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COLOR
Clorofila A
Verde azulado
Clorofila B
Verde amarillento
Carotenos
Naranja
Xantofilas
Amarillo
La tcnica que se describe a continuacin se puede realizar sin ningn problema en
casa.
Material necesario.
Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones.
Alcohol de 96 (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas)
Un mortero
Dos filtros de caf
Un embudo
Un vaso
Una pinza de la ropa
Cmo lo hacemos?
Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido, se aade un poco de alcohol
y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.
Determinacin de protenas
Uno de los mtodos mas usados hoy en da es el mtodo de Bradford (1976) .
Mtodo de Bradford (1976)
Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin azul entre los
residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el colorante Azul de Comassie.
Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos
Reactivos:
Reactivo de Bradford
Disolver 5 mg de azul de Comassie en 2.5 ml de etanol al 96%
P6
P8
Agua
100
90
80
60
40
20
Patrn
10
20
40
60
80
Problema
Bradford
1000 1000 1000 1000 1000 1000
Nota: todas estas cantidades estn expresadas en microlitros.
Agitar bien. Esperar 2-3 minutos.
Leer absorbancia a 295 nm.
La reaccin es estable durante 1 hora.
Lavar la cubeta con metanol entre medida y medida.
P10
Pr1
Pr2
100
1000
25
1000
50
1000
Mtodo de Makino
En este ejemplo concreto vamos a usar el kiwi como modelo.
Se tritura 1 g material en un mortero con nitrgeno lquido y 1% de
polivinilpirrolidona(PVPP) (p7v) con el fin de eliminar los fenoles. El polvo obtenido se
disolvi en 1 ml de tampn Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8. El extracto obtenido se utiliz para
determinar protenas totales y Rubisco.
El ensayo de protenas totales se realiz mediante annlisis colorimtrico, utilizando el
kit Protein Assay de BIORAD, USA. Antes de cada ensayo se realiz una curva de
calibracin con diluciones conocidas de una solucin de seroalbmina bovina (BSA),
entre 2 y 20 microgramos/microlitros.
Para la separacin del enzima rubisco ya se llevaron a cabo ms pasos y de mayor
complejidad.
Mtodo de Lowry
Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del biuret, el complejo protena-Cu 2+ se
hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloracin azul, con un
mximo de absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido
fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno de composicin no
definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos
e histidilos de las protenas que forman el complejo con el Cu2+.
Las caractersticas del mtodo son:
La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos de la
protena.
Es ms sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml.
Presenta muchas interferencias.
Complejo
Protena-Cu 2+
AA red.
Complejo
Protena-Cu 2+
AA oxid.
Reactivo Folin
oxid.
AMARILLO
Reactivo Folin
red.
AZUL
H2 N
CO
NH2
H2 N
CO
NH2
H2 N
CO
Urea
NH CO NH2
Biuret
NH
RC H
O
HN
Cu2+
NH
RC H
H CR
C
HN
H CR
Violeta-prpura
Complejo protena-Cu(II)