Mezcle brevemente y centrifugue.
Cubra cada muestra con 25 l de aceite mineral ultrapuro.
Asegrese de que hay suficiente aceite en cada pozo de la mquina de PCR para que
exista un contacto apropiado con el tubo, y coloque los tubos en la mquina de PCR.
Amplifique usando el siguiente programa 5 :
1 ciclo de:
25 ciclos de
1 ciclo de
94C por 1 min
94C por 1 min
72C por 1 min
55C por 2 min
72C por 2 min*
* Nota: puede ser necesario duplicar el tiempo de extensin para los insertos ms
largos de 1.5 Kb.
Retire el aceite agregando 25 l de TE + 25 l de cloroformo. Mezcle y centrifugue.
Pase la capa acuosa superior a un tubo nuevo usando una pipeta.
Cuantifique la produccin de inserto usando el ensayo de fluorescencia de puntos o el
fluormetro.
Verifique la amplificacin cargando 5 l de cada muestra (1 l de DNA + 1 l de 5X
SGB + 3 l de dH2O) en un gel al 1.0%.

1 Puede ser necesario determinar las concentraciones ptimas de MgCl y Taq con cada lote
2

nuevo de enzima.
2

Se ha encontrado que este ingrediente optativo ayuda a amplificar insertos grandes o

"difciles".

Diluido en "solucin amortiguadora para dilucin de DNA" (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA,
10 mM NaCl).

Ejemplos de secuencias de iniciadores:

vectores derivados CV725 - ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT - 3de pUC y M13CV765 AAACAGCTATGACCATGATTACGCC - 3insertos en CV2365 - GCGCAACGTTGTTGCCAT - 3pBR322
PstICV2375 - CGAGCGTGACACCACGAT - 3
5
Condiciones ptimas para el termociclador de sistema TwinBlockTM de ERICOMP.

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Cuantificacin y control de calidad

del DNA
CUANTIFICACION DEL DNA CON UV
Agregue 15 l de cada muestra a 735 l de TE, mezcle bien y lea la DO 260 y la DO280
para determinar la pureza. Consulte en los Apndices las instrucciones sobre cmo
usar el espectrofotmetro DU-65 de Beckman y el listado del programa para la lectura
automtica de muestras.
Diluya la muestra a 0.2 0.3 g/l con TE y almacene a 4C. La muestra se mantendr
utilizable por hasta seis meses.
Concentration del DNA (g/l) =
Es preciso determinar la relacin DO260/DO280 con el fin de evaluar la pureza de la
muestra. Si esa relacin es de 1.8-2.0, es probable que la absorcin sea causada por
los cidos nucleicos. Una relacin inferior a 1.8 indica que pueden existir protenas y/u
otros elementos absorbentes de UV en la muestra; en este caso, es conveniente volver
a precipitar el DNA. Una relacin superior a 2.0 indica que las muestras pueden estar
contaminadas con cloroformo o fenol y se debe volver a efectuar la precipitacin con
etanol (OPCION B).
En los Apndices se incluye un programa para espectrofotmetro DU-65 de Beckman,
el cual efecta la entrada automtica de las muestras (con un dispositivo absorbedor)
y calcula todos los valores apropiados para cada muestra.

CONTROL DE LA CALIDAD DEL DNA

1.
2.
3.

4.

Este paso es esencial para verificar que el DNA aislado es de alto peso molecular. Para
una resolucin adecuada de los RFLPs, el DNA original debe emigrar como una banda
apretada de peso molecular 40 kb. No obstante, es inevitable la degradacin de una
parte del DNA aislado y el protocolo presentado a continuacin est diseado para
correr el DNA en condiciones ptimas con el fin de asegurar las cantidades relativas de
DNA degradado y de DNA de alto peso molecular. El procedimiento tambin permite
verificar la cuantificacin con UV sealada antes.
Si tiene pocas muestras de DNA (digamos, menos de 25), verifquelas a todas. En caso
contrario, verifique slo el 10-20% de las muestras asegurndose de que la seleccin
es totalmente aleatoria.
Despus de la cuantificacin con UV, ajuste la concentracin de cada muestra de DNA
a 0.3 g/l o a una concentracin que usted escoja.
Prepare una dilucin de 10 ng/l de las muestras seleccionadas (por ejemplo, 4 l de
DNA a 0.3 g/l + 116 l de TE).
Cargue 100 ng de cada muestra diluida (10 l de DNA + 2 l de 5X SGB) en un gel de
agarosa al 0.7%. Incluya por lo menos una pista por peine de DNA Lambda ( ) no
cortado como marcador del peso molecular. Cargue 100 ng (de una dilucin de 10
ng/l) de este marcador para verificar tanto la calidad como la cantidad de los DNA de
las muestras.
Corra el gel a 50 mA por unos 90 minutos. Vea en la seccin sobre electroforesis en gel
los detalles sobre la preparacin del gel, las condiciones de corrida y la visualizacin
del DNA.

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Minipreparaciones de plsmidos
(basado en el mtodo de Birnboim y Doly, 1979*)

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Incube un cultivo bacteriano de 10 ml hasta el da siguiente.

Coseche las clulas centrifugando todo el cultivo en un tubo de 15 ml para
centrifugadora durante 5 min a velocidad mxima en una centrifugadora de
mesa (1300-1500 x g). Deseche la capa sobrenadante.
Resuspenda el precipitado de clulas revolviendo en un Vortex y agregue 200
l de Solucin I que contenga 5 mg/ml de lisozima (agregue la lisozima dentro
de la hora anterior a la utilizacin). Revuelva y deje a la temperatura ambiente
durante 5 min. Es ms fcil volver a suspender las clulas si se las revuelve en
el Vortex antes de agregar la mezcla de lisozima.
Agregue 400 l de Solucin II, mezcle e incube 10 min sobre hielo (la solucin
debe estar clara).
Agregue 300 l de Solucin III, mezcle e incube 15 min sobre hielo.
Centrifugue 15 min a velocidad mxima en la centrifufadora de mesa, vierta la
capa sobrenadante en un tubo de 1.5 ml para microcentrifugadora.
Agregue 600 l de isopropanol helado, mezcle, centrifugue 5 min a velocidad
mxima en la microcentrifugadora (~12,000 rpm), vierta la solucin y seque el
tubo.
Disuelva el precipitado en 190 l de dH 2O.
Agregue 5 l de 1 mg/ml de RNAasa A y 5 l de 500 U/ml de RNAasa T1.
Incube a 37C (o a la TA) durante 15 min.
Agregue 5 l de 10 mg/ml de Proteinasa K. Incube a 37C (o a la TA) durante
20 min.
Extraiga con 200 l de fenol [o 200 l de fenol/cloroformo (1:1)].
Centrifugue durante 2 min a velocidad mxima en la centrifugadora de mesa
(1300-1500 x g). Transfiera la capa (superior) acuosa a otro tubo para
microcentrifugadora.
Agregue 100 l de 7.5 M NH4OAc.
Agregue 750 l de EtOH absoluto y mezcle; incube a -80C durante 30 min,
centrifugue 5 min a velocidad mxima en la microcentrifugadora.
Lave el precipitado con 1 ml de 75% EtOH, centrifugue 3 min en la
microcentrifugadora, vierta la capa sobrenadante y seque el tubo en el
desecador de vaco.
Disuelva el precipitado en 50 l de TE-8.0.

CUANTIFICACION DEL DNA CON UV

Agregue 5 l de cada muestra a 745 l de TE, lea la DO 260 y la DO280 para
determinar la pureza. Diluya la muestra con TE a 1 g/l. Conserve a -20C. Se
podr usar la muestra durante un perodo de hasta 6 meses. (Vea en los
apndices el programa del espectrofotmetro de Beckman.)

Birnboim, H.C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA. Nucelic Acid Research 7:1513-1518.

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Soluciones
Solucin I: 25 mM Tris-8.0, 10 mM EDTA, 50 mM glucose
SOL. CONC.

10 ml

20 ml

30 ml

40 ml

50 ml

1.0 M Tris-8.0
250 l
500 l
750 l
1000 l
1250 l
0.5 M EDTA-8.0
200 l
400 l
600 l
800 l
1000 l
Glucose
90 mg
180 mg
270 mg
360 mg
450 mg
NOTA: La solucin I se puede preparar como una solucin concentrada 10X y
conservarse distribuida en pequeas partes iguales a -20C, para su
uso posterior. Para el empleo, desconglela, dilyala y agregue la
lisozima.
Solucin II: 0.2 M NaOH, 1.0% SDS
SOL. CONC.

100 ml

200 ml

300 ml

400 ml

500 ml

1.0 M NaOH
20% SDS

20 ml
5 ml

40 ml
10 ml

60 ml
15 ml

80 ml
20 ml

100 ml
25 ml

Solucin III: 3 M KOAc, pH 5.5

Disuelva 29.5 g de acetato de potasio en 60 ml de dH 2O. Agregue suficiente
cido actico glacial para llevar el pH a 5.5 (aproximadamente 11 ml).
Complete el volumen hasta tener 100 ml.

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Preparacin de clulas competentes

congeladas
NOTA: Se recomienda este protocolo para la produccin de grandes cantidades
de clulas competentes de eficiencia mediana para la subclonacin
rpida de insertos individuales.
1. Cultive hasta el da siguiente la cepa deseada en 5 ml de caldo LB (sin
antibitico).
2. Diluya el cultivo obtenido con caldo LB (sin antibitico) en una proporcin de
1:100 y agtelo a 37C hasta que la DO600 llegue a 0.3-0.4.
3. Transfiera las clulas a botellas de 250 ml para centrifugadora y enfre sobre
hielo durante 10 minutos.
4. Centrifugue las clulas durante 7 min a 3500 rpm a 4C.
5. Elimine con cuidado la capa sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado
pipeteando con suavidad 5 ml de 10 mM MgCl 2 estril y helado. Una vez que
las clulas estn nuevamente en suspensin, agregue otros 120 ml de 10 mM
MgCl2.
6. Centrifugue las clulas durante 7 min a 3500 rpm a 4C.
7. Elimine con cuidado la capa sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado
pipeteando con suavidad 5 ml de 50 mM CaCl 2, 20% de glicerol, estriles y
helados. Una vez que las clulas estn nuevamente en suspensin, agregue
otros 5 ml de 50 mM CaCl2, 20% de glicerol.
8. Coloque sobre el hielo durante al menos 1 h.
9. Transfiera porciones iguales de 400 l de clulas a tubos individuales de 500 l
para microcentrifugadora, esterilizados.
10. Congele rpidamente las clulas en hielo seco/bao de etanol (o en etanol a
-80C) y conserve a -80C hasta el empleo.

Soluciones
10 mM MgCl2
SOL. CONC.

100 ml

200 ml

300 ml

400 ml

500 ml

1.0 M MgCl2
ddH2O

1 ml
99 ml

2 ml
198 ml

3 ml
297 ml

4 ml
396 ml

5 ml
495 ml

50 mM CaCl2, 20 % Glicerol
SOL. CONC.

100 ml

200 ml

300 ml

400 ml

500 ml

1.0 M CaCl2
Glicerol
ddH2O

5 ml
20 ml
75 ml

10 ml
40 ml
150 ml

15 ml
60 ml
225 ml

20 ml
80 ml
300 ml

25 ml
100 ml
375 ml

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Trasformaciones bacterianas
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Agregue 40 ng de DNA de plsmido a 20 l de clulas competentes

descongeladas.
Mezcle muy suavemente.
Coloque sobre hielo durante 30 min.
Provoque un choque trmico a 42C durante 40 segundos en bao de Mara.
Coloque sobre hielo durante 10 min.
Agregue 80 l de caldo LB (sin antibiticos).
Agite durante 2-4 h a 225 rpm a 37C.
Siembre en forma homognea las clulas sobre una placa de LB + el
antibitico adecuado.
Cultive hasta el da siguiente a 37C (o hasta que se vean con nitidez las
colonias).

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